CN115807031A - 白菜HSK激酶及其编码基因BraDMR1和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白菜HSK激酶及其编码基因BraDMR1和应用，属于基因工程育种技术领域。本发明提供了HSK激酶或调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质在调控植物霜霉病抗性中的应用，所述HSK激酶为氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质。本发明还提供了调控植物霜霉病抗性的方法，所述方法包括通过调控所述HSK激酶编码基因的表达或调控所述HSK激酶的活性或含量，来调控植物抗病性。BraDMR1基因有望用于基因工程育种，将育种中间材料中的BraDMR1基因敲除后可获得霜霉病抗性增强的材料。

Description

白菜HSK激酶及其编码基因BraDMR1和应用

技术领域

本发明属于基因工程育种技术领域，具体涉及白菜HSK激酶及其编码基因BraDMR1和应用。

背景技术

大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensis(Lour.)Olsson)是十字花科芸薹属芸薹种中的一个栽培亚种，原产于我国。作为我国栽培面积最大的蔬菜作物，大白菜的产量和品质关系到蔬菜的市场供应和市场价格，是名副其实的重要蔬菜。在大白菜的生长过程中，经常受到霜霉病、病毒病、软腐病、黑斑病、白斑病及黑腐病的侵染，其中霜霉病是白菜的三大病害之一，也是白菜生产中最常见的病害。

霜霉病是一种由专性寄生霜霉菌(Peronospora parasitica(Pers)Fr.)引起的真菌性病害，病原菌主要以卵孢子的形式在土壤中残存或以菌丝体的形式在窖贮采种母株上越冬，在春季温湿度适宜时萌发侵染，发病部位产生孢子囊重复侵染，成为十字花科霜霉病的主要初侵染来源；侵染初期在叶片背面形成淡绿色小点，发病后期湿度大时出现白色霉层，叶片出现叶脉限制的褐色病斑，之后病斑逐渐扩大连片，最终导致叶片干枯，对白菜的产量和品质造成极大影响，特别是苗用白菜、青梗菜和菜心等速生白菜；白菜霜霉病在气温较低、湿度较大的早春和晚秋发病严重，在气候潮湿、冷凉的地区及沿江沿海地区易流行，流行年份白菜发病率可达80％-90％，减产30％-50％，全生育期均可发病，严重影响白菜的产量和品质(陈锋，2016，浅析白菜三大主要病害发生危害及防治对策.中国农业信息，(17):103-125；高天一，任锡亮，孟秋峰等，2019，芸薹属蔬菜霜霉病研究概况及进展.长江蔬菜，(16):49-53)。

培育持久抗病品种是白菜霜霉病最安全有效的防治方法(曹晓媚，余红梅，刘建军，2016，白菜霜霉病不同处理防治效果试验.现代农村科技，(05):46)，白菜霜霉病病原菌存在多个生理小种，抗病机理复杂，抗病基因挖掘进展缓慢。钮心恪(1984)通过对抗感材料及其F1后代的抗性分析，确认大白菜苗期对霜霉病的抗性为显性遗传(钮心恪，1984，大白菜抗霜霉病，病毒病原始材料的筛选及抗性遗传的研究.中国蔬菜，(4):28-32.)，但关于抗病基因定位与标记筛选的研究报道屈指可数(冷月强，侯喜林，史公军，2007，白菜抗霜霉病基因的RAPD标记.园艺学报，34(003):763-766；虞慧芳，钟新民，李必元等，2010，与大白菜抗霜霉病基因连锁的分子标记研究.中国农学通报，26(15):66-70；Kim SG.,Song YH.,LeeJY.,et al.,2011.Identification of the BrRHP1 locus that confers resistance todowny mildew in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)and developmentof linked molecular markers.Theoretical and Applied Genetics,123:1183-1192)。本实验室在国内率先开展了白菜霜霉病病原菌鉴定、种质筛选、抗病QTL定位与图位克隆的研究，目前在A08、A01和A04染色体上分别精细定位了主效QTLs位点BraDM、BR-DM1.1和BR-DM04，并开发出与这些位点紧密连锁的SSR、SNP、Indel标记(Yu SC.,Zhang FL.,Yu RB.,etal.,2009.Genetic mapping and localization of a major QTL for seedlingresistance to downy mildew in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis).Molecular breeding,23(4):573-590.；Yu SC.,Zhang FL.,Zhao XY.,et al.,2011.Sequence-characterized amplified region and simple sequence repeatmarkers for identifying the major quantitative trait locus responsible forseedling resistance to Downy Mildew in Chinese cabbage(Brassica rapassp.Pekinensis).Plant breeding,130(5):580-583；李慧，于拴仓，张凤兰等，2011.与大白菜霜霉病抗性主效QTL连锁的分子标记开发.遗传学报，33(11):1271-1278；Yu SC.,SuTB.,Zhi SH.,et al.,2016.Construction of a sequence-based bin map and mappingof QTLs for downy mildew resistance at four developmental stages in Chinesecabbage(Brassica rapa L.ssp pekinensis).Molecular Breeding,36(4):1-12.；只升华，苏同兵，于拴仓等，2016，利用全基因组关联分析获得白菜A01染色体定位的霜霉病抗病位点和相关分子标记开发.植物生理学报，52(5):693-702.；Zhang B.,Li P.,Su TB.,etal.,2018.BrRLP48,encoding a receptor-like protein,is involved in downy mildewresistance in Brassica rapa.Frontiers in Plant science,9:1708)，然而白菜抗霜霉病基因的挖掘还任重道远。

