CN108410926B - 一种制备提取高分子量透明质酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于透明质酸制备技术领域，公开了一种制备提取高分子量透明质酸的方法，包括以下步骤：步骤1)菌株活化，步骤2)发酵培养，步骤3)醇沉，步骤4)第一次板框过滤，步骤5)第二次板框过滤，步骤6)第三次板框过滤。本发明方法工艺可得到2300‑2600KDa的透明质酸产品，纯度高，技术简便、高效，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于透明质酸制备技术领域，具体涉及一种制备提取高分子量透明质酸的方法。
背景技术
透明质酸(hyaluronic acid，HA)是普遍存在于脊椎动物和某些细菌荚膜中的一种大分子粘多糖。由于透明质酸具有高度可塑性和粘弹性，良好的生物相容性以及超强的渗透性和保水性，被广泛应用于药物、医学、食品和化妆品等领域。不同分子量的透明质酸具有的生物活性优势不同，低分子透明质酸对皮肤和口服来说，容易吸收，而高分子量透明质酸保水性优于低分子量透明质酸，可用于眼科粘性手术、修复软组织、治疗关节病或作为药物载体等，特别是在减少和预防外科手术后组织粘连中具有很高的应用价值。
目前低分子量透明质酸的制备方法较多，主要有物理、化学和酶等方法，由于高分子量透明质酸较容易降解，提取过程又经常需要酸碱环境，不利于保持透明质酸分子量，所以关于高分子量透明质酸的制备方法目前主要是直接发酵法。
申请人之前的专利技术CN105368912A采用两菌株混合发酵，大大提高了发酵效率，但是该方法对培养条件要求较高，可能导致不能形成优势菌株，而且产生的透明质酸包括小、中、大三种分子量的透明质酸，不能形成纯度较高的单一产品，降低了产品附加值。高分子透明质酸的产生与发酵培养基类型、发酵条件以及菌株细胞通透性等条件的影响。如何制备和提取高分子透明质酸是我们需要解决的技术问题。
发明内容
为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种发酵法生产高分子量透明质酸的方法。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种制备、提取高分子量透明质酸的方法，包括以下步骤：步骤1)菌株活化，步骤2)发酵培养，步骤3)醇沉，步骤4)第一次板框过滤，步骤5)第二次板框过滤，步骤6)第三次板框过滤。
具体地，所述方法包括如下步骤：
步骤1)菌株活化：将兽疫链球菌取出，接种于活化培养基进行活化；
步骤2)发酵培养：将活化好的菌种接种于发酵罐中进行发酵培养,发酵培养6h后，往发酵罐中添加甘油，控制甘油的浓度为200-300mg/L；继续发酵培养8-10h，超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵，得到发酵液；发酵过程中，通过流加浓度为100g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；
步骤3)醇沉：将发酵液过滤去除菌体，得到上清液，向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；
步骤4)第一次板框过滤：往湿物料中加纯水，加热至55℃，溶解后，加入1-1.2‰重量份的中性活性炭和0.8-1％重量份的珍珠岩，并调节pH 6.8，100rpm搅拌3min，再添加8-10‰重量份的NaCl，100rpm搅拌3min，然后51℃保温1h，进行第一次板框过滤，收集湿物料B；
步骤5)第二次板框过滤：往湿物料B加入50℃纯水再次溶解后，再添加1-1.2％重量份的硅藻土，利用氢氧化钠调pH至10，进行第二次板框过滤，收集湿物料C；
步骤6)第三次板框过滤：往湿物料C加入50℃纯水再次溶解，调节pH至7.5，进行第三次板框过滤；将所得湿物料D进行离心烘干，得高分子量透明质酸产品。
优选地，
所述活化培养基的组分为：蔗糖70g/L、蛋白胨2.0g/L以及硫酸镁1.5g/L。
优选地，
所述发酵罐培养基的组分为：蔗糖60g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾1.5g/L，pH 7.0。
优选地，
所述超声处理的参数：超声功率分别为200-300w，超声的作用时间为每次4s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为70-140s。
本发明还要求保护上述方法制备的高分子透明质酸。
本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
本发明在发酵制备透明质酸的方法中，对多种因素进行优化和改进，提高了透明质酸的产量、分子量，纯度也大大提高；
本发明在发酵过程中，通过添加甘油可以显著改善透明质酸的产率，甘油浓度在200mg/L发酵产量最高，随着甘油浓度的增加，透明质酸的产量逐渐下降；随着甘油浓度在增加，透明质酸的分子量增大，300mg/L以后分子量增幅并不明显，为了实现了高产量和高分子量结果的统一，选择甘油浓度为200-300mg/L为最佳。
