CN108192899A

CN108192899A - 一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用

Info

Publication number: CN108192899A
Application number: CN201810036054.1A
Authority: CN
Inventors: 陈振; 刘德华
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2018-06-22
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN108192899B

Abstract

本发明提供一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明将兽疫链球菌经NTG诱变引起该菌乳酸脱氢酶基因ldhA发生了一个碱基的突变，697位碱基由A突变为G(A697G)，导致其氨基酸序列的233位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸(T233A)，该基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，能够使乳酸脱氢酶酶活降低50％以上，进一步证实含有该基因突变体的兽疫链球菌在发酵生产透明质酸的过程中，能够显著降低乳酸的积累，乳酸积累量降低60％以上，透明质酸的产量提高50％以上，具有重要的工业应用前景。

Description

一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用。

背景技术

透明质酸是D-葡萄糖醛酸及N-乙酰氨基葡萄糖通过β-1,3及β-1,4糖苷键连接而成的高分子多糖类物质，又称玻尿酸。透明质酸广泛地存在于人体的各个部位，具有极其重要的生理作用，如协助水电解质的扩散转运，润滑关节，调节血管壁的通透性，促进伤口愈合等。另外，透明质酸具有极强的保湿作用，被称为理想的天然保湿因子。它是目前自然界中发现的化妆品用保湿性能最好的物质。透明质酸具有不同的分子量，其分布从几千到几百万道尔顿，因其分子量的不同，其性能及应用也有所不同。小分子量的透明质酸(分子量<10万)能渗入真皮，容易被人体吸收，因此主要作于保健食品，美容食品及药物载体领域；中分子量的透明质酸(10万<分子量<100万)能够紧致肌肤，因此在保湿、面膜、化妆品领域具有广泛应用；大分子的透明质酸(分子量>100万)，可以作为皮肤填充剂，在美容、医药领域具有广泛的应用。目前全球透明质酸的市场已经超过100亿美元。

透明质酸的生产方法主要包括动物组织提取法和微生物发酵法两种。前者由于来源有限、产率较低等因素，生产成本较高且容易产生免疫反应。因此，目前透明质酸的生产主要是通过发酵法进行。目前，工业上透明质酸的生产菌株主要包括兽疫链球菌、马链球菌和类马链球菌等。这类菌株在发酵生产透明质酸的过程当中，同时产生了大量有机酸，特别是乳酸在发酵过程当中大量积累。乳酸的积累一方面极大降低了透明质酸的质量得率，另一方面乳酸会对菌体产生毒害作用，降低透明质酸的终浓度。

发明内容

本发明目的是提供一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其在提高透明质酸产量中的应用。

本发明首先对兽疫链球菌ATCC39920进行亚硝基胍(NTG)诱变处理，筛选能够提高透明质酸产量的突变菌株，并对突变的菌株进行全基因组测序，并在分子水平上进行验证。最后获得一种能够显著降低乳酸积累并提高透明质酸产量的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体。

本发明提供的一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体，其为697位碱基由A突变为G，导致其氨基酸序列的233位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸，该基因突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明提供的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明提供了含有上述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的生物材料，所述生物材料为表达载体、表达盒或宿主细胞。

本发明提供了含有上述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的工程菌。

所述工程菌包括但不限于重组兽疫链球菌、重组马链球菌或重组类马链球菌。

本发明提供了上述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体在降低乳酸脱氢酶酶活力中的应用。

本发明提供了上述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体或含有该基因突变体的生物材料或含有该基因突变体的工程菌在制备透明质酸中的应用。

本发明提供了上述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体或含有该基因突变体的生物材料或含有该基因突变体的工程菌在发酵领域降低发酵过程中乳酸积累量的应用。

本发明提供了上述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体或含有该基因突变体的生物材料或含有该基因突变体的工程菌在提高透明质酸产量中的应用。

