CN112195210B - 一种透明质酸的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种透明质酸的生产方法，步骤如下：将马疫链球菌进行活化培养；将活化后的马疫链球菌接种到种子培养基中，在35‑40℃、200‑300r/min的条件下培养8‑14h；将副干酪乳杆菌接种到种子培养基中，在36‑38℃的条件下培养12‑24h；将马疫链球菌种子液和副干酪乳杆菌种子液接种到发酵培养基，在30‑33℃、150‑250r/min的条件下发酵培养8‑10h，再在35‑38℃、300‑500r/min的条件下继续发酵9‑12h，得到含有透明质酸的发酵液。本申请将马疫链球菌和副干酪乳杆菌进行共同发酵，副干酪乳杆菌可以抑制发酵体系中透明质酸酶的活性，保证了发酵液中透明质酸的活性和产量。
Description
技术领域
本申请涉及透明质酸的制备技术领域，特别涉及一种透明质酸的生产方法。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid，简称 HA)又名玻璃酸，是一种由葡萄糖醛酸和 N-乙酰氨基葡萄糖胺通过β-1,3 和β-1,4 糖苷键反复交替连接而成的一种链状高分子聚合物，广泛存在于皮肤、眼玻璃体、脐带、软骨、关节滑液等生物体各种组织中，并在其中起到保湿、营养、修复和预防损伤等生理作用。透明质酸具有极好的保水性和协助渗透的特性，在医药、化妆品、食品保健等领域得到广泛研究与应用。
由于透明质酸的分子量能够显著影响其理化特性与应用效果，所以根据分子量的不同将透明质酸分为高分子量透明质酸(HMHA，Mr>2×106Da)和低分子量透明质酸(LMHA，Mr<1×106Da)。高分子量HA具有良好的黏弹性和保湿、润滑功能，一般应用于医药领域；低分子量HA外用时能被皮肤吸收，能有效增加皮肤弹性，一般应用于化妆品和食品领域。
透明质酸传统的制备方法是采用动物组织为原料，从人脐带、鸡冠、猪牛羊眼的玻璃体中提取透明质酸，但动物组织价格昂贵，且产品的产率低，所以微生物发酵生产透明质酸的技术应运而生。微生物发酵法就是利用兽疫链球菌、马疫链球菌等链球菌属菌种通过其自身的生理代谢而产生透明质酸的过程。但是，目前微生物发酵生产透明质酸的产量普遍不高，不能进行规模化生产，不能满足日益增长的市场需求。
发明内容
针对现有技术存在的透明质酸产量低的问题，本申请的目的是提供一种透明质酸的生产方法，以达到提高透明质酸产量的技术效果。
本申请的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：
一种透明质酸的生产方法，包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在35-40℃条件下活化培养12-24h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到种子培养基中，在35-40℃、200-300r/min的条件下培养8-14h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
c.将副干酪乳杆菌IJH-SONE68接种到种子培养基中，在36-38℃的条件下培养12-24h，得到副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液；
d.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到发酵培养基上，在30-33℃、150-250r/min的条件下发酵培养8-10h，再在35-38℃、300-500r/min的条件下继续发酵9-12h，得到含有透明质酸的发酵液。
通过采用上述技术方案，本申请首先将马疫链球菌在平板培养基上进行活化培养，再在种子培养基上将菌种培养至对数生长期；同时将副干酪乳杆菌在种子培养基上进行种子培养；然后将获得的马疫链球菌种子液和副干酪乳杆菌种子液接种到发酵培养基中，发酵获得透明质酸。在发酵过程中，副干酪乳杆菌能够抑制马疫链球菌在菌体生长或代谢过程中形成的透明质酸酶的活性，降低透明质酸酶对透明质酸的降解能力，从而在发酵结束后，获得高含量、高活性的透明质酸。另外，本申请限定了发酵过程中摇床转速或搅拌转速，也就是通气量，在发酵前期以较低的转速进行培养，利于马疫链球菌和副干酪乳杆菌菌体的生长，为副干酪乳杆菌发挥抑制透明质酸酶活性的作用提供条件；发酵后期提高转速，马疫链球菌为了不被氧自由基杀死，会分泌更厚荚膜保护层，而荚膜的主要成分就是透明质酸，因此透明质酸生产水平会显著提升，同时较高的转速也可以加速荚膜从细胞表面脱离，从而提高发酵液中透明质酸的含量。
本申请平板培养基是在种子培养基成分的基础上加入2%的琼脂制备而成。
优选的，步骤b、c中，种子培养基包括以下组分和含量：15-25g/L葡萄糖、12-18g/L酵母膏、0.5-0.8g/L MgSO4·7H2O 、1-2g/L KH2PO4，调节pH至7.5（灭菌前）。
通过采用上述技术方案，本申请的种子培养基可以同时满足马疫链球菌和副干酪乳杆菌的生长需求，且培养基营养丰富，利于菌体快速吸收利用，为后期发酵产生透明质酸提供了基础。
优选的，步骤b中，种子培养基的装液量为摇瓶容积的10%-15%；步骤c中，种子培养基的装液量为摇瓶容积的40%-50%。
通过采用上述技术方案，本申请除了通过摇床转速或搅拌转速控制通气量外，还通过控制装液量对通气量进行控制。在对马疫链球菌进行种子培养时，种子培养基的装液量仅为摇瓶容积的10%-15%并伴随200-300r/min的转速，利于提高培养基中氧气的含量，从而利于马疫链球菌的菌体生长。在对副干酪乳杆菌进行种子培养时，种子培养基的装液量为摇瓶容积的40%-50%并采用静置培养的方式，尽量减少培养基中氧气的含量，从而利于副干酪乳杆菌的菌体生长。
