CN116375839B - 毒性效应蛋白及其在小麦抗病育种中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毒性效应蛋白Pst_20643，在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码该毒性效应蛋白的Pst_20643基因的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。Pst_20643基因在条锈菌侵染过程中上调表达。将Pst_20643基因特异片段克隆入干扰载体，利用农杆菌介导的转基因技术转化小麦幼胚，获得的转基因小麦植株对小麦条锈菌表现出抗性。本发明为利用效应蛋白Pst_20643及其编码基因创制小麦抗病材料，培育持久抗条锈病小麦品种提供了技术思路。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及效应蛋白及其编码基因作用机制，具体涉及一种在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能的效应蛋白、编码基因及其在抗性品种选育中的应用。
背景技术
小麦条锈病是由条形柄锈菌小麦专化形（Puccinia striiformis f.sp.Tritici，Pst）引起的一类重大真菌病害。由于该病害具有气传性，发生面积广，流行频率高，危害损失大，严重威胁着小麦粮食生产安全。目前小麦条锈病的防治方法以化学防治为主，化学农药给环境和粮食安全造成的危害已引起人们的普遍关注。因此抗病育种是防治小麦条锈病最为经济有效的措施之一。但抗病基因的挖掘周期长，抗病品种的培育难度大，而且条锈菌毒性变异快，导致该病害在防治中一直难以实现持久的控制。因此，创制广谱、持久的抗病材料是防控小麦条锈病的根本途径。
效应蛋白是由病原菌分泌的一类外泌型蛋白分子，通过植物病原互作可以改变寄主植物细胞的结构和防卫途径，进而促进病原菌对寄主植物成功侵染及定殖或者触发寄主防卫反应。病原菌侵染寄主植物分泌的效应蛋白，通过靶定植物不同的抗病途径操控寄主抗性反应，促进病原菌侵染。条锈菌与小麦互作时分泌的效应蛋白，促进条锈菌侵染小麦或者激发寄主防卫反应。效应蛋白主要通过改变寄主植物细胞的结构功能以及调控寄主的免疫系统，促进对寄主植物的成功侵染。因此，效应蛋白在病原菌致病过程中具有极其重要的作用。基于此，通过揭示条锈菌的致病机制、鉴定条锈菌毒性效应蛋白，为利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料提供新思路和育种材料。
发明内容
条锈病是严重危害小麦生产的主要病害之一，化学农药防治方法的技术缺陷日益显现并引发人们关注。条锈菌毒性变异快，传统抗病品种培育周期长，小麦条锈病持久防控尚存在诸多困难。目前对条锈菌侵染小麦过程中的效应蛋白的认知尚不清晰，关键效应蛋白的筛选与发掘仍为当前利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料需要解决的核心技术问题。
针对现有技术存在的上述问题，本发明通过分子生物学和基因工程手段，提供了一种利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料的新的技术方案。本发明筛选鉴定出了小麦条锈致病菌侵染小麦的关键毒性效应蛋白（病原菌致病因子），即本发明所述的毒性效应蛋白Pst_20643。经证实，所述效应蛋白Pst_20643的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能。
目前，尚未见小麦条锈菌侵染中的关键效应蛋白及其在小麦品种改良、新品种培育中的应用。小麦条锈菌效应蛋白的发掘及利用，是小麦作物改良最为经济有效的措施之一，对培育抗锈小麦品种防治小麦条锈病的流行至关重要。本发明所述效应蛋白Pst_20643是抑制小麦作物免疫相关的重要或关键效应蛋白。基于此，本发明请求保护所述的毒性效应蛋白Pst_20643在小麦抗条锈品种培育中的应用。
基于本发明的记载，本发明首次提出小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643在小麦抗条锈品种培育中的应用，本领域普通技术人员结合现有技术，不难实现抗条锈小麦品种的培育工作。作为培育抗条锈小麦品种应用的优选实施方式，通过基因沉默抑制所述效应蛋白Pst_20643表达，提高小麦对条锈菌的抗性。
本发明采用反向遗传学方法获知了所述效应蛋白Pst_20643的编码基因Pst_ 20643。所述基因Pst_20643的开放阅读框，具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。经证实，Pst_20643基因在条锈菌侵染过程中上调表达。采用寄主介导的基因沉默技术沉默Pst_ 20643基因，确定Pst_20643基因在条锈病侵染过程中的毒性功能。
进一步地，本发明请求保护所述的基因Pst_20643在小麦抗条锈品种培育中的应用。作为所述应用的优选实施方式，沉默所述Pst_20643基因，提高小麦对条锈菌的抗性。本领域普通技术人员结合现有技术，通过基因工程技术手段，可以获得沉默Pst_20643基因表达的转基因小麦材料，以显著提高小麦植株对条锈菌的抗性。
本发明意在利用毒性效应蛋白Pst_20643及其编码基因，创制抗锈的小麦品系，为抗条锈品种的培育提供优良的小麦材料。为此，本发明提供了一种小麦抗病育种的方法，其将Pst_20643基因沉默片段转入小麦材料，得到沉默所述Pst_20643基因的小麦品种，所述Pst_20643基因沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明所述小麦抗病育种的方法，包括构建包含Pst_20643基因的表达载体；农杆菌介导转入小麦幼胚；得到所述Pst_20643基因沉默的转基因小麦。所述表达载体含有所述Pst_20643基因沉默片段。
