CN116004584B

CN116004584B - 一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用

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Publication number: CN116004584B
Application number: CN202210984055.5A
Authority: CN
Inventors: 陈桃; 赵艳丽; 谢甲涛; 姜道宏; 付艳苹; 程家森
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2022-08-17
Filing date: 2022-08-17
Publication date: 2024-04-02
Anticipated expiration: 2042-08-17
Also published as: CN116004584A

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用。本所述几丁质酶PbChia1来源于根肿菌，体外表达的PbChia1蛋白可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发，延缓根肿菌的发育，缓解油菜根肿病根肿的症状，生防效果为61.29％。超表达PbChia1的转基因植物可以显著降低根肿菌在植物内的定殖率，延缓根肿菌的发育，对根肿病的生防效果高达62.3％。转基因植株对活体营养型病原丁香假单胞菌PstDC3000及死体营养型病原核盘菌和立枯丝核菌均显示抗病能力。表明根肿菌几丁质酶PbChia1可为根肿病的绿色防控提供新基因资源。

Description

一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用。

背景技术

十字花科根肿病是世界范围的重要植物病害，该病害由原生动物根肿菌(Plasmodiophora brassicae)引起，主要危害植物根部。根肿菌不仅侵染油菜，而且还侵染十字花科蔬菜，如白菜、花菜、萝卜、包菜、西兰花等。根肿病是典型的土传病害，防治困难，一旦有根肿病危害的地块基本很难清除，因此迫切需要高效的根肿病绿色防控技术。

几丁质是n-乙酰葡糖胺通过β连接聚合而成的结构同多糖，主要存在于昆虫和甲壳类动物的外骨骼，真菌和硅藻的细胞壁中，有的原生动物中也含有几丁质。而植物和高等动物中不含有几丁质，几丁质代谢过程中的合成酶和水解酶都可以设计为绿色药剂的理想分子靶标，但是目前对于根肿菌中几丁质酶的代谢途径研究并不深入，需要开发新的功能基因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用，无论是自体来源的几丁质酶还是外源的几丁质酶都使得植物对于根肿菌的抗性增强，为根肿病的绿色防控提供新基因资源。

本发明提供了一种抗根肿菌的几丁质酶，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明还提供了一种编码上述几丁质酶的基因。

优选的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了一种体外表达上述几丁质酶的原核表达载体。

优选的，所述原核表达载体的基础载体包括pGEX-6p-1和/或pET-28a。

本发明还提供了上述几丁质酶在提高作物根肿病抗性中的应用。

优选的，所述几丁质酶的来源包括自体表达和/或体外表达。

优选的，所述根肿病抗性包括抑制休眠根肿菌孢子萌发、延缓根肿菌的发育和/或缓解根肿病根肿症状。

本发明还提供了一种通过创制超表达上述基因的转基因株系在获取抗根肿病材料中的应用。

优选的，抗根肿病材料的性状包括：显著降低根肿菌在植物内的定殖率和/或延缓根肿菌的发育。

有益效果：本发明利用几丁质pull-down和LC-MS分析筛选和鉴定出一种来源于根肿菌的几丁质酶PbChia1，体外表达的PbChia1蛋白可以抑制根肿菌休眠孢子的萌发，延缓根肿菌的发育，缓解油菜根肿病根肿的症状，生防效果为61.29％。超表达PbChia1的转基因植物可以显著降低根肿菌在植物内的定殖率，延缓根肿菌的发育，对根肿病的生防效果高达62.3％。转基因植株对活体营养型病原丁香假单胞菌Pst DC3000及死体营养型病原核盘菌和立枯丝核菌均显示抗病能力。本发明证实表明超表达PbChia1的转基因植物使植物获得了较广的抗病能力，说明几丁质酶PbChia1具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为PbChia1基因结构、表达分析及信号肽的功能验证，其中A：根肿菌ZJ-1菌株PbChia1基因结构图；B：根肿菌ZJ-1菌株PbChia1基因表达模式；C：利用酵母系统验证根肿菌ZJ-1菌株PbChia1蛋白信号肽功能；

图2为PbChia1蛋白体外几丁质酶活性，其中A和C为PbChia1蛋白几丁质酶活的检测；B和D为PbChia1蛋白结合几丁质的能力检测；

图3为PbChia1蛋白体外抑制根肿菌的休眠孢子的萌发，其中A：PbChia1几丁质酶处理3d后，根肿菌休眠孢子的浓度，PB为阴性对照，PB+PbChia1为处理组，用PbChia1处理根肿病的休眠孢子；B：PbChia1几丁质酶处理3d后，根肿病休眠孢子萌发率的统计；one-wayANOVA，p<0.05，n＝3；C：根肿病休眠孢子DAPI染色，标尺大小为10μm；

图4为PbChia1在体外防治油菜根肿病，其中A为用几丁质酶处理水培油菜的根部表型，植株照片拍摄于处理后30d，标尺大小为1cm；B为根肿菌接种30dpi 24-28株油菜的不同发病等级的百分率和病情指数统计，t-test，p<0.05；C为qPCR检测病根中根肿菌的含量，内参基因为油菜的Actin基因，以根肿菌Actin基因指示根肿菌含量，n＝3，one-wayANOVA检验分析差异性，p<0.05，试验重复3次，结果相似；

图5为PbChia1处理油菜根肿病的含菌比例，其中A：石蜡切片观察接种根肿菌30d的油菜病根，红色五角星标记根肿菌，标尺＝1um；B：根细胞内含菌的比例；

图6为超表达PbChia1转基因拟南芥的生长表型，其中A：超表达PbChia1转基因拟南芥生长表型；B：Westernblot鉴定阳性转基因植株；C：超表达PbChia1转基因拟南芥3d根毛数量的统计，n＝6；D：超表达PbChia1转基因拟南芥10d根毛数量的统计，n＝11；E：PbChia1转基因拟南芥10d根长的统计，n＝6；F：超表达PbChia1转基因拟南芥200粒种子重量的测定，n＝6；one-wayANOVA，p<0.05；

图7为超表达PbChia1拟南芥显示抗根肿的表型，其中A：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌21d后的根部表型，标尺大小为1cm；B：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌21d后的病情指数统计，n＝40；C：qPCR检测超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌21d后根肿菌的含量，n＝3；one-wayANOVA检验差异性，p<0.05；

图8为超表达PbChia1可以提高植株的存活率和产量，其中A：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌后的表型，标尺大小为1cm；B：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌30d和55d后的存活率统计；C：超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌后收获种子并进行称量统计；one-wayANOVA检验分析差异性，p<0.05，n＝3；