优选的，步骤d中，发酵培养基包括以下组分和含量：50-60g/L葡萄糖、12-18g/L酵母膏、1.5-2g/L MgSO4·7H2O、1-2g/L KH2PO4，调节pH至7.5（灭菌前）。
通过采用上述技术方案，本申请的发酵培养基大比例的提高了葡萄糖的含量，防止在发酵过程中马疫链球菌和副干酪乳杆菌对葡萄糖产生竞争抑制，影响透明质酸的产量。另外，本申请的发酵培养基原料易于获得，价格低廉，适合工业化生产。
优选的，步骤d中，发酵培养基的装液量为摇瓶容积的8%-12%。
通过采用上述技术方案，本申请将发酵培养基的装液量进一步降低至摇瓶容积的8%-12%，可以进一步提高发酵培养基中的通气量，提高透明质酸的产量。
优选的，步骤d中，马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液的接种量为发酵培养基体积的5-20 %。
优选的，步骤d中，副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液的接种量为发酵培养基体积的3-8 %。
通过采用上述技术方案，本申请将马疫链球菌和副干酪乳杆菌同时接种到发酵培养基中，马疫链球菌的接种量显著高于副干酪乳杆菌，这样以马疫链球菌为发酵主体，副干酪乳杆菌在发酵过程中并不产生透明质酸，而是辅助马疫链球菌进行发酵，保证发酵中形成的透明质酸的活性和含量。
优选的，步骤d中，在发酵过程中控制发酵液的pH，发酵前8-10h，发酵液pH控制在7.8-8.1；发酵后9-12h，发酵液pH控制在6.8-7.2。进一步的，本申请可以通过加入0.1MNaOH来控制发酵液的pH。
通过采用上述技术方案，本申请在发酵过程中，严格控制发酵温度和发酵液pH，具体为在发酵前期，发酵温度控制在相对较低水平，pH控制在相对较高水平；而发酵后期，发酵温度控制在相对较高水平，pH控制在相对较低水平。这是因为发酵前期主要以菌体生长为主，低温度和高pH利于菌体生长并获得高分子量的透明质酸；而发酵后期，主要以产透明质酸为主，高温度和低pH利于提高透明质酸的产量。另外，本申请控制发酵液pH的另一个原因在于马疫链球菌和副干酪乳杆菌在发酵过程中会形成大量乳酸，乳酸会造成发酵体系pH急剧下降，强酸环境强烈抑制菌体生长和透明质酸合成，所以，在发酵过程中严格控制发酵液pH是非常重要的。
优选的，步骤d中，将两种菌的种子液接种到发酵培养基后，并向发酵培养基中加入丙酮，丙酮的加入量为发酵培养基体积的0.8-1.2%。
通过采用上述技术方案，本申请在发酵培养基中加入丙酮，丙酮既可以显著提高菌体量，又可以提高透明质酸的产量。
优选的，步骤d中，发酵8-10h后，向发酵液中加入2-5%发酵培养基体积的前体物质，所述前体物质选用UDP-葡糖醛酸或UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。
通过采用上述技术方案，本申请在发酵后期，即透明质酸产生阶段加入前体物质，可以提高马疫链球菌利用前体物质转化形成透明质酸的速率，进一步的提高透明质酸的产量。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请将马疫链球菌CNCMⅠ-4645和副干酪乳杆菌IJH-SONE68进行共同发酵，副干酪乳杆菌IJH-SONE68可以抑制发酵体系中透明质酸酶的活性，从而保证了发酵产生的透明质酸的活性和产量；
2、本申请通过严格控制种子培养过程和发酵过程中的温度、pH、搅拌转速等参数，可以显著提高透明质酸的产量并提高获得的透明质酸的分子量；
3、本申请的种子培养基和发酵培养基成分易于获得，价格低廉，且发酵过程简单，适合工业化生产。
具体实施方式
本申请的马疫链球菌CNCMⅠ-4645来源于法国巴黎巴斯德研究所的法国国立微生物保藏中心，保藏号为CNCM I-4645；
本申请的副干酪乳杆菌IJH-SONE68来源于日本技术评价研究所生物资源中心，保藏号为NITE BP-02242。
本申请的UDP-葡糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖购自Sigma-Aldcich公司。
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
实施例1
一种透明质酸的生产方法，其包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在35℃条件下活化培养12h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到含有50mL种子培养基的500mL摇瓶中，在40℃、300r/min的条件下培养8h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
c.将副干酪乳杆菌IJH-SONE68接种到含有200mL种子培养基的500mL摇瓶中，在36℃的条件下培养24h，得到副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液；
种子培养基包括以下组分和含量：15g/L葡萄糖、18g/L酵母膏、0.5g/L MgSO4·7H2O 、2g/L KH2PO4，调节pH至7.5；
d.将8mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和1.2mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有40mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在30℃、250r/min、pH=7.8的条件下发酵培养10h，然后在38℃、500r/min、pH=7.2的条件下继续发酵12h，得到含有透明质酸的发酵液；