进一步地，利用植物基因工程技术将小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643基因特异片段转化入小麦细胞，得到小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643RNAi的小麦品种。更进一步地，构建包含小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643基因的植物干扰载体；利用农杆菌介导的遗传转化方法，将植物干扰载体转化小麦幼胚；得到Pst_20643RNAi转基因小麦。
为了完整无异议地理解本发明的技术方案，需要补充说明的是，本发明所述毒性效应蛋白用非倾斜字体“Pst_20643”表示，所述效应蛋白Pst_20643的编码基因用倾斜字体“Pst_20643”表示。当然，本领域普通技术人员可以根据本发明的记载，清楚、完整地理解相关基因及其编码蛋白的含义与表述。
与现有技术相比，本发明“毒性效应蛋白及其在小麦抗病育种中的应用”具有下述的有益效果或优点：
1）本发明首次揭示效应蛋白Pst_20643在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能，是一种小麦条锈菌关键毒性效应蛋白。效应蛋白Pst_20643具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明通过解析小麦条锈病的致病机理，为利用效应蛋白Pst_20643及其编码基因创制小麦抗病材料奠定理论基础，对培育持久抗条锈病小麦品种具有重要的意义。
2）本发明为创制小麦抗病材料提供了新的技术思路。借助基因工程技术，通过小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643基因沉默，提高小麦对条锈病的抗性，本发明为从分子生物学角度开展小麦抗条锈品种培育提供了新的解决思路。
3）本发明明确了一种小麦抗条锈品种培育方法。该方法是将小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643基因沉默片段转入小麦材料，得到沉默所述效应蛋白Pst_20643基因的小麦品种。Pst_20643RNAi转基因植株对小麦条锈菌CYR31表现出抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所涉及附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。
图1是本发明实施例提供的小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643在培育、改良小麦抗锈病品种中的应用的验证方法流程图。
图2是本发明实施例提供的小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643基因的表达谱分析示意图。图2中的US表示未萌发孢子。
图3是本发明实施例提供的Pst_20643基因沉默表型结果示意图。图3中第一组图为沉默示意图。第一组图中PDS表示沉默八氢番茄红素脱氢酶基因；第一组图中00表示γ空载体，作为阴性对照；第一组图中Pst_20643表示沉默Pst_20643基因，PDS发生光漂白现象，表明进行了有效沉默；图3中第二组图是表示沉默后接菌表型示意图，第二组图中00表示阴性对照接种CYR31表型示意图；第二组图中Pst_20643表示沉默Pst_20643基因后接种CYR31表型示意图。
图4是本发明实施例提供的获得Pst_20643干扰载体图。图4中LB、HPT、BAR、Ubi-pro、Gus-Linker、T-Nos、RB分别表示左边框、潮霉素标记基因、抗除草剂基因、植物泛素启动子、β-葡萄糖苷酸酶基因、T-Nos终止子、右边框。
图5是本发明实施例提供的Pst_20643RNAi接种条锈菌表型结果示意图。图5中WT表示野生型Fielder，L2表示Pst_20643RNAi转基因小麦第2个品系，L5表示Pst_20643RNAi转基因小麦第5个品系。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例和说明书附图，对本发明做进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明的保护范围。
实施例1
从小麦与条锈菌互作转录组中筛选获得在小麦条锈菌侵染阶段上调表达效应蛋白Pst_20643，并利用NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），得到小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
实施例2
以正常土培的小麦品种水源11为模式材料，在小麦幼苗二叶一心期，采用毛笔接种条锈菌生理小种CYR31并进行保湿，12小时、24小时、36小时、48小时、72小时、120小时、168小时采样并提取样品总RNA。总RNA的提取采用Trizol试剂（购自Invitrogen），并进行RNA的纯化。
采用逆转录酶M-MLV（购自Thermo scientific）将总RNA逆转录合成cDNA第一链，反应条件为：42℃，60min；70℃，5min。然后，从每个时间点样品的cDNA取出一定量混合成总模板，利用Pst_20643基因特异性引物F1（5'-ATGAAGAGCATCAATTCTT-3'）和R1（5'-TCATTTTCGACCTTTTTTTGCAC-3'）进行PCR扩增，扩增出含有Pst_20643基因全长编码框的DNA片段，反应条件为：95℃预变性5min；95℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 3min，35个循环；72℃补充延伸5min。