病原菌侵染植物后，植物通过细胞膜表面的模式识别受体PRRs识别病原菌表面的病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，引起PTI反应(PAMPs triggered immunity)，PTI反应是植物的第一层先天性免疫，能抑制大部分病原菌的侵染，通常伴随着Ca2+外流、水杨酸(Salicylic acid，SA)及茉莉酸(Jasmonic acid，JA)大量产生、MAPK被激活等，同时引起抗病相关基因上调表达，活性氧大量产生，但免疫反应相对较弱；随后病原菌分泌效应因子进入寄主细胞抑制植物的PTI反应，之后植物则通过R蛋白(Resistance protein)直接或间接识别效应因子，引发ETI反应(Effector triggeredimmunity)(Zhou JM.&Zhang Y.,2020.Plant immunity:danger perception andsignaling.Cell,181(5):978-989)，即第二层先天性免疫。ETI反应与PTI反应过程类似，但反应较剧烈，持续时间较长，对病原菌的抑制程度较强，如过敏反应(Hypersensitiveresponse，HR)。当抗病基因被激活后，通过调控EDS1、PAD4等激活植物激素SA的合成，转录辅因子NPR1识别SA的大量合成，随后转移到细胞核激活抗菌因子的表达(Zhang J.,CoakerG.,Zhou JM.,et al.,2020.Plant immune mechanisms:from reductionistic toholistic points of view.Molecular Plant,13(10):1358-1378)。

近年来有研究报道，植物体内存在一些可以帮助病原菌侵染寄主或促进病原菌在寄主体内繁殖的基因；由于该类基因降低植物对病原菌的抗性，促进植物感病，因此被称为感病基因。根据感病基因在病原菌侵染寄主、在寄主体内繁殖的不同功能，将其分为三类：第一类感病基因在病原菌侵染早期发挥功能，如调控病原菌孢子萌发、促进菌丝生长等，玉米中glossy 11突变后可抑制白粉病孢子的萌发(Hansjakob A.,Riederer M.,Hildebrandt U.,2011，Wax matters:absence of very-long-chain aldehydes from theleaf cuticular wax of the glossy11 mutant of maize compromises theprepenetration processes of Blumeria graminis.Plant Pathology,60:1151–1161)；第二类感病基因编码植物免疫反应的负调节因子，抑制植物的PTI反应或ETI反应，促进病原菌侵染，拟南芥中调控纤维素合成的CESA3突变后，可通过提高ABA、JA、SA的合成来提高对多种病原菌的抗性(Ellis C.,Karafyllidis I.,Wasternack C.,et al.,2002,TheArabidopsis mutant cev1 links cell wall signaling to jasmonate and ethyleneresponses.Plant Cell,14:1557–1566)；第三类感病基因维持病原菌在寄主体内的生长代谢，水稻中蔗糖转运蛋白SWEET可被TAL类型效应因子激活，为病原菌的生长提供碳源(Streubel J.,Pesce C.,Hutin M.,et al.,2013,Five phylogenetically close riceSWEET genes confer TAL effector-mediated susceptibility to Xanthomonas oryzaepv.oryzae.New Phytol,200:808–819)。

自然界中存在的隐性抗性可能是由于感病基因核心位点突变引起，目前在拟南芥、水稻、番茄、辣椒等作物中均发现存在感病基因，利用CRISPR/Cas9技术敲除感病基因后会产生多效性效应。因此，挖掘感病基因、敲除感病基因是获得抗性品种的另一重要途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：如何提高植物的抗病性，尤其是白菜霜霉病抗性。

为解决上述技术问题，第一个方面，本发明提供应用，所述应用可为C1)或C2)或C3)：

C1)、HSK激酶或调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用；

C2)、HSK激酶或调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

C3)、HSK激酶或调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述HSK激酶可为如下A1)或A2)或A3)：

A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

A2)、将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性的功能的蛋白质；

A3)、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

进一步地，上述的应用中，所述HSK激酶来源于白菜，所述植物抗病性可为植物霜霉病抗性，所述霜霉病可为专性寄生霜霉菌(Peronospora parasitica(Pers)Fr.)侵染植物引起的真菌性病害。

