CN109652396A - 一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用。本发明类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。利用大肠杆菌表达系统，可高效可溶性表达该类芽孢杆菌甲壳素酶。然后利用离子液体对蟹壳粉进行预处理，以纯化后的类芽孢杆菌甲壳素酶为催化剂，同未处理的蟹壳粉相比，处理后的蟹壳粉的酶解效率提高了三倍。因此，本发明类芽孢杆菌甲壳素酶及其在酶解离子液体预处理后蟹壳粉中的应用，具有良好的工业应用前景。

Description

一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用。
背景技术
甲壳素酶（Chitinase, EC.3.2.1.12）是一类可水解甲壳素中β-1,4糖苷键的水解酶，主要存在于细菌、真菌及植物中。根据其结构特征，可分为糖苷水解酶（Glycosidehydrolase, GH）18和19两个家族，大部分细菌来源的甲壳素酶属于GH18家族，而GH19家族甲壳素酶主要为植物来源。甲壳寡糖是甲壳素经甲壳素酶水解得到的低聚糖，在医药、食品保健和植物防御等方面的应用已经被发掘，并已成为甲壳素研究的一个热点。在工业上，常用化学法（强酸、强碱）和物理法对甲壳素类生物大分子进行水解以制备甲壳低聚糖，但这两种方法制备的壳寡糖产品性质不稳定、降解条件难以控制，且化学法对环境污染较严重。酶法转化甲壳素为下游壳聚糖及壳寡糖类产品，是降低传统化学法对环境造成污染的一个有效的解决途径。蛋白酶及纤维素酶等非特异性酶的使用，虽然能在一定程度上缓解以上状况，但专一性的不足限制了此类酶制剂的使用。因此，研发高活性的甲壳素酶对壳寡糖类产品的工业生产具有重要意义。
本发明研究人员前期从含甲壳素土壤中筛选出一株产甲壳素酶菌株，通过对其发酵培养基进行优化，使其甲壳素酶产量有了一定的提高。通过对其全基因组进行测序及分析，发现该菌株有多种甲壳素酶基因。因此，为获得高活性的甲壳素酶，我们选择选取其中一种甲壳素基因进行克隆并在大肠杆菌中进行表达。
发明内容
本发明的目的是提供一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用，旨在提供一种经济高效的甲壳素酶，并将其应用于经离子液体预处理的蟹壳粉末的降解中，具有很好的工业化应前景。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下。
一种类芽孢杆菌甲壳素酶，所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.2 所示。
优选的，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
以上所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的制备方法，该方法包括以下步骤：
将核酸序列如SEQ ID NO.1 所示的甲壳素酶基因与表达载体连接，构建重组载体，然后将重组载体转入表达菌株中，诱导并获得可胞内可溶性表达的类芽孢杆菌甲壳素酶。
优选的，所述甲壳素酶基因(PpChi1)来源于类芽孢杆菌菌株CS0611(分类命名为Paenibacillus pasadenensis CS0611，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2014458，保藏日期为 2014年10月8日)，为本实验室筛选得到，其全基因组测序由深圳华大基因完成。通过Illumina Hiseq2500平台测序，样品共产出1,255Mb数据。基因组组分分析后发现，样品paenibacillus的基因组含有5,468个基因，总长度为4,848,621 bp，平均长度887bp，占基因组全长的85.63％。串联重复序列共964个，总长为73,335bp，占基因组全长的1.2952％。小卫星序列701个，微卫星序列52个，tRNA 22个，rRNA 0个。
优选的，所述表达载体为pET-22b、pET-28a及pET-30a中的一种。
优选的，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
优选的，所述诱导是在添加了0.1-1.0 mM IPTG的LB液体培养基中，温度为16-30℃下诱导16-24h。
优选的，所述类芽孢杆菌甲壳素酶制备的具体步骤包括：
（1）将甲壳素酶PpChi1氨基酸序列SEQ ID NO.2提交至生物信息学数据库SignalP 4.1Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)，对其进行信号肽分析；
（2）利用PCR扩增出无信号肽的甲壳素酶目的基因，并将目的基因与表达载体pET-28a连接，构建重组质粒并对其进行测序以验证序列正确性；
（3）将上述重组质粒转化至表达菌株大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导培养获得甲壳素酶；
（4）对胞内表达甲壳素酶PpChi1的大肠杆菌进行破碎，取上清经亲和层析柱纯化，获得可溶性表达的PpChi1；
（5）对上述纯化后的甲壳素酶进行活力测定，并用SDS-PAGE对其纯度进行分析。
以上所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的应用，包括以下步骤：
利用离子液体对蟹壳粉进行预处理，然后以预处理后的蟹壳粉为底物，纯化的类芽孢杆菌甲壳素酶为催化剂，酶解制备具有还原性的可溶性甲壳寡糖。
优选的，所述离子液体为1-烯丙基-3-乙基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐中的一种以上。
优选的，所述预处理条件为：固液比为1-4wt%，预处理温度为80-140℃，时间为0.5-3h。
优选的，所述酶解的体系为：0.1-0.2mg类芽孢杆菌甲壳素酶，10-30mg预处理的蟹壳粉，酶解时间为1-24h。
