CN107338201B - 马链球菌兽疫亚种sxy36及在发酵生产透明质酸中的应用 - Google Patents
马链球菌兽疫亚种sxy36及在发酵生产透明质酸中的应用 Download PDFInfo
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- C12R2001/46—Streptococcus ; Enterococcus; Lactococcus
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
Abstract
本发明公开了一种马链球菌兽疫亚种SXY36及在发酵生产透明质酸中的应用，本发明提供了马链球菌兽疫亚种SXY36菌株，以及发酵工艺法控制HA分子量的方法，其有益效果主要体现在：(1)SXY36经紫外线、微波和γ射线照射诱变选育，无溶血性，HA发酵产率高，遗传稳定，在优选的发酵条件下，摇瓶发酵产率可达0.731g/L，发酵罐发酵的产率可达4.78g/L；(2)采用两段变温发酵和稳定pH法，可以发酵制备高分子量HA，分子量可达1.89MDa，是常规发酵法的2倍。(3)采用发酵液自酶降解法制备不同分子量HA，控制酶解时间，即可生产分子量在0.035～1.89MDa范围内的HA。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一株透明质酸产生菌—马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.zooepidimicus)SXY36菌株，及其在可控分子量透明质酸的发酵法生产中的应用。
(二)背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)又被叫做玻尿酸、玻璃酸等，是以D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺，两者之间以β-1,3-糖苷键或β-1,4糖苷键相连组成二糖结构，二糖继续交联便组成了线性、无支链的高分子聚合物，一般研究和应用的HA的平均分子量在0.1-10MDa之间。在适当的pH条件或者生理环境中，HA中糖醛酸的羧基便会与钠离子结合生成盐，因此工业生产中的产品多为透明质酸钠(sodium hyaluronate，简称SH)。因HA具有极佳的保水性，独特的流变性、超高的润滑性等多糖的性质，以及其良好的生物兼容性、无毒副作用和可吸收性等特点，在美容护肤、医药保健，手术医疗等领域均有广泛的应用。
目前HA的生产主要有两种，一是从高等动物的部分组织中分离纯化，二是通过微生物发酵获得。可以用来制备HA的动物组织有眼睛玻璃体、鸡冠、脐带和关节滑液等，其中整体含量最高的是鸡冠，其次是关节滑液，基于材料来源和成本的考虑，生产上主要用眼睛玻璃体和鸡冠。与动物组织提取法相比，微生物发酵法因成本低、不受材料限制、提取分离简单方便、产物纯度高、能规模化生产等优点，逐渐成为生产HA的主流方法，即便如此，围绕提高HA发酵产率，控制分子量的研究仍在继续。
通过发酵获得的HA分子量分为3种：高分子量HA(HMWHA)、低分子量HA(LMWHA)以及HA寡聚糖(o-HA)，其中HMWHA的平均分子量一般大于1MDa，LMWHA为0.01～0.1MDa，o-HA小于0.01MDa。
HMWHA具有较好的保水性、粘弹性、流变性，能够抑制炎性反应、润滑组织关节等，一般应用于眼科手术和化妆品。LMWHA与HMWHA相比，有不同的生物学功能。例如，在刺激软骨细胞和淋巴母细胞分化方面，平均分子量在0.2～0.4MDa范围内的HA刺激作用最强，而平均分子量大于1.0MDa的HA则无刺激作用。HMWHA会抑制炎症反应，而LMWHA可促进。近年来，LMWHA由于有促进血管增生、伤口愈合、诱导免疫因子的表达，抑制肿瘤的增殖和抗菌等作用，被越来越多的用在医药和保健食品方面。
目前，LMWHA的获得主要是通过大分子HA水解制备，主要有物理、化学和生物降解法。物理降解一般采取加热、机械剪切、γ-射线照射、超声波、紫外线等。化学降解可分为水解型和氧化型降解。在氧化降解中，氧自由基攻击中的糖苷键，HA分子发生断裂就会产生小分子量HA。生物降解主要是通过透明质酸酶的作用，一般酶解法的效率最高，产生的平均分子量最小，如中国发明专利“一种添加透明质酸酶提高小分子透明质酸发酵产量的方法”(201410308790.X)向兽疫链球菌的发酵液中添加透明质酸酶，能得到LMWHA和o-HA，但外加透明质酸酶，无疑增加了生产成本。