图9为超表达PbChia1转基因植株与野生型植株植物根部的根毛和皮层感染的比较(标尺＝10μm)，其中A：台盼蓝染色后，用光学显微镜拍摄的拟南芥根毛和皮层侵染阶段照片，接种3d，用台盼蓝染色观察根毛内形成初级游动孢子囊的百分率；接种12d，观察根毛内和皮层内形成游动孢子囊的百分比；B：PbChia1转基因植物、Col-0和EV载体对照根毛侵染和皮层侵染的定殖率；PbChia1转基因植物、Col-0和EV植物超过15株的根，切成1-2厘米的片段，每个样品总共观察和计数大约100个根段，以统计侵染率；误差值代表从三个生物学重复获得的实验值的SD，p<0.05，one-wayANOVA；

图10为透射电镜观察根肿菌的发育状态(标尺＝2μm)，转基因植株和对照植株接种根肿菌21d后，透射电镜观察细胞内根肿菌的发育状态，CW＝plant cell wall，植物细胞壁；Nu＝nucleus，细胞核；N＝nucleus without nucleolus，细胞核无核仁；

图11为野生型植株和超表达PbChia1植株接种PstDC30004 d后的表型和数目，其中A：野生型植株和超表达PbChia1植株接种Pst DC30004 d后的表型；B：接种0d和4d后，植物叶片中细菌数量的统计；one-wayANOVA检验差异性，p<0.05；

图12为野生型植株和超表达PbChia1植株接种核盘菌198030h后的表型和病斑面积统计，其中A：表型观察；B：病斑面积统计；每个样品10个叶片，病斑面积用平均值±S.E；one-wayANOVA检验差异性，字母相同显示没有显著性差异，p<0.05；

图13为超表达PbChia1植株接种立枯丝核菌3d后的表型和病情指数，其中A：野生型拟南芥和超表达PbChia1转基因植株接种立枯丝核菌3天后的表型；B：野生型拟南芥和超表达PbChia1转基因植株接种立枯丝核菌3天后的病情指数，n＝12，one-wayANOVA检验差异性，p<0.05。

具体实施方式

本发明提供了一种抗根肿菌的几丁质酶，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示：

本发明所述几丁质酶的氨基酸序列中，加粗部分表示信号肽。

本发明所述几丁质酶优选来源于根肿菌，在实施例中共收集接种根肿菌30天后肿大的油菜根部组织，提取总蛋白，用胶体几丁质进行吸附沉淀，SDS-PAGE电泳后切取目标胶条进行分析。利用胶体几丁质结合几丁质酶的原理，结合LC-MS/MS技术，筛选出15个几丁质酶，其中14个来源于寄主油菜，1个来源于根肿菌，其中根肿菌的蛋白编号为PlasB_10400，命名为PbChia1。本发明实施例中，还对根肿菌PbChia1蛋白进行结构功能验证，证实了其信号肽有分泌功能。

本发明还提供了一种编码上述几丁质酶的基因。

本发明所述基因的CDS序列优选如SEQ ID NO.2所示。

本发明优选根据基因组内PbChia1的核苷酸序列，设计基因的全长引物，PCR扩增获得PbChia1基因全长如SEQ ID NO.2所示，PbChia1基因全长为1203bp，编码400个氨基酸，含有一个信号肽和GH18结构域。本发明实施例还利用酵母的表达系统证明所述蛋白具有分泌功能；同时也对PbChia1蛋白酶学性质的研究，体外能结合几丁质，并且在37℃具有较高的几丁质酶活性，表明PbChia1蛋白是一个典型的分泌型的几丁质酶，并且在根肿菌的各个发育阶段表达量都比较高。

本发明所述全长引物优选包括PbChia1-F(SEQ ID NO.3):5'-TGCTCTAGAATGCGGTTCGGCAGCGTTTT-3'和PbChia1-R(SEQ ID NO.4):5'-CGCGGATCCTCAGCACAGTTCATCTCGAATA-3'。本发明所述PCR扩增的程序优选包括：95℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸1min，循环34次；72℃最后延伸5min。本发明所述PCR扩增的反应体系以20μL计，优选包括：ddH₂O 8μL，2×PCR MasterMix(含Taq酶和dNTP)10μL，10μΜ的引物PbChia1-F 0.5μL，10μΜ的引物PbChia1-R 0.5μL，cDNA模板(50ng/μL)1μL。本发明在进行所述PCR扩增后，优选还包括对PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像仪拍照，将大小鉴定正确的PCR产物应用PCR回收试剂盒回收，由武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。

本发明可利用原核表达载体对所述几丁质酶PbChia1进行体外表达，所述原核表达载体的基础载体优选包括pGEX-6p-1和/或pET-28a。本发明优选将编码所述几丁质酶PbChia1的核苷酸序列插入所述基础载体，从而构建得到所述原核表达载体。在本发明中，将SEQ ID NO.2所示的序列插入的基础载体的多克隆位点相同，优选均为BamHⅠ。

本发明还提供了包含上述原核表达载体的重组菌，所述重组菌优选以大肠杆菌为基础菌，将所述原核表达载体转化入基础菌中，验证阳性后即得所述重组菌。本发明对所述转化的方法并没有特殊限定。

本发明优选利用IPTG诱导的方法，对构建得到的阳性重组菌进行几丁质酶PbChia1的原核表达。本发明可根据原核表达载体的标签类型选择不同的纯化方法，如GST标签蛋白的纯化或His标签蛋白的纯化等。

本发明所述几丁质酶的来源优选包括自体表达和/或体外表达。本发明所述体外表达优选为上述原核表达，所述自体表达优选包括在植株中表达或超表达上述几丁质酶PbChia1。本发明所述根肿病抗性优选包括抑制休眠根肿菌孢子萌发、延缓根肿菌的发育和/或缓解根肿病根肿症状。

在本发明实施例中，利用上述原核表达并纯化的PbChia1蛋白，处理根肿菌休眠孢子1d～3d，可以使休眠孢子数量下降61.40％～71.20％；同时抑制32.10％的根肿菌休眠孢子的萌发；用该蛋白处理水培的油菜，根肿菌的生防效果可以达到61.29％，同时抑制根内根肿菌的发育状态，显著减少病根内病菌的含量，缓解病症。这些结果表明PbChia1蛋白不仅影响根肿菌休眠孢子的萌发，影响根肿菌在根细胞内的生长和发育，也可以降解休眠孢子，结合该基因的表达情况，推测PbChia1蛋白在根肿菌的整个生命周期都行使重要的生理功能。

本发明在实施例中，还构建了超表达PbChia1基因的转基因拟南芥，与对照植株在根、根毛、叶及种子的产量等表型上均无明显差异，但是超表达PbChia1基因的转基因拟南芥呈现很强的抗病表型。首先，在抗根肿病表型上，可以使根肿菌在根毛细胞内或者根皮层细胞内的定殖率下降60％～75％；同时使根细胞内的根肿菌的发育迟缓，显著缓解根部肿大的表型；转基因植株的防效可以高达62.30％，后期转基因植株的存活率可以提高2.4倍，产量增加1倍。PbChia1转基因植株可以显著提高植物对半活体营养型细菌丁香假单胞菌Pst DC3000、死体营养型真菌核盘菌1980和立枯丝核菌的抗性。这些结果表明超表达PbChia1的转基因植物使植物获得了较广的抗病能力，说明几丁质酶PbChia1具有很好的应用前景。

