CN107354119A - 一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于基因工程和生物化工领域的一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。该高产透明质酸的基因工程菌是将谷氨酸棒杆菌中的乳酸脱氢酶基因失活，并转入透明质酸合成酶基因构建而成。本发明中的谷氨酸棒杆菌宿主对人和动物均无致病性，为食品级安全微生物；高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌的透明质酸产量高，高达22g/L以上，为现有工业生产水平的3倍，新菌株具有良好的产业化应用前景。

Description

一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物化工及微生物发酵领域，具体涉及一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
透明质酸(Hyaluronic acid,HA)是一类广泛存在于人和动物体内的酸性粘多糖，其分子结构是由D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid,GlcA)和N-乙酰-氨基葡萄糖胺(N-acetyl-D-glucosamine,GlcNAc)交替线性共聚而成，分子量可达105～107Da。在人体内，透明质酸主要起着润滑、促进伤口愈合、调节结缔组织通透性等作用。临床上，透明质酸广泛用于眼科手术和关节炎手术，以及药物递送。由于透明质酸可以吸收自身重量1000倍的水分，故在化妆品中常被用作保湿因子。小分子透明质酸则可以作为口服保健品，来增强细胞新陈代谢，预防衰老。
20世纪80年代之前，透明质酸的来源主要是生物组织提取法，原料为雄公鸡的鸡冠，产量很低；同时产品中会残留有动物源蛋白，对一些蛋白过敏人群而言有一定的安全隐患。
随着微生物技术的发展，我国生产透明质酸的方法主要是微生物发酵法。常用的生产菌株为兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等动物致病菌(中国发明专利ZL94104439.4，制备透明质酸的微生物、培养基和方法)，透明质酸的产量一般为4～7g/L。国外同样也利用链球菌进行透明质酸的发酵生产(Kim J H,Yoo S J,Kweon Y G,Selection of a Streptococcus equi mutant and optimization of cultureconditions for the production of high molecular weight hyaluronic acid,EnzymeMicrobiol.Technol,1996,19:440-445)。链球菌发酵生产的营养要求较高，培养基中的血清、脑心浸取液等原料价格昂贵，工业生产的成本高；另一方面，由于链球菌株具有一定的致病风险，透明质酸生产的安全性需求限制了它的发展。开发研究新的更加安全且经济可行的基因重组菌发酵工艺逐渐被重视。
透明质酸的重组合成需要引入透明质酸合成酶。中国发明专利ZL 98812773.3于2001年公开了“透明质酸合成酶基因及其应用”。丹麦Novozyme公司考察了来自不同链球菌种属的透明质酸合成酶基因，并开发了基于重组枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的透明质酸生产工艺，其最优产量可以达到链球菌的生产水平(Widner B,Behr R,Von DollenS,Hyaluronic acid production in Bacillus subtilis,Appl Environ Microbiol,2005,71(7):3747-52)，并申请了中国专利“低分子量透明质酸的产生”(CN101384724A)。Yu等人则着眼于在革兰氏阴性菌重组大肠杆菌(Escherichia coli)中发酵生产透明质酸的可行性，结果表明操纵子选择、稀有密码子效应、细菌生长抑制等因素均会影响透明质酸的产量和分子量(Yu H,Stephanopoulos G,Metabolic engineering of Escherichia colifor biosynthesis of hyaluronic acid,Metab Eng.,2008,10(1):24-32)。Kaur等人于在2016年通过基因工程和代谢工程手段成功构建了基因重组乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，透明质酸积累量达3.03g/L(Kaur,M.,Jayaraman,G.,Hyaluronanproduction and molecular weight is enhanced in pathway-engineered strains oflactate dehydrogenase-deficient Lactococcuslactis.Metab.Eng.Commun.2016,3:15-23.)