本发明提供一种提高透明质酸产量的方法，用含有本发明所述的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的重组菌株进行发酵培养，发酵培养基为：葡萄糖20-70g/L,酵母粉5-20g/L，蛋白胨10-20g/L，KH₂PO₄ 0.5-4g/L，MgSO₄ 0.5-2g/L；发酵过程温度控制在30-37℃，发酵周期为18-36h。

本发明还提供了一种克隆兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的方法，是以兽疫链球菌基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.3-4所示的引物进行PCR扩增得到含有T233A突变的ldhA基因片段。

本发明的有益效果在于，本发明的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体能够使乳酸脱氢酶酶活降低50％以上，甚至降低80％以上，利用含有该基因突变体的兽疫链球菌或其他相关菌在发酵生产透明质酸的过程中，能够显著降低乳酸的积累，乳酸积累量降低60％以上，透明质酸的产量较原始菌提高50％以上，能够显著地降低生产成本，提高产业效率，具有重要的工业应用前景。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

实施例1通过随机突变的方法发现能够降低乳酸产量的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体

将兽疫链球菌ATCC 39920在新鲜的LB固体平板上过夜培养，培养温度为37℃。第二天，在平板上加入5ml的无菌水洗脱菌体。将洗脱液在离心机中用4℃，5000rpm条件下离心10分钟，去除上清液，将菌体用5ml的PBS缓冲液(0.05M KH2PO4，pH7.0)洗涤两次，再重悬于5ml的PBS缓冲液中。在重悬液加入100mg/ml的亚硝基胍(NTG)，37℃震荡培养40分钟进行诱变，之后加入5ml的BHI溶液(包含37g/L脑心浸液的水溶液)30℃复苏6个小时。将复苏后的菌体稀释10-10000倍后涂布于血琼脂平板(其成分包括10g/L的蛋白胨，3g/L的牛肉粉，5g/L的氯化钠，50ml的脱纤维羊血，15g/L的琼脂，5g/L的乳酸)，37℃培养48h。

从血琼脂平板上挑取100株菌落较大且菌落周围不行成透明圈的菌落在摇瓶中(500ml摇瓶中包含50ml发酵液)进行发酵培养。发酵培养基成分是葡萄糖40g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄2g/L，硫酸镁0.5g/L。培养条件为34℃，150rpm，发酵48h后检测透明质酸的产量。

透明质酸的检测方法为：取1mL的发酵液，向其中加入等量0.1％的十二烷基磺酸钠溶液(SDS)，在室温下静置30min，12000rpm条件下将发酵液离心10min，收集上清液，加入2倍体积的无水乙醇，于4℃条件下静置1h，充分沉淀。4℃，12000rpm条件下离心10min，弃去上清液，风干至乙醇完全挥发，用与原发酵液等体积的去离子水重悬沉淀。加入取300μL经过一次重悬稀释后的透明质酸溶液，向其中加入700μL的乙酸缓冲溶液(浓度为0.2mol/L的乙酸钠和0.15mol/L的NaCl，用乙酸将pH调到6.0左右)，然后向其中加入2ml CTAB溶液(2.5g/L的CTAB，使用0.5mol/L的NaOH溶解)，反应进行5min后测定OD400值。

发酵结果显示，在100株菌株中4#菌株透明质酸的产量达到4.0g/L,乳酸产量为4g/L，将该菌株命名为Sz01。而对照菌株ATCC 39920透明质酸的产量为2.7g/L,乳酸产量为12g/L。相比于对照菌株，Sz01的乳酸积累降低了66.7％，而透明质酸的产量提高了50％。

实施例2验证乳酸脱氢酶基因ldhA突变体能导致乳酸产量降低

将实施例筛选得到的突变的兽疫链球菌Sz01进行全基因组测序(由华大基因公司完成)，发现兽疫链球菌Sz01全基因组一共包含27个突变。其中Sz01的乳酸脱氢酶基因ldhA发生了一个碱基的突变，697位碱基由A突变为G(A697G)(序列如SEQ ID No.1所示)，导致其氨基酸序列的233位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸(T233A)(序列如SEQ ID No.2所示)。