本发明对所述转基因株系的创制方法并没有特殊限定，以本领域中任何能将外源基因导入目标植株并能稳定表达的方式均可，实施例中优选利用农杆菌介导的方法转化拟南芥，更优选为花序浸渍法。

本发明所述抗根肿病材料的性状，优选包括：显著降低根肿菌在植物内的定殖率和/或延缓根肿菌的发育。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种抗根肿菌的几丁质酶及编码基因和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

值得注意的是，本发明实施例中所用的材料，如非特殊说明，均为常规市售产品。

1、植物材料：华双四号油菜；拟南芥野生型(Arabidopsis thaliana，Col-0)

华双四号油菜种子用2％NaClO表面消毒处理10min，用无菌蒸馏水清洗6次，处理后的油菜种子置于湿润的滤纸上萌发，放于人工植物光照培养室，培养温度设定为22℃，16h光照和8h黑暗交替，75％相对湿度，一周后选取生长健壮大小一致的油菜幼苗移栽到营养土中，继续放于人工植物光照培养室中种植，大约3d浇水1次，必要时杀虫处理，维持植株的正常生长。

拟南芥种子用2％NaClO表面消毒处理8min，用无菌蒸馏水清洗6次，处理后的拟南芥种子点在1/2MS培养基上，培养条件与油菜相同，7d后，选取生长健壮，大小一致的拟南芥幼苗移栽到营养土中，继续放于人工植物光照培养室中种植，管理模式与油菜相似。

2、植物营养土配方：芬兰凯吉拉泥炭土：江苏培蕾基质：蛭石＝8:4:1。

3、供试载体：拟南芥超量表达载体pCNF3-2×35S:MCS-FLAG(公开在文章：Acerato-plataninprotein SsCP1 targets plant PR1 and contributes to virulenceof Sclerotinia sclerotiorum)；大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1和pET-28a。

4、供试菌株：用于普通转化的大肠杆菌Eschrichia coli为MG1061；用于原核表达的大肠杆菌为Rosetta(DE3)；用于病原菌接种实验的菌株为丁香假单胞菌番茄致病变种(Pseudomonas syringaepv.tomato DC3000，PstDC3000)。真菌菌株核盘菌菌株1980(ATCC18683)，从华中农业大学油菜实验田中的病株分离获得的立枯丝核菌株(Rhizoctoniasolani)。根肿菌ZJ-1菌株。

5、主要培养基

马铃薯葡萄糖液体培养基(Potato dextrose broth，PDB)：200g马铃薯，葡萄糖20g，补蒸馏水至1L。1L中添加20g琼脂即为马铃薯葡萄糖固体培养基。

LB培养基：蛋白胨(Tryptone)10g，酵母粉(Yeast extract)5g，NaCl 5g，用NaOH调pH至7.0，补水至1L。

KB培养基：蛋白胨NO.310g，K₂HPO₄·3H₂O 0.75g，MgSO₄0.75 g，50％甘油10mL，补水至1L，121℃高压灭菌15～30min；固体培养基则还需要加入13g琼脂。

TSA培养基：胰蛋白胨(Bacto-tryptone)10g，蔗糖(Sucrose)10g，谷氨酸(Glutamic acid)1g，定容至1L，121℃高压灭菌15min～30min。固体培养基则还需要加入13g琼脂。

霍格兰营养液配方：大量元素(四水硝酸钙945mg/L，硝酸钾506mg/L，硝酸铵80mg/L，磷酸二氢钾136mg/L，硫酸镁493mg/L，微量元素5mL/L，铁盐2.5mL/L，pH 6.0)。微量元素(硫酸镁493mg/L，硼酸6.2mg/L，硫酸锰22.3mg/L，硫酸锌8.6mg/L，钼酸钠0.25mg/L，硫酸铜0.025mg/L，氯化钴0.025mg/L)。铁盐(七水硫酸亚铁2.78g，乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)3.73g，蒸馏水500mL，pH 5.5)。

本发明实施例中，所有数据均运用Excel 2019和GraphPad Prism 8进行数据处理；运用Origin 2018进行绘图。所有试验均重复3次及以上。

实施例1几丁质酶的筛选

1、植物蛋白的提取

采集接种根肿菌(Plasmodiophora brassicae)ZJ-130天的油菜肿大的根部，于液氮中迅速研磨2～3次至粉末状，称取约20g粉末转移到加有40mL预冷的Western及IP裂解液(Beyotime，China，货号P0013)的50mL离心管中，另外加入PMSF使终浓度达到1mmol/L，涡旋振荡使粉末均匀悬浮，冰上静置裂解30min，4℃，8000r/mim离心15min，上清转移至另一新的50mL离心管，重复离心2次，上清由0.22μm的细菌过滤器再次除杂后备用。

1.2.2胶体几丁质的制备及Chitinpull-down试验

胶体几丁质的制备：称取2g商品化的几丁质粉末(Sigma C7170)，缓慢加入到60mL浓HCl中，于4℃剧烈搅拌过夜。将上述混合物加入到2L冰冷的95％乙醇中，快速搅拌后于室温(25℃)放置过夜。4℃，5000r/min离心20min收集沉淀。利用无菌蒸馏水反复冲洗沉淀，直到pH到7.0。加入100mL无菌蒸馏水，制备2％的胶体几丁质溶液，于4℃保存备用。

参考文献(Liu et al 2012)的描述的Chitin pull-down试验方法，进行植物组织总蛋白的Chitinpull-down试验：准备好的植物蛋白中加入2mL 2％胶体几丁质，4℃缓慢摇动孵育3h。4℃，8000r/min离心5min，去上清，加入1mL预冷的Western及IP裂解液冲洗，重复3～5次，加入100μL 5×Loading Buffer，沸水浴10min，12000r/min离心10s，SDS-PAGE蛋白电泳后，用考马斯亮蓝(R-250)染色30min，在脱色液中脱色过夜；切取胶条，送样，进行Trpsin酶解，及液相串联质谱liquid chromatography coupled with tandem massspectrometry(LC-MS/MS)的数据采集和分析，LC-MS/MS的检测和分析由华中农业大学生命科学技术学院蛋白质谱平台进行。