本发明中，所述调控所述HSK激酶编码基因表达或调控所述HSK激酶活性或含量可为下调或抑制或降低所述HSK激酶编码基因表达或下调或抑制或降低所述HSK激酶活性或含量。

本发明中，所述植物育种的目的可包括提高抗病性的植物，尤其是培育提供霜霉病抗性的植物。

上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

其中，SEQ ID No.2由370个氨基酸残基组成。

本文中，所述蛋白质标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白质一起融合表达的一种多肽或者蛋白质，以便于目的蛋白质的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白质标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。

进一步地，上述的应用中，所述调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B15)中的任一种：

B1)、抑制或降低或下调所述HSK激酶的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低或下调所述HSK激酶的活性或含量的RNA分子；

B2)、表达B1)所述RNA分子的编码基因；

B3)、含有B2)所述编码基因的表达盒；

B4)、含有B2)所述编码基因的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)、含有B2)所述编码基因的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)、含有B2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B7)、含有B2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B8)、含有B2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B4)所述重组载体的转基因植物器官；

B9)、编码所述HSK激酶的核酸分子；

B10)、含有B9)所述核酸分子的表达盒；

B11)、含有B9)所述核酸分子的重组载体、或含有B10)所述表达盒的重组载体；

B12)、含有B9)所述核酸分子的重组微生物、或含有B10)所述表达盒的重组微生物、或含有B11)所述重组载体的重组微生物；

B13)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B11)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B14)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B11)所述重组载体的转基因植物组织；

B15)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B11)所述重组载体的转基因植物器官。

进一步地，上述的应用中，B1)所述RNA分子为靶向所述HSK激酶编码基因的gRNA，所述gRNA的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.1第218-236位和/或所述gRNA的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.1第696-714位的反向互补序列。

进一步地，上述的应用中，B2)所述编码基因为表达靶向所述HSK激酶编码基因的gRNA的DNA分子；

B9)所述核酸分子为BraDMR1基因，所述BraDMR1基因为如下b1)、b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)、编码链的编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b2)、编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b3)、与b1)或b2)所示的DNA分子具有80％的同一性，且编码HSK激酶的DNA分子。

本文中，所述同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

进一步地，上述的应用中，所述植物可为下述P1)-P4)中任一种：

P1)、单子叶植物或双子叶植物；

P2)、十字花科植物；

P3)、芸薹属属植物；

P4)、白菜。

本发明中，所述抑制或减少或下调所述HSK激酶编码基因表达可通过基因敲除或基因沉默实现。

所述基因敲除(gene knock out)是指通过同源重组使特定靶基因失活的现象。基因敲除是通过DNA序列的改变使特定靶基因失活。

所述基因沉默是指在不损伤原有DNA的情况下使基因不表达或低表达的现象。基因沉默以不改变DNA序列为前提，使基因不表达或低表达。基因沉默可发生在两种水平上，一种是由于DNA甲基化、异染色质化以及位置效应等引起的转录水平的基因沉默，另一种是转录后基因沉默，即在基因转录后的水平上通过对靶标RNA进行特异性抑制而使基因失活，包括反义RNA、共抑制(co-suppression)、基因压抑(quelling)、RNA干扰(RNAi)和微小RNA(miRNA)介导的翻译抑制等。

本发明中，B5)或B12)所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻类或真菌。所述细菌可为革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌。所述革兰氏阴性细菌可为根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具体可为根癌农杆菌GV3101；所述革兰氏阴性细菌可为大肠杆菌(Escherichia coli)，所述大肠杆菌可以为大肠杆菌DH5α。

本发明中，B7)或B14)所述植物组织可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。

本发明中，B8)或B15)所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。

本发明中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官可包括繁殖材料，也可不包括繁殖材料。

为解决上述技术问题，第二个方面，本发明提供一种调控植物抗病性的方法，所述方法包括通过调控所述HSK激酶编码基因的表达或调控所述HSK激酶的活性或含量，来调控植物抗病性。

进一步地，上述的方法中，所述方法包括向受体植物中导入上述gRNA分子的编码基因和Cas蛋白的编码基因来抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶编码基因的表达或抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶的活性或含量，得到抗病性与受体植物不同的目的植物或抗病性高于所述受体植物的目的植物。

本发明中，所述Cas蛋白可为Cas9蛋白。

进一步地，所述Cas9蛋白的编码基因位于pKSE401载体上。

进一步地，上述的方法中，所述植物可为下述P1)-P4)中任一种：

P1)、单子叶植物或双子叶植物；

P2)、十字花科植物；

P3)、芸薹属属植物；

P4)、白菜。

进一步地，上述方法中所述的目的植物可为霜霉病抗性高于受体植物的白菜。

为解决上述技术问题，第三个方面，本发明提供一种制备抗霜霉病白菜的方法，所述方法包括向受体白菜中导入上述gRNA分子的编码基因和Cas蛋白的编码基因来抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶编码基因的表达或抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶的活性或含量，得到抗病性抗病性高于所述受体白菜的目的白菜。