发酵培养基包括以下组分和含量：50g/L葡萄糖、18g/L酵母膏、1.5g/L MgSO4·7H2O、2g/L KH2PO4，调节pH至7.5。
实施例2
一种透明质酸的生产方法，其包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在40℃条件下活化培养24h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到含有75mL种子培养基的500mL摇瓶中，在35℃、200r/min的条件下培养14h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
c.将副干酪乳杆菌IJH-SONE68接种到含有250mL种子培养基的500mL摇瓶中，在38℃的条件下培养12h，得到副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液；
种子培养基包括以下组分和含量：25g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、0.8g/L MgSO4·7H2O 、1g/L KH2PO4，调节pH至7.5；
d.将3mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和4.8mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有60mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在33℃、150r/min、pH=8.1的条件下发酵培养8h，然后在35℃、300r/min、pH=6.8的条件下继续发酵9h，得到含有透明质酸的发酵液；
发酵培养基包括以下组分和含量：60g/L葡萄糖、12g/L酵母膏、2g/L MgSO4·7H2O、1g/L KH2PO4，调节pH至7.5。
实施例3
一种透明质酸的生产方法，其包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在37℃条件下活化培养18h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到含有60mL种子培养基的500mL摇瓶中，在37℃、250r/min的条件下培养12h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
c.将副干酪乳杆菌IJH-SONE68接种到含有225mL种子培养基的500mL摇瓶中，在37℃的条件下培养18h，得到副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液；
种子培养基包括以下组分和含量：20g/L葡萄糖、15g/L酵母膏、0.6g/L MgSO4·7H2O 、1.5g/L KH2PO4，调节pH至7.5；
d.将6mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和2.5mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在32℃、200r/min、pH=7.9的条件下发酵培养9h，然后在36℃、400r/min、pH=7的条件下继续发酵11h，得到含有透明质酸的发酵液；
发酵培养基包括以下组分和含量：55g/L葡萄糖、15g/L酵母膏、1.8g/L MgSO4·7H2O、1.5g/L KH2PO4，调节pH至7.5。
实施例4
一种透明质酸的生产方法，其包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在36℃条件下活化培养20h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到含有55mL种子培养基的500mL摇瓶中，在38℃、280r/min的条件下培养10h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
c.将副干酪乳杆菌IJH-SONE68接种到含有210mL种子培养基的500mL摇瓶中，在37.5℃的条件下培养20h，得到副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液；
种子培养基包括以下组分和含量：18g/L葡萄糖、16g/L酵母膏、0.7g/L MgSO4·7H2O 、1.8g/L KH2PO4，调节pH至7.5；
d.将3.6mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和2.7mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有45mL发酵培养基的500mL摇瓶中，并向培养基中加入0.36mL的丙酮，在31℃、180r/min、pH=7.9的条件下发酵培养8.5h；然后在37℃、450r/min、pH=6.9的条件下继续发酵10h，得到含有透明质酸的发酵液；
发酵培养基包括以下组分和含量：58g/L葡萄糖、14g/L酵母膏、1.7g/L MgSO4·7H2O、1.2g/L KH2PO4，调节pH至7.5。
实施例5
一种透明质酸的生产方法，其包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在38℃条件下活化培养16h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到含有65mL种子培养基的500mL摇瓶中，在36℃、220r/min的条件下培养13h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