筛选结果如表1所示，共筛选出15个几丁质酶，其中14个来源于寄主油菜，1个来源于根肿菌，根肿菌的蛋白编号为PlasB_10400，命名为PbChia1。

表1 LC-MS/MS筛选几丁质酶结果

实施例2 PbChia1的克隆与原核表达

1、根据基因组内PbChia1的核苷酸序列，设计基因的全长引物(SEQ ID NO.3和SEQID NO.4)。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s；61℃退火30s；72℃延伸1min，循环35次，72℃最后延伸5min。PCR反应体系(20μL)：ddH2O 8μL，2×PCR MasterMix(含Taq酶和dNTP)10μL，10μΜ的引物PbChia1-BamHI-F 0.5μL，10μΜ的引物PbChia1-BamHI-R 0.5μL，cDNA模板(50ng/μL)1μL。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，利用凝胶成像仪拍照。大小鉴定正确的PCR产物应用PCR回收试剂盒回收，由武汉天一辉远生物科技有限公司进行测序。PCR扩增获得PbChia1基因全长。PbChia1基因全长(SEQ ID NO.2)为1203bp，编码400个氨基酸(SEQ ID NO.1)，1-23氨基酸编码一个信号肽(Signal peptide)，据此预测PbChia1蛋白是一个分泌蛋白；31-386编码一个GH18结构域(Glyco_18domain)(图1中A)。

在实施例1中接种根肿菌的油菜根部，根据侵染的不同时期分别取样，利用qPCR的方法检测PbChia1的表达量，所有q-PCR实验相关反应体系采用SYBR Green Real-Time PCRMaster Mix(Bio-Rad,California,USA)，20μL反应体系的配制根据产品说明书，在配套仪器CFX96TM real-time PCR detection system(Bio-Rad)上运行荧光定量实验，以拟南芥的Actin基因为内参，扩增内参基因的引物为：Atactin-F(SEQ ID NO.5):5’-AATCCACGAGACAACCTA-3’和Atactin-R(SEQ ID NO.6):5’-AGCGATACCTGAGAACATA-3’，根肿菌Actin基因：Pbactin-F(SEQ ID NO.7):5’-CACCGACTACCTGATGAA-3’和Pbactin-R(SEQ IDNO.8):5’-CAGCTTCTCCTTGATGTC-3’。利用根肿菌Actin指示根肿菌含量，计算拟南芥(以拟南芥Actin基因为模板的扩张曲线Ct值)中根肿菌的含菌量(以根肿菌Actin基因为模板的扩张曲线Ct值)。结果如图1中B所示。PbChia1基因在侵染的各个时期均有表达。

2、PbChia1蛋白的分泌性功能验证

采用酵母菌的信号肽序列陷阱系统来验证PbChia1蛋白的分泌性功能(Song etal 2015)。将编码PbChia1蛋白基因的信号肽区域全长克隆至酵母表达载体pSUC2的EcoRI和XhoI之间(该质粒中包含有截短的酵母转化酶基因SUC2，其N端缺失起始密码和信号肽序列)。阳性对照为将编码已验证效应子蛋白Avr1b的基因信号肽区域(GenBank:AF449625.1)克隆至载体pSUC2；阴性对照为空载体pSUC2。

信号肽区域全长克隆引物：上游(SEQ ID NO.9)：5’CCGGAATTCATGCGGTTCGGCAGCGTTTT 3’；下游(SEQ ID NO.10)：5’CCGCTCGAGCGTATAGTACGCGCATACGA 3’。

酵母突变型菌株YTK12分泌性的转化酶功能缺陷，而该转化酶是酵母菌利用棉子糖(三糖)作为碳源所必须的，因此突变型菌株YTK12不能在含有棉子糖的选择性培养基(YPRAA培养基，棉子糖代替蔗糖)生长。利用PEG LiAc转化酵母细胞方法将重组pSUC2质粒和阴性对照质粒热击转化至YTK12菌株中。转化后的YTK12菌株均匀涂于CMD-W(minus Trp)培养基上，30℃培养直至培养基上有单克隆出现。挑取酵母转化菌株的单克隆至CMD-W液体培养基中，30℃，220r/min摇培至菌液浑浊，用PbChia1基因的特有引物(SEQ ID NO.9和SEQID NO.10)PCR验证酵母转化菌株的阳性。阳性酵母菌株进一步通过转接至YPRAA培养基上验证其具有分泌性转化酶活性。最后利用阳性酵母菌株可以将2,3,5-三苯基氯化四氮唑(TTC)还原至不可溶的红色三苯甲月替的特性来进一步验证其分泌性转化酶活性。

利用酵母菌的分泌转化酶系统验证PbChia1信号肽的分泌性，结果如图1中C所示，结果证实在CMD-W和YPRAA培养基上，转入pSUC2和PbChia1-sp重组质粒的酵母阳性菌株均能够生长，也能使TCC显红色，表明根肿菌PbChia1蛋白的信号肽有分泌功能。

3、目的蛋白的原核表达及蛋白纯化

原核表达：将全长PbChia1的cDNA去除信号肽后分别克隆到pGEX-6p-1与pET28a原核表达载体的BamHI上，构建的质粒转化大肠杆菌表达菌株，挑取单菌落到抗性LB培养基上，37℃过夜培养，随后按照1-2％接种量活化3小时左右，使OD₆₀₀的数值在0.5左右，加入终浓度为0.05～1.0mmol/L IPTG，28℃诱导表达6小时，取1mL菌液离心去上清，加100μL水悬浮细胞，再加入50μL 3×SDS Loading Buffer煮沸10分钟，20μL点样，12％SDS-PAGE电泳。

GST标签蛋白的纯化：收集200mL表达目的蛋白的菌液，离心去上清后，加入35mLGST Binding Buffer(25mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，150mmol/LNaCl，1mmol/L EDTA)后置于冰上，涡旋振荡把菌体打散混匀；利用液压破碎仪将细胞彻底破碎(压强900kPa)，破碎后的菌体4℃5000r/min离心1h；离心等待时间可以处理纯化柱(碧云天FCL30)，取下纯化柱top cap和bottom cap，用ddH2O冲洗干净，先向纯化柱中加入10mL GST Binding Buffer，再加入400μL的谷胱甘肽琼脂糖填料(Glutathione Resin，GenScript，Cat.No.L00206)，用枪吹打后静置5min，拿掉bottom cap，让液体自然流出；盖上bottom cap，加入10mL GSTBinding Buffer，用枪吹打后静置5min，重复1次，等纯化柱中液体排完后备用；将细胞破碎液离心后的上清用0.22μm或者0.45μm的过滤器过滤；加入10mL过滤后的蛋白液到纯化柱中，用枪吹打混匀静置10min，拿掉bottomcap，让液体自然流出，直到全部蛋白液都自然流过柱子；加入10mL的GST Binding Buffer到纯化柱中，用枪吹打混匀静置10min，拿掉bottom cap，让液体自然流出，重复2次；利用top cap排挤出纯化柱中残余的Buffer，并用ddH₂O冲洗纯化柱底部尖端部分和bottom cap，盖上bottom cap加入1mL的GST ElutionBuffer(10mmol/L还原型谷胱甘肽在GST Binding Buffer)，用枪吹打混匀静置10min，利用top cap排挤出全部的GST ElutionBuffer到新的1.5mL EP管中，即得到纯化好的蛋白；纯化好的蛋白可以放在4℃的冰盒中保存，1周之内使用。