进一步地，上述的调控植物抗病性的方法和/或制备抗霜霉病白菜的方法中，所述抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶编码基因的表达或抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶的活性或含量为将序列表中序列1进行下述任一种突变：

M1)将BraDMR1基因突变为BraDMR1-1基因，BraDMR1-1基因是将序列表中序列1的第395位的核苷酸C缺失得到的DNA分子；

M2)将BraDMR1基因突变为BraDMR1-2基因，BraDMR1-2基因是将序列表中序列1的第343位的脱氧核苷酸G突变为A、第337位的脱氧核苷酸T突变为C、第336位的脱氧核苷酸T缺失、第313位的脱氧核苷酸C突变为A获得的DNA分子；

M3)将BraDMR1基因突变为BraDMR1-3基因，BraDMR1-3基因是将序列表中序列1的第313位的脱氧核苷酸C缺失得到的DNA分子。

为解决上述技术问题，第四个方面，本发明提供上述应用中的所述蛋白质或上述应用中的所述生物材料。

本发明从白菜感病材料胶二叶中克隆到一个编码HSK蛋白的DMR1基因BraDMR1，感病材料中该基因的表达量高于抗病材料，且接种霜霉菌后BraDMR1的表达量上调；利用CRISPR-Cas9技术敲除感病材料中的BraDMR1基因进行功能研究，发现BraDMR1被敲除后能提高感病材料胶二叶对霜霉病的抗性，减少病斑面积产生。BraDMR1有望用于基因工程育种，将育种中间材料中的BraDMR1基因敲除后可获得霜霉病抗性增强的材料，提高白菜对霜霉病的抗性。

采用上述方案，本发明具有以下优点：

(1)本发明从白菜中克隆到了一个HSK激酶基因BraDMR1及其编码的氨基酸序列。利用CRISPR-Cas9技术敲除感病材料中的BraDMR1基因后能提高感病材料胶二叶对霜霉病的抗性，减少病斑面积产生。将该基因敲除后可获得对霜霉病抗性增强的材料。

(2)本发明从感病基因角度入手，验证了白菜中存在利于病原菌侵染的感病基因，并且验证了感病基因敲除后可使植株对霜霉病的抗性增强，为白菜抗病育种提供新策略。

(3)通过本发明的技术方案可以获得霜霉病抗性显著高于初始受体白菜品种的白菜株系。

附图说明

图1为sgRNA表达盒的物理图谱。

图2为BraDMR1敲除后不同单株病斑面积比例的照片。

图3为敲除株系中BraDMR1敲除位点检测。

图4为BraDMR1敲除后不同单株病斑面积比例的柱形图。

图5为部分未敲除BraDMR1基因的白菜单株霜霉病抗性鉴定结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述的胶二叶(也叫R032)，为白菜高代自交系品种，是霜霉病感病材料；下述实施例中所述536浅(也叫R031)，为白菜高代自交系品种，是霜霉病抗病材料；两个材料均为本实验室保存，在文献“于锐芳，苏同兵，于拴仓等，2016，种芽春化和绿体春化对大白菜现蕾及开花时间的影响.中国蔬菜，(05):27-32.”中公开，公众可从申请人处获得上述生物材料，所得生物材料仅可用于验证本发明的实验，不可作为其他用途。

pKSE401载体和pCBC-DT1T2载体由中国农业大学生物学院植物生理与生化国家重点实验室提供，pCBC-DT1T2载体在文献“CRISPR/Cas9基因编辑技术在植物中的应用.中国农业大学硕士学位论文”中公开，pKSE401载体在文献“Su TB.,Wang WH.,Li P.,et al.,2021,Natural variations of BrHISN2 provide a genetic basis for growth-flavourtrade-off in different Brassica rapa subspecies.New Phytologist.6(231):2186-2199.”中公开，公众可从申请人处获得上述生物材料，所得生物材料仅可用于验证本发明的实验，不可作为其他用途。

白菜霜霉菌在文献“Zhang B.,Li P.,Su TB.,2018,BrRLP48,EncodingaReceptor-Like Protein,Involved in Downy Mildew Resistance in Brassicarapa..Frontiers in plant science,9:1708.”中公开，公众可从申请人处获得上述生物材料，所得生物材料仅可用于验证本发明的实验，不可作为其他用途。

