CN105861596B

CN105861596B - 透明质酸的制备方法

Info

Publication number: CN105861596B
Application number: CN201510035560.5A
Authority: CN
Inventors: 晏礼明; 陶勇; 张丛丛; 陈笑; 温雅; 陈彩霞
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2020-02-04
Anticipated expiration: 2035-01-23
Also published as: CN105861596A

Abstract

本发明涉及一种透明质酸的制备方法，其解决了现有方法产率不高的技术问题，其包括以下步骤：种子培养；菌体发酵；蛋白酶诱导表达；生物转化。本发明还提供了其专用培养基。本发明可广泛用于透明质酸的制备领域。

Description

透明质酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种高分子多糖的制备方法，具体说是一种透明质酸的制备方法。

背景技术

透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是由(1-β-4)D-葡糖醛酸(1-β-3)N-乙酰基-D-氨基葡萄糖双糖单位重复连接组成的高分子直链多糖。具有高保湿性、粘弹性和生物相容性等优良性质，已被广泛应用到医药、日化、食品等领域，是国内外生物化工界热点产品之一。

目前，生产HA的方法主要有：动物组织提取法及兽疫链球菌发酵法。动物组织提取法原料来源有限且生产成本高，已逐渐被微生物发酵法取代。然而，近年来，原料价格上涨导致微生物发酵法生产HA成本的提高，HA的大规模生产面临着巨大挑战，进而限制了HA在医药等领域的广泛应用。微生物发酵法的出发菌株为兽疫链球菌，是一种致病菌，潜在威胁相关从业人员的安全。而且，由于兽疫链球菌自身的生理代谢特性，使得HA产量的提高受到多方面因素的制约，如：高发酵粘度、低传质传氧、菌体生长与HA生物合成竞争碳源与能量等。因此，如何用更高效、经济、安全的生产方法制备HA成为HA产业能否持续发展的关键。

随着分子生物学及基因工程技术的成熟，HA的高效安全性生产有了长足的发展。有文献报道：通过代谢工程手段，可以实现在安全的宿主生物中重建或改造生物合成途径来生产HA的目标。因此，大量的研究者开始研究基因工程菌制备HA的方法。

目前，应用较广泛的是全细胞催化技术。全细胞催化法的基本原理是利用完整的生物有机体作为催化剂进行化学转化，将某种前体分子转化成特定产物，其实质是利用生物体系中酶的催化作用。主要技术路线为培养菌体并诱导菌体表达作为生物催化剂，然后加入底物并利用生物体系中酶及能量、代谢系统进行生物转化反应。

Widner,B.等在枯草芽孢杆菌中成功表达链锁状球菌的HA合成基因，工程菌在摇瓶中发酵获得0.5～0.6g/L HA。2008年美国麻省理工学院的Stephanopoulos G.研究组在大肠杆菌中优化表达链锁状球菌的HA合成基因，获得约0.2g/L的HA。2011年，专利号为CN102154405 A的发明公开了一种大肠杆菌生产HA的方法，该方法在大肠杆菌中共表达透明质酸合成酶基因hasA和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因hasB，发酵得到2.5g/L HA。是迄今报道的大肠杆菌工程菌合成HA的最高水平。但是该方法与发酵法仍有很大差距而难以获得产业化运用。因为其HA产量及产率低、培养基成分复杂、成本高、发酵过程繁琐、生产周期长、生产条件严苛，严重制约了规模化生产。

综上所述，虽然目前HA制备仍多采用传统发酵法，并已逐渐向全细胞催化技术发展。但仍存在一定的缺陷：(1)发酵过程要求严格的无菌条件，维持纯种培养，避免杂菌的入侵，生产过程复杂；(2)生产过程受罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、pH、溶氧、培养基等条件及参数的限制；(3)发酵过程中参数监测要及时，并需规范化控制生产过程，要求严格，操作复杂；(4)出发菌株为致病性的兽疫链球菌，对相关从业人员构成潜在的威胁；(5)兽疫链球菌发酵制备HA存在一定的弊端，代谢复杂，副产物多，后续的分离纯化工艺复杂；(6)目前采用全细胞催化技术制备HA多面临着工艺过程复杂、产率低、难以满足工业化生产需求等问题。