。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)是一类好氧细菌，细胞呈短杆或小棒状，为革兰氏阳性。2003年，谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组测序工作完成(http://gib.genes.nig.ac.jp/)。谷氨酸棒杆菌作为美国食品药物管理局认定的GRAS(一般认为安全)菌株，长期被应用于氨基酸或食品添加剂的生产。其本身不分泌任何内毒素和外毒素的特点保证了其分泌产品符合食品安全和医药产品安全标准。于慧敏等人于2014年成功构建了可以生产透明质酸的基因工程谷氨酸棒杆菌，其产量达6.0g/L以上(CN103937734A)。陈振等人则在重组谷氨酸棒杆菌中，通过阻断磷酸戊糖途径，使中等分子量的透明质酸产量达到9.6g/L(CN106190939A)。
发明内容
本发明为了强化透明质酸的合成，以及获得高产的新菌株，提出一种高产透明质酸的基因工程菌及其构建方法与应用。具体技术方案如下：
一种高产透明质酸的基因工程菌，其是将谷氨酸棒杆菌中的乳酸脱氢酶基因失活，并转入透明质酸合成酶基因构建而成。
进一步地，上述的基因工程菌还转入了UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上。
进一步地，上述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
一种高产透明质酸的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建乳酸脱氢酶基因的同源重组交换质粒；
(2)将同源重组交换质粒转入谷氨酸棒杆菌，得到乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌；
(3)将透明质酸合成酶基因转入上述乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌，得到基因工程菌。
进一步地，上述构建方法还包括：将UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上转入步骤(3)所述基因工程菌。
进一步地，上述构建方法还包括：优选将UDP-葡萄糖脱氢酶基因转入步骤(3)所述基因工程菌。
进一步地，所述构建同源重组交换质粒的方法包括：
(1)以谷氨酸棒杆菌的DNA基因组为模板，利用引物dLDH-F和dLDH-R进行PCR，得到乳酸脱氢酶基因中间片段；
(2)以质粒pK18mobmobsacB为模板，利用引物pK18-F和pK18-R进行PCR，获得含有大肠杆菌复制起始位点ori序列和卡那霉素抗性基因序列的片段；
(3)连接步骤(1)和步骤(2)中的片段，获得重组质粒pK18dLDH；
其中，所述引物序列如下：
dLDH-F：5’-TTTAGGCCCGGCAGATCACCTTGCGATCATC-3’
dLDH-R：5’-TCTGACGCTCTTCTAGTTCGACAACGCGGC-3’
pK18-F：5’-CGAACTAGAAGAGCGTCAGACCCCGTAGAA-3’
pK18-R：5’-GGTGATCTGCCGGGCCTAAAGAACTAAAAAATCTA-3’。
将上述重组质粒pK18dLDH转入到谷氨酸棒杆菌中，筛选阳性克隆，得到乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌。
进一步地，所述构建同源重组交换质粒的方法包括：
(1)以谷氨酸棒杆菌的DNA基因组为模板，利用引物dLDH-1和dLDH-2进行PCR，获得乳酸脱氢酶基因上游片段；
(2)以谷氨酸棒杆菌的DNA基因组为模板，利用引物dLDH-3和dLDH-4进行PCR，获得乳酸脱氢酶基因下游片段；
(3)利用EcorI/XbaI对质粒pK18mobmobsacB进行双酶切，并对酶切后pK18mobmobsacB进行纯化；
(4)将步骤(1)上游片段和步骤(2)下游片段连接到步骤(3)酶切后的pK18mobmobsacB上，获得重组质粒pK18mobmobsacB-dldh；
其中，所述引物序列如下：
dLDH-1：5’-CTATGACCATGATTACGAATTCAGGTGCCGACACTAATG-3’
dLDH-2：5’-ACCGACGGTTTCTTTCATTTTCGATCCCACTTCCTGATTT-3’
dLDH-3：5’-ATCGAAAATGAAAGAAACCGTCGGTAACTTTTTGGTTTA-3’
dLDH-4：5’-TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCTTCCAGACGGTTTCAT-3’。
将上述重组质粒pK18mobmobsacB-dldh转入到谷氨酸棒杆菌中，筛选阳性克隆，得到乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌。
上述高产透明质酸的基因工程菌在制备透明质酸中的应用。
一种利用基因工程菌生产透明质酸的方法，包括如下步骤：
(1)将上述基因工程菌接入LB液体培养基中进行培养，得到基因工程菌菌液；
(2)按照1-20％的体积百分比将上述得到的基因工程菌菌液接入发酵培养基中，培养1-5h后加入诱导剂，继续培养，期间维持糖浓度5-10g/L，得到含有透明质酸的发酵液。
上述发酵培养基的组成为：糖类20-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源2-40g/L，KH2PO4 0.1-5g/L，K2HPO4·12H2O 0.5-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-8g/L，MnSO4·H2O 0.002-0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.002-0.1g/Lg/L，pH 6.0-8.0。
步骤(1)中培养条件为：温度25-40℃，转速100-300rpm/min，时间10-30h；步骤(2)中培养条件为：温度25-40℃，转速100-300rpm/min，pH为6.0-8.0，继续培养时间24-72h。
步骤(2)中所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷或乳糖，加入量为0.05-5.0g/L。
上述发酵培养基中的糖类为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉或淀粉水解液；无机氮源为硫酸铵、氯化铵、硝酸铵、硝酸钠或硝酸钾；有机氮源为蛋白胨、酵母膏、酵母粉、牛肉膏、玉米浆、玉米浆粉或大豆粉。
本发明的有益效果为：本发明采用分子生物学方法和技术，通过代谢工程基因敲除策略，敲除乳酸旁路基因来改造其代谢网络，并引入透明质酸合成相关基因，构建得到高产透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌；本发明的谷氨酸棒杆菌宿主对人和动物均无致病性，为食品级安全微生物；新菌株的透明质酸产量高，高达22g/L以上，为现有工业生产水平的3倍；新菌株具有良好的产业化应用前景。
附图说明
图1为单交换同源重组构建重组菌株Cg-△ldh(1)的PCR验证。其中，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为重组菌株Cg-△ldh(1)使用基因组上的引物LDH-F和质粒pK18dLDH上的引物ori-R进行PCR扩增的结果，约1.1kb。
图2为双交换同源重组构建重组菌株Cg-△ldh(2)的PCR验证。其中，泳道1为DNA分子量标准；泳道2为重组菌株Cg-△ldh(2)使用引物dLDH-1和dLDH-4进行PCR扩增的结果，约1.4kb。
图3为Cg/AB、Cg-△ldh(1)/AB和Cg-△ldh(2)/AB三株菌在5L发酵罐中培养时的透明质酸产量比较。
具体实施方式
以下实施例便于更好地理解本发明，但不限于本发明。下述实验方法如无特殊说明均为常规方法，下述试剂如无特殊说明均可通过商业途径获得。
谷氨酸棒杆菌在发酵过程中会产生乳酸小分子有机酸代谢副产物，不利于目标产物合成。乳酸副产物途径阻断可以使发酵原料和能量更多地流向目标产物透明质酸。本专利的核心在于阻断谷氨酸棒杆菌中乳酸副产物的合成，尤其是乳酸合成。
实施例1：通过单交换同源重组构建ldh敲除重组菌株Cg-△ldh(1)
重组菌株Cg-△ldh(1)的构建，包括如下步骤：
1、谷氨酸棒杆菌自杀质粒pK18dLDH的构建
以谷氨酸棒杆菌ATCC13032的DNA基因组为模板，以dLDH-F和dLDH-R为引物进行PCR，获得乳酸脱氢酶基因ldh中间约700bp的片段，并对产物进行纯化，作为同源臂；
以质粒pK18mobsacB(参见CN105420154A)为模板，以pK18-F和pK18-R为引物进行PCR，扩增得到含有大肠杆菌复制起始位点序列ori序列和卡那霉素抗性基因Kan序列的片段，并对产物进行纯化；
将上述两个片段利用Gibson Assembly试剂盒(试剂盒于NEB购买，基因片段和质粒片段共5μL，连接缓冲液5μL，50℃孵育10min)连接成环状质粒，转化E.coli宿主菌TOP10感受态细胞(购买于TianGen，加入10μL连接液后冰浴30min，42℃热激90s后冰浴120s，加入0.9mLSOC培养基，并在200rpm，37℃下复苏45min)，涂布含20mg/L卡那霉素的LB培养基固体平板，挑选抗性克隆，进行PCR验证，得重组质粒pK18dLDH。
SOC复苏培养基配制：蛋白胨20g/L，酵母粉5g/L，NaCl 0.5g/L，KCl 2.5mM，MgCl210mM，葡萄糖20mM。
