CN110724677B

CN110724677B - 琼胶酶及其制备方法

Info

Publication number: CN110724677B
Application number: CN201810774252.8A
Authority: CN
Inventors: 江晓路; 朱常亮; 崔欣
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2018-07-16
Filing date: 2018-07-16
Publication date: 2022-08-05
Anticipated expiration: 2038-07-16
Also published as: CN110724677A

Abstract

本发明属于药物化学、生物化工领域，涉及一种交替假单胞菌、一种琼胶酶及制备方法。具体地，本发明涉及一种来源于潮间带污泥的交替假单胞菌Q30F（Pseudoalteromonas sp.Q30F），该菌株具有营养条件简单、易培养的特点。本发明还公开了琼胶酶，氨基酸序列及其基因编码。本发明还涉及上述琼胶酶的编码基因及其表达载体、细胞系。

Description

琼胶酶及其制备方法

技术领域

本发明属于药物化学、生物化工领域。

背景技术

琼胶( Agar )主要产自江蓠、紫菜等食用红藻，与褐藻胶、卡拉胶并称产量最大、用途最广的三大海洋多糖，广泛应用于食品、医药和化工行业。琼脂糖( Agarose )是琼胶的主要成分之一，属中性多糖，其分子主链由二糖单元β-D-半乳糖和3，6-内醚-α-L-半乳糖以α-1，3和β-1，4糖苷键交替连接组成。琼胶寡糖是琼胶水解后得到的分子量较低的寡糖。琼胶寡糖有两类，琼寡糖和新琼寡糖。琼胶寡糖具有抗炎、抗过敏、抗肿瘤、免疫调节、美白、预防糖尿病、抵御植物病害等活性，在食品生产中可作天然防腐剂和甜味剂，在医药领域可作为抗肿瘤、抗过敏、消炎药研发的原料，在化工领域可作为美白、保湿、抗衰老成分用于化妆品的生产。目前，已有琼胶寡糖作为活性成分的保健品和日化产品在日本市场上销售。

琼胶寡糖的制备主要有物理降解、化学降解法和酶降解法。国内外有关琼胶寡糖结构和活性方面的报道很少。已有报道的降解方法主要有超声波法．过氧化氢氧化法和酸水解。通过这些传统工艺降解琼胶或琼脂糖后，其寡糖产物的聚合度较为多样，迄今无法有效实现琼胶寡糖的定向制备。相比而言。酶解法在海藻寡糖的制备方法中具有绝对优势。（1）反应过程中产生的副产物少，降解得到的产物专一性强，产物结构受到的损伤小；（2）反应条件温巧，过程易控制。（3）安全环保，对工厂设备损伤小。

虽然琼胶酶制备寡糖具有很多优势，但在工业上并没有得到广泛应用，其中高效的、低成本的琼胶酶制剂的制备成为了限制红藻产业高值化利用的关键性因素。目前，工业级的琼胶酶制剂市场还属空白，商用级的琼胶酶价格高昂，仅供研究使用。根据报道的数据进行调研，大多数产琼胶酶的菌株的活性较低，产量较低，阻碍了红藻产业的深度发展。因此，开发活性高、产量高、安全性高的琼胶酶，形成成熟的、低成本琼胶酶制备方法成为了本技术领域的当务之急。

发明内容

本发明分离纯化出一株来源于海洋的交替假单胞菌Q30F（Pseudoalteromonassp. Q30F），其特征是产生琼胶酶，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏号：CCTCC No：M 2017622，保藏日期：2017年10月23日。本发明的目的是提供一种来源于海洋的菌株Pseudoalteromonas sp. Q30F、编码琼胶酶的基因序列及蛋白氨基酸序列。本发明还提供了用于以高产率制备有效的琼胶酶的方法，并且其可在工业规模应用不存在困难。

本发明涉及一株来源于海洋的交替假单胞菌。经过基因测序技术，遗传标志是包含序列表SEQ.ID.No.1所示的16SrDNA核酸序列，通过在GenBank数据库同源比对和生理生化鉴定，确定其为交替假单胞菌Q30F，命名为Pseudoalteromonas sp. Q30F。