进一步检测Sz01的乳酸脱氢酶活性，其酶活为0.34U/mg,相比于对照菌株ATCC39920的乳酸脱氢酶活性(1.89U/mg)降低了82％。乳酸脱氢酶酶活的检测方法如下：在1ml的反应体系中包含100mM的KH₂PO₄(pH7.5)，1mM的NADH，5mM的丙酮酸，100ug的菌体蛋白，25℃反应3min，检测在340nm波长下吸光度的变化值。

为了进一步验证是否是由于乳酸脱氢酶的T233A氨基酸突变引起的乳酸积累下降和透明质酸产量的提高，本实施例进一步对菌株ATCC 39920的乳酸脱氢酶基因进行定点突变。以实施例1筛选得到的兽疫链球菌Sz01的基因组为模板，以引物ldhA-F(ctcactgcagatgactgcaactaaacaacataaaa)和ldhA-R(gcatgtcgactcacatgaagatatttcaatgggaa)为引物进行PCR，获得包含T233A突变的ldhA基因片段约1200bp并进行PCR产物纯化。将传化后的PCR产物用PstI/SalI进行双酶切，并与同样用PstI/SalI进行双酶切的兽疫链球菌自杀性质粒pSET4s-sacB(Appl MicrobiolBiotechnol，2013，97:8629–8636)进行连接，获得的重组质粒命名为pSET4s-sacB-ldhA。

利用电穿孔仪(伯乐)将重组质粒pSET4s-sacB-ldhA通过电转化转入到兽疫链球菌ATCC 39920中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含100mg/L的壮观霉素THY平板上筛选。该重组菌进一步在液体THY培养基(TODD-HEWITT肉汤加20g/L的酵母粉)里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖THY平板上进行二次筛选。利用ldhA-F和ldhA-R为引物进行菌落PCR并进行测序，筛选包含T233A的突变株，将该重组菌命名为S.zooepidemicus-lhdA(T233A)。

将菌株S.zooepidemicus-lhdA(T233A)和ATCC 39920进行发酵培养。发酵培养基成分是葡萄糖40g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄ 2g/L，硫酸镁0.5g/L。培养条件为34℃，150rpm，发酵48h后检测透明质酸的产量。

发酵结果显示，S.zooepidemicus-lhdA(T233A)透明质酸的产量达到3.5g/L,乳酸产量为3.8g/L，而对照菌株ATCC 39920透明质酸的产量为2.4g/L,乳酸产量为12g/L。

同样检测S.zooepidemicus-lhdA(T233A)和ATCC 39920的乳酸脱氢酶活性，S.zooepidemicus-lhdA(T233A)和ATCC 39920的乳酸脱氢酶活性分别为0.34U/mg和2.04U/mg。

由于S.zooepidemicus-lhdA(T233A)和ATCC 39920相比仅包含ldhA基因的T233A突变，说明确实是由于乳酸脱氢酶基因ldhA的A697G突变(氨基酸序列T233A突变)导致乳酸脱氢酶活性的下降进而引起了乳酸积累量的下降和透明质酸产量的提升。

实施例3构建包含乳酸脱氢酶T233A的突变体的其他重组兽疫链球菌并验证其功能

为了测试乳酸脱氢酶突变T233A是否也能提高其他兽疫链球菌的透明质酸产量，本实施例进一步对兽疫链球菌ATCC 35246的乳酸脱氢酶进行突变。

利用电穿孔仪(伯乐)将pSET4s-sacB-ldhA通过电转化转入到兽疫链球菌ATCC35246中，电击条件为电压2.5KV，电阻200Ω，电容25μF(电击杯宽度为2mm)。一次重组菌在含100mg/L的壮观霉素THY平板上筛选。该重组菌进一步在液体THY培养基里过夜培养，之后在含有100g/L的蔗糖THY平板上进行二次筛选。利用ldhA-F和ldhA-R为引物进行菌落PCR并进行测序，筛选包含T233A的突变株，将该重组菌命名为S.zooepidemicus 35246-lhdA(T233A)。