优选的，所述构建甲壳寡糖制备体系的具体步骤包括：
（1）将一定量的蟹壳粉末与离子液体混合，在特定的温度和时间下进行预处理；
（2）上述预处理的蟹壳粉-离子液体胶状物，经加水沉淀甲壳素，然后对沉淀物进行抽滤分离离子液体溶液；
（3）上述沉淀物经冻干即为预处理后的甲壳素酶底物，回收的离子液体溶液经减压旋蒸浓缩后可再次用于预处理的溶剂；
（4）以上述预处理的蟹壳粉为底物，纯化的甲壳素酶为催化剂，在适宜的温度和缓冲液条件下进行水解反应，以DNS法检测水解混合物中的寡糖含量。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明的甲壳素酶来源于类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis CS0611，使用大肠杆菌BL21(DE3)为表达菌株。此前未有Paenibacillus pasadenensis来源的甲壳素酶被报道，且所用质粒pET-28a为高表达载体，大肠杆菌BL21(DE3)为工业化生产生物催化酶制剂常用菌株。因此，本发明所述甲壳素酶不仅有一定的学术价值，而且可大量生产，作为农业级甲壳寡糖的工业化生产用酶制剂。
（2）本发明所用的蟹壳粉底物为离子液体预处理后的底物，结晶度大大降低，水解效率大大提高。未经处理的蟹壳粉为甲壳素、蛋白质和碳酸钙的混合物，结晶度较高，不易水解，经离子液体预处理后，水解效率提高了3倍。用离子液体直接对蟹壳粉进行预处理，未经过传统的强酸强碱操作过程，降低对环境的影响，且离子液体可回收再利用。因此，本发明所述的甲壳寡糖制备体系具有巨大的应用潜力，对虾蟹壳的高值化应用具有重要意义。
附图说明
图1是本发明所述甲壳素酶PpChi1纯化后的SDS-PAGE结果图。
图2是甲壳素酶PpChi1在不同温度下的活力对比图，最适温度处的活力定义为100%。
图3是甲壳素酶PpChi1在不同pH下的活力对比图，最适pH处的活力定义为100%。
图4a、图4b分别是蟹壳粉末预处理前后的SEM图。
图5是使用甲壳素酶PpChi1水解预处理后蟹壳粉的时间曲线图，图中横坐标为时间，纵坐标为反应产生的还原糖浓度。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
类芽孢杆菌甲壳素酶PpChi1的克隆表达和酶学性质表征
（1）PpChi1的克隆表达与分离纯化
根据基因组测序结果，选取含有信号肽序列的PpChi1的基因序列（Genebank No.：KX431050.1）为研究对象，结合信号肽序列预测结果，设计正向引物Chip1_F: 5’-GACAAGCTTGCGCATCAAACTACAAGATC-3’，反向引物Chip1_R：5’-GTGCTCGAGTTTCAGCTTCCAAAGAGC-3’，以Paenibacillus pasadenensis CS0611的基因组为模板，扩增PpChi,将其连接至表达载体pET-28a,酶切位点为HindIII和XhoI,构建重组质粒pET-28a-Chip1,并将其测序以确定序列正确性。
利用热激法将重组质粒pET-28a-Chip1转化至大肠杆菌BL21(DE3)超级感受态细胞中。
挑取单菌落至50mL LB液体培养基（含50μg/mL卡那霉素），37℃培养过夜，按1%的比例接种至100 mL LB液体培养基中（含50μg/mL卡那霉素），37℃培养至OD=0.6,继续将培养瓶置于17℃培养50min，加入终浓度0.15mM 的IPTG，继续于17℃培养20h，5000g离心5min,收集菌体，并用生理盐水洗去残余培养液，置于-80℃保存备用。
采用超声破碎法破碎菌体，收集上清，利用Hitrap FF Ni亲和层析柱对甲壳素酶进行纯化。首先，用Binding buffer (pH 7.4，50 mM NaH2PO4,500 mM NaCl, 20 mMimidazole）重悬细胞，超声波破碎菌体（300W, 开3s，关5s）。在4℃，10000g条件下离心20min，收集上清粗酶液。将粗酶液上样至柱子，并用Binding buffer洗脱以除去结合力弱的蛋白质，然后用Wash buffer (pH 7.4，50 mM NaH2PO4,500 mM NaCl,250 mM imidazole）梯度洗脱，收集含有高甲壳素酶活性的组分，并用透析袋过夜透析除盐，所得酶液即为PpChi1。得到重组表达的PpChi1,其SDS-PAGE结果如图1所示。由图1可见重组蛋白的分子量为70.2kDa。
（2）甲壳素酶活力测定
甲壳素酶酶活力的测定采用DNS测定反应产物中还原糖的方法，底物为2wt%的胶体甲壳素溶液。向1mL 反应产物中加入2mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却，补水至10mL，测定其在540nm处的吸光值。标准曲线的绘制以N-乙酰葡萄糖胺为标准底物，酶活力单位定义为每分钟产物1μM N-乙酰葡萄糖胺为一个单位。
（3）温度和pH对酶活力的影响
温度的影响。分别将0.5mL PpChi1溶液（0.1 mg/mL，5mM pH7.0 PBS）和0.5 mL 2 wt%胶体甲壳素溶液（pH 5.0 0.2 M 柠檬酸缓冲液）加入10 mL离心管中，然后将反应体系置于不同温度（30,35,40,45,50,55,60,70,80℃）下，磁力搅拌反应30min,加入2mL DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却，补水至10mL,测定540nm处吸光度值。如图2所示，在45℃时，PpChi1的相对活力最高，40℃时的相对活力可达82%，而55℃时的酶活力降低至40%。因此，PpChi1的最适温度为45℃。
pH的影响。分别将0.5mL PpChi1溶液（0.1 mg/mL，5mM pH7.0 PBS）和0.5 mL 2wt%胶体甲壳素溶液加入10 mL离心管中。胶体甲壳素溶液由0.2 M不同pH（pH3-11）的缓冲液配置而成。将反应体系置于45℃的水浴锅中，磁力搅拌30min，加入2mL DNS试剂终止反应，沸水浴5min，冷却，补水至10mL,测定540nm处吸光度值。如图3所示，在pH5.0时，PpChi1的相对活力最高。在pH4-8的缓冲液中，PpChi1可保持40%以上的相对活性。因此，PpChi1的最适pH为5.0