本发明涉及包含如SEQ. ID. NO.10所示的氨基酸序列的琼胶酶。

本发明所研究并公开的琼胶酶，氨基酸序列如SEQ ID No.7或10所示。

本发明同时涉及核苷酸序列，其特征在于编码氨基酸序列如SEQ ID No.7或10所示的琼胶酶，核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示。

本发明同时涉及重组载体，其包含如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.8所示的核酸分子。

根据本发明，这些目的和下文中会变得更明显的其他目的，是通过如下制备琼胶酶的方法实现的。

利用本发明的公开的SEQ ID NO.4中所示的核苷酸序列的载体，经过基因重组、诱导表达、发酵培养获得含琼胶酶的发酵液。

本发明的这些目的也可以通过发酵的方法获得的包含SEQ.ID.No.10的源自Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的琼胶酶（SEQ.ID.No.7）来实现。

本发明的这些目的也已经通过包含SEQ.ID.No.4中示出的核苷酸序列的多核苷酸实现，其编码包含SEQ.ID.No.10中示出的氨基酸序列的细菌琼胶酶。本发明的这些目的也已经通过包含所述多核苷酸的基因工程化重组载体实现。

本发明的这些目的已经通过包含所述基因工程化重组载体的宿主细胞实现。

本发明的这些目的也已经通过包含纯化形式并且包含SEQ.ID.No.7或SEQ.ID.No.10中示出的氨基酸序列的来自Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M2017622的所述琼胶酶具有如下用途之一或二种以上：1）作为工具酶降解红藻或大分子琼胶产生小分子琼胶糖链；2）作为工具酶，降解琼胶定向制备不同凝胶度的琼胶；3）降解新鲜红藻类细胞壁，游离出原生质体或单胞藻，用于养殖或遗传研究；4）与其他制剂耦合联用，制备富含以特征性琼胶寡糖为主的海洋酵素、饮品或食品；5）用于制备化妆品级、医药级的琼胶糖链。

在本发明的范围内，“源自或来自Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M2017622的琼胶酶”意指与原始分离自Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622生物体的琼胶酶具有高度同源性的琼胶酶，其能够通过生物技术从除Pseudoalteromonassp. Q30F CCTCC No：M 2017622之外的微生物（例如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌）产生。

相比于现有技技术，根据本发明的方法能够。

从特征在于安全的来源于大肠杆菌E.coli的菌株或枯草芽孢杆菌获得琼胶酶，并且通过重组技术（代替通过提取的方式）生产，从而适合于工业规模生产，并且目的蛋白在在胞外基质或细胞内中产生。

本发明采用原核表达系统成功实现细菌来源的琼胶酶异源高效活性表达，表达琼胶酶操作及其纯化制备方法简单。在未对细菌琼胶酶基因做任何修饰的情况下，构建基因工程菌株（大肠杆菌或枯草芽孢杆菌），其具有培养条件简单，发酵时间短，生产强度大。本发明为实现细菌来源琼胶酶的工业化制备生产奠定了基础。

附图说明

提供一下附图以更好地描述本发明，而不是意在限制本发明的范围。

图1：在1％琼脂糖凝胶中进行在生产步骤中琼胶酶基因PCR验证实验。经PCR获得1338bp片段分布的实验。

图2：来源于Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的如SEQ.ID.No.7所示的蛋白信号肽分析。

图3：:来源于Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的Agarase分子量和等电点的确定。

图4：来源于Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的AgaraseNS分子量和等电点的确定。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，首次揭示来源于Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCCNo：M 2017622琼胶酶。本发明的琼胶酶蛋白稳定性好，生物活性高。本发明还公开了含有琼胶酶基因的表达载体和宿主细胞，以及表达琼胶酶的方法。根据本发明的技术方案，可以实现以较低的成本大量生产重组琼胶酶。

如本文所用，所述的“琼胶酶活性”是以酶的活力单位来定义的。酶活力单位(U)定义为：在实验条件下，每min降解琼胶产生1μg还原糖（以葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个酶活力单位（U）。发酵液酶活力单位定义为：每升发酵液含酶活单位（U/L）。

如本文所用，所述的“以还原糖的标定测定酶活力”是按如下的测定方法：2mL20mM pH 7.0 含有0.2%琼胶的磷酸盐缓冲液，添加50μL酶液，40℃反应30min，添加2mL DNS试剂，520nm波长下测出反应结束后体系中的还原糖含量。

本发明的琼胶酶可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从宿主（例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。

