CN116333078A - 小麦坏死相关因子TaVPE3及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程技术领域，公开了一种小麦坏死相关因子TaVPE3及其应用。小麦坏死相关因子TaVPE3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码基因开放阅读框序列如SEQ ID NO：2所示。本发明利用农杆菌介导的遗传转化，获得了TaVPE3的转基因植株，转基因TaVPE3 RNAi植株对CYR23抗性降低。本发明揭示TaVPE3基因在小麦抗条锈病中起正调作用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及小麦的调控因子，具体涉及小麦坏死相关因子TaVPE3及其应用。
背景技术
小麦是全球种植面积最广泛、产量最大的禾谷科作物之一。小麦条锈病是由活体专性寄生真菌条形柄锈菌（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起的一种严重危害小麦生产的流行性真菌病害。条锈菌定型变异，毒性小种不断涌现，导致植株抗病性丧失。因而，寻找抗条锈病基因，从分子水平解析小麦对条锈菌防御机制对防治小麦条锈病具有重要意义。由于基因型相似、抗源相同的抗病品种广泛种植，单一抗病基因对条锈菌造成了巨大的选择压力，条锈菌毒性迅速变异，一旦病原菌群体毒性变异，现有品种的抗性就会被克服，从而导致病害的大爆发。
过敏性坏死反应（HR）是植物最常见的一种抗病形式。研究表明具有caspase活性的液泡加工酶（vacuolar processing enzyme，VPE）参与了液泡蛋白的成熟以及激发子诱导的HR。近年来TaVPE3的研究主要集中在对植物抵抗非生物逆境调控上，而其在植物应对病原菌侵染中的作用及作用机制还鲜有报道。
目前，小麦条锈病的防治方法以化学防治为主，使用化学农药给环境和食品安全所带来的危害已引起人们的普遍关注。抗病育种是防治小麦条锈病最为经济有效的措施之一。但抗病基因的挖掘周期长，抗病品种的培育难度大，而且条锈菌毒性变异快，导致该病害在防治中一直难以实现持久的控制。因此，创制广谱、持久的抗病材料是防控小麦条锈病的根本途径和关键技术。
发明内容
本发明的目的在于解决传统抗病育种存在生殖隔离和远缘杂交不亲和性，在较短培育周期内难以实现目标性状的定向改良；同时，条锈菌毒性变异快，致使小麦条锈病持久防控在当前技术条件下尚存在诸多困难。
为解决现有技术问题实现本发明的技术目的，本发明在现有技术的基础上进一步探素小麦天然免疫防御机制，挖掘在条锈菌入侵小麦的防御反应中起正调控作用的抗病基因，通过开展基因功能研究，为利用该抗病基因创制小麦抗病材料防控小麦条锈病提供新路径。
本发明提供了一种小麦坏死相关因子TaVPE3。小麦坏死相关因子TaVPE3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因ORF（开放阅读框）序列如SEQ ID NO：2所示。
进一步地，本发明提供了小麦坏死相关因子TaVPE3在小麦抗条锈品种培育中的应用。
在本发明提供的应用中，所述小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因ORF序列受农杆菌介导的遗传转化表达，在小麦与条锈菌互作中具有正调控作用，过表达所述小麦坏死相关因子TaVPE3能增强小麦对条锈病病菌的抗性。
还有，本发明提供了一种小麦抗条锈品种培育方法，包括：在植株内表达小麦坏死相关因子TaVPE3或在所述植株内转入小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因ORF序列。
在本发明提供的小麦抗条锈品种培育方法中，包括：将所述小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因ORF序列转化入所述植株的细胞，得到基因编辑所述小麦坏死相关因子TaVPE3的植物品种。
在本发明提供的小麦抗条锈品种培育方法中，包括：构建包含所述小麦坏死相关因子TaVPE3编码ORF序列的编辑载体；利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化所述植株幼胚，得到基因编辑所述小麦坏死相关因子TaVPE3的植物品种。
进一步地，在本发明提供的小麦抗条锈品种培育方法中，所述植株为单子叶植物，所述单子叶植物为禾谷类作物，所述禾谷类作物为小麦。
与现有技术相比，本发明的有益效果或优点：
（1）与传统抗病育种技术相比，植物抗病基因工程技术可以突破物种间的生殖隔离和远缘杂交不亲合性，在较短的时间内实现目标性状的定向改良，给作物提供更为全面、持续、广谱的保护。本发明通过基因功能研究，发现TaVPE3基因受到条锈菌非亲和小种的诱导，在条锈菌入侵小麦的防御反应中起正调控作用，即小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因ORF序列过表达能够提高小麦抗条锈病的能力。小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因ORF序列在植物体内过量表达时，可以赋予植物一定的抗病性。
（2）本发明提供了一种小麦抗条锈品种培育方法。该方法借助基因工程技术，在小麦植株体内过表达所述的小麦坏死相关因子TaVPE3，增强小麦对条锈病病菌的抗性。经验证，采用本发明方法获得的转基因小麦对条锈菌主要的流行小种表现出抗性。TaVPE3转基因植株对田间流行的多种小种CYR32、CYR33和CYR34都表现出抗性，因此，可以利用该坏死相关因子创制了广谱抗锈的品系，为抗条锈品种的培育提供优良的小麦材料。
附图说明