下述实施例采用SPSS19.0统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，*表示具有显著性差异(P＜0.05)，**表示具有极显著性差异(P＜0.01)，***表示具有极显著性差异(P＜0.001)。下述实施例中如无特殊说明，试验设置三次重复。

实施例1、目的基因的获得

1.1、白菜BraDMR1基因序列扩增

根据白菜参考基因组序列设计扩增BraDMR1基因全长的引物BrDMR1-F和BrDMR1-R，BrDMR1-F和BrDMR1-R的核苷酸序列如下所示：

BrDMR1-F：5'-ATGGCAACACTCTGCTTCCACTCT-3'，

BrDMR1-R：5'-TCACCTGGAGACGCTACTAACAAG-3'。

取白菜感病材料胶二叶的幼嫩叶片提取DNA及RNA，并将RNA反转录成cDNA，RNA提取使用华越洋RNA提取试剂盒，反转录所用试剂为TAKARA PrimeScript^TMRT reagentKitwith gDNA Eraser试剂盒，步骤参考试剂盒的使用说明。以胶二叶的cDNA为模板，以引物BrDMR1-F和BrDMR1-R作为上下游引物进行PCR反应扩增BraDMR1的CDS全长序列，以胶二叶的DNA为模板进行PCR反应扩增BraDMR1的DNA全长序列。PCR反应体系如下：cDNA/DNA 2μl，上下游引物各2μl，Tks Gflex DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，2×Gflex PCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)25μl，H2O 18μl。PCR反应程序为94℃预变性1min；98℃10sec，55℃10sec，68℃45sec，共38个循环；4℃保存。PCR产物回收后连入pEASY-Blunt Zero载体、转化DH5α大肠杆菌，经过单克隆筛选、测序、序列分析等获得胶二叶中的BraDMR1序列。

1.2、目的基因及蛋白的序列

BraDMR1基因的编码序列是核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子，BraDMR1基因没有内含子，所以BraDMR1基因的基因组序列也是核苷酸序列为SEQ ID No.1的DNA分子。白菜BraDMR1基因编码的HSK激酶的氨基酸序列是SEQ ID No.2。

表1：序列1和序列2

实施例2、BraDMR1基因敲除株系制备

2.1、BraDMR1敲除靶点选择及敲除载体构建

1)sgRNA表达盒的构建

根据CRIPSR-P(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计BrDMR1基因敲除靶点T1和T2，根据两个靶点序列分别设计引物DMR1-BsF、DMR1-F0、DMR1-R0和DMR1-BsR，并以pCBC-DT1T2载体为模板通过搭桥PCR扩增得到带有靶点序列的sgRNA表达盒DMR1-pCBC-DT1T2。

搭桥PCR反应体系如下：Tks Gflex DNA Polymerase(1.25U/μl)1μl，2×GflexPCR Buffer(Mg2+，dNTP plus)25μl，pCBC-DT1T2(5ng/μL)1μL，DMR1-BsF(20μM)1μL，DMR1-F0(1μM)1μL，DMR1-R0(1μM)1μL，DMR1-BsR(20μM)1μL，ddH2O 19μL，反应总体积50μL。反应程序为：第一轮：94℃变性1min；第二轮：98℃变性10sec，55℃退火10sec，68℃延伸45sec，38个循环。

反应结束后，产物通过1％琼脂糖凝胶电泳检测，产物片段大小为603bp，切取目的片段所在胶块，通过胶回收试剂盒进行片段回收。将胶回收品片段送样测序，DMR1-pCBC-DT1T2的序列如序列表中序列3所示。序列3的第17-36位为sgRNA1的编码序列，第568-586位为sgRNA2的编码序列。DMR1-pCBC-DT1T2的图谱如图1所示。

表2：序列3

靶点及引物的核苷酸序列分别如下：

T1：GGCTGCGCCGTCGACGGCCT(Br1.5ch07g2309817-Br1.5ch07g2309836)；

T1为SEQ ID No.1第217-236位；

T2：GGTCGGAGCTTCGAACTCA(Br1.5ch07g2309339-Br1.5ch07g2309358)；

T2为SEQ ID No.1第696-714位的反向互补序列；

DMR1-BsF：ATATATGGTCTCGATTGGCTGCGCCGTCGACGGCCTGTT(下划线为靶点1(T1)的核苷酸序列)；

DMR1-F0：TGGCTGCGCCGTCGACGGCCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGC(下划线为靶点1(T1)的核苷酸序列)；

DMR1-R0：AACTGAGTTCGAAGCTCCGACCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC

(下划线为靶点2(T2)的反向互补序列)；

DMR1-BsR：ATTATTGGTCTCGAAACTGAGTTCGAAGCTCCGACCCAA(下划线为靶点2(T2)的反向互补序列)；

2)基因编辑载体的构建

将DMR1-pCBC-DT1T2及pKSE401载体分别用Bsa I酶切并后构建BraDMR1-401载体。

Golden Gate酶切连接反应：将带有靶点序列的DMR1-pCBC-DT1T2片段和pKSE401载体通过Bsa I进行酶切，同时通过T4 DNA Ligase进行连接，构成的重组载体命名为BraDMR1-401。具体反应体系如下：DMR1-pCBC-DT1T2片段(100ng/μL)8μL，pKSE401(400ng/μL)2μL，10×T4 Ligase Buffer(NEB)1.5μL，10×BSA 1.5μL，BsaI(NEB)1μL，T4 DNA Ligase(NEB)1μL，反应总体积15μL。反应程序为：第一步：37℃，5h；第二步：50℃，5min；第三步：80℃，10min。

3)转化大肠杆菌

将连接好的载体采用热激法转入大肠杆菌DH5α。将10μl连接产物加入50μl冰上解冻的大肠杆菌DH5α感受态，轻柔混匀后置于冰上30min，42℃热激85s后迅速置于冰上，冷却2min后加入500μl空白LB液体培养基，置于37℃摇床中180rpm震动培养45-60min；根据载体拷贝数取适量菌液涂布于含有100mM的kana固体LB培养基上，置于37℃培养箱中暗培养；12h左右长出单克隆后挑取单克隆并加入500μl液体LB培养基(100mM kana)震动培养6h(37℃，180rpm)至菌液变浑浊，对菌液PCR检测后将阳性单克隆测序，测序正确的单克隆保存菌液并提取质粒。保存菌液时使用60％甘油1:1比例混合，混匀后置于-80℃保存。

质粒提取：取100μl测序正确的大肠杆菌菌液，加入20ml新鲜的液体LB培养基(100mM kana)，37℃、180rpm震动培养过夜，采用诺维赞质粒提取试剂盒提取质粒，提取好的质粒测定浓度后保存。

测序结果表明BraDMR1-401是将序列表中序列3的第14-586所示的DMR1-pCBC-DT1T2片段替换载体pKSE401的Bsa I切割位点之间的片段，保持载体p6401 pKSE401的其他序列不变，得到的重组表达载体。BraDMR1-401表达靶向于BraDMR1基因的sgRNA1(靶标序列为T1)和sgRNA2(靶标序列为T2)。

4)转化农杆菌

取1μg提取好的质粒加入50μl农杆菌GV3101感受态，混匀后冰上放置10min，液氮中冰冻处理5min，立即放于37℃水浴锅中5min，取出后立即置于冰上5min，之后加入新鲜的液体LB培养基，置于28℃摇床中180rpm震动培养2-3h；取100μl菌液涂布于固体LB培养基上(100mM kana，50mM rifampin)置于28℃培养箱中暗培养；2d后长出单克隆，挑取单克隆并加入1ml液体LB培养基(100mM kana，50mM rifampin)震动培养24h(28℃，180rpm)至菌液变浑浊，对菌液PCR检测后将阳性单克隆保存菌液。

2.2、BraDMR1敲除植株的获得

利用上述转化好的携带BraDMR1-401载体的农杆菌侵染胶二叶叶片，获得转基因植株，具体方法如下：

1)播种

将种子装入10ml离心管并加入5ml左右75％的乙醇，震动45s，立即在超净工作台内倒掉所有酒精，用冷却的无菌水冲洗3次，加入5ml左右次氯酸钠NaClO₃，震动8-10min，立即倒掉所有液体，用无菌水冲洗4-6次，吸干所有液体后即可播种于MS固体培养基。播种后暗培养2d后置于16h光照、8h黑暗条件下直至子叶完全展开即可。

2)侵染

子叶完全展开后将其切下，平铺于MSO固体培养基上，暗培养2d后侵染菌液。菌液直接倒入平铺子叶的培养皿内，晃动8-10min后吸干菌液，暗培养2d即可转移至MS培养基。侵染前菌液准备：将含有BraDMR1-401质粒的农杆菌GV3101用液体LB(kana 100Mm，50mMrifampin，100μM AS)培养基摇床培养(28℃，180rpm)至OD600＝0.8-1.0，常温4000rpm离心10min收集菌体并用液体MSO培养基(100mg/ml NAA，100mg/ml 6-BA，100μM AS)重悬至OD600＝0.6。

3)筛选培养

侵染后的子叶转移至MS培养基，每14d或子叶变黄时更换一次培养基，直至出现再生苗。

4)生根

再生苗长出健壮根系后即可练苗定植。

5)定植

完全去除再生苗根部培养基，定植于营养钵内并套袋，缓苗后即可逐渐去除袋子。

获得的基因编辑植株为T₀代，T₀代自交获得T₁代。

2.3、BraDMR1敲除后代敲除位点检测

将获得的基因编辑植株T₁代、野生型植株感病材料胶二叶、野生型植株抗病材料536浅播种于50孔穴盘中，提取DNA进行PCR扩增，对PCR产物测序，进行敲除位点检测。