本发明包括琼胶酶的片段。如本文所用，是指基本上保持本发明的天然琼胶酶相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段可以是(i) 有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基) 被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii) 在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii) 附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽( 如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J. 萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002 中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件

1. 一株Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的筛选与纯化

本发明Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的获得：从胶东海岸潮间带淤泥，加入到装有25mL的富集培养基中（琼胶0.2g，牛肉膏0.5g，K2HPO4 1g，MgSO40.5g，NaCl 0.5g，CaCl2 0.01g，H2O 1000mL，自然pH）的三角瓶中，28℃，160rpm摇瓶培养2d，然后将富集培养液用无菌生理盐水适当稀释后，取 0.1ml 涂布初筛分离培养基 (琼胶0.2g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，CaCl2 0.01g，牛肉膏0.5g，琼脂粉18.0g，H2O1000mL，自然pH ) 平板。 28℃倒置培养 2d，获得选取平板上有的菌落，经过摇瓶发酵测酶活，得到一株能产琼胶酶的细菌。

2. 一株Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的鉴定

采用chelex-100基因组提取DNA，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGCTCAG-3′（SEQ.ID.No.2），反向引物1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′（SEQ.ID.No.3）。反应体系50ul；反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，最后72℃ 延伸 10min。PCR产物的纯化、克隆、测序由上海生物工程有限公司完成，将16SrDNA基因序列测序结果（SEQ.ID.No.1）在GenBank数据库进行同源比对确定其为交替假单胞菌属。再经过伯杰手册节杆菌属的形态和生理生化鉴定，其特征是：革兰氏阴性，没有荚膜，兼性厌氧，氧化酶阳性，V.P阳性，可以利用葡萄糖产酸不产气，可以还原硝酸盐。菌株细胞直径为0.5μm×1.5-3.0μm。该菌株分离自近海污泥，最适温度在18℃-30℃，确定其为交替假单胞菌，命名为Pseudoalteromonas sp. Q30F。已送中国典型培养物保藏中心进行菌株保藏，简称CCTCC，保藏号：CCTCC No：M 2017622。

3. 来源于Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622琼胶酶的表达基因确定

取培养到对数期的Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622的菌液，根据TIAamp Bacteria DNA Kit（TIANGEN BIOTECH（BEIJING）CO.,LTD）试剂盒的操作说明进行提取，提取后在NanoDrop2000（Thermofisher Scientific CO.,）进行基因组DNA浓度和纯度测定，经测定，提取的基因组DNA浓度为380ng/mL，OD260/OD280比值为1.98。再经过1%琼脂糖凝胶电泳中进行DNA条带检测，检测条件：上样量5μL，电压120V，电泳30min，在凝胶成像系统中观察条带，如图1所示，条带均一性良好。将提取的DNA样品送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行细菌基因组精细图谱绘制，通过NR、GO、KEGG、COG、SwissProt、Pfam数据库的功能性基因注释，获得Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622琼胶酶的表达基因，见序列表中SEQ.ID.No.4所示。根据测序结果及蛋白信号肽分析，如图2所示，并以此为依据，设计引物F-NSAgarase：GAGTTCCCAAACAATCAAGAA（SEQ.ID.No.9），R-NSAgarase：AACTTTACTAATCGTATTAT（SEQ.ID.No.6），以提取的基因组DNA为模板，经过PCR获得一条含有琼胶酶的1281bp（SEQ.ID.No.8）的序列。根据如SEQ.ID.No.1所示表达基因及全基因组序列，确定经过对序列内的限制性酶切位点分析，并以此为依据设计引物，F-Agarase：ATGAACAAAACAACATTG（SEQ.ID.No.5），R-Agarase：AACTTTACTAATCGTATTAT（SEQ.ID.No.6）经过PCR获得一条含有琼胶酶基因的约1338bp（SEQ.ID.No.4）的序列，如图1所示，经过测序发现，获得的PCR片端序列与全基因组中注释琼胶酶基因片端一致。经过在线模拟计算（http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool），琼胶酶Agarse和NSAgarase的分子量分别为50.1kDa和48.15kDa，经过氨基酸分析其等电点分别为4.81和4.76，如图3和图4所示。