LB培养基配制：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，固体平板含琼脂1.5％。
引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解并稀释至10μM使用。PCR扩增所用Phanta聚合酶Mix购自Vazyme公司。
引物序列如下：
dLDH-F：5’-TTTAGGCCCGGCAGATCACCTTGCGATCATC-3’
dLDH-R：5’-TCTGACGCTCTTCTAGTTCGACAACGCGGC-3’
pK18-F：5’-CGAACTAGAAGAGCGTCAGACCCCGTAGAA-3’
pK18-R：5’-GGTGATCTGCCGGGCCTAAAGAACTAAAAAATCTA-3’。
PCR扩增反应体系为：
PCR条件为：
2、将重组质粒pK18dLDH以电穿孔法转化入谷氨酸棒杆菌ATCC13032的感受态细胞，由于pK18dLDH没有谷氨酸棒杆菌所使用的复制起始位点，故只能通过同源重组的方式整合至基因组中，涂布含20mg/L卡那霉素的LB培养基固体平板，挑取阳性克隆，进行PCR验证，得到重组菌株Cg-△ldh(1)。
上述电穿孔法的具体操作为：向一个1.5mL离心管中加入20μL重组质粒以及100μL谷氨酸棒杆菌ATCC13032感受态细胞，混匀后加入0.1cm电转杯，冰浴30min；调节电穿孔仪电压为1.8kV，将电转杯装入电穿孔仪，按下电击键；电击结束后，向电转杯中加入1mL SOC复苏培养基，重悬细胞，转入1.5mL离心管，37℃、200rpm震荡培养2h；取300μL菌液涂布于LB固体培养基(20μg/mL卡那霉素)，置于30℃培养箱中倒置培养16小时，挑取单菌落，使用基因组上的引物LDH-F(5’-ATGAAAGAAACCGTCGGTAACAA-3’)和质粒上的引物ori-R(5’-ACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCT-3’)进行PCR验证。正确的菌株可以扩增得到大小约为1.1kb的条带，如图1所示，即成功获得重组谷氨酸棒杆菌Cg-△ldh(1)。
摇瓶发酵培养Cg-△ldh(1)菌株36小时，检测乳酸脱氢酶活性和乳酸的生成量。结果表明：Cg-△ldh(1)的乳酸脱氢酶酶活下降至原始菌株的5％以下，乳酸含量在检出限以下。
实施例2：通过双交换同源重组构建ldh敲除重组菌株Cg-△ldh(2)
重组菌株Cg-△ldh(2)的构建，包括如下步骤：
1、重组质粒pK18mobmobsacB-dldh的构建
挑取野生谷氨酸棒杆菌为模板，以dLDH-1/dLDH-2和dLDH-3/dLDH-4为引物分别扩增其基因组中ldh基因的上下游约700bp的序列，并对产物进行纯化；
利用EcorI/XbaI对质粒pK18mobmobsacB进行双酶切，并对产物进行纯化。将酶切后的质粒，上游片段和下游片段进行Gibson Assembly连接反应，获得重组质粒pK18mobmobsacB-dldh。
引物由铂尚生物技术(上海)有限公司合成，用无菌水溶解并稀释至10μM使用。PCR扩增所用Phanta聚合酶Mix购自Vazyme公司。
引物序列如下：
dLDH-1：5’-CTATGACCATGATTACGAATTCAGGTGCCGACACTAATG-3’
dLDH-2：5’-ACCGACGGTTTCTTTCATTTTCGATCCCACTTCCTGATTT-3’
dLDH-3：5’-ATCGAAAATGAAAGAAACCGTCGGTAACTTTTTGGTTTA-3’
dLDH-4：5’-TGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGCTTCCAGACGGTTTCAT-3’
PCR扩增反应体系为：
PCR条件为：
2、将重组质粒以实施例1的电转方式转入谷氨酸棒杆菌ATCC13032中，利用卡那霉素进行第一次筛选，将得到的阳性重组子于LB液体培养基中培养16h，然后涂布于含有100g/L蔗糖的LB平板上进行二次筛选，挑取阳性克隆并利用dLDH-1和dLDH-4两条引物进行PCR验证，ldh敲除菌株可以扩增出一条大小约为1.4kb的条带(如图2所示)，得到重组菌株Cg-△ldh(2)。
摇瓶发酵培养Cg-△ldh(2)菌株36小时，检测乳酸脱氢酶活性和乳酸的生成量。结果表明：Cg-△ldh(2)的乳酸脱氢酶酶活下降至原始菌株的5％以下，乳酸含量在检出限以下。
实施例3：以Cg-△ldh(1)和Cg-△ldh(2)为宿主构建产透明质酸的重组菌株
将携带有hasA的质粒pXMJ19-A(其构建参照专利CN103937734A)、携带有hasA和hasB的质粒pXMJ19-AB(其构建参照专利CN103937734A)、携带有hasA和hasC的质粒pXMJ19-AC、携带有hasA和hasD的质粒pXMJ19-AD、携带有hasA和hasE的质粒pXMJ19-AE、携带有hasA、hasB和hasC的质粒pXMJ19-ABC(其构建参照专利CN103937734A)、携带有hasA、hasB和hasD的质粒pXMJ19-ABD和携带有hasA、hasB和hasE的质粒pXMJ19-ABE，利用电转化的方式转入实施例1和实施例2中构建的重组ldh敲除菌株Cg-△ldh(1)和Cg-△ldh(2)中。