HA在国内外市场上的需求量非常大，但近年来原材料价格和发酵成本的提高限制了HA的生产，进而限制了其在医药、化妆品和保健食品等方面的应用。因此如何通过微生物发酵法的可控性特点来进一步提高HA的产率，以及根据需求生产不同分子量的HA成为新的研究方向。本发明使用发酵控制手段可以将HA的分子量提高1倍，采用自酶降解法，可以制备不同分子量范围的LMWHA，满足不同领域应用的需求。
(三)发明内容
本发明目的是提供一株透明质酸产生菌—马链球菌兽疫亚种(Streptococcus.equi subsp.zooepidimicus)SXY36菌株，及其可控分子量透明质酸的发酵法生产中应用。具有透明质酸发酵产率高，可生产不同分子量的HA，生产周期短，操作简单等优点。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一株新的透明质酸产生菌——马链球菌兽疫亚种(Streptococcus.equi subsp.zooepidimicus)SXY36菌株，保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60146，保藏日期为2017年2月27日，地址：中国广州市先烈中路100号，邮编：510070。
所述的马链球菌兽疫亚种SXY36菌株由马链球菌兽疫亚种(S.equisubsp.zooepidimicus)GIM1.437(购自广东微生物菌种保藏中心)，经紫外线、微波和γ射线诱变选育而来，无溶血性，摇瓶发酵HA的产率较GIM1.437提高了64.5％。
本发明还涉及所述的马链球菌兽疫亚种SXY36在发酵生产透明质酸中的应用，所述的应用是将马链球菌兽疫亚种SXY36接种入发酵培养基，35～40℃、200～250r/min摇瓶发酵培养18～24h，得含HA的发酵液，发酵液分离纯化，获得HA；所述发酵培养基终浓度组成为葡萄糖2～13.8g/L，牛肉膏5～11.2g/L，蛋白胨5～10.4g/L，酵母浸出粉2～4g/L，MgSO41.5～2.5g/L，K2HPO4 2.5～4.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。优选的发酵培养终浓度组成为：葡萄糖13.8g/L，牛肉膏11.2g/L，蛋白胨10.4g/L，酵母浸出粉4g/L，MgSO4 2.5g/L，K2HPO44.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。优选的发酵条件为37℃、250r/min振荡培养24h。
本发明所述马链球菌兽疫亚种SXY36在发酵培养前，通常需要先经斜面活化培养，然后经种子培养、获得种子液再接入发酵培养基进行培养，具体步骤如下：
(1)将马链球菌兽疫亚种SXY36接种于斜面培养基，于35～37℃培养24～36h，得到活化后的斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖2g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/L，K2HPO4 2.5g/L，MgSO4 1.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(2)将步骤(1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中，于35～37℃、200～250r/min振荡条件下培养18～24h，得到种子液；所述的种子培养基终浓度组成除不加琼脂外，其他成分同斜面培养基；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度2％～5％的接种量，移种到发酵培养基中，于35～40℃、200～250r/min振荡条件下培养18～24h，得到含HA的发酵液。
本发明还涉及所述马链球菌兽疫亚种SXY36在机械搅拌通风发酵罐中发酵制备透明质酸的应用，所述发酵条件为：温度为37±1℃，pH为7.0±0.5，通气量0.6～1.0v/v·min，搅拌转速200～250r/min，溶氧饱和度60％～100％，发酵运行16～24h后，得到含有HA的发酵液。