实施例2. 来源于Pseudoalteromonas sp. Q30F CCTCC No：M 2017622琼胶酶的重组载体构建

确定经过对序列内的限制性酶切位点分析，并以此为依据，对序列内的限制性酶切位点分析，含有限制性酶切位点的前后引物对含有琼胶酶基因的1281bp（SEQ.ID.No.8）和1338bp（SEQ.ID.No.4）序列进行PCR扩增，PCR产物经过Cycle-Pure Kit（OMEGA Bio-TekCo.）纯化试剂盒纯化，分别与载体pProEX-HTa、pHT43进行双酶切，酶切条件：37℃，5h。酶切产物进行琼脂糖电泳，电泳条件：70V，1h，用Gel extraction kit（OMEGA Bio-Tek Co.）胶提取试剂盒进行切胶回收，用T4连接酶进行含有琼胶酶基因的1281bp和1338bp序列片段分别与载体pProEX-HTa、pHT43连接，连接条件：16℃，16h。获得含有琼胶酶基因的1281bp（SEQ.ID.No.8）的重组子AgaraseNS-HTa、AgaraseNS-pHT43和含有琼胶酶基因的1338bp（SEQ.ID.No.4）的重组子Agarase-pHT43、Agarase-HTa。

实施例3. 含琼胶酶基因重组子的克隆与表达的宿主菌构建

选择大肠杆菌菌株DH5α( Invitrogen，基因型：F-φ80 lac ZΔM15 Δ(lacZYA-arg F) U169 endA1 recA1 hsdR17(rk-,mk+) supE44λ- thi -1 gyrA96 relA1 phoA。经过感受态细胞制备、热激转化（42℃，60s）、孵育（37℃，160rpm，45min）、在含有100μg/mL氨苄青霉素钠固体平板（LB固体培养基：胰蛋白胨：10g，酵母提取物：5g，NaCl：10g，蒸馏水：1000mL，pH7.0）筛选，37℃培养16h，菌落PCR检测，获得阳性克隆菌株AgaraseNS-HTa-DH5α、AgaraseE-HTa-DH5α、AgaraseNS-pHT43-DH5α、Agarase-pHT43-DH5α，将四种阳性菌株分别接种于LB液体培养基，37℃培养12h，用Plasmid Mini Kit（OMEGA Bio-Tek Co.）进行质粒提取，获得四种重组质粒： AgaraseNS-HTa、Agarase-HTa、AgaraseNS-pHT43、Agarase-pHT43。

选择大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），基因型：F-ompT hsdS(rB-mB-)gALdcm(DE3)，经过感受态细胞制备、热激转化（42℃，60s）、孵育（37℃，160rpm，45min），将提取后的重组质粒AgaraseNS-HTa、Agarase-HTa转化进大肠杆菌表达菌株BL21（DE3），氨苄青霉素固体平板（LB固体培养基，100μg/mL氨苄青霉素钠）筛选，37℃培养16h，菌落PCR检测，获得阳性克隆菌株AgaraseNS-HTa-BL21、Agarase-HTa-BL21，接着，在孵育期后以及适当检查培养物的无菌情况后，分别加入一定量的无菌甘油冷却每一培养物直至达到甘油的最终浓度为15％。置于-80℃下保存。

选择枯草芽孢杆菌表达菌株WB800N，基因型：nprE aprE epr bpr mpr::blenprB::bsr Δvpr wprA::hyg cm::neo; NeoR，经过感受态细胞制备、电转化（1.2kV，2ms）、孵育（37℃，200rpm，3h），将提取后的重组质粒Agarase-pHT43、AgaraseNS-pHT43转化进枯草芽孢杆菌表达菌株WB800N，氯霉素固体平板（LB固体培养基，5μg/mL氯霉素钠）筛选，37℃培养20h，菌落PCR检测，获得阳性克隆菌株Agarase-pHT43-WB800N、AgaraseNS-pHT43-WB800N。接着，在孵育期后以及适当检查培养物的无菌情况后，分别加入一定量的无菌甘油冷却每一培养物直至达到甘油的最终浓度为15％。置于-80℃下保存。