将菌株S.zooepidemicus 35246-lhdA(T233A)和ATCC 35246进行发酵培养。发酵培养基成分是葡萄糖40g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，KH₂PO₄ 2g/L，硫酸镁0.5g/L。培养条件为34℃，150rpm，发酵48h后检测透明质酸的产量。

发酵结果显示，S.zooepidemicus 35246-lhdA(T233A)透明质酸的产量达到3.2g/L,乳酸产量为4.2g/L，而对照菌株ATCC 35246透明质酸的产量为2.2g/L,乳酸产量为14g/L。

检测S.zooepidemicus 35246-lhdA(T233A)和ATCC 35246的乳酸脱氢酶活性，S.zooepidemicus 35246-lhdA(T233A)和ATCC 35246的乳酸脱氢酶活性分别为0.47U/mg和2.94U/mg。说明在兽疫链球菌ATCC 35246中引入乳酸脱氢酶基因的T233A突变，同样可以降低乳酸脱氢酶的活性，从而降低乳酸的积累量和提高透明质酸的产量。

基于上述实验结果，本领域技术人员可以合理预期在其他兽疫链球菌或其他可用于发酵生产透明质酸的微生物中构建含有本发明突变体的重组微生物用于发酵生产透明质酸，均能够在发酵过程中降低乳酸的积累量并提高透明质酸的产量。这不超出本领域技术人员的认知范围。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 清华大学

<120> 一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体及其应用

<130> KHP171119349.6

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgactgcaa ctaaacaaca taaaaaagtc atcttggttg gcgatggtgc tgtaggctct 60

tcttatgcct ttgcactagt aacccaaaat attgcccaag agcttggtat tattgatatt 120

tttaaagaaa aaactcaagg agatgctgag gatttaagcc atgcgcttgc ctttacctcc 180

cctaaaaaga tctatgctgc tgattatgct gactgtcacg atgctgacct agttgtttta 240

acagctggcg ctcctcaaaa gccaggtgag actcgtcttg accttgttga gaaaaatcta 300

cgcattaata aagaggtggt tactcaaatt gtggcctcag gctttaaggg aattttcctt 360

gttgctgcta atccggtgga tattttgacc tattcaacct ggaaattctc aggcttccct 420

aaggaacgcg tcatcggttc tggaacatca cttgactcag cacgcttccg tcaagcactt 480

gctgctaaaa tcggtgtaga tgcacgttct gtccatgctt acatcatggg tgagcatgga 540

gattcagaat ttgctgtttg gtcacatgct aatgttgcag gggttggatt gtacgactgg 600

cttcaggcta atcgtgacgt tgatgaacaa ggcttggtag acctctttat ctctgtacgt 660

gacgcagctt actctatcat caataaaaag ggtgctgcct tctatgggat tgcagtcgcc 720

ctagcacgta ttacaaaggc tatccttgat gatgaaaatg cagtacttcc actttctgtc 780

ttccaagaag gccaatacga gggggttgag gattgctaca tcggtcagcc tgctatcgtt 840

ggtgcttatg gtattgttcg tccagtcaat atcccgttga atgatgctga gcttcaaaaa 900

atgcaagctt cagcaaacca attgaaggct attatcgacg aagccttctc taaagaagag 960

tttgcgtctg ctgctaaaaa ctaa 984

<210> 2

<211> 327

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Ala Thr Lys Gln His Lys Lys Val Ile Leu Val Gly Asp Gly