c.将副干酪乳杆菌IJH-SONE68接种到含有240mL种子培养基的500mL摇瓶中，在36.5℃的条件下培养16h，得到副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液；
种子培养基包括以下组分和含量：22g/L葡萄糖、14g/L酵母膏、0.75g/L MgSO4·7H2O 、1.2g/L KH2PO4，调节pH至7.5；
d.将9.9mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和2.2mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有55mL发酵培养基的500mL摇瓶中，并向培养基中加入0.66mL的丙酮，在31.5℃、220r/min、pH=8.0的条件下发酵培养9.5h；然后在36℃、350r/min、pH=7.1的条件下继续发酵10.5h，得到含有透明质酸的发酵液；
发酵培养基包括以下组分和含量：52g/L葡萄糖、16g/L酵母膏、1.6g/L MgSO4·7H2O、1.7g/L KH2PO4，调节pH至7.5。
实施例6
一种透明质酸的生产方法，与实施例4的不同之处在于：将3.6mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和2.7mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有45mL发酵培养基的500mL摇瓶中，并向培养基中加入0.36mL的丙酮，在31℃、180r/min、pH=7.9的条件下发酵培养8.5h；然后向发酵液中加入0.9mL UDP-葡糖醛酸，并在37℃、450r/min、pH=6.9的条件下继续发酵10h，得到含有透明质酸的发酵液。
实施例7
一种透明质酸的生产方法，与实施例5的不同之处在于：将9.9mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和2.2mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有55mL发酵培养基的500mL摇瓶中，并向培养基中加入0.66mL的丙酮，在31.5℃、220r/min、pH=8.0的条件下发酵培养9.5h；然后向发酵液中加入2.75mL UDP-葡糖醛酸，并在36℃、350r/min、pH=7.1的条件下继续发酵10.5h，得到含有透明质酸的发酵液。
实施例8
一种透明质酸的生产方法，与对比例6的不同之处在于：前体物质选用UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。
实施例9
一种透明质酸的生产方法，与对比例7的不同之处在于：前体物质选用UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。
对比例1
一种透明质酸的生产方法，其包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在37℃条件下活化培养18h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到含有60mL种子培养基的500mL摇瓶中，在37℃、250r/min的条件下培养12h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
种子培养基包括以下组分和含量：20g/L葡萄糖、15g/L酵母膏、0.6g/L MgSO4·7H2O 、1.5g/L KH2PO4，调节pH至7.5；
c.将6mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液接种到含有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在32℃、200r/min、pH=7.9的条件下发酵培养9h，然后在36℃、400r/min、pH=7的条件下继续发酵11h，得到含有透明质酸的发酵液；
发酵培养基包括以下组分和含量：55g/L葡萄糖、15g/L酵母膏、1.8g/L MgSO4·7H2O、1.5g/L KH2PO4，调节pH至7.5。
对比例2
一种透明质酸的生产方法，与对比例3的不同之处在于：步骤d中，将6mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和2.5mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在32℃、200r/min、pH=7.9的条件下发酵培养20h，得到含有透明质酸的发酵液。
对比例3
一种透明质酸的生产方法，与对比例3的不同之处在于：步骤d中，将6mL马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和2.5mL副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到含有50mL发酵培养基的500mL摇瓶中，在36℃、400r/min、pH=7的条件下继续发酵20h，得到含有透明质酸的发酵液。
性能检测
（1）采用Bitter-Muir氏法测定发酵液中透明质酸的浓度；
J.KRAHULEC,J.KRAHULCOVA.Increase in Hyaluronic Acid Production byStreptococcus Equi Subsp Zooepidemicus Strain Deficient in Betaglucuronidasein Laboratory Conditions. Applied Microbiology and Biotechnology, 2006, 71:415-422.