发明内容

本发明就是为了克服现有技术制备透明质酸工艺过程复杂、产率低、难以满足工业化生产的技术问题，提供一种以大肠杆菌工程菌高效制备透明质酸的方法。

为此，本发明采用如下技术方案：

全细胞催化法制备透明质酸的方法，包括以下步骤：

(1)种子培养：将工程菌E.coli pBPAB/BW25113接种到LB培养基，培养温度35-40℃，培养时间2-6h，转速200-300r/min，当菌体生长至对数生长期时进行转接。

(2)菌体发酵：将种子液转接到发酵培养基中，培养温度30-37℃，转速200-300r/min，菌体密度(OD_600nm)至0.6-1.5OD时，进行蛋白酶诱导。

(3)蛋白酶诱导表达：添加0.1-2g/L诱导物L-阿拉伯糖，同时降低诱导温度至27-35℃，转速200-300r/min，培养16-20h，得到转化菌体，并离心收集菌体。

(4)生物转化：用转化培养基重悬菌体至10-40OD，转化温度30-37℃，转速200-300r/min，用氨水每隔2-5h调节pH值至7.0-9.0，转化16-24h，得含有透明质酸的转化液。

优选地，发酵培养基的组成成分为：酪蛋白1-10g/L；酵母粉1-5g/L；甘油1-8g/L；NaCl 5-10g/L；无机氮源30-70mM。

优选地，无机氮源包括：硫酸铵，氯化铵，硝酸铵，尿素，硝酸钾，硝酸钠。

优选地，转化培养基的组成成分为葡萄糖30-60g/L；N-乙酰葡萄糖胺20-45g/L；硫酸铵3-5g/L；正十二烷2-7％；硫酸镁1-4mM；氯化锰1-2mM；磷酸氢二钾15-20g/L；磷酸二氢钾1-5g/L。

现有的微生物发酵法生产HA基本采用单一分批发酵模式，而本发明颠覆了这种常规的发酵培养模式。通过采用分段的全细胞催化技术，将整个过程分两个阶段分别进行菌体生长及产物合成，有效地使HA产量提高至8.0g/L-10.0g/L。比传统发酵法的6.0g/L-8.0g/L提高了20％-30％，比目前全细胞催化法的3.0g/L，提高了1.5-2.5倍，具有显著的进步意义。

本发明的优点是：

(1)本发明采用全细胞催化技术，生产过程中的反应是通过生命体自动调节方式进行，可充分利用微生物代谢产生的ATP，避免了添加昂贵的ATP，从而使反应过程更高效率、低成本、绿色环保。

(2)本发明采用全细胞催化技术，转化阶段不要求无菌操作，转化底物不要求进行高温灭菌，避免了杂菌污染对生产过程的干扰以及高温对转化培养基成分的破坏。

(3)本发明采用全细胞催化技术，转化阶段工艺要求简单，生产过程无需控制罐温、空气流量、罐压、液位、补料、加糖等，操作条件更温和易控且有效节省了生产成本。

(4)本发明以大肠杆菌为出发菌株，生产过程中不会产生毒素和透明质酸酶，保证了HA产品的安全性及高分子量。

(5)本发明培养基组分简单明了，减少了菌体的副反应，便于后续分离纯化工艺。

(6)本发明最大程度的简化了培养基组分，减少了各种营养成分的用量，极大地降低了生产成本。

(7)本发明采用甘油作为发酵阶段的唯一碳源，并辅配一定浓度的无机氮源，显著提高了透明质酸产品产率，可达8.0-10.0g/L。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下面实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。本说明书中公开的任一特征，除非特别叙述，均可被其他等效或具有类似目的的替代特征加以替换。

本发明中所用的工程菌E.coli pBPAB/BW25113制备方法如下：

本发明用一种表达透明质酸合成酶基因(hyaluronic acid synthase,hasA)和尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶基因(UDP-glucose Dehydrogenase,hasB)的高效产透明质酸工程大肠杆菌pBPAB/BW25113来生产透明质酸。

含有透明质酸合成酶基因和UDP-萄糖脱氢酶基因的高效产透明质酸工程大肠杆菌是通过以下方法构建获得的：

一、含多杀巴氏杆菌的透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的共表达载体pBPAB的构建

以多杀巴氏杆菌CVCC 408的基因组DNA为模版，PCR扩增PmhasA和PmhasB基因，各自的PCR反应条件如下：

PmhasA：95℃预变性2min，然后每个循环95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环，最后延伸5min；

PmhasB：95℃预变性2min，然后每个循环95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共35个循环，最后延伸5min。