根据测序结果共获得3株纯合的基因编辑植株，分别命名为：BraDMR1-CP1、BraDMR1-CP2和BraDMR1-CP3，敲除株系中BraDMR1敲除位点检测的结果如图3所示。图3中，胶二叶为基因编辑前的野生型基因序列，BraDMR1-CP1、BraDMR1-CP2和BraDMR1-CP3为基因编辑后的序列；但是由于该基因在染色体上是一个反向的基因(基因起始位点位于2310052位置，终止密码子位于2308940位置)，序列比对的时候是顺着染色体序列(2308940至2310052)比对的，与该基因的序列(2310052至2308940)是反向互补的。

测序结果表明：

与胶二叶野生型(胶二叶)相比，BraDMR1-CP1突变体的BraDMR1基因突变为BraDMR1-1基因，BraDMR1-1基因是将序列表中序列1的第395位(碱基为C的脱氧核苷酸)缺失，其编码序列是将序列表中序列1的第395位的碱基C缺失，导致移码突变和翻译提前终止，从而将BraDMR1基因敲除；

与胶二叶野生型(胶二叶)相比，BraDMR1-CP2突变体的BraDMR1基因突变为BraDMR1-2基因，BraDMR1-2基因是将序列表中序列1的第343位(碱基为G的脱氧核苷酸)突变为A(碱基为A的脱氧核苷酸)、第337位(碱基为T的脱氧核苷酸)突变为C(碱基为C的脱氧核苷酸)、第336位(碱基为T的脱氧核苷酸)缺失、第313位(碱基为C的脱氧核苷酸)突变为A(碱基为A的脱氧核苷酸)，其编码序列是将序列表中序列1的第343位(碱基为G的脱氧核苷酸)突变为A(碱基为A的脱氧核苷酸)、第337位(碱基为T的脱氧核苷酸)突变为C(碱基为C的脱氧核苷酸)、第336位(碱基为T的脱氧核苷酸)缺失、第313位(碱基为C的脱氧核苷酸)突变为A(碱基为A的脱氧核苷酸)，导致移码突变和翻译提前终止，从而将BraDMR1基因敲除；

与胶二叶野生型(胶二叶)相比，BraDMR1-CP3突变体的BraDMR1基因突变为BraDMR1-3基因，BraDMR1-3基因是将序列表中序列1的第313位(碱基为C的脱氧核苷酸)缺失，其编码序列是将序列表中序列1的第313位(碱基为C的脱氧核苷酸)缺失，导致移码突变和翻译提前终止，从而将BraDMR1基因敲除。

本实验共鉴定T1代植株100株，仅筛选出以上3株纯合敲除植株。

2.4、基因编辑植株的抗病性鉴定

T₁代BraDMR1敲除植株BraDMR1-CP1、BraDMR1-CP2和BraDMR1-CP3，及未敲除植株、野生型植株感病材料胶二叶、野生型植株抗病材料536浅，长至两叶一心后接种白菜霜霉菌进行抗病性鉴定。

病原菌准备：白菜霜霉菌为活体寄生菌，将接种霜霉菌7d左右的白菜置于湿度大于90％rh、黑暗的环境中12h，即可在叶片背面长出霉层及霜霉菌孢子，用刷子取下霜霉菌孢子后悬浮于水中，配置成侵染液，侵染液浓度约为1.0x10⁸ cfu。

病原菌接种：将配置好的病原菌悬浮液喷与待接种植株(基因编辑植株T₁代BraDMR1-CP1、BraDMR1-CP2和BraDMR1-CP3，胶二叶野生型植株、抗病材料536浅、T1代未敲除植株)的所有真叶及子叶背面，并置于22℃、湿度大于90％rh、黑暗的环境中24h，之后放置在22℃、正常湿度的16h光照环境中6d。第7天再将所有植株置于22℃、湿度大于90％rh、黑暗的环境中12h，即可观察抗性表型，抗性鉴定结果分别以感病材料野生型胶二叶、抗病材料536浅为对照。

结果如图2和图4所示所示，图2为BraDMR1敲除后不同单株病斑面积比例的照片，图4为BraDMR1敲除后不同单株病斑面积比例的柱形图。结果表明：敲除BraDMR1的单株BraDMR1-CP1、BraDMR1-CP2和BraDMR1-CP3接种霜霉菌后出现不同程度的抗性增强，病斑面积显著少于野生型感病材料胶二叶。