图1为小麦坏死相关因子TaVPE3在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用的验证方法流程图。
图2为小麦坏死相关因子TaVPE3基因的表达谱分析示意图。
图3为小麦坏死相关因子TaVPE3基因沉默片段图解及特异性沉默TaVPE3基因表型结果示意图。大麦条纹花叶病毒（Barley stripe mosaic virus，BSMV），MOCK（左）为水源11未接BMSV病毒；BSMV:γ为空载体接BMSV病毒；BSMV:TaVPE3-as1为TaVPE3基因片段1接BMSV病毒；BSMV:TaVPE3-as2为TaVPE3基因片段2接BMSV病毒；BSMV:γ-PDS为阳性对照PDS接BMSV病毒（会使叶片漂白）；MOCK（右）为水源11未接BMSV病毒接CYR23；BSMV:γ为空载体接BMSV病毒接CYR23；BSMV:TaVPE3-as1为TaVPE3基因片段1接BMSV病毒CYR23；BSMV:TaVPE3-as2为TaVPE3基因片段2接BMSV病毒CYR23。
图4为小麦坏死相关因子TaVPE3 -RNAi植株PCR检测结果示意图。MARKER为DNAMARKER；L6为T2代阳性植株；L14为T2代阳性植株；PC为阳性质粒；NC为阴性对照；WT为野生型植株。
图5为TaVPE3 RNAi植株接种条锈菌主要流行小种表型结果示意图。WT为野生型植株；L6为T2代阳性植株；L14为T2代阳性植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但本发明并不限于下述的实施例。
为了使本领域技术人员更好地理解、实施本发明的技术方案，结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
各实施例中所涉及的实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所涉及的试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
本发明实施例利用植物植物基因工程技术将小麦TaVPE3基因转化入小麦细胞，得到表达TaVPE3的小麦品种。具体地，本领域技术人员利用现有技术构建包含小麦TaVPE3基因的植物表达载体；利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化小麦幼胚，得到TaVPE3转基因小麦。
如图1所示，本发明实施例提供的小麦TaVPE3在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用的验证方法包括：
S101，获取TaVPE3转基因小麦，对获得的TaVPE3转基因小麦进行分子检测；
S102，对T2代的转基因植株接种条锈菌主要流行小种，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种的抗性，确定表达TaVPE3的小麦品种的抗条锈病特性。
本发明实施例提供的功能鉴定方法包括：
基于qRT-PCR以延伸因子基因TaEF1-α为内参，利用基因TaVPE3的特异引物进行实时定量PCR，确定TaVPE3基因在条锈菌侵染小麦的不同侵染时间的表达量；
利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默坏死相关基因TaVPE3，于二叶接种病毒第7天检测在沉默TaPDS后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；于3叶接种小麦条锈菌新鲜孢子接种后第12天检测叶片表面是否出现漂白状，若是，则表示病毒接种成功。
利用农杆菌介导的遗传转化的方法创制TaVPE3干扰植株，对转基因植株接种主要流行小种，进行表型鉴定发现TaVPE3-RNAi植株对条锈菌表现出广谱抗性减弱。
TaVPE3-cDNA-F：ATGGCGATGGCGTCCTT；
TaVPE3-cDNA-R：TTAAGCACTAAAACCCTTGTGTGT。
为了明确分析基因TaVPE3在小麦与条锈菌互作中的功能，对基因TaVPE3在条锈菌侵染小麦的亲和、非亲和体系的不同阶段进行表达谱分析，结果（图2）发现TaVPE3在非亲和体系中条锈菌侵染24 h表达量达到最高，而在亲和体系中的表达几乎没有变化。这说明基因TaVPE3在小麦对条锈菌抗性中发挥功能。
定量引物：
TaVPE3-qRT-F：GTCAAACCCTGCTAACGAG；
TaVPE3-qRT-R：CCACCCACAGAACCAAAC。
内参引物：
TaEF1-F：TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT；
TaEF1-R：ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT。
如图2所示，TaVPE3基因在小麦与条锈菌非亲和表达下，24 h出现明显上调诱导表达趋势。48h、72h都有不同程度的上调，而后表达量逐渐恢复至对照水平；在亲和组合中，除接种后24 h TaVPE3基因呈现轻微的上调表达外，在其它各个时间点相对表达量变化并不明显，说明TaVPE3基因参与小麦与条锈菌互作的非亲和的过程。
本发明实施例利用病毒诱导的瞬时沉默技术，分别对基因TaVPE3的两个特异片段进行了基因沉默。在小麦生长16 d进行摩擦接种。接种后放置于24℃黑暗100%保湿24 h，随后放置到24℃光照16 h、黑暗8 h光周期的生长培养箱中。接种7 d后可以观察到接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，则证明接种成功。接种条锈菌无毒性小种CYR23，放置到保湿箱内16℃黑暗保湿24 h，接着转置于16℃光照16 h、14℃黑暗8 h光周期的生长培养箱中。待接种14 d可以观察到沉默基因TaVPE3的叶片上产生了孢子堆。说明TaVPE3参与到小麦对条锈菌的抗性中。