实施例4. 含琼胶酶基因工程化表达菌株的诱导表达

将阳性克隆菌株AgaraseNS-HTa-BL21、Agarase-HTa-BL21接种于LB液体培养基（100μg/mL氨苄青霉素钠）中，37℃培养至OD600为0.6时，加入IPTG至0.5mM浓度，24℃诱导24h，用标定还原糖法测定胞内和胞外的琼胶酶的活力，经过测量，Agarase-HTa-BL21表达菌株最终胞外琼胶酶活数据最高达到265.6 U/L，胞内琼胶酶活数据最高达到105.2 U/L。AgaraseNS-HTa-BL21表达菌株最终胞外琼胶酶活数据最高达到134.5U/mL，胞内蛋白酶活数据最高达到244.5 U/L。

将阳性克隆菌株Agarase-pHT43-WB800N、AgaraseNS-pHT43-WB800N接种于无菌的含有5μg/mL氯霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD600为0.8时，加入IPTG至1mM浓度，于32℃培养24h，用标定还原糖法测定胞内和胞外的琼胶酶的活力，经过测量， AgaraseNS-pHT43-WB800N表达菌株最终胞外琼胶酶活数据最高达到255.5U/mL。Agarase- pHT43-WB800N表达菌株最终胞外琼胶酶活数据最高达到 284.3U/mL。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 琼胶酶及其制备方法

<130> 2017-12-12

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1417

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 1

cctaccatgc aagtcgagcg gtaacagaaa gtagcttgct actttgctga cgagcggcgg 60

acgggtgagt aatgcttggg aacatgcctt gaggtggggg acaacagttg gaaacgactg 120

ctaataccgc ataatgtcta cggaccaaag ggggcttcgg ctctcgcctt tagattggcc 180

caagtgggat tagctagttg gtgaggtaat ggctcaccaa ggcaacgatc cctagctggt 240

ttgagaggat gatcagccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300

cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga 360

aggccttcgg gttgtaaagc actttcagtc aggaggaaag gttagtagtt aatacctgct 420

agctgtgacg ttactgacag aagaagcacc ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat 480

acggagggtg cgagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa gcgtacgcag gcggtttgtt 540

aagcgagatg tgaaagcccc gggctcaacc tgggaactgc atttcgaact ggcaaactag 600

agtgtgatag agggtggtag aatttcaggt gtagcggtga aatgcgtaga gatctgaagg 660

aataccgatg gcgaaggcag ccacctgggt caacactgac gctcatgtac gaaagcgtgg 720

ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgtct actagaagct 780

cggagcctcg gctctgtttt tcaaagctaa cgcattaagt agaccgcctg gggagtacgg 840

ccgcaaggtt aaaactcaaa tgaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 900

ttaattcgat gcaacgcgaa gaaccttacc tacacttgac atacagagaa cttaccagag 960

atggtttggt gccttcggga actctgatac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt 1020

tgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaacccc tatccttagt tgctagcagg 1080

taatgctgag aactctaagg agactgccgg tgataaaccg gaggaaggtg gggacgacgt 1140

caagtcatca tggcccttac gtgtagggct acacacgtgc tacaatggcg catacagagt 1200

gctgcgaact cgcgagagta agcgaatcac ttaaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc 1260

tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc tagtaatcgc gtatcagaat gacgcggtga 1320

atacgttccc gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gggagtgggt tgctccagaa 1380

gtagatagtc taaccctcgg gaggacgtta ccacgga 1417

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Universal primer)

<400> 2

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Universal primer)