实施例2
PpChi1水解离子液体预处理后蟹壳粉的应用
（1）蟹壳粉的预处理
考察不同离子液体对预处理效果的影响：分别将90mg过100目筛的蟹壳粉加入3mL 1-烯丙基-3-乙基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑四氟氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐4种离子液体中，100℃条件下预处理1h，加水使甲壳素析出，分离固体甲壳素，并冻干沉淀物，即为预处理后的蟹壳粉（treated-CSP1, treated-CSP2,treated-CSP3, treated-CSP4）。取10 mg预处理后蟹壳粉于0.8 mL pH5.0 0.2 M柠檬酸缓冲液，加入0.2 mL PpChi1（0.2 mg）溶液,在45℃及pH5.0条件下，反应30 min，以未经处理的蟹壳粉为对照，比较不同离子液体预处理后蟹壳粉的水解效率。结果发现，treated-CSP3的水解效率最好，同未处理蟹壳粉相比，水解效率提高了2倍。预处理前后的蟹壳粉的扫描电镜图如图4a、图4b所示。图4a为1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐预处理前的蟹壳粉，图4b为预处理后的蟹壳粉。由图可看出，预处理后蟹壳粉的形貌发生变化。
考察蟹壳粉添加量对预处理效果的影响：分别将30、60和90mg过100目筛的蟹壳粉加入3mL1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐离子液体中，100℃条件下预处理1h，加水使甲壳素析出，分离固体甲壳素，并冻干沉淀物，比较不同蟹壳粉添加量对预处理效果的影响。结果发现，固液比为3wt%时的水解效率最高，同未处理的蟹壳粉相比，预处理后的水解效率提高了2.3倍。
（2）PpChi1水解经离子液体预处理蟹壳粉的反应体系
取60mg treated-CSP3于4.8 mL pH5.0 0.2 M柠檬酸缓冲液，并加入1.2 mL PpChi1(1.2 mg)溶液, 反应体系置于40℃水浴锅中，于不同时间取出1mL 反应液，测定反应液中还原糖的浓度。同时，以未处理的蟹壳粉为对照。反应过程曲线如图5所示，反应8h后，反应液中还原糖浓度达到最大。同未处理的蟹壳粉相比，预处理的蟹壳粉水解效率提高至3倍，水解效率可达31%。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种类芽孢杆菌甲壳素酶及其制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1842
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌甲壳素酶(Paenibacillus pasadenensis)
<400> 1
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Ala Gly Ala Ala Gly Gly Gly Cys Ala Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala
980 985 990
Cys Thr Thr Cys Thr Ala Thr Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Ala Ala
995 1000 1005
Gly Cys Gly Ala Ala Cys Thr Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ala Cys Ala
1010 1015 1020
Ala Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Cys Gly Cys Gly
1025 1030 1035 1040
Cys Thr Ala Thr Thr Gly Gly Ala Ala Thr Gly Ala Thr Gly Cys Cys
1045 1050 1055
Gly Cys Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Cys Cys Thr Thr Ala Cys Cys
1060 1065 1070
Thr Gly Thr Ala Cys Ala Ala Thr Cys Cys Gly Ala Cys Cys Ala Ala
1075 1080 1085
Cys Gly Gly Cys Ala Cys Gly Thr Ala Cys Ala Thr Cys Ala Gly Cys
1090 1095 1100
Thr Ala Thr Gly Ala Cys Gly Ala Thr Gly Thr Thr Cys Ala Ala Thr
1105 1110 1115 1120
Cys Cys Thr Thr Cys Gly Ala Cys Thr Thr Cys Ala Ala Gly Ala Cys
1125 1130 1135
Gly Ala Gly Cys Thr Ala Cys Cys Thr Gly Ala Ala Ala Thr Cys Cys
1140 1145 1150
Ala Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Gly
1155 1160 1165
Cys Gly Ala Thr Gly Thr Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Cys
1170 1175 1180
Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys
1185 1190 1195 1200
Ala Ala Gly Ala Cys Gly Cys Thr Gly Cys Thr Gly Ala Ala Cys Ala
1205 1210 1215
Ala Gly Cys Thr Gly Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr Cys Thr
1220 1225 1230
Cys Gly Gly Cys Thr Ala Thr Gly Cys Gly Gly Gly Cys Gly Cys Ala
1235 1240 1245
Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly Gly Thr Ala Cys
1250 1255 1260
Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly
1265 1270 1275 1280
Cys Gly Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Ala
1285 1290 1295
Ala Cys Cys Gly Cys Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Cys Gly
1300 1305 1310
Thr Cys Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Ala Cys Cys Gly Ala Cys
1315 1320 1325
Gly Ala Cys Ala Ala Gly Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Ala
1330 1335 1340
Ala Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly
1345 1350 1355 1360
Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Gly Gly
1365 1370 1375
Cys Ala Cys Gly Thr Gly Cys Ala Cys Gly Gly Thr Gly Ala Cys Gly
1380 1385 1390
Gly Cys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Cys Thr Cys Gly Ala Cys Gly Gly
1395 1400 1405
Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ala Cys Gly Gly Gly Cys Gly Gly
1410 1415 1420
Ala Cys Ala Ala Ala Ala Gly Gly Cys Thr Thr Cys Cys Thr Ala Cys
1425 1430 1435 1440
Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Cys Gly Ala Thr Thr Thr Ala Cys Gly
1445 1450 1455
Ala Ala Gly Cys Gly Ala Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Ala Cys
1460 1465 1470
Cys Cys Ala Ala Gly Gly Cys Gly Ala Thr Cys Gly Thr Cys Cys Gly
1475 1480 1485
Gly Ala Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Gly Ala Gly Cys Gly Ala
1490 1495 1500
Ala Cys Gly Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly Cys
1505 1510 1515 1520
Ala Gly Cys Cys Gly Gly Cys Ala Cys Thr Thr Gly Cys Gly Gly Ala
1525 1530 1535
Ala Cys Gly Ala Cys Ala Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys
1540 1545 1550
Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys
1555 1560 1565
Gly Cys Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Cys Gly Cys Gly
1570 1575 1580
Ala Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys Gly Cys Cys Ala Ala Gly Cys Gly
1585 1590 1595 1600
Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Ala Ala Cys Cys Gly Ala Gly
1605 1610 1615
Cys Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Cys Gly Cys Cys Gly
1620 1625 1630
Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Thr Ala Cys Gly Cys
1635 1640 1645
Cys Ala Ala Gly Cys Gly Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Thr Ala Cys