超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；随着超声强度的增加，透明质酸的产量先升后降，而分子量随着强度的增加会降低，最终选择超声强度在200-300w最为合适；
本发明提取工艺使用中性活性炭在中性环境下提取透明质酸，降低透明质酸分子量的降解和损失，达到提取高分子量透明质酸的目的；采用多级板框过滤，大大提高了纯度；
本发明制备的透明质酸以分子量介于2300-2500KDa的透明质酸钠的形式作为产品。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
一种制备提取高分子量透明质酸的方法，包括以下步骤：
将兽疫链球菌取出，接种于成分为蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.5g/L的活化培养基进行活化；
将活化好的菌种接种于50L的发酵罐中进行发酵，发酵配方为蔗糖60g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾1.5g/L，pH 7.0，温度40℃，溶氧3.2L/min；发酵培养6h后，往发酵罐中添加甘油，控制甘油的浓度为200mg/L；继续发酵培养9h，超声处理，超声处理的参数：超声功率分别为200w，超声的作用时间为每次4s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为140s；然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵总时间为17h；发酵过程中，通过流加浓度为100g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；
利用板框去除菌体，得到上清液，选择上清液的体积为10L，经检测透明质酸含量为3.85g/L，向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；往湿物料中加纯水，加热至55℃，溶解后，加入1‰重量份的中性活性炭及0.8％重量份的珍珠岩，并调节pH 6.8，100rpm搅拌3min，再添加10‰重量份的NaCl，100rpm搅拌3min，然后51℃保温1h，进行第一次板框过滤，收集湿物料B，加入50℃纯水再次溶解后，再添加1％重量份的硅藻土，利用氢氧化钠调pH至10，进行第二次板框过滤，收集湿物料C，加入50℃纯水再次溶解，调节pH至7.5，进行第三次板框过滤；将所得湿物料D进行离心烘干，得高分子量透明质酸产品36.17g。
经检测，获得的透明质酸经粘度计测定粘度。根据公式[η]＝0.36M0.78计算透明质酸分子量，其分子量为2400KDa，收率为93.9％，纯度为99.8％，且外观洁白透亮，达到食品和化妆品级产品的要求。
实施例2
一种制备提取高分子量透明质酸的方法，包括以下步骤：
将兽疫链球菌取出，接种于成分为蔗糖70g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.5g/L的活化培养基进行活化；
将活化好的菌种接种于50L的发酵罐中进行发酵，发酵配方为蔗糖60g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾1.5g/L，pH 7.0，温度40℃，溶氧3.2L/min；发酵培养6h后，往发酵罐中添加甘油，控制甘油的浓度为300mg/L；继续发酵培养8h，超声处理，超声处理的参数：超声功率分别为300w，超声的作用时间为每次4s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为105s；然后继续发酵培养2h，终止发酵；发酵总时间为16h；发酵过程中，通过流加浓度为100g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；
利用板框去除菌体，得到上清液，选择上清液的体积为10L，经检测透明质酸含量为3.81g/L，向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；往湿物料A中加纯水，加热至55℃，溶解后，加入1.2‰重量份的中性活性炭及1％重量份的珍珠岩，并调节pH 6.8，100rpm搅拌3min，再添加8-‰重量份的NaCl，100rpm搅拌3min，然后51℃保温1h，进行第一次板框过滤，收集湿物料B，加入50℃纯水再次溶解后，再添加1％重量份的硅藻土，利用氢氧化钠调pH至10，进行第二次板框过滤，收集湿物料C，加入50℃纯水再次溶解，调节pH至7.5，进行第三次板框过滤；将所得湿物料D进行离心烘干，得高分子量透明质酸产品35.87g。