（2）采用Laurent的特性粘度法测定发酵液中透明质酸的相对分子质量；
L. J. CHIEN, C. K. LEE. Hyaluronic Acid Production by RecombinantLactococcus Lactis. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 77:339-346.
实验结果参见表1。
从表1可以看出，本申请实施例1-9发酵获得的透明质酸的分子量在2.8×106 Da左右，实施例1-3发酵液中透明质酸的含量在10 g/L左右；实施例4、5加入丙酮后，发酵液中的透明质酸含量提高到11.5 g/L左右；实施例6-9加入前体物质后，发酵液中的透明质酸含量进一步提高，达到12.8 g/L左右。实验结果表明，丙酮和前体物质的加入可以提高发酵液中透明质酸的含量。
对比例1与实施例3的不同之处在于，只进行马疫链球菌的单菌发酵。从表1可以看出，发酵获得的透明质酸的分子量在1.52×106 Da，而发酵液中透明质酸的含量只有3.3g/L。实验结果表明，发酵体系中的副干酪乳杆菌虽然不发酵产生透明质酸，但是对马疫链球菌发酵产生的透明质酸具有很好的保护作用。
对比例2、3与实施例3的不同之处在于，发酵过程中对温度、pH以及转速的控制不采用分段的方式。从表1可以看出，对比例2在整个发酵过程中温度控制在32℃，pH控制在7.9，转速控制在200r/min，最终获得的透明质酸的分子量为1.15×106 Da，发酵液中透明质酸的含量为5.9 g/L；对比例3在整个发酵过程中温度控制在36℃，pH控制在7，转速控制在400r/min，最终获得的透明质酸的分子量为0.64×106 Da，发酵液中透明质酸的含量为7.4 g/L。实验结果表明，pH相对较高，温度相对较低且转速相对较低时，可以获得高分子量的透明质酸；而pH相对较低，温度相对较高且转速相对较高时，可以获得产量较高的透明质酸。所以本申请采用分段式控制方法，可以最大限度的提高透明质酸产量的同时，获得高分子量的透明质酸。
本具体实施方式的实施例均为本申请的较佳实施例，并非依此限制本申请的保护范围，故：凡依本申请的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本申请的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种透明质酸的生产方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种在平板培养基上，在35-40℃条件下活化培养12-24h；
b.将活化后的马疫链球菌CNCMⅠ-4645接种到种子培养基中，在35-40℃、200-300r/min的条件下培养8-14h，得到马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液；
c.将副干酪乳杆菌IJH-SONE68接种到种子培养基中，在36-38℃的条件下培养12-24h，得到副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液；
d.将马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液和副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液接种到发酵培养基上，在30-33℃、150-250r/min、发酵液pH控制在7.8-8.1的条件下发酵培养8-10h，再在35-38℃、300-500r/min、发酵液pH控制在6.8-7.2的条件下继续发酵9-12h，得到含有透明质酸的发酵液。
2.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤b、c中，种子培养基包括以下组分和含量：15-25g/L葡萄糖、12-18g/L酵母膏、0.5-0.8g/L MgSO4·7H2O 、1-2g/L KH2PO4，调节pH至7.5。
3.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤b中，种子培养基的装液量为摇瓶容积的10%-15%；步骤c中，种子培养基的装液量为摇瓶容积的40%-50%。
4.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤d中，发酵培养基包括以下组分和含量：50-60g/L葡萄糖、12-18g/L酵母膏、1.5-2g/L MgSO4·7H2O、1-2g/LKH2PO4，调节pH至7.5。
5.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤d中，发酵培养基的装液量为摇瓶容积的8%-12%。
6.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤d中，马疫链球菌CNCMⅠ-4645种子液的接种量为发酵培养基体积的5-20 %。
7.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤d中，副干酪乳杆菌IJH-SONE68种子液的接种量为发酵培养基体积的3-8 %。
8.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤d中，将两种菌的种子液接种到发酵培养基后，并向发酵培养基中加入丙酮，丙酮的加入量为发酵培养基体积的0.8-1.2%。
9.根据权利要求1所述的一种透明质酸的生产方法，其特征在于：步骤d中，发酵8-10h后，向发酵液中加入2-5%发酵培养基体积的前体物质，所述前体物质选用UDP-葡糖醛酸或UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。
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