<400> 3

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 4

<211> 1338

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 4

atgaacaaaa caacattgtt tatcggctgt ttactcacta ctaccaactt gtttgcaaat 60

gattgggact caattccttt accggttact cccggtgatg gcaaagtctg gcagctacaa 120

gaaacatact cagactcatt taattacaca ggtaaacctg ctgcatttac cagtaaatgg 180

aatgatactt actttaatag ttggacaggt ccaggtttga cctattggca gcaagatgag 240

tcatgggttt cagacggcaa ccttataatt agtgcttcgc gtcgtgctgg tacagataaa 300

gttaatgcag gggtgatcac ctcgaaaaca aaagttagct ttccaatctt tttagaggca 360

aacattaagg taagtaatct ggaattatct tcaaattttt ggctgctaag tgacaatgac 420

gaacgagaga tagatgtgct cgaggtatac ggtggggcac gtgatgattg gtttgctaaa 480

aatatgtcga cgaactttca tgtgtttatt cgtgatcaac aatctaacca aataattagt 540

gattacaatg atcaaacgca taatacgcct agttggggaa cgtattggcg tgaaggtttt 600

catcgttttg gcgtgtattg gaaaagccca acagaagtca cattttacat tgatggccag 660

caaacgcctg atggttcatg ggcgcaggtg gtgatgaaag ataaagacta taccggtgcg 720

acgttaaaca agaacacaca taatatggat caatccgctt atattattat tgatacagaa 780

gatcacgatt ggcgttcaga ggcgggaaat attgctacag atgccgattt ggctgacggt 840

agtaaaaata aaatgtatgt cgattgggtg cgagtttata aacctgttaa tgcgtccaat 900

acaaacagtg ttagtaatgg tgtacagatc aaagctaagc atagtcaaaa gtgtattgat 960

ataacagctg gcgctatgag taatggctct tattatcagc agtggggttg tggctctgat 1020

aatactaacc aacaatttaa ccttgttgag ttaagtaata atgaatatgc aattagctcg 1080

cagttaagtg gtttgtgcat gcagattgaa aacgccacta caagtaatgg cgctaagttg 1140

gagcagtggg tttgtgatca tgcaaaagcc agtcaacgct ttactctcaa tagcacgggt 1200

gacggctact ttgagcttaa atcaagttta agtaataaat gtgttgatat cgcaggtaaa 1260

ttgcaaacaa atggtgctga tattgtacag tggcagtgtt ataacggcga caatcaacgt 1320

tttcaactta ttgaataa 1338

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 5

atgaacaaaa caacattg 18

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 6

aactttacta atcgtattat tc 22

<210> 7

<211> 445

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 7

Met Asn Lys Thr Thr Leu Phe Ile Gly Cys Leu Leu Thr Thr Thr Asn

1 5 10 15

Leu Phe Ala Asn Asp Trp Asp Ser Ile Pro Leu Pro Val Thr Pro Gly

20 25 30

Asp Gly Lys Val Trp Gln Leu Gln Glu Thr Tyr Ser Asp Ser Phe Asn

35 40 45

Tyr Thr Gly Lys Pro Ala Ala Phe Thr Ser Lys Trp Asn Asp Thr Tyr

50 55 60

Phe Asn Ser Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Trp Gln Gln Asp Glu

65 70 75 80

Ser Trp Val Ser Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ser Arg Arg Ala

85 90 95

Gly Thr Asp Lys Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser Lys Thr Lys Val

100 105 110

Ser Phe Pro Ile Phe Leu Glu Ala Asn Ile Lys Val Ser Asn Leu Glu

115 120 125

Leu Ser Ser Asn Phe Trp Leu Leu Ser Asp Asn Asp Glu Arg Glu Ile

130 135 140

Asp Val Leu Glu Val Tyr Gly Gly Ala Arg Asp Asp Trp Phe Ala Lys

145 150 155 160

Asn Met Ser Thr Asn Phe His Val Phe Ile Arg Asp Gln Gln Ser Asn

165 170 175

Gln Ile Ile Ser Asp Tyr Asn Asp Gln Thr His Asn Thr Pro Ser Trp

180 185 190

Gly Thr Tyr Trp Arg Glu Gly Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Lys

195 200 205

Ser Pro Thr Glu Val Thr Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Gln Thr Pro Asp