本发明涉及利用两段变温和稳定pH法发酵生产高分子量透明质酸(HMWHA)，所述应用为：将马链球菌兽疫亚种SXY36接种入发酵培养基，先在37～38℃的恒温摇床中200～250r/min培养12h，之后转入34～35℃，并将发酵液pH调节稳定于7.0～7.5，200～250r/min下继续培养6h，得到含有高分子量透明质酸的发酵液，发酵液分离纯化，获得高分子量透明质酸；所述高分子量HA的相对分子量为1.07～1.89MDa，最高分子量1.89MDa，是常规发酵法(0.923MDa)的2.05倍。
本发明涉及利用发酵液自酶降解法制备低分子量透明质酸(LMWHA)的方法，所述的应用为：将马链球菌兽疫亚种SXY36接种入发酵培养基，37～38℃、200～250r/min摇瓶发酵培养18～24h，发酵液经离心去除菌体后，上清液加入终浓度为0.2mol/L的NaCl，用2mol/L的KH2PO4水溶液调节pH＝6.0，于38℃条件下酶解0～72h，获得含低分子量透明质酸的混合液，分离纯化，获得低分子量透明质酸；所述低分子量透明质酸的相对分子量为0.035～1.00MDa，HA的含量无显著降低。
本发明所述的含HA发酵液分离纯化方法为：用体积浓度25％的三氯乙酸水溶液将发酵液的pH调至4.0，再用2mol/L的NaOH水溶液将pH调至7.0，发酵液5000～8000r/min离心10～15min，弃去沉淀，在所得上清液中添加原发酵液2～3倍体积的无水乙醇，充分搅拌后静置15～20h，再次5000～8000r/min离心10～15min，弃去上清液，沉淀物再用0.1mol/L的NaCl水溶液溶解，加入氯代十六烷基吡啶(CPC)使其在溶液中的体积浓度为2～4％，充分搅拌后静置1～2h，再以5000～8000r/min的转速离心10～20min后，得到络合沉淀物，将所得的络合沉淀物于0.2～0.4mol/L的NaCl水溶液中搅拌解离至沉淀溶解，然后再添加发酵液2～3倍体积的无水乙醇沉淀，收集沉淀物冷冻干燥得HA产品。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明提供了马链球菌兽疫亚种SXY36菌株，以及发酵工艺法控制HA分子量的方法，其有益效果主要体现在：(1)SXY36经紫外线、微波和γ射线照射诱变选育，无溶血性，HA发酵产率高，遗传稳定，在优化的发酵条件下，摇瓶发酵产率可达0.731g/L，发酵罐发酵的产率可达4.78g/L；(2)采用两段变温发酵和稳定pH法，可以发酵制备高分子量HA，分子量可达1.89MDa，是常规发酵法的2倍。(3)采用发酵液自酶降解法制备不同分子量HA，控制酶解时间，即可生产分子量在0.035～1.89MDa范围内的HA。
(四)附图说明
图1葡萄糖醛酸-A530标准曲线。
图2 HA样品浓度与粘度的回归曲线。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：马链球菌兽疫亚种SXY36菌株诱变
从广东微生物菌种保藏中心购买的马链球菌兽疫亚种(S.equisubsp.zooepidimicus)GIM1.437的HA发酵产率较低，为了提高其HA的发酵产率，采用紫外线、微波和γ射线对其进行连续诱变，从突变株中筛选高产菌株。
(1)紫外诱变
制备出发菌株GIM1.437的菌悬液，经紫外线照射诱变后，菌液经稀释后涂布平板培养基培养，挑取单个菌落转接斜面培养基获得菌株，再将各菌株菌体接入摇瓶培养基，于37℃、200r/min培养24h后，检测HA含量，初筛出HA产率提高大于10％的菌株，再进行传代复筛，得到HA发酵产率显著提高的突变菌株。
所述紫外线诱变方法为：打开超净工作台的紫外灯(20W)，使其预热和消毒30min。取直径9cm无菌培养皿3只，分别加入制备好的GIM1.437菌悬液5mL和1根无菌回形针，放于磁力搅拌器上搅拌。打开培养皿盖，在距离紫外灯30cm处边搅拌边照射，使不同培养皿中菌体分别被照射100s、120s和140s。照射后，菌液用生理盐水稀释105倍后涂布平板培养基，每个照射条件做3个重复，平板用黑布包裹于37℃下培养24h。GIM1.437经过紫外线照射100s、120s和140s后，致死率分别为91.4％、97.1％和100％。
从经紫外线照射100s和120s诱变后长出的菌落中，获得29个菌株，各菌株接种摇瓶培养基，于37℃，200r/min恒温振荡培养24h后，分析发酵液中HA含量，其中编号为SY31、SY131、SY161、SY211和SY271产率提高大于10％，对这5个菌株做传代和复筛，复筛结果见表1。
表1紫外线诱变复筛菌株传代后的HA产率(g/L)
从表1可知，SY211产率较高，较出发菌株GIM1.437提高了16.6％，且遗传稳定，所以选为进一步微波诱变的出发菌株。
(2)微波诱变