1 5 10 15

Ala Val Gly Ser Ser Tyr Ala Phe Ala Leu Val Thr Gln Asn Ile Ala

20 25 30

Gln Glu Leu Gly Ile Ile Asp Ile Phe Lys Glu Lys Thr Gln Gly Asp

35 40 45

Ala Glu Asp Leu Ser His Ala Leu Ala Phe Thr Ser Pro Lys Lys Ile

50 55 60

Tyr Ala Ala Asp Tyr Ala Asp Cys His Asp Ala Asp Leu Val Val Leu

65 70 75 80

Thr Ala Gly Ala Pro Gln Lys Pro Gly Glu Thr Arg Leu Asp Leu Val

85 90 95

Glu Lys Asn Leu Arg Ile Asn Lys Glu Val Val Thr Gln Ile Val Ala

100 105 110

Ser Gly Phe Lys Gly Ile Phe Leu Val Ala Ala Asn Pro Val Asp Ile

115 120 125

Leu Thr Tyr Ser Thr Trp Lys Phe Ser Gly Phe Pro Lys Glu Arg Val

130 135 140

Ile Gly Ser Gly Thr Ser Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Gln Ala Leu

145 150 155 160

Ala Ala Lys Ile Gly Val Asp Ala Arg Ser Val His Ala Tyr Ile Met

165 170 175

Gly Glu His Gly Asp Ser Glu Phe Ala Val Trp Ser His Ala Asn Val

180 185 190

Ala Gly Val Gly Leu Tyr Asp Trp Leu Gln Ala Asn Arg Asp Val Asp

195 200 205

Glu Gln Gly Leu Val Asp Leu Phe Ile Ser Val Arg Asp Ala Ala Tyr

210 215 220

Ser Ile Ile Asn Lys Lys Gly Ala Ala Phe Tyr Gly Ile Ala Val Ala

225 230 235 240

Leu Ala Arg Ile Thr Lys Ala Ile Leu Asp Asp Glu Asn Ala Val Leu

245 250 255

Pro Leu Ser Val Phe Gln Glu Gly Gln Tyr Glu Gly Val Glu Asp Cys

260 265 270

Tyr Ile Gly Gln Pro Ala Ile Val Gly Ala Tyr Gly Ile Val Arg Pro

275 280 285

Val Asn Ile Pro Leu Asn Asp Ala Glu Leu Gln Lys Met Gln Ala Ser

290 295 300

Ala Asn Gln Leu Lys Ala Ile Ile Asp Glu Ala Phe Ser Lys Glu Glu

305 310 315 320

Phe Ala Ser Ala Ala Lys Asn

325

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ctcactgcag atgactgcaa ctaaacaaca taaaa 35

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gcatgtcgac tcacatgaag atatttcaat gggaa 35

Claims

1.一种兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体，其为697位碱基由A突变为G，导致其氨基酸序列的233位氨基酸残基由苏氨酸突变为丙氨酸，该基因突变体的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示。

2.如权利要求1所述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1或2所述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的生物材料，所述生物材料为表达载体、表达盒或宿主细胞。

4.含有权利要求1或2所述兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的工程菌。

5.如权利要求4所述的工程菌，其特征在于，其为重组兽疫链球菌、重组马链球菌或重组类马链球菌。

6.权利要求1或2所述的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体在降低乳酸脱氢酶酶活力中的应用。

7.权利要求1或2所述的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体或权利要求3所述的生物材料或权利要求4所述的工程菌在制备透明质酸中的应用。

8.权利要求1或2所述的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体或权利要求3所述的生物材料或权利要求4所述的工程菌在发酵领域降低发酵过程中乳酸积累量中的应用。

9.权利要求1或2所述的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体或权利要求3所述的生物材料或权利要求4所述的工程菌在提高透明质酸产量中的应用。

10.一种提高透明质酸产量的方法，其特征在于，用含有权利要求1或2所述的兽疫链球菌乳酸脱氢酶基因突变体的重组菌株进行发酵培养，发酵培养基为：葡萄糖20-70g/L,酵母粉5-20g/L，蛋白胨10-20g/L，KH₂PO₄ 0.5-4g/L，MgSO₄ 0.5-2g/L；发酵过程温度控制在30-37℃，发酵周期为18-36h。