His标签融合蛋白的纯化：参考上述方法破碎表达了含目的蛋白菌液，4℃12,000rpm离心20分钟，取上清到100μLNi-NTA琼脂糖凝胶(洗涤过)，冰上摇摆孵育2-3小时(振荡器左右摆动，30rpm)，12,000rpm离心1分钟小心的吸去上清，用PBS洗涤Beads 3次，冰上摇摆洗涤每次半个小时，加适量体积含50～500mmol/L咪唑的PBS洗脱液摇匀置10分钟，收集每次洗脱的上清，12％SDS-PAGE电泳分析可以将目的蛋白洗脱下来的咪唑浓度，收集此时的上清，4℃贮存备用。

经标签抗体和分子量验证，符合预期，为目的蛋白在大肠杆菌中的外源表达。

实施例3 PbChia1蛋白体外几丁质酶活性

用检测试剂盒(Beijing Boxbio Science&Technology Co.,Ltd.AKSU045M)检测实施例2纯化后的几丁质酶(His-PbChia1和GST-PbChia1)的活性。酶活单位定义为37℃条件下，每mg蛋白每小时产生1μmol N-乙酰氨基葡萄糖为一个酶活单位。

通过体外酶活的检测，His-PbChia1蛋白的几丁质酶活在20℃时是3.379U/mg，在37℃时是11.735U/mg，在50℃时是5.905U/mg，而Mock对照组的酶活几乎检测不到(图2中A)。GST-PbChia1蛋白的几丁质酶活在20℃时是1.898U/mg，在37℃时是11.954U/mg，在50℃时是6.592U/mg，而GST对照组的酶活在20℃时是1.218U/mg，在37℃时是1.321U/mg，在50℃时是1.030U/mg(图2中C)。His-PbChia1和GST-PbChia1蛋白在体外均有几丁质酶活性，在37℃酶的活性最高，高于或者低于37℃酶活迅速下降。

纯化蛋白的Chitinpull-down试验：将100μL 2％的胶体几丁质和100μL0.3mg/mL纯化的PbChia1蛋白在300μL binding buffer[20mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，100mmol/LNaCl，0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L苯甲基磺酰氟和0.1％Triton X-100]中4℃缓慢摇动孵育2h。4℃，12000r/min离心3min，去上清，加入1mLwashingbuffer[20mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，200mmol/LNaCl，0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L苯甲基磺酰氟和0.2％Nonidet P-40]洗涤5次，加入100μL 5×Loading Buffer，沸水浴10min，12000r/min离心10s，样品用anti-GST抗体检测。

通过几丁质pull down试验，检测PbChia1蛋白是否可以在体外结合几丁质。Western-blot结果如图2中B和D所示，PbChia1蛋白在体外可以结合几丁质。综上所述，体外纯化PbChia1蛋白，具有几丁质酶活性，能够体外结合几丁质，是一个典型的几丁质酶。

实施例4验证几丁质酶对根肿菌休眠孢子的影响

1、根肿菌休眠孢子液的制备

从湖北省枝江市的油菜根肿病病田中采集大量的油菜病根，存于-20℃冰箱。提取根肿菌休眠孢子之前将材料从冰箱拿出解冻，用大量自来水清洗肿大的根，用刀切成小块，随即放入匀浆机中加入适量的无菌水匀浆，用8层纱布过滤掉根部的残渣，滤液用5000r/min离心10min，倒掉上清液，用50％(w/v)蔗糖溶液悬浮沉淀，5000r/min离心15min，收集含有休眠孢子的上清液到另一个无菌离心管中，加入等量的无菌水，充分混匀后5000r/min离心15min，弃上清液，用无菌水悬浮管底的干净休眠孢子沉淀，重复该步骤5次，以充分洗净休眠孢子中的蔗糖。制备好的休眠孢子用血球计数板统计浓度，于4℃保存备用。

2、根肿菌休眠孢子的萌发

油菜根系分泌液制备：在培养皿中铺3层高温灭菌滤纸片，将油菜种子用75％酒精消毒8～10min，无菌水清洗6～7次后置于培养皿中，每皿50粒种子，加入灭菌的霍格兰营养液培养，待其生长到出现两片真叶(1周左右)，收集培养液，经0.22μm细菌过滤器过滤，即得根系分泌物溶液，置于4℃冰箱保存，备用。

用制备好的油菜根系分泌物将根肿菌的休眠孢子稀释到1×10⁷spores/mL，加入50μL商品化几丁质水解酶(Sigma C6137，Chitinase from Streptomyces griseus)或者实施例2中经GST标签纯化的根肿菌几丁质酶蛋白，浓度为0.3mg/mL，加无菌水为空白对照，37℃暗处理3d，每天取样检测休眠孢子的浓度。第3d时，还利用DAPI将休眠孢子染色1min，在荧光显微下统计休眠孢子的萌发率。

3、为了探究PbChia1蛋白在体外对根肿病休眠孢子的影响，通过体外纯化的PbChia1蛋白处理根肿菌休眠孢子。

PB对照组：接种病原菌，并利用PBS处理根肿菌休眠孢子；

PB处理组：接种病原菌，并利用PbChia1蛋白处理根肿菌休眠孢子。

处理之前，PB对照组与处理组根肿菌休眠孢子的数量没有显著性差异；1d后，处理组根肿菌休眠孢子的数量相对于对照组降低了61.40％，是3.04×10⁶；2d后，降低了70.90％；3d后，降低了71.20％，结果表明PbChia1蛋白处理能显著降低根肿菌休眠孢子的数量(图3中A)。

采用DAPI染色检测根肿病休眠孢子的萌发，结果如图3所示，在紫外激发下观察到有荧光的细胞核则表明孢子未萌发，白色三角形标注；没有荧光，但是可以明显看见细胞的形状，表明根肿病的休眠孢子已经萌发，白色箭头标注。休眠孢子在油菜根际分泌物的诱导下会萌发为初级游动孢子，用商业化的几丁质酶作为阳性对照(图3中B和C)。PbChia1蛋白处理根肿菌休眠孢子第3d，PB对照组的萌发率是68.20％，PB+PbChia1处理组的萌发率是46.30％，PB+商业化几丁质处理组的萌发率是42.00％，结果表明PbChia1蛋白处理能显著降低休眠孢子的萌发，抑制率为32.10％。综上所述，PbChia1蛋白处理不仅能显著降低根肿菌休眠孢子的数量，而且还能抑制根肿菌休眠孢子的萌发。