用NcoⅠ和BamHⅠ对透明质酸合成酶基因PmhasA的扩增产物进行双酶切，用BamHⅠ和SacⅠ对UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的扩增产物进行双酶切，用NcoⅠ和SacⅠ对载体pBAD-HisB进行双酶切。使用PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段。采用T4连接酶将上述3个片段连接，16℃过夜。转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于氨苄平板(100μg/mL)。挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定(上游引物为PmhasA-F和下游引物为PmhasB-R)，挑选阳性克隆(PCR片段在4000-5000bp)提质粒，送上海生工进行测序鉴定。重组载体记作pBPAB。

二、重组菌的构建

pBPAB/BW25113菌液的获得：从大肠杆菌BW25113平板上挑选单克隆接种到5ml的LB培养基中，在37℃，200rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.3-0.4之间，冰上放置10min，然后4000rpm离心10min，弃上清，菌体用预冷的氯化钙溶液(0.1mol/L CaCl₂)洗涤，4000rpm离心10min，菌体悬浮于200μl的氯化钙溶液中。将测序鉴定正确的质粒pBPAB加入到上述感受态细胞中，冰浴30min，于42℃热休克90s，加入500μl的LB培养基，在37℃，200rpm条件下培养1h，取50μl涂布在氨苄平板上，37℃培养过夜。挑选单克隆，接种到5ml的LB培养基中，培养过夜，所得为pBPAB/BW25113的菌液。

菌种保藏：500μl的上述菌液与50％的无菌甘油等体积混匀，保存在-70℃冰箱。

本发明通过共表达透明质酸合成酶基因和含有UDP-葡萄糖脱氢酶基因的重组E.coli pBPAB/BW25113，并利用简单糖类及简化工艺合成透明质酸。大肠杆菌BW25113购自于普如汀生物技术有限公司。

实施例1

一种全细胞催化法制备透明质酸的工艺过程如下：

(1)种子培养：将工程菌E.coli pBPAB/BW25113甘油管菌种按1％接种量接种到装有灭菌LB培养基100mL的500mL摇瓶中添加100mg/L的Amp，然后35℃培养3h，转速200r/min，观察菌体生长情况，当菌体生长至对数生长期时进行转接。

(2)菌体发酵：按1％接种量将摇瓶种子液接种到装有灭菌发酵培养基100mL的500mL摇瓶中(酪蛋白10.0g/L、酵母粉5.0g/L、甘油1.0g/L、NaCl 10.0g/L、尿素30mM)，然后37℃、转速200r/min培养3h至菌体OD为0.6。

(3)蛋白酶诱导表达：添加2.0g/L诱导物L-阿拉伯糖，降低温度至35℃，转速250r/min，培养16h，6000r离心15min收集菌体。

(4)生物转化：按如下配方配制转化培养基：葡萄糖30g/L；N-乙酰葡萄糖胺20g/L；硫酸铵5g/L；正十二烷2％；硫酸镁1mM；氯化锰2mM；磷酸氢二钾15g/L；磷酸二氢钾5g/L。然后用转化培养基重悬菌体，制备成10OD的菌悬液，30℃、转速300r/min进行转化。过程中用氨水每隔5h调节pH值至9.0，转化24h。

经测定，本实施例所制备的透明质酸转化液中，HA产量为8.3g/L。

实施例2：

(1)种子培养：将工程菌E.coli pBPAB/BW25113甘油管菌种按1％接种量接种到装有灭菌LB培养基100mL的500mL摇瓶中添加100mg/L的Amp，然后37℃培养4h，转速300r/min，观察菌体生长情况，当菌体生长至对数生长期时进行转接。

(2)菌体发酵：按1％接种量将摇瓶种子液接种到装有灭菌发酵培养基100mL的500mL摇瓶中(酪蛋白5.0g/L、酵母粉3.0g/L、甘油5.0g/L、NaCl 7.0g/L、硝酸铵50mM)，然后35℃、转速250r/min培养4h至菌体OD为1.2。

(3)蛋白酶诱导表达：添加1.0g/L诱导物L-阿拉伯糖，降低温度至33℃，转速200r/min，培养18h，6000r离心15min收集菌体。

(4)生物转化：按如下配方配制转化培养基：葡萄糖45g/L；N-乙酰葡萄糖胺30g/L；硫酸铵5g/L；正十二烷5％；硫酸镁4mM；氯化锰1mM；磷酸氢二钾18g/L；磷酸二氢钾3g/L。然后用转化培养基重悬菌体，制备成30OD的菌悬液，33℃、转速200r/min进行转化。过程中用氨水每隔2h调节pH值至8.0，转化16h。