制备出发菌株SY211的菌悬液，经微波处理后，菌液经稀释后涂布平板培养基培养，挑取单个菌落转接斜面培养基获得菌株，再将各菌株菌体接入摇瓶培养基，于37℃、200r/min培养24h后，检测HA含量，初筛出HA产率提高大于10％的菌株，再进行传代复筛，得到HA发酵产率显著提高的突变菌株。
所述微波诱变方法为：打开微波炉加热，使其预热和杀菌消毒1min。3支无菌试管中分别加入5mL菌悬液，然后放入一烧杯中，于微波炉中600W依次地处理100s、120s和140s。为防止因为溶液过热引起菌体死亡，每照射20s立刻冰水浴20s。处理后，菌液用生理盐水稀释105倍后涂布平板，每个照射条件做3个重复，放入37℃培养箱培养24h。SY211经过微波处理100s、120s和140s后，致死率分别为90.8％、97.3％和100％。
从经微波处理100s和120s诱变后长出的菌落中，获得22个菌株，各菌株接种摇瓶培养基，于37℃，200r/min恒温振荡培养24h后，分析发酵液中HA含量，其中编号为SWY51，SWY61，SWY111，SWY131产率提高大于10％，对这4个菌株做传代和复筛，复筛结果见表2。
表2微波诱变复筛菌株传代后的HA产率(g/L)
从表2可知，SWY111产率较高，较出发菌株SY211提高了14.2％，且遗传稳定，所以选为进一步γ射线诱变的出发菌株。
(3)γ射线诱变
制备出发菌株SWY111的菌悬液，经γ射线诱变后，菌液经稀释后涂布平板培养基培养，挑取单个菌落转接斜面培养基获得菌株，再将各菌株菌体接入摇瓶培养基，于37℃、200r/min培养24h后，检测HA含量，初筛出HA产率提高大于10％的菌株，再进行传代复筛，得到HA发酵产率显著提高的突变菌株。
γ射线诱变及培养方法为：SWY111的菌悬液用无菌生理盐水依次稀释0倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，将稀释过的菌悬液在室温下震荡30min，混匀，制成待诱变的菌悬液。上述不同稀释倍数的菌悬液5mL于试管中，放入γ射线环境照射(放射源为60Co，辐射率为2.5Gy/min，菌株离放射源中心距离为40cm，总放射量为300Gy)。完毕后菌液稀释1～1×106倍后涂布平板培养基，上述不同稀释倍数的菌悬液做3个重复，放入37℃恒温培养箱24h。SWY111菌悬液稀释10000倍和100000倍，经γ射线照射后，致死率分别为95.1％和96.6％。
从γ射线诱变后的长出的菌落中，获得75个菌株，各菌株接种摇瓶培养基，于37℃，200r/min恒温振荡培养24h后，分析发酵液中HA含量，其中SXY11，SXY24，SXY36，SXY56，SXY64的HA产率提高大于10％，对这5个菌株做传代和复筛，复筛结果见表3。
表3γ射线诱变复筛菌株传代后的HA产率(g/L)
从表3可知，SXY36产率较高，较出发菌株SWY111提高了22.7％，且遗传稳定。
出发菌株GIM1.437经过紫外线、微波和γ射线连续诱变后，筛选获得的SXY36菌株，HA的产率为0.423g/L，较GIM1.437提高64.5％，即为马链球菌兽疫亚种(Streptococcus.equi subsp.zooepidimicus)SXY36菌株，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60146，保藏日期2017年2月27日，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；邮编：510075。
菌株SXY36实验室保藏采用冷冻甘油管保藏法，具体操作为：SXY36菌体接种摇瓶培养基，于37℃、180r/min摇瓶发酵培养24h，培养液与等体积的50％甘油混合，用移液器吸取1mL于1.5mL的无菌离心管中，扣紧盖子，-20℃保存。
所述平板培养基和斜面培养基组成为：葡萄糖2g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/L，K2HPO4 2.5g/L，MgSO4 1.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
所述摇瓶培养基组成除不加琼脂外，其他成分同平板培养基。
所述的菌悬液的制备方法为：培养18h后的发酵液100mL，5000r/min下离心10min后舍弃上清液，加入等体积生理盐水洗涤2次，再重新加入等体积生理盐水，加入无菌的回形针，放在磁力搅拌器上搅拌20min，菌体细胞均匀分散后稀释调整至菌体1×108个/mL，将制备好的菌悬液放在无菌环境中保存备用。