将获得的PCR扩增产物进行T连接，构建到pGEM-T载体（购自TaKaRa），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自TaKaRa），筛选检测出阳性克隆并过夜摇菌，提取质粒命名为Pst_20643-T，测序（杨凌奥科生物技术公司）。得到基因Pst_20643的开放阅读框，具有如SEQ IDNO：2所示的核苷酸序列。
实施例3
本实施例描述Pst_20643基因的表达谱分析。在实施例1和2的基础上，采用实时荧光定量PCR技术，分析Pst_20643基因在条锈菌侵染下的表达谱。
以提取的不同时间点样品的小麦-条锈菌互作cDNA为模板，以小麦延伸因子基因为内参基因（qRT-TaEF-F：5’-TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT-3’和qRT-TaEF-R：5'-ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT-3'），利用Pst_20643基因特异性引物（Pst_20643-F：5'-CAAGCCTCAGTCCCGAT-3'和Pst_20643-R：5'-GATGTTTTCTGTCCCGTCA-3'）进行实时荧光定量PCR，反应条件为：95℃预变性3min；95℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，40个循环。
图2呈现了小麦品种水源11接种条锈菌生理小种CYR31后，小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643在不同时间点的表达谱。由图2可以获知，Pst_20643基因在侵染小麦水源11中上调表达，是一个与小麦条锈菌毒性相关的基因。
实施例4
通过序列比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）及特异性分析，Pst_20643基因具有一段序列特异性较高的基因片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）。本实施例以此特异性基因片段为基础构建Pst_20643基因沉默载体。
Pst_20643基因沉默载体的构建过程参照实施例2。以条锈菌-小麦互作的cDNA文库为模板，以Pst_20643基因特异性引物扩增出代表Pst_20643基因的特异性沉默片段，（核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）。将其通过同源重组方式构建γ载体，并利用病毒诱导的瞬时沉默技术，对小麦条锈菌效应蛋白Pst_20643的特异片段进行沉默。具体实施为在小麦生长16天进行摩擦接种大麦条纹花叶病毒，接种后放置于24℃黑暗100%保湿24小时，随后放置到24℃光照16小时，黑暗8小时光周期的生长培养箱中。接种7天后可以观察到接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，则证明病毒接种成功。接种条锈菌毒性小种CYR31，放置到保湿箱内16℃黑暗保湿24小时，接着转置于16℃光照16小时，14℃黑暗8小时光周期的生长培养箱中。待接种14天可以观察沉默Pst_20643的叶片上孢子堆减少。说明Pst_20643在小麦条锈菌侵染小麦过程中发挥毒性功能，并基于此实验结果创制Pst_20643基因沉默表达转基因小麦。
实施例5
本实施例描述Pst_20643基因沉默表达转基因小麦的培育和其抗病性鉴定，方法流程参见图1。将上述Pst_20643沉默片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）通过同源重组方式各插入PC336载体的2个位置（一个片段为正向插入，另一个为反向互补插入，从而可以形成发卡结构），获得Pst_20643干扰载体（如图4所示）。
将测序正确的重组Pst_20643-PC336质粒转化农杆菌EHA105菌株，通过农杆菌介导的转化法将Pst_20643基因沉默载体导入小麦品种Fielder受体材料，经过卡纳霉素抗性愈伤组织的筛选、预再生、再生、生根等步骤产生T0代转基因植株。经过生长收种获得转基因T1代植株。
选取两个独立的Pst_20643基因沉默转基因纯合株系（L2和L5）进行抗条锈病鉴定，病菌接种方法参照实施例4。结果表明（如图5所示），沉默Pst_20643基因转基因小麦在接种CYR31后产孢减少，坏死增多，表明该转基因小麦对条锈菌的抗病性显著提高。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.编码毒性效应蛋白Pst_20643的基因Pst_20643在小麦抗条锈品种培育中的应用，其特征在于，构建含有Pst_20643基因沉默片段的干扰载体，农杆菌介导所述干扰载体转入小麦幼胚，所述Pst_20643基因沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，所述基因Pst_ 20643的开放阅读框的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种小麦抗条锈品种培育的方法，其特征在于，构建含有Pst_20643基因沉默片段的干扰载体，农杆菌介导所述干扰载体转入小麦幼胚，所述Pst_20643基因沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
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