经测定，本实施例所制备的透明质酸转化液中，HA产量为8.8g/L。

实施例3：

(1)种子培养：将工程菌E.coli pBPAB/BW25113甘油管菌种按1％接种量接种到装有灭菌LB培养基100mL的500mL摇瓶中添加100mg/L的Amp，然后40℃培养2h，转速250r/min，观察菌体生长情况，当菌体生长至对数生长期时进行转接。

(2)菌体发酵：按1％接种量将摇瓶种子液接种到装有灭菌发酵培养基100mL的500mL摇瓶中(酪蛋白1.0g/L、酵母粉1.0g/L、甘油8.0g/L、NaCl 5.0g/L、硫酸铵70mM)，然后30℃、转速200r/min培养5h至菌体OD为1.5。

(3)蛋白酶诱导表达：添加0.1g/L诱导物L-阿拉伯糖，降低温度至27℃，转速300r/min，培养20h，6000r离心15min收集菌体。

(4)生物转化：按如下配方配制转化培养基：葡萄糖60g/L；N-乙酰葡萄糖胺45g/L；硫酸铵3.0g/L；正十二烷4％；硫酸镁3mM；氯化锰2mM；磷酸氢二钾20g/L；磷酸二氢钾1.0g/L。然后用转化培养基重悬菌体，制备成10OD的菌悬液，33℃、转速300r/min进行转化。过程中用氨水每隔5h调节pH值至7.0，转化16h。

经测定，本实施例所制备的透明质酸转化液中，HA产量为9.8g/L。

从以上实施例中可见，本发明进行HA生产，产量高达8-10g/L，大大提高了大肠杆菌工程的HA合成能力，为规模化生产奠定了基础。

Claims

1.一种透明质酸的制备方法，其特征是包括以下步骤：（1）种子培养：将工程菌E.colipBPAB/BW25113接种到LB培养基，培养温度35-40℃，培养时间3-6 h，转速200-300 r/min，当菌体生长至对数生长期时进行转接；（2）菌体发酵：将种子液转接到发酵培养基中，培养温度30-37℃，转速200-300 r/min，菌体密度至0.6-1.5 OD时，进行蛋白酶诱导；（3）蛋白酶诱导表达：添加0.1-2 g/L诱导物L-阿拉伯糖，同时降低诱导温度至27-35℃，转速200-300r/min，培养16-20 h，得到转化菌体，并离心收集菌体；（4）生物转化：用转化培养基重悬菌体至10-40 OD，转化温度30-37℃，转速200-300 r/min，用氨水每隔2-5 h调节pH值至7.0-9.0，转化16-24 h，得含有透明质酸的转化液；所述发酵培养基的组成成分为：酪蛋白1-10g/L；酵母粉1-5 g/L；甘油1-8 g/L；NaCl 5-10 g/L；无机氮源30-70 mM；所述转化培养基的组成成分为：葡萄糖30-60 g/L；N-乙酰葡萄糖胺20-45 g/L；硫酸铵3-5 g/L；正十二烷2-7%；硫酸镁1-4 mM；氯化锰1-2 mM；磷酸氢二钾15-20 g/L；磷酸二氢钾1-5g/L；所述工程菌E.coli pBPAB/BW25113的构建方法包括如下步骤：（一）含多杀巴氏杆菌的透明质酸合成酶基因PmhasA和UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的共表达载体pBPAB的构建以多杀巴氏杆菌CVCC 408的基因组DNA为模版，PCR扩增PmhasA和PmhasB基因，用NcoⅠ和BamHⅠ对透明质酸合成酶基因PmhasA的扩增产物进行双酶切，用BamHⅠ和SacⅠ对UDP-葡萄糖脱氢酶基因PmhasB的扩增产物进行双酶切，用NcoⅠ和SacⅠ对载体pBAD-HisB进行双酶切；使用PCR产物纯化试剂盒回收DNA片段；采用T4连接酶将上述3个片段连接；转化到大肠杆菌DH5α中，挑选阳性克隆提质粒，重组载体记作pBPAB；（二）重组菌的构建pBPAB/BW25113菌液的获得：从大肠杆菌BW25113平板上挑选单克隆接种到LB培养基中，培养，将测序鉴定正确的质粒pBPAB加入到上述感受态细胞中，培养，挑选单克隆，培养，所得为pBPAB/BW25113的菌液。