经检测，获得的透明质酸经粘度计测定粘度。根据公式[η]＝0.36M0.78计算透明质酸分子量，其分子量为2370KDa，收率为94.1％，纯度为99.7％，且外观洁白透亮，达到食品和化妆品级产品的要求。
实施例3
发酵工艺中各因素对透明质酸产量和分子量的影响：
影响因素一：甘油。以实施例1为例，设置多个甘油浓度组别，分别是0mg/L，100mg/L，200mg/L，300mg/L，400mg/L，500mg/L，其余同实施例1。检测发酵液中透明质酸的产量以及产品中透明质酸的分子量，具体见表1：
表1
| 甘油浓度mg/L | 透明质酸产量g/L | 透明质酸分子量(KDa) |
| 0 | 2.73 | 1891 |
| 100 | 3.02 | 2132 |
| 200 | 3.85 | 2400 |
| 300 | 3.77 | 2438 |
| 400 | 3.34 | 2446 |
| 500 | 3.09 | 2459 |
结论：如表1所示，添加甘油可以显著改善透明质酸的结果，甘油浓度达到200mg/L发酵产量最高，随着甘油浓度的增加，透明质酸的产量逐渐下降；随着甘油浓度在增加，透明质酸的分子量增大，300mg/L以后分子量增幅并不明显，
为了实现了高产量和高分子量结果的统一，选择甘油浓度为200-300mg/L为最佳。上述原因可能是甘油能够对细胞膜结构和空隙产生影响，从而会对糖链分泌的正向作用，但是浓度过高可能会抑制菌株产透明质酸的途径。
影响因素二：超声处理。以实施例1为例，设置多个超声强度组别，分别是0，100w，200w，300w，400w，其余同实施例1。检测发酵液中透明质酸的产量以及分子量，具体见表2：
表2
| 超声强度w | 透明质酸产量g/L | 透明质酸分子量(KDa) |
| 0 | 2.84 | 2519 |
| 100 | 3.12 | 2481 |
| 200 | 3.85 | 2400 |
| 300 | 3.91 | 2326 |
| 400 | 3.46 | 2278 |
结论：超声的空化作用可以导致细胞的非热生物效应，使细胞膜短时局部破裂，从而改变细胞质膜的通透性，使胞内物质释放到细胞外；如表2所示，随着超声强度的增加，透明质酸的产量先升后降，可能是超声波能够改变细胞膜结构，对细菌产生不利影响，从而导致透明质酸产量提高，但是随着强度的增大，对菌株产生了部分致死，导致产量下降；而分子量随着强度的增加会降低，最终选择超声强度在200-300w最为合适，能够实现高产量和高分子量结果的统一。
以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种制备提取高分子量透明质酸的方法，包括以下步骤：步骤1)菌株活化，步骤2)发酵培养，步骤3)醇沉，步骤4)第一次板框过滤，步骤5)第二次板框过滤，步骤6)第三次板框过滤；
所述方法包括如下步骤：
步骤1)菌株活化：将兽疫链球菌取出，接种于活化培养基进行活化；
步骤2)发酵培养：将活化好的菌种接种于发酵罐中进行发酵培养,发酵培养6h后，往发酵罐中添加甘油，控制甘油的浓度为200-300mg/L；继续发酵培养8-10h，进行超声处理，然后继续发酵培养2h，终止发酵，得到发酵液；发酵过程中，通过流加浓度为100g/L的蔗糖溶液将残糖浓度控制在不低于30g/L；
步骤3)醇沉：将发酵液过滤去除菌体，得到上清液，向上清液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀90min，收集沉淀得到湿物料A；
步骤4)第一次板框过滤：往湿物料A中加入纯水，加热至55℃，溶解后，加入占湿物料A1-1.2‰重量份的中性活性炭和0.8-1％重量份的珍珠岩，并调节pH 6.8，100rpm搅拌3min，再添加占湿物料A 8-10‰重量份的NaCl，100rpm搅拌3min，然后51℃保温1h，进行第一次板框过滤，收集湿物料B；
步骤5)第二次板框过滤：往湿物料B加入50℃纯水再次溶解后，再添加占湿物料B1-1.2％重量份的硅藻土，利用氢氧化钠调pH至10，进行第二次板框过滤，收集湿物料C；
步骤6)第三次板框过滤：往湿物料C加入50℃纯水再次溶解，调节pH至7.5，进行第三次板框过滤；将所得湿物料D进行离心烘干，得高分子量透明质酸产品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述活化培养基的组分为：蔗糖70g/L、蛋白胨2.0g/L以及硫酸镁1.5g/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵罐中培养基的组分为：蔗糖60g/L，玉米浆5g/L，蛋白胨2.0g/L，硫酸镁1.5g/L，硫酸钾1.5g/L，pH 7.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超声处理的参数：超声功率为200-300w，超声的作用时间为每次4s，间隔时间为3s，超声处理的总时间为70-140s。
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