所述的发酵液中HA含量测定方法为：
(1)HA待测样品的处理：5mL发酵液离心后取上清，加10mL无水乙醇，摇匀后静置20min使HA沉淀。离心后，沉淀加入去离子水10mL溶解HA(实际测定时，根据发酵液中的HA含量稀释一定的倍数，以保证分光光度计的读数在标准曲线范围内)，制成HA待测样品。
(2)HA含量测定：取HA待测样品液1mL于试管中，试管置于冰水浴中。取出已经在4℃冰箱中保存2h的四硼酸钠硫酸溶液(浓度为9.54g/L)，边搅拌边缓慢地向每个试管中加入5mL。加完后搅拌均匀，放入沸水中煮15min，在冰水浴中冷却。每个试管加入0.2mL咔唑乙醇溶液(浓度为1.25g/L)，摇匀后放入沸水中煮15min，冷却至室温。以1mL蒸馏水代替待测样品的相同处理为参比，在530nm下测定吸光度(A530)。
根据葡萄糖醛酸(GA)浓度-A530标准曲线，由测定样品的A530计算出相应的GA含量，再根据公式1计算出HA含量。
HA(g/L)＝2.07×n×GA(g/L) (公式1)
公式1中，n-样品稀释倍数；2.07是在理论情况下，HA的重复双糖单位的相对分子质量401.3除以GA相对分子质量194.1所得。
(3)GA标准曲线的制备：按表4制备系列GA标准溶液，然后将其置于冰水浴中。取出已经在4℃冰箱中保存2h的四硼酸钠硫酸溶液(浓度为9.54g/L)，边搅拌边缓慢地向每个试管中加入5mL。加完后搅拌均匀，放入沸水中煮15min，在冰水浴中冷却。每个试管加入0.2mL的咔唑乙醇溶液(浓度为1.25g/L)，摇匀后放入沸水中煮15min，冷却至室温。以0号试管为参比，在530nm下测定各组吸光度。以测得的A530为纵坐标，GA浓度为横坐标，拟合出标准曲线，标准曲线见附图1。
表4葡萄糖醛酸(GA)标准溶液系列浓度
实施例2：优选条件下SXY36菌株摇瓶发酵生产HA的方法
以SXY36菌株为菌种，经过发酵培养基组成及发酵条件优化后，摇瓶发酵生产HA的产率显著提高，具体步骤如下：
(1)将冷冻甘油管保存的SXY36菌株接种于斜面培养基，于37℃培养24h，得到SXY36菌株的活化斜面。所述的斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖2g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/L，K2HPO42.5g/L，MgSO41.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH为7.0。
(2)接种环挑取步骤(1)活化培养后SXY36菌体2环接种至100mL种子培养基中，于37℃、200r/min振荡条件下培养24h，得干菌体浓度为1.34g/L的种子液；所述的种子培养基组成除不加琼脂外，其他成分同斜面培养基，250mL的三角瓶装100mL种子培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度5％的接种量(即4mL)，移种到发酵培养基中，于37℃、250r/min振荡条件下培养18h，得含HA的发酵液。经分析，发酵中的HA含量为0.692g/L，干菌体含量为3.71g/L。所述发酵培养基组成为：葡萄糖13.8g/L，牛肉膏11.2g/L，蛋白胨10.4g/L，酵母浸出粉4g/L，MgSO4 2.5g/L，K2HPO4 4.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。250mL的三角瓶装80mL产酶培养基，8层纱布扎口，高压蒸汽121℃灭菌20min。
实施例3：SXY36菌株在发酵罐中生产透明质酸的方法
以SXY36菌株为菌种，利用10L机械搅拌发酵罐发酵生产透明质酸，具体步骤如下：
(1)将冷冻甘油管保存的SXY36细胞接种于斜面培养基，于37℃培养24h，得到SXY36菌株的活化斜面。所述的斜面培养基组成和制备方法同实施例2；
(2)接种环挑取步骤(1)活化培养后SXY36菌体各2环接种至3瓶100mL种子培养基中，于37℃、200r/min振荡条件下培养24h，得到干菌体浓度为1.37g/L种子液；所述种子培养基组成和制备方法同实施例2；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度2％的接种量，即300mL的种子液移种到6L发酵培养基中。温度设定为37℃，调节通气量0.6～1.0v/v·min，搅拌转速300～500r/min，使得溶氧饱和度在60％～100％，通过流加2moL/L的NaOH水溶液或2moL/L的HCl水溶液，控制pH＝7.0±0.5。发酵运行16h放罐，发酵液中HA含量为4.78g/L，干菌体含量为7.26g/L。