1650 1655 1660
Ala Cys Cys Thr Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys Cys Gly
1665 1670 1675 1680
Ala Cys Gly Cys Cys Gly Thr Cys Cys Gly Cys Ala Ala Cys Gly Cys
1685 1690 1695
Cys Ala Gly Gly Cys Gly Cys Cys Thr Cys Thr Gly Cys Cys Thr Gly
1700 1705 1710
Gly Gly Cys Thr Gly Cys Ala Gly Gly Cys Gly Thr Ala Gly Cys Gly
1715 1720 1725
Thr Ala Thr Ala Ala Ala Gly Cys Gly Gly Gly Ala Gly Ala Thr Gly
1730 1735 1740
Thr Cys Gly Thr Gly Ala Cys Thr Thr Ala Cys Ala Gly Cys Gly Gly
1745 1750 1755 1760
Cys Ala Ala Gly Ala Cys Gly Thr Ala Thr Gly Cys Cys Thr Gly Cys
1765 1770 1775
Cys Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Ala Cys Ala Cys Cys Thr
1780 1785 1790
Cys Gly Cys Thr Cys Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly Gly Ala
1795 1800 1805
Gly Cys Cys Gly Gly Cys Thr Ala Cys Gly Ala Cys Thr Cys Cys Cys
1810 1815 1820
Gly Cys Thr Cys Thr Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Cys Thr Gly Ala
1825 1830 1835 1840
Ala Ala
<210> 2
<211> 614
<212> PRT
<213> 类芽孢杆菌甲壳素酶(Paenibacillus pasadenensis)
<400> 2
Ala Ser Asn Tyr Lys Ile Val Gly Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Ala Tyr
1 5 10 15
Gly Arg Ala Tyr Asn Val Thr Asp Ile Asp Ala Ser Lys Met Asn Val
20 25 30
Ile Asn Tyr Ala Phe Ala Asp Ile Cys Trp Asn Gly Lys His Gly Asn
35 40 45
Pro Asp Pro Thr Gly Pro Asn Pro Thr Thr Trp Ser Cys Gln Asn Glu
50 55 60
Ala Gly Gln Ala Ile Asn Val Pro Asn Gly Thr Val Val Leu Gly Asp
65 70 75 80
Pro Trp Ile Asp Ala Gln Lys Ser Phe Gly Asp Asp Lys Trp Asp Asp
85 90 95
Pro Ile Lys Gly Asn Leu Lys Gln Leu Trp Lys Leu Lys Asp Lys Asn
100 105 110
Pro Asp Leu Lys Thr Val Ile Ser Ile Gly Gly Trp Thr Trp Ser Asn
115 120 125
Arg Phe Ser Asp Val Ala Ala Thr Ala Ala Thr Arg Glu Val Phe Ala
130 135 140
Asn Ser Ser Val Asp Phe Ile Arg Lys Tyr Lys Met Asp Gly Val Asp
145 150 155 160
Leu Asp Trp Glu Tyr Pro Val Ser Gly Gly Leu Asp Gly Asn Ser Tyr
165 170 175
Arg Pro Glu Asp Lys Gln Asn Tyr Val Leu Leu Leu Gln Lys Ile Arg
180 185 190
Glu Lys Leu Asp Ala Ala Glu Lys Ala Asp Gly Lys Asp Tyr Leu Leu
195 200 205
Thr Ile Ala Ser Gly Ala Gly Pro Thr Tyr Ile Gln Asn Asn Asp Leu
210 215 220
Ala Gly Ile Ala Ser Ile Val Asp Trp Ile Asn Ile Met Thr Tyr Asp
225 230 235 240
Phe Asn Gly Ser Trp Asn Lys Thr Ser Gly His Asn Ala Pro Leu Tyr
245 250 255
Tyr Asp Thr Ala Ala Ala Thr Ser Gly Leu Thr Asp Pro Gln Asn Phe
260 265 270
Asn Ile Asp Lys Ala Val Thr Thr Tyr Leu Ala Lys Gly Val Pro Ala
275 280 285
Ser Lys Leu Val Leu Gly Met Ala Phe Tyr Gly Arg Gly Trp Gly Gly
290 295 300
Cys Pro Thr Ala Gly Asn Gly Gln Tyr Gln Val Cys Ala Gly Ile Ser
305 310 315 320