210 215 220

Gly Ser Trp Ala Gln Val Val Met Lys Asp Lys Asp Tyr Thr Gly Ala

225 230 235 240

Thr Leu Asn Lys Asn Thr His Asn Met Asp Gln Ser Ala Tyr Ile Ile

245 250 255

Ile Asp Thr Glu Asp His Asp Trp Arg Ser Glu Ala Gly Asn Ile Ala

260 265 270

Thr Asp Ala Asp Leu Ala Asp Gly Ser Lys Asn Lys Met Tyr Val Asp

275 280 285

Trp Val Arg Val Tyr Lys Pro Val Asn Ala Ser Asn Thr Asn Ser Val

290 295 300

Ser Asn Gly Val Gln Ile Lys Ala Lys His Ser Gln Lys Cys Ile Asp

305 310 315 320

Ile Thr Ala Gly Ala Met Ser Asn Gly Ser Tyr Tyr Gln Gln Trp Gly

325 330 335

Cys Gly Ser Asp Asn Thr Asn Gln Gln Phe Asn Leu Val Glu Leu Ser

340 345 350

Asn Asn Glu Tyr Ala Ile Ser Ser Gln Leu Ser Gly Leu Cys Met Gln

355 360 365

Ile Glu Asn Ala Thr Thr Ser Asn Gly Ala Lys Leu Glu Gln Trp Val

370 375 380

Cys Asp His Ala Lys Ala Ser Gln Arg Phe Thr Leu Asn Ser Thr Gly

385 390 395 400

Asp Gly Tyr Phe Glu Leu Lys Ser Ser Leu Ser Asn Lys Cys Val Asp

405 410 415

Ile Ala Gly Lys Leu Gln Thr Asn Gly Ala Asp Ile Val Gln Trp Gln

420 425 430

Cys Tyr Asn Gly Asp Asn Gln Arg Phe Gln Leu Ile Glu

435 440 445

<210> 8

<211> 1281

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 8

aatgattggg actcaattcc tttaccggtt actcccggtg atggcaaagt ctggcagcta 60

caagaaacat actcagactc atttaattac acaggtaaac ctgctgcatt taccagtaaa 120

tggaatgata cttactttaa tagttggaca ggtccaggtt tgacctattg gcagcaagat 180

gagtcatggg tttcagacgg caaccttata attagtgctt cgcgtcgtgc tggtacagat 240

aaagttaatg caggggtgat cacctcgaaa acaaaagtta gctttccaat ctttttagag 300

gcaaacatta aggtaagtaa tctggaatta tcttcaaatt tttggctgct aagtgacaat 360

gacgaacgag agatagatgt gctcgaggta tacggtgggg cacgtgatga ttggtttgct 420

aaaaatatgt cgacgaactt tcatgtgttt attcgtgatc aacaatctaa ccaaataatt 480

agtgattaca atgatcaaac gcataatacg cctagttggg gaacgtattg gcgtgaaggt 540

tttcatcgtt ttggcgtgta ttggaaaagc ccaacagaag tcacatttta cattgatggc 600

cagcaaacgc ctgatggttc atgggcgcag gtggtgatga aagataaaga ctataccggt 660

gcgacgttaa acaagaacac acataatatg gatcaatccg cttatattat tattgataca 720

gaagatcacg attggcgttc agaggcggga aatattgcta cagatgccga tttggctgac 780

ggtagtaaaa ataaaatgta tgtcgattgg gtgcgagttt ataaacctgt taatgcgtcc 840

aatacaaaca gtgttagtaa tggtgtacag atcaaagcta agcatagtca aaagtgtatt 900

gatataacag ctggcgctat gagtaatggc tcttattatc agcagtgggg ttgtggctct 960

gataatacta accaacaatt taaccttgtt gagttaagta ataatgaata tgcaattagc 1020

tcgcagttaa gtggtttgtg catgcagatt gaaaacgcca ctacaagtaa tggcgctaag 1080

ttggagcagt gggtttgtga tcatgcaaaa gccagtcaac gctttactct caatagcacg 1140

ggtgacggct actttgagct taaatcaagt ttaagtaata aatgtgttga tatcgcaggt 1200

aaattgcaaa caaatggtgc tgatattgta cagtggcagt gttataacgg cgacaatcaa 1260

cgttttcaac ttattgaata a 1281

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 9

aatgattggg actcaatttc c 21

<210> 10

<211> 427

<212> PRT