4、PbChia1处理水培油菜

选取油菜品种为华双四号。首先对油菜种子用2％NaClO表面消毒处理10min，然后用无菌蒸馏水清洗种子6次，消毒处理后的油菜种子置于用霍格兰营养液湿润的无菌滤纸上，放于人工植物光照培养箱(培养条件设定：22℃，16h光照，8h黑暗，80％相对湿度)中生长。油菜种子萌发10d后，选取生长健壮的油菜幼苗移栽到装满霍格兰营养液的10mL EP管中，继续放于人工植物光照培养箱中种植，每天按时补充水分，必要时杀虫处理，维持植株的正常生长。实验设计共分5小组，第1组为阴性对照(Mock空白对照组)，只含有霍格兰营养液，第2组只接种根肿菌(PB阳性对照组)，终浓度1×10⁷spores/mL，第3组接种与对照相同浓度的根肿菌和实施例2纯化好的GST蛋白(PB+GST阳性对照组)，终浓度为0.3mg/mL，第4组接种与对照相同的根肿菌和实施例2纯化好的PbChia1-GST蛋白(PB+PbChia1组)，终浓度为0.3mg/mL，第5组接种与对照相同的根肿菌和商品化几丁质酶(PB+CC组)，终浓度为0.3mg/mL。EP管中的水培液每7d更换1次，以保证油菜植株正常生长的营养供应充足。

接种30d后，统计油菜根组织发病情况，Mock空白对照组植株生长正常，PB和PB+GST阳性对照组根系明显肿大，而PB+PbChia1和PB+CC处理组植株肿大症状缓解(图4中A)。病情指数(Disease Index)显示对照组植株病情指数为73.00和72.32，而PB+PbChia1处理组植株病情指数为28.13，生防效果为61.29％，PB+商业化几丁质处理组植株病情指数为33.33，生防效果为54.13％(图4中B)。

5、根肿菌含量的检测

基因组DNA提取：取待提取的样品置于液氮中充分研磨，转入2mL灭菌的EP管中。向样品加入1000μL经65℃预热的CTAB提取缓冲液，充分混匀后，将样品置于65℃水浴锅中水浴30min，该期间每隔5min取出EP管，轻轻颠倒混匀EP管一次。水浴结束后，12000r/min离心10min，小心取上清液到另一1.5mL EP管中，加入等体积的氯仿/苯酚(v/v＝1/1)，充分振荡均匀；12000r/min离心10min，小心取上清液于另一1.5mL EP管中，加入等体积的氯仿，充分振荡均匀；12000r/min离心10min，小心取上清液于另一1.5mL EP管中，加入等体积-20℃预冷的异丙醇充分混匀。混合样品置于-20℃沉淀30min后，12000r/min离心12min，小心弃上清液，管底DNA沉淀用75％酒精洗涤3次，最后洗涤后通过离心的方法将残余的酒精集中于管底，用移液器吸取干净，以加速DNA干燥。获得的DNA沉淀室温干燥，加适量的TE缓冲液溶解，电泳检测提取基因组DNA的质量和纯度，检测合格的基因组DNA样品置于-20℃或-80℃保存备用。

实时荧光定量PCR(qPCR)检测根肿菌的含量：根据Bio-Rad公司产品iTaq^TMUniversalGreen Supermix提供的方法进行。利用Beacon designer 8.0Real-time PCR引物设计软件设计定量引物。

Bnactin-F(SEQ ID NO.11):5’-TGAAGATCAAGGTGGTCGCA-3’和Bnactin-R(SEQ IDNO.12):5’-GAAGGCAGAAACACTTAGAAG-3’；

根肿菌Actin基因(SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8)。

实时荧光定量PCR反应体系如下：iTaq^TMUniversal ：5μL、Forwardprimers(10μmol/L)：0.5μL、Reverse primers(10μmol/L)：0.5μL和DNA模板：cDNA：100ng～100fg/Genomic DNA：50ng～5pg，补去离子水至20μL。

反应条件：95℃，2min，95℃，15s，60℃，30s，72℃，20s重复35～40个循环；65℃-95℃绘制熔解曲线(5s/0.5℃)。

在Bio-Rad CFX 96仪器上进行反应。待扩增结束后，使用2^-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。油菜的Actin基因为内参，以根肿菌Actin基因为根肿菌含量的指标，计算单位重量油菜组织(以油菜Actin基因为模板的扩张曲线Ct值)中的含菌量(以根肿菌Actin基因为模板的扩张曲线Ct值)。每次生物学重复至少有15棵油菜植株进行分析，至少3次试验重复。

qPCR结果表明病根内部根肿菌的含量显著下降(图4中C)。以上结果表明PbChia1蛋白在体外使用缓解根肿病的病症。

6、为了探究PbChia1在体外防治油菜根肿病的原因，对具有代表性的根组织进行甲苯胺蓝染色石蜡切片光学显微镜观察。

结果如图5所示，PB和PB+GST对照组中植物根细胞内部有大量的根肿菌，有些处于成熟的休眠孢子阶段，也有一些处于次级孢子囊阶段；PB+PbChia1和PB+商业化几丁质处理组的植物根细胞中根肿菌显著减少，还处于早期的孢子囊阶段；未接种的Mock对照组中，寄主皮层组织中都没有发现病原物；由此可见，PbChia1处理能显著降低寄主内部的病原，还能延缓根肿菌的发育(图5中A)。进一步统计根组织内部的含菌量比列，显示PB+PbChia1和PB+商业化几丁质酶处理组的含菌量显著少于PB和PB+GST对照组(图5中B)，与根部切片的结果一致，综合上述结果表明PbChia1蛋白处理水培油菜根肿病，可以抑制根肿菌的入侵，延缓根肿菌的发育，使根部根肿菌的含量显著下降，缓解根肿病病症。

实施例5

1、农杆菌介导转化拟南芥(花序浸渍法)

用引物PbChia1-F/PbChia1-R扩增PbChia1基因，通过XbaI/BamHI双酶切，连接至载体pCNF3-2×35S:MCS-FLAG，得到pCNF3-PbChia1重组质粒。将含有目的基因(SEQ IDNO.2)的双元载体的农杆菌GV3101，在含有Kana和Rif的LB平板上划线培养2d；挑取单菌落于2mL含有所需抗性的LB中，28℃，220r/min，振荡培养12h以上；吸取200μL的农杆菌菌液于200mL含有Kana和Rif的LB中，28℃，220r/min，振荡培养12h以上；将农杆菌菌液，4℃，5000r/min，离心5～10min，收集农杆菌菌体，弃上清，用200mL的5％(W/V)蔗糖溶液重新悬浮菌体，加入40μL的Silwet L-77使其终浓度为0.02％(即500mL蔗糖溶液加入100μL的Silwet L-77)；在转化前剪去拟南芥植株上所有的果荚和露白的花，将拟南芥的所有花序浸入到农杆菌菌悬液中，轻轻晃动15s，沥干多余的农杆菌菌液，1h后，重复此步骤；将经农杆菌蘸花处理的拟南芥保湿暗培养16h后，转移至正常培养；7～10d后，重复一次；收集所有成熟的拟南芥种子，作下一步筛选；将成熟的拟南芥种子分装于1.5mL离心管中，加入1mL的无菌水后，再加入20μL 84消毒液浸泡10～15min，期间颠倒数次，弃去消毒液，加入1mL无菌水冲洗，重复6～7次，将消毒液去除，加入适量的无菌水悬浮种子，吸取种子涂布于含有Cef(100μg/mL)及相应抗生素(Kana 50μg/mL)的1/2MS筛选培养基上，将平板封口，置于4℃，春化处理16h，春化处理后，置于培养箱中培养(光照22℃，16h/黑暗20℃，8h)；挑取转化子，移栽至营养土中；在3周龄～4周龄时，提取DNA，进行PCR验证，提取蛋白进行Western blot验证。获得的T1代转基因植株，继续在含有抗性的1/2MS筛选T2代和T3代，直到获得纯合的转基因植株为止。