所述发酵培养基组成为同实施例3，加0.05％体积浓度的聚醚消泡剂(PPE)，10L发酵罐装6L发酵培养基，原位高压蒸汽121℃灭菌20min。
实施例4：变温发酵与稳定pH法提高HA分子量
按实施例2和实施例3法发酵制备的HA，平均分子量为0.923MDa，为了扩大发酵法生产的HA应用范围，采用变温发酵与稳定pH法提高HA分子量，达到高分子量HA要求的范围，具体方法如下：
(1)按实施例2方法制备SXY3种子液，以体积浓度5％的接种量，即4mL种子液移种到80mL发酵培养基中，于38℃、250r/min振荡条件下培养12h，此时发酵液的菌体含量为2.45g/L。
(2)将步骤(1)中所得发酵液，在无菌条件下用K2HPO4调节pH为7.0，转入35℃、250r/min振荡条件下继续培养6h，并每隔2h调节一次pH至7.0。
此法摇瓶发酵的HA产率为0.731g/L，HA平均分子量为1.89MDa，是实施例2和实施例3方法发酵制备HA分子量(0.923MDa)的2.05倍。
所述HA分子量的测定方法采用粘度法，操作步骤为：发酵液经过离心去除菌体后加入2倍体积的无水乙醇沉淀，根据测得的HA含量用0.2mol/L的NaCl水溶液配制0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6g/L的HA系列溶液，在25℃下分别检测样品黏度η和溶剂的黏度η0，计算增比粘度ηsp(公式2)，以浓度(mg/100mL)为横坐标，增比粘度与浓度的比值为纵坐标作回归分析，HA样品的回归方程见附图2。回归方程拟合的曲线在纵轴上的截距即为特性粘度[η]，按公式3计算HA样品的平均分子量(MDa)。
公式2中，ηsp-增比粘度；η-检测样品黏度(Pa·s)；η0-溶剂的黏度(Pa·s)。
[η]＝3.6×10-4M0.78 (公式3)
公式3中，[η]-特性粘度；M-HA分子量(MDa)。
实施例5：自酶降解法制备低分子量HA
为了扩大发酵法生产HA的分子量范围，采用自酶降解法制备LMWHA，具体方法如下：
(1)按实施例4方法制备HA发酵液100mL，HA产率为0.731g/L，HA平均分子量为1.89MDa；
(2)8000r/min离心10min去除发酵液中的菌体，上清液中加入1.17g NaCl，使其在溶液中的浓度为0.2mol/L，用2mol/L的或K2HPO4调节pH为6.0，在水浴温度38℃酶解0～72h，酶解时间与HA分子量的关系见表5。实际生产中，可根据需要，控制酶解时间，即可控制生产所需HA的分子量。
表5自酶降解时间与HA分子量之间的关系
实施例6：HA的分离纯化
按实施例3方法制备200mL发酵液(HA含量为4.78g/L，干菌体浓度为7.26g/L)，用25％的三氯乙酸水溶液将发酵液的pH调至4.0，再用2mol/L的NaOH水溶液将pH调至7.0，发酵液8000r/min离心10min，弃去沉淀。在所得上清液中添加500mL的无水乙醇，充分搅拌后静置15h，再次8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀物再用0.1mol/L的NaCl水溶液溶解，并加入氯代十六烷基吡啶(CPC)使其在溶液中的体积浓度为3％，充分搅拌后静置2h，再8000r/min离心15min后，得到络合沉淀物，将所得的络合沉淀物于0.4mol/L的NaCl水溶液中搅拌解离至沉淀溶解，然后再添加250mL的无水乙醇沉淀，收集沉淀物冷冻干燥得HA产品。
最终得到0.995g的HA产品，纯度为91.7％，发酵中HA的提取收率为95.4％。
Claims (9)
1.马链球菌兽疫亚种(Streptococcus.equi subsp.zooepidimicus)SXY36，保藏于广东微生物菌种保藏中心，保藏编号：GDMCC No:60146，保藏日期为2017年2月27日，地址：中国广州市先烈中路100号，邮编：510070。