其中，hasA为透明质酸合成酶基因，hasB为UDP-葡萄糖脱氢酶基因，hasC为UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，hasD为葡萄糖胺尿苷转移酶基因，hasE为磷酸葡萄糖变位酶基因。
上述质粒pXMJ19-AC、pXMJ19-AD、pXMJ19-AE、pXMJ19-ABD和pXMJ19-ABE的构建具体为：
以谷氨酸棒杆菌的DNA基因组为模板，利用引物C-F/C-R、D-F/D-R、E-F/E-R、BD-F/BD-R和BE-F/BE-R进行PCR，得到hasC、hasD、hasE、B-hasD和B-hasE片段。
利用KpnI/EcorI对质粒pXMJ19-A(CN103937734A)进行双酶切，并对产物进行纯化。将酶切后的质粒，分别与hasC、hasD和hasE片段进行Gibson Assembly连接反应(试剂盒于NEB购买，基因片段和质粒片段共5μL，连接缓冲液5μL，50℃孵育10min)，获得重组质粒pXMJ19-AC、pXMJ19-AD、pXMJ19-AE。
利用EcorI对质粒pXMJ19-AB(CN103937734A)进行单酶切，对产物进行纯化。将酶切后的质粒，分别与B-hasD和B-hasE片段进行Gibson Assembly连接反应(试剂盒于NEB购买，基因片段和质粒片段共5μL，连接缓冲液5μL，50℃孵育10min)，获得重组质粒pXMJ19-ABD和pXMJ19-ABE。
其中，所述引物序列如下：
C-F：5’-TAAGGATCCCCGGGTACCAAAGGAGGACACATATGAGTTTGCCAATAGCTCAGC-3’
C-R：5’-CCAAAACAGCCAAGCTGAATTCTTAAGATTCAAACTCAGCGAGTATT-3’
D-F：5’-TAAGGATCCCCGGGTACCAAAGGAGGACACATATGAGCGCAAGCGATTTCTCG-3’
D-R：5’-CCAAAACAGCCAAGCTGAATTCTTAGCCTTCCTGGTTGTGGACG-3’
E-F：5’-TAAGGATCCCCGGGTACCAAAGGAGGACACATATGGCGGACATTTCGACCAC-3’
E-R：5’-CCAAAACAGCCAAGCTGAATTCCTACCTATTTGCGCGGTACCACT-3’
BD-F：5’-GTGACTAAGAGCTCGAATTCAAAGGAGGACACATATGAGCGCAAGCGATTTCTCG-3’
BD-R：5’-AACAGCCAAGCTGAATTCTTAGCCTTCCTGGTTGTGGACG-3’
BE-F：5’-GTGACTAAGAGCTCGAATTCAAAGGAGGACACATATGGCGGACATTTCGACCAC-3’
BE-R：5’-ACAGCCAAGCTGAATTCCTACCTATTTGCGCGGTACCACT-3’。
上述电转化的具体操作为：向一个1.5mL离心管中加入5μL上述重组质粒以及100μLCg-△ldh(1)或Cg-△ldh(2)感受态细胞，混匀后加入0.1cm电转杯，冰浴30min；调节电穿孔仪电压为1.8kV，将电转杯装入电穿孔仪，按下电击键；电击结束后，向电转杯中加入1mLSOC复苏培养基，重悬细胞，转入1.5mL离心管，37℃、200rpm震荡培养2h；取300μL菌液涂布于LB固体培养基(5μg/mL氯霉素)，置于30℃培养箱中倒置培养16小时，挑取单菌落并进行PCR验证。获得具有透明质酸合成能力的重组菌株Cg-△ldh(1)/A、Cg-△ldh(1)/AB、Cg-△ldh(1)/AC、Cg-△ldh(1)/AD、Cg-△ldh(1)/AE、Cg-△ldh(1)/ABC、Cg-△ldh(1)/ABD、Cg-△ldh(1)/ABE和Cg-△ldh(2)/A、Cg-△ldh(2)/AB、Cg-△ldh(2)/AC、Cg-△ldh(2)/AD、Cg-△ldh(2)/AE、Cg-△ldh(2)/ABC、Cg-△ldh(2)/ABD、Cg-△ldh(2)/ABE共16株菌。
上述重组菌株的发酵培养过程中，均未检测到乳酸的生成。
实施例4：使用Cg-△ldh基因工程菌生产透明质酸
将中国专利CN103937734A所构建的重组菌株Cg/AB和实施例3中所构建的Cg-△ldh(1)/AB和Cg-△ldh(2)/AB接种于LB液体培养基(含5μg/mL氯霉素)中，30℃、200rpm下培养16小时后，以5％的比例接入发酵培养基中，在30℃、搅拌桨600rpm、通气1vvm、pH7.2的条件下下培养3h，加入IPTG(终浓度0.1mM)，继续培养48h，期间流加碳源，维持糖浓度在5-10g/L，培养结束后常温8000rpm离心即得含透明质酸的发酵液。