L2、L3和L5转基因植株在生长和发育等方面与Col-0和EV阴性对照不存在差异(图6中A)。Westernblot结果表明PbChia1蛋白的表达可以在L2、L3和L5转基因植株中被检测到(图6中B)。分别在第3d和第10d统计转基因植株的根毛数量，转基因植株的根毛数量和对照植株无显著差异(图6中C和D)。在第10d统计转基因植株的根长表型，转基因植株的根长和对照植株没有显著差异(图6中E)。种子成熟后，统计转基因植株和对照的200粒种子的重量，结果也没有明显的差别(图6中F)。综合以上表型结果，PbChia1超表达不影响拟南芥植株根毛的发育，根的生长和种子的重量。

2、拟南芥植株发病情况统计与分析

将种子播种到营养土中，14天后接种10⁷/mL的根肿菌，选取2周L2、L3和L5转基因拟南芥和Col-0和EV转基因植株接种根肿菌休眠孢子，21dpi统计拟南芥根部的发病情况。

根据下式来计算油菜植株的病情指数：病情指数(DI)＝(1n₁+2n₂+3n₃+4n₄)×100/4N_t，其中n₁-n₄分别是发病程度处于1到4级的油菜植株棵数，N_t是油菜植株的总棵数。

本发明采用的根肿病病情分级的标准为：植株根部无肿瘤，根系生长发育正常(0级)；植株的侧根有少量小的肿瘤，没有影响主根正常生长(1级)；少许肿瘤着生于植株主根或侧根(2级)；植株主根或者下胚轴着生中等或较大的肿瘤，有明显的较大结节状或球状肿块，植株的生长受到一定的影响(3级)；植株主根和侧根均有较大的肿瘤成纺锤形，植株生长受到严重影响(4级)。

结果发现Col-0和EV阴性对照组植株根系明显肿大，而L2、L3和L5转基因株系并没有明显肿大的症状(图7中A)。同时统计拟南芥植株的病情指数，Col-0植株病情指数为43.13，EV转基因植株病情指数为41.25，L2株系的病情指数为20.00，L3株系的病情指数为20.63，L5株系的病情指数为16.25(图7中B)。病情指数统计结果表明超表达PbChia1拟南芥可以增强对根肿菌的抗病性，显著缓解根部肿大症状，最好的防效高达62.30％。也通过qPCR技术检测了拟南芥根组织的含菌量，L2、L3和L5转基因拟南芥根组织根肿菌积累量显著少于Col-0和EV对照组(图7中C)。综上，超表达PbChia1拟南芥接种根肿菌后，拟南芥根组织根肿菌的积累量可以明显减少，根系肿大症状被显著缓解，对拟南芥根肿病有较好的防治作用。实验重复3次，结果相似。

为了研究超表达PbChia1对拟南芥存活率和产量影响，超表达的转基因植株和对照植株均种植40棵，接种根肿菌30d和55d后统计存活率，并收集拟南芥种子，并晾干称重(图8中A)。结果发现L3和L5转基因拟南芥植株比Col-0和EV转基因植株存活率显著升高。在接种30d时，Col-0植株存活率仅为15.00％，EV转基因植株存活率为19.60％，而L3植株存活率为44.00％，L5植株存活率为49.80％，也就是说超表达PbChia1植株相对于对照植株存活率至少提高了1倍；在接种根肿菌55d后，Col-0植株存活率为9.90％，EV转基因植株存活率为12.10％，而L3植株存活率为39.90％，L5植株存活率为35.00％(图8中B)，接种55d后，超表达PbChia1植株存活率提高了约2.40倍。同时收获这些处理组的种子并进行称量，L3和L5转基因拟南芥种子重量分别为263.23mg和232.27mg，Col-0和EV转基因植株种子重量分别为115.07mg和144.30mg(图8中C)，超表达PbChia1拟南芥的产量增加近1倍。综上结果表明超表达PbChia1可以提高植株的存活率和产量至少1倍。实验重复3次，结果相似。

3、根肿菌早期根毛侵染和后期皮层侵染的观察与统计

将1mL根肿菌休眠孢子悬液(约1×10⁶spores/mL)分别向14d苗龄的拟南芥(Col-0、EmptyVector、L2、L3和L5)根部周围接种，将接种后的植物放于人工植物光照培养箱(培养条件设定：22℃，16h光照，8h黑暗，75％相对湿度)中生长。按时浇水，必要时杀虫处理，维持植株的正常生长。在2d和5d时观察根部根毛侵染情况，在12d时观察根部皮层侵染情况，并统计根肿菌的入侵效率。

统计的方法如下：分别取接种2d，5d和10d的拟南芥根组织，用自来水冲洗干净表面附着的土壤杂质，吸水纸吸干表面水分，用手术刀小心将根系剪成小段(约1cm左右)，每个样品准备50～100小段根系，将其放于2mL EP管中，向管中加入1.5mL乳酸酚溶液(20％乳酸，20％苯酚，40％甘油和20％的水)，保证根系浸没于乳酸酚溶液中，再加入100μL 0.05％(w/v)的台盼蓝(trypan blue)染色过夜；染色结束后，取出根系，用ddH₂O漂洗3次，洗去根系表面附着的染色液。制片后光学显微镜(Nikon Eclipse 90i or Olympus BX63,Japan)观察根系。