Ser Thr Gly Thr Trp Glu Lys Gly Ser Tyr Asp Phe Tyr Asp Leu Glu
325 330 335
Ala Asn Tyr Ile Asn Lys Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Trp Asn Asp Ala
340 345 350
Ala Lys Val Pro Tyr Leu Tyr Asn Pro Thr Asn Gly Thr Tyr Ile Ser
355 360 365
Tyr Asp Asp Val Gln Ser Phe Asp Phe Lys Thr Ser Tyr Leu Lys Ser
370 375 380
Lys Gly Leu Ala Gly Ala Met Phe Trp Glu Thr Ser Gly Asp Arg Asn
385 390 395 400
Lys Thr Leu Leu Asn Lys Leu Ala Ser Asp Leu Gly Tyr Ala Gly Ala
405 410 415
Thr Pro Thr Pro Val Pro Thr Ala Thr Pro Ser Ala Thr Pro Thr Pro
420 425 430
Thr Ala Thr Pro Ser Val Thr Pro Thr Pro Thr Thr Ser Pro Ser Ala
435 440 445
Thr Pro Thr Pro Ser Ala Thr Pro Thr Pro Gly Thr Cys Thr Val Thr
450 455 460
Ala Trp Ser Ser Thr Ala Val Tyr Thr Gly Gly Gln Lys Ala Ser Tyr
465 470 475 480
Asn Gly Thr Ile Tyr Glu Ala Lys Trp Trp Thr Gln Gly Asp Arg Pro
485 490 495
Asp Leu Ser Gly Ala Asn Gly Pro Trp Lys Ala Ala Gly Thr Cys Gly
500 505 510
Thr Thr Arg Pro Thr Pro Ser Ala Thr Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ala
515 520 525
Thr Pro Thr Pro Ser Ala Thr Pro Lys Pro Ser Ala Thr Pro Thr Pro
530 535 540
Thr Ala Thr Pro Thr Pro Ser Ala Thr Pro Thr Pro Thr Ala Thr Pro
545 550 555 560
Thr Pro Ser Ala Thr Pro Gly Ala Ser Ala Trp Ala Ala Gly Val Ala
565 570 575
Tyr Lys Ala Gly Asp Val Val Thr Tyr Ser Gly Lys Thr Tyr Ala Cys
580 585 590
Leu Gln Pro His Thr Ser Leu Ala Gly Trp Glu Pro Ala Thr Thr Pro
595 600 605
Ala Leu Trp Lys Leu Lys
610

Claims (10)

1.一种类芽孢杆菌甲壳素酶，其特征在于，所述类芽孢杆菌甲壳素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
2.根据权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶，其特征在于，编码该类芽孢杆菌甲壳素酶的基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.制备权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
将核酸序列如SEQ ID NO.1 所示的甲壳素酶基因与表达载体连接，构建重组载体，然后将重组载体转入表达菌株中，诱导并获得可胞内可溶性表达的类芽孢杆菌甲壳素酶。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表达载体为pET-22b、pET-28a及pET-30a中的一种。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表达菌株为大肠杆菌BL21(DE3)。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述诱导是在添加了0.1-1.0 mMIPTG的LB液体培养基中，温度为16-30℃下诱导16-24h。
7.权利要求1所述的一种类芽孢杆菌甲壳素酶的应用，其特征在于，包括以下步骤：
利用离子液体对蟹壳粉进行预处理，然后以预处理后的蟹壳粉为底物，纯化的类芽孢杆菌甲壳素酶为催化剂，酶解制备具有还原性的可溶性甲壳寡糖。
8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述离子液体为1-烯丙基-3-乙基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑氯盐、1-丁基-3-甲基咪唑醋酸盐和1-乙基-3-甲基咪唑醋酸盐中的一种以上。
9.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述预处理条件为：固液比为1-4wt%，预处理温度为80-140℃，时间为0.5-3h。
10.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述酶解的体系为：0.1-0.2mg类芽孢杆菌甲壳素酶，10-30mg预处理的蟹壳粉，pH5.0 0.2 M柠檬酸缓冲液，酶解时间为1-24h。
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