发酵培养基的配方为：葡萄糖30g/L，(NH4)2SO430g/L，玉米粉10g/L，KH2PO4 1g/L，K2HPO4：0.5g/L，MnSO4·7H2O 10mg/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。
取上述所得发酵液1mL加入1mL 0.1％w/v的SDS溶液混匀，室温温浴20分钟；12000rpm离心10min，将上清液转移至新的10mL EP管中，加入2倍体积的冰乙醇，4℃放置1h；然后12000rpm离心10min，除去上清后室温下放置，待乙醇完全挥发后用去离子水重悬。取300μL重悬后的溶液，加入700μL乙酸缓冲液(0.2mol/L醋酸钠、0.15mol/L氯化钠，用乙酸调节pH至6.0)和2mL 2.5g/L的CTAB溶液(0.5mol NaOH溶解)，反应5min后测定OD400。
测定结果显示：没有敲除ldh的重组菌株透明质酸产量可达13.8g/L，而单交换和双交换敲除ldh的重组菌株产量均达到22g/L(图3)，是我国现有的马链球菌工业化生产水平的约3倍。
实施例3中构建的其它基因工程菌生产透明质酸，其产量相对于对照菌株，均提高40％以上。其中，Cg-△ldh(1)/AB和Cg-△ldh(2)/AB的透明质酸产量最高。
透明质酸分析采用高压液相色谱，色谱柱为Shodex SB-806M OHpak(8×300mm)，流动相为0.2MNaCl，流速为0.5ml/min。分子量标准购自Lifecore Biomedical Inc.，USA。结果表明，分子量Mw可以达到106Da。

Claims (10)

1.一种高产透明质酸的基因工程菌，其是将谷氨酸棒杆菌中的乳酸脱氢酶基因失活，并转入透明质酸合成酶基因构建而成。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还转入了UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上。
3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述谷氨酸棒杆菌为谷氨酸棒杆菌ATCC13032。
4.一种高产透明质酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建乳酸脱氢酶基因的同源重组交换质粒；
(2)将同源重组交换质粒转入谷氨酸棒杆菌，得到乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌；
(3)将透明质酸合成酶基因转入上述乳酸脱氢酶基因失活的谷氨酸棒杆菌，得到基因工程菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，还包括：将UDP-葡萄糖脱氢酶基因、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因、葡萄糖胺尿苷转移酶基因或磷酸葡萄糖变位酶基因的一种或一种以上转入步骤(3)所述基因工程菌。
6.权利要求1-3任一项所述高产透明质酸的基因工程菌在制备透明质酸中的应用。
7.一种利用基因工程菌生产透明质酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求1-3任一项所述的基因工程菌接入LB液体培养基中进行培养，得到基因工程菌菌液；
(2)按照1-20％的体积百分比将上述得到的基因工程菌菌液接入发酵培养基中，培养1-5h后加入诱导剂，继续培养，期间维持糖浓度5-10g/L，得到含有透明质酸的发酵液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的组成为：糖类20-100g/L，无机氮源10-50g/L，有机氮源2-40g/L，KH2PO4 0.1-5g/L，K2HPO4·12H2O 0.5-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-8g/L，MnSO4·H2O 0.002-0.1g/L，FeSO4·7H2O 0.002-0.1g/L，pH 6.0-8.0。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中培养条件为：温度25-40℃，转速100-300rpm/min，时间10-30h；步骤(2)中培养条件为：温度25-40℃，转速100-300rpm/min，pH为6.0-8.0，继续培养时间24-72h。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述诱导剂为异丙基硫代半乳糖苷或乳糖，加入量为0.05-5.0g/L。
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