台盼蓝染色观察根肿菌的皮层和根毛侵染过程(图9中A)。每组样品植株数目大于15，将根切成1～2厘米的片段，每组随机挑选大约100个根段来统计侵染效率。接种3d后，统计根毛侵染阶段，PbChia1转基因植株L2、L3和L5的根毛吸附和初级游动孢子囊形成率分别是25.70％、19.50％和21.50％，Col-0和EV的定殖率分别是92.30％和91.70％，转基因植株较对照植株的定殖率下降了约75％，表明超表达PbChia1可以显著降低拟南芥根肿病的根毛侵染；接种12d后，统计根毛内部生成的游动孢子囊百分比，PbChia1转基因植株L2、L3和L5的生成百分比分别是35.70％、34.30％和27.10％，对照Col-0和EV的生成百分比分别是83％和81.83％，转基因植株较对照植株的定殖率下降了约61％；统计根皮层内部形成游动孢子囊的百分比，PbChia1植株L2、L3和L5的百分比分别是27.30％、23.40％和20.10％，Col-0和EV的百分比分别是78.30％和77.80％，转基因植株较对照植株的定殖率下降了约70％(图9中B)，由此可见，超表达PbChia1拟南芥植株会显著降低根毛侵染和皮层侵染的效率，减少初级和次级游动孢子囊的形成，使根肿菌在植物根部细胞内定殖率下降，呈现抗病表型。

为了观察根肿菌在根细胞内部的发育状态，对接种根肿菌21d后，超表达PbChia1转基因植株及对照植株的根进行透射电镜的观察。Col-0和EV空载体对照的根细胞中充满了早期成熟的休眠孢子，已经可以观察到典型的细胞核，核仁已经形成(图10中A和B)。超表达PbChia1 L3株系中，寄主细胞内可以观察到次级游动孢子囊，细胞核没有形成，次级游动孢子囊还未分割成休眠孢子(图10中C)。透射电镜的结果表明超表达PbChia1植株可以使根肿菌的发育延缓。

4、病原细菌PstDC3000的致病力检测

植物在生长室培养4周，将保存于-80℃冰箱的菌液在KB平板上划线活化，置于28℃培养箱培养2d直到细菌长出；挑选单菌落接种到KB+抗生素(Pst.DC3000为Rif抗性)液体培养基，28℃摇床震荡培养过夜。室温5000r/min，离心5min收集菌体，弃上清，ddH₂O洗涤两次，重悬于500μL的10mmol/LMgCl₂中；测定细菌OD₆₀₀来计算细菌浓度，然后用10mmol/L的MgCl₂将细菌稀释到1×10⁶CFU/mL。

选取植物的第3轮或第4轮叶片，利用1mL无针头的注射器取100μL菌液从叶片下表皮轻轻打入，用透明盖子盖住保湿5h～8h，将植株放到生长室观察发病情况，每天早上给植株叶面喷水保湿；接种2d～3d后可测定细菌增长数量。使用打孔器打孔接种叶片，收集6片叶圆片(5mm直径)，按照发病程度分级，取平均后放到3个含有100μL ddH₂O的1.5mL离心管中，每管2片；磨碎叶圆片，加入900μL ddH₂O混匀，连续梯度稀释，使用10^-3和10^-4两种稀释倍数来细菌计数，0d样品则用10^-2浓度，取10μL稀释菌液接种到含对应抗生素的TSA平板，用接种环涂布均匀，28℃培养4d后计算细菌菌落形成(单位CFU/cm²)。

4周苗岭的PbChia1转基因植株和对照植株，接种Pst.DC30004 d后，观察植物叶片的发病情况，并且统计叶片中细菌的数量，从拍摄的典型照片可以看出，L2、L3和L5叶片的病症比野生型对照和载体对照程度轻(图11中A)；细菌计数结果也表明PbChia1转基因植株L2、L3和L5单位面积的叶片细菌含量显著低于阴性对照组(图11中B)，表明超表达PbChia1可以显著增强植物对Pst.DC3000的抗病能力。

5、核盘菌和立枯丝核菌致病力测定

核盘菌1980菌株致病性测定方法：将4℃保存的核盘菌1980菌株在PDA平板进行生长，挑取幼嫩菌丝于新PDA上生长。待生长1～2d后，挑取幼嫩菌丝于含有15mL PDA的9cm培养皿上培养36h左右，用打孔器打取菌落边缘，然后接种于相应的植物叶片。其中，接种拟南芥的菌丝块大小为2mm，试验设置每处理10片叶子。30h后，十字交叉法量取病斑直径，计算病斑面积用于统计分析。致病力测定试验重复3次以上。

立枯丝核菌致病力测定方法：将4℃保存的立枯丝核菌菌株在PDA平板进行培养，挑取幼嫩菌丝于新PDA上生长。待生长1～2d后，挑取幼嫩菌丝于含有15mL PDA的9cm培养皿上培养36h左右，用打孔器在菌落边缘打取5mm大小的菌丝块10个，然后接种于PDB培养基中，22℃摇床震荡培养7d。将摇培的菌丝体用匀浆机打碎，吸取1mL接种在移栽14d大小的拟南芥根部，试验设置每处理12株苗，将各种处理的植株置于22℃恒温保湿培养，3d后观察并记录发病情况，参考分级标准，记录接种植株的病级数，并计算病情指数，致病力测定试验重复3次以上。病害分级标准和病情指数公式如下。根茎部病级分级标准：0级：茎部无发病症状；1级：茎部病斑扩展面积，低于茎周1/2，根部无发病症状；2级：茎部病斑扩展面积，高于茎周1/2，根部无发病症状；3级：茎部病斑扩展面积，高于茎周1/2，根部发病；4级：植株倒伏，萎蔫死亡。病情指数的计算公式同上。

生长4周的PbChia1转基因植物和对照植物叶片接种核盘菌1980(图12中A)，接种核盘菌198030h后植物叶片可以呈现明显的病症，Col-0和EV上的病斑面积为33.93mm²和37.71mm²，而L3和L5转基因植株的病斑面积为13.61mm²和11.05mm²，转基因植株的病斑面积较对照植株的面积减小约66％(图12中B)，结果表明，PbChia1转基因植株可以显著提高对核盘菌1980抗病能力。

2周L3，L5转基因拟南芥和Col-0植株接种立枯丝核菌，3d后统计植株的发病情况。结果发现Col-0植株的发病情况很严重，绝大部分坏死，而L3和L5转基因拟南芥植株还有一大部分存活(图13中A)，Col-0植株病情指数为93.75，而L3和L5转基因的植株病情指数为58.33和50.00(图13中B)，防治效果约42.30％。这结果表明超表达PbChia1拟南芥可以增强对立枯丝核菌的抗病性。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims

1.几丁质酶在提高作物抗病能力中的应用，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述作物抗病能力为抗根肿菌、丁香假单胞菌Pst DC3000、核盘菌和立枯丝核菌引发病害的能力。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述几丁质酶的来源为自体表达和/或体外表达。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗根肿菌表现为抑制休眠根肿菌孢子萌发、延缓根肿菌的发育和/或缓解根肿病根肿症状。

5.一种超表达几丁质酶的转基因株系在获取抗根肿病材料中的应用，其特征在于，所述几丁质酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述几丁质酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，抗根肿病材料的性状为：显著降低根肿菌在植物内的定殖率和/或延缓根肿菌的发育。