基因编辑株系T₁代BraDMR1-CP1、BraDMR1-CP2和BraDMR1-CP3与感病亲本胶二叶(胶二叶)相比抗性明显增强，其余未敲除单株感病性与感病亲本一致。图5为部分未敲除BraDMR1基因的白菜单株霜霉病抗性鉴定结果，结果表明：未敲除BraDMR1的白菜植株，霜霉病抗性未提高。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.应用，其特征在于：所述应用为C1)或C2)或C3)：

C1)、HSK激酶或调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质在调控植物抗病性中的应用；

C2)、HSK激酶或调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质在制备调控植物抗病性的产品中的应用；

C3)、HSK激酶或调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质在植物育种中的应用；

所述HSK激酶为如下A1)或A2)或A3)：

A1)、氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白质；

A2)、将A1)所示的氨基酸序列经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有调控植物抗病性的功能的蛋白质；

A3)、在A1)或A2)的N末端或/和C末端连接蛋白标签得到的融合蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述HSK激酶来源于白菜，所述植物抗病性为植物霜霉病抗性，所述霜霉病为专性寄生霜霉菌(Peronospora parasitica(Pers)Fr.)侵染植物引起的真菌性病害。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控所述HSK激酶编码基因表达的物质或调控所述HSK激酶活性或含量的物质为生物材料，所述生物材料为下述B1)至B15)中的任一种：

B1)、抑制或降低或下调所述HSK激酶的编码基因的表达的RNA分子或抑制或降低或下调所述HSK激酶的活性或含量的RNA分子；

B2)、表达B1)所述RNA分子的编码基因；

B3)、含有B2)所述编码基因的表达盒；

B4)、含有B2)所述编码基因的重组载体、或含有B3)所述表达盒的重组载体；

B5)、含有B2)所述编码基因的重组微生物、或含有B3)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B6)、含有B2)所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有B3)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B7)、含有B2)所述编码基因的转基因植物组织、或含有B3)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；

B8)、含有B2)所述编码基因的转基因植物器官、或含有B3)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B4)所述重组载体的转基因植物器官；

B9)、编码所述HSK激酶的核酸分子；

B10)、含有B9)所述核酸分子的表达盒；

B11)、含有B9)所述核酸分子的重组载体、或含有B10)所述表达盒的重组载体；

B12)、含有B9)所述核酸分子的重组微生物、或含有B10)所述表达盒的重组微生物、或含有B11)所述重组载体的重组微生物；

B13)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B11)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B14)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B11)所述重组载体的转基因植物组织；

B15)、含有B9)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B11)所述重组载体的转基因植物器官。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：B1)所述RNA分子为靶向所述HSK激酶编码基因的gRNA，所述gRNA的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.1第217-236位和/或所述gRNA的靶标序列的核苷酸序列是SEQ ID No.1第696-714位的反向互补序列。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

B2)所述编码基因为表达靶向所述HSK激酶编码基因的gRNA的DNA分子；

B9)所述核酸分子为BraDMR1基因，BraDMR1基因为如下b1)、b2)或b3)所示的DNA分子：

b1)、编码链的编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b2)、编码链的核苷酸序列是SEQ ID No.1所示的DNA分子；

b3)、与b1)或b2)所示的DNA分子具有80％的同一性，且编码HSK激酶的DNA分子。

6.一种调控植物抗病性的方法，其特征在于：所述方法包括通过调控所述HSK激酶编码基因的表达或调控所述HSK激酶的活性或含量，来调控植物抗病性。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括向受体植物中导入权利要求5中所述gRNA分子的编码基因和Cas蛋白的编码基因来抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶编码基因的表达或抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶的活性或含量，得到抗病性与受体植物不同的目的植物或抗病性高于所述受体植物的目的植物。

8.一种制备抗霜霉病白菜的方法，所述方法包括向受体白菜中导入权利要求5中所述gRNA分子的编码基因和Cas蛋白的编码基因来抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶编码基因的表达或抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶的活性或含量，得到抗病性抗病性高于所述受体白菜的目的白菜。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶编码基因的表达或抑制或降低所述受体植物中所述HSK激酶的活性或含量为将序列表中序列1进行下述任一种突变：

M1)将BraDMR1基因突变为BraDMR1-1基因，BraDMR1-1基因是将序列表中序列1的第395位的核苷酸C缺失得到的DNA分子；

M2)将BraDMR1基因突变为BraDMR1-2基因，BraDMR1-2基因是将序列表中序列1的第343位的脱氧核苷酸G突变为A、第337位的脱氧核苷酸T突变为C、第336位的脱氧核苷酸T缺失、第313位的脱氧核苷酸C突变为A获得的DNA分子；

M3)将BraDMR1基因突变为BraDMR1-3基因，BraDMR1-3基因是将序列表中序列1的第313位的脱氧核苷酸C缺失得到的DNA分子。

10.权利要求1或2所述应用中的所述蛋白质或权利要求3-5中任一项所述应用中的所述生物材料。

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