<213> Pseudoalteromonas sp. Q30F

<400> 10

Met Asn Asp Trp Asp Ser Ile Pro Leu Pro Val Thr Pro Gly Asp Gly

1 5 10 15

Lys Val Trp Gln Leu Gln Glu Thr Tyr Ser Asp Ser Phe Asn Tyr Thr

20 25 30

Gly Lys Pro Ala Ala Phe Thr Ser Lys Trp Asn Asp Thr Tyr Phe Asn

35 40 45

Ser Trp Thr Gly Pro Gly Leu Thr Tyr Trp Gln Gln Asp Glu Ser Trp

50 55 60

Val Ser Asp Gly Asn Leu Ile Ile Ser Ala Ser Arg Arg Ala Gly Thr

65 70 75 80

Asp Lys Val Asn Ala Gly Val Ile Thr Ser Lys Thr Lys Val Ser Phe

85 90 95

Pro Ile Phe Leu Glu Ala Asn Ile Lys Val Ser Asn Leu Glu Leu Ser

100 105 110

Ser Asn Phe Trp Leu Leu Ser Asp Asn Asp Glu Arg Glu Ile Asp Val

115 120 125

Leu Glu Val Tyr Gly Gly Ala Arg Asp Asp Trp Phe Ala Lys Asn Met

130 135 140

Ser Thr Asn Phe His Val Phe Ile Arg Asp Gln Gln Ser Asn Gln Ile

145 150 155 160

Ile Ser Asp Tyr Asn Asp Gln Thr His Asn Thr Pro Ser Trp Gly Thr

165 170 175

Tyr Trp Arg Glu Gly Phe His Arg Phe Gly Val Tyr Trp Lys Ser Pro

180 185 190

Thr Glu Val Thr Phe Tyr Ile Asp Gly Gln Gln Thr Pro Asp Gly Ser

195 200 205

Trp Ala Gln Val Val Met Lys Asp Lys Asp Tyr Thr Gly Ala Thr Leu

210 215 220

Asn Lys Asn Thr His Asn Met Asp Gln Ser Ala Tyr Ile Ile Ile Asp

225 230 235 240

Thr Glu Asp His Asp Trp Arg Ser Glu Ala Gly Asn Ile Ala Thr Asp

245 250 255

Ala Asp Leu Ala Asp Gly Ser Lys Asn Lys Met Tyr Val Asp Trp Val

260 265 270

Arg Val Tyr Lys Pro Val Asn Ala Ser Asn Thr Asn Ser Val Ser Asn

275 280 285

Gly Val Gln Ile Lys Ala Lys His Ser Gln Lys Cys Ile Asp Ile Thr

290 295 300

Ala Gly Ala Met Ser Asn Gly Ser Tyr Tyr Gln Gln Trp Gly Cys Gly

305 310 315 320

Ser Asp Asn Thr Asn Gln Gln Phe Asn Leu Val Glu Leu Ser Asn Asn

325 330 335

Glu Tyr Ala Ile Ser Ser Gln Leu Ser Gly Leu Cys Met Gln Ile Glu

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Ser Asn Gly Ala Lys Leu Glu Gln Trp Val Cys Asp

355 360 365

His Ala Lys Ala Ser Gln Arg Phe Thr Leu Asn Ser Thr Gly Asp Gly

370 375 380

Tyr Phe Glu Leu Lys Ser Ser Leu Ser Asn Lys Cys Val Asp Ile Ala

385 390 395 400

Gly Lys Leu Gln Thr Asn Gly Ala Asp Ile Val Gln Trp Gln Cys Tyr

405 410 415

Asn Gly Asp Asn Gln Arg Phe Gln Leu Ile Glu

420 425

Claims

1.一种琼胶酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID No.7或10所示。

2.一种核苷酸，其特征在于编码权利要求1所述的琼胶酶。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

5.重组载体，其包含权利要求2-4任一项所述的核苷酸。

6.重组细胞，其包含权利要求5所述的重组载体，所述重组细胞为非动物品种和植物品种。

7.制备权利要求1或2所示的琼胶酶的方法，其特征如下：

经重组细胞诱导发酵，分离纯化获得酶蛋白；

a)将含有权利要求6所述的重组细胞接种到生物反应器中；在存在甘油或葡萄糖作为营养液的条件下，使之在适当的pH和温度下进行发酵；

b)向步骤a)的混合物中加入lac基因的诱导物；

c)使步骤b)的混合物经历8至48小时的诱导期；

d)将在步骤c)中获得的细菌细胞离心，收集上清获得含琼胶酶的发酵液。

8.根据权利要求1所述的琼胶酶在琼胶降解中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征是所述琼胶酶应用为如下用途之一；

1)作为工具酶降解红藻或大分子琼胶产生小分子琼胶糖链；

2)作为工具酶，降解琼胶定向制备不同凝胶度的琼胶；

3)降解新鲜红藻类细胞壁，游离出原生质体或单胞藻，用于养殖或遗传研究；

4)与其他制剂耦合联用，制备富含以特征性琼胶寡糖为主的海洋酵素或者饮品；

5)用于制备化妆品级、医药级的琼胶糖链。