2.一种权利要求1所述马链球菌兽疫亚种SXY36在发酵生产透明质酸中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用是将马链球菌兽疫亚种SXY36接种入发酵培养基，35～40℃、200～250r/min摇瓶发酵培养18～24h，得含透明质酸的发酵液，发酵液分离纯化，获得透明质酸；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖2～13.8g/L，牛肉膏5～11.2g/L，蛋白胨5～10.4g/L，酵母浸出粉2～4g/L，MgSO4 1.5～2.5g/L，K2HPO4 2.5～4.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述马链球菌兽疫亚种SXY36在发酵培养前，先经斜面活化培养，然后经种子培养，获得种子液再接入发酵培养基进行培养，具体步骤如下：
(1)将马链球菌兽疫亚种SXY36菌株接种于斜面培养基，于35～37℃培养24～36h，得到活化后的斜面菌体；所述的斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖2g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，酵母浸出粉2g/L，K2HPO4 2.5g/L，MgSO4 1.5g/L，琼脂20g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0；
(2)将步骤(1)活化后的斜面菌体接种至种子培养基中，于35～37℃、200～250r/min振荡条件下培养18～24h，得到种子液；所述的种子培养基终浓度组成除不加琼脂外，其他成分同斜面培养基；
(3)将步骤(2)种子液以体积浓度2％～5％的接种量，移种到发酵培养基中，于35～40℃、200～250r/min振荡条件下发酵培养18～24h，得到含透明质酸的发酵液。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养终浓度组成为：葡萄糖13.8g/L，牛肉膏11.2g/L，蛋白胨10.4g/L，酵母浸出粉4g/L，MgSO4 2.5g/L，K2HPO4 4.5g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养在发酵罐中进行，条件为：温度为37±1℃，pH为7.0±0.5，通气量0.6～1.0v/v·min，搅拌转速300～500r/min，溶氧饱和度60％～100％，发酵运行16～24h后，得到含有透明质酸的发酵液。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用为：将马链球菌兽疫亚种SXY36接种入发酵培养基，先在37～38℃的恒温摇床中200～250r/min培养12h，之后转入34～35℃，并将发酵液pH调节稳定于7.0～7.5，200～250r/min下继续培养6h，得到含有高分子量透明质酸的发酵液，发酵液分离纯化，获得高分子量透明质酸；所述高分子量透明质酸的相对分子量为1.07～1.89MDa。
8.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述的应用是将马链球菌兽疫亚种SXY36接种入发酵培养基，35～40℃、200～250r/min摇瓶发酵培养18～24h，发酵液经离心去除菌体后，上清液加入终浓度为0.2mol/L的NaCl，用2mol/L的KH2PO4水溶液调节pH＝6.0，于38℃条件下酶解0～72h，获得含低分子量透明质酸的混合液，分离纯化，获得低分子量透明质酸；所述低分子量透明质酸的相对分子量为0.035～1.00MDa。
9.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述分离纯化方法为：用体积浓度25％的三氯乙酸水溶液将发酵液的pH调至4.0，再用2mol/L的NaOH水溶液将pH调至7.0，发酵液5000～8000r/min离心10～15min，弃去沉淀，在所得上清液中添加原发酵液2～3倍体积的无水乙醇，充分搅拌后静置15～20h，再次5000～8000r/min离心10～15min，弃去上清液，沉淀物再用0.1mol/L的NaCl水溶液溶解，加入氯代十六烷基吡啶使其在溶液中的体积浓度为2～4％，充分搅拌后静置1～2h，再以5000～8000r/min的转速离心10～20min后，得到络合沉淀物，将所得的络合沉淀物于0.2～0.4mol/L的NaCl水溶液中搅拌解离至沉淀溶解，然后再添加发酵液2～3倍体积的无水乙醇沉淀，收集沉淀物冷冻干燥得HA产品。
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