本发明实施例所用沉默片段的载体构建引物：
TaVPE3-Vigs-2AS-F：CCTTAATTAAATCCATGGCGATGGCGTC；
TaVPE3-Vigs-2AS-R：TATGCGGCCGCGAGTCATCGTCCTCCTGCCC。
TaVPE3-VIigs-1AS-F：CCTTAATTAACATTGTTCCTGAAGCGATG；
TaVPE3-Vigs-1AS-R：TATGCGGCCGCCAAGCACTACTGACCCTGTGT。
接种BSMV:γ-PDS-as植株新长叶片出现光漂白现象，不同处理接种病毒均出现病毒症状，说明沉默系统运行正常，可以继续进行实验。在接种条锈菌后第12天观察叶部表型。如图3所示，接种CYR23后在对照和不同沉默植株的叶片上均观察到明显地过敏性坏死反应，但在接种BSMV:TaVPE3-as1，BSMV:TaVPE3-as2病毒的叶片上均产生少量夏孢子堆。这表明TaVPE3基因的沉默减弱了小麦“水源11”品种对条锈菌无毒性小种CYR23的抗病性。
为进一步揭示基因TaVPE3在小麦抗锈病品种改良中的应用，本发明实施例通过农杆菌介导的遗传转化获得的转基因植株进行PCR检测，选取了T2代的L6和L14两个株系分别接种主要流行小种CYR23，结果发现TaVPE3-RNAi植株对条锈菌CYR23表现出抗性降低。
本发明实施例所用RNAi载体构建引物：
TaVPE3-RNAi-F：GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTACCATTGTTCCTGAAGCGATG；
TaVPE3-RNAi-R：GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTACAAGCACTACTGACCCTGTGT。
为明确基因TaVPE3在小麦与小麦条锈菌中的功能，本专利发明人创制了TaVPE3- RNAi转基因材料。将获得的小麦RNAi转基因T0代幼苗从生根培养基中取出，并将根部清洗干净，然后单株种植于富含营养基质的花盆中，进行培养。待幼苗生长至合适时期，采集叶片，通过CTAB法提取基因组DNA。图4为小麦坏死相关因子TaVPE3 -RNAi植株PCR检测结果示意图。经PCR鉴定，阴性对照和野生型植株没检测到条带，而L6、L14两个阳性植株检测到的条带大小和阳性质粒检测的一样，说明结果正确，从而得到阳性植株。
选供试小麦种子，每盆约25粒种子均匀散播于直径10 cm的陶瓷小花盆中，后置于14-17°C，16/8 h光/暗周期的温室中培养。约8天后，待第一叶完全展平，进行条锈菌接种。接种时首先用无菌水悬浮条锈菌CYR23新鲜夏孢子，用毛笔轻轻蘸取条锈菌并均匀涂抹于小麦叶片正面，以相同方法接种无菌水作为对照。接种完成后，将幼苗放在保湿柜中低温、黑暗充分保湿24 h，之后转移至16℃左右，16/8 h光/暗周期的温室中培养，14天后统计结果，试验结果见图5。由图5可知，在接种小麦条锈菌CYR23生理小种后，TaVPE3 -RNAi植株有不同程度的产孢现象，而野生型Fielder则为典型的细胞过敏性坏死。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (5)
1.小麦坏死相关因子TaVPE3在小麦抗条锈品种培育中的应用，其特征在于，所述小麦坏死相关因子TaVPE3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述小麦坏死相关因子TaVPE3的编码基因开放阅读框序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述小麦坏死相关因子TaVPE3在小麦与条锈菌互作中具有正调控作用，过表达所述小麦坏死相关因子TaVPE3增强小麦对条锈病病菌的抗性。
3.一种小麦抗条锈品种培育方法，其特征在于，在小麦植株内表达小麦坏死相关因子TaVPE3，或在所述小麦植株内转入小麦坏死相关因子TaVPE3的编码基因开放阅读框序列；
所述小麦坏死相关因子TaVPE3的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；
所述小麦坏死相关因子TaVPE3的编码基因开放阅读框序列如SEQ ID NO：2所示。
4.根据权利要求3所述的小麦抗条锈品种培育方法，其特征在于，包括：将所述小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因开放阅读框序列转化入所述小麦植株的细胞，得到基因编辑所述小麦坏死相关因子TaVPE3的植物品种。
5.根据权利要求3所述的小麦抗条锈品种培育方法，其特征在于，包括：构建包含所述小麦坏死相关因子TaVPE3编码基因开放阅读框序列的编辑载体；利用农杆菌介导的遗传转化的方法转化小麦植株幼胚，得到基因编辑所述小麦坏死相关因子TaVPE3的植物品种。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 段小圆: "小麦与条锈菌互作过程中类受体激酶基因和坏死相关基因VPE的克隆及功能研究", 中国博士学位论文全文数据库 农业科技辑, pages 3 * |
| 王康: "小麦与条锈菌互作过程中坏死相关基因 TaVPE3 功能研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑 (月刊), no. 6, pages 3 * |
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