CN114621332A - 条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用 - Google Patents

条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用。所述效应蛋白Hasp170及其编码基因在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能，效应蛋白Hasp170氨基酸序列如SEQ ID NO：1，编码小麦条锈菌效应蛋白Hasp170的开放阅读框具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。Hasp170基因在条锈菌侵染小麦前期过程中诱导表达，将效应蛋白Hasp170基因沉默片段转入小麦材料，得到沉默所述效应蛋白Hasp170基因的小麦品种。本发明为利用效应蛋白Hasp170创制小麦抗病材料奠定了理论基础，对培育持久抗条锈病小麦品种具有重要的意义。

Description

条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及植物病害防治及抗性品种选育，具体涉及一种小麦条锈菌效应蛋白Hasp170、编码基因及其应用。
背景技术
由条形柄锈菌小麦专化形（Puccinia striiformis f. sp. Tritici，Pst）引起的小麦条锈病是小麦生产中的一类重大真菌病害，病害流行年份可导致小麦严重减产甚至绝收。小麦条锈病的防治方法主要以化学防治为主，使用化学农药给环境和食品安全所带来的危害已引起人们的普遍关注。抗病育种是防治小麦条锈病最为经济有效的措施之一。但抗病基因的挖掘周期长，抗病品种的培育难度大，而且条锈菌毒性变异快，导致该病害的防治一直难以实现持久的控制。因此，如何创制广谱、持久的抗病材料是防控小麦条锈病的根本途径。
效应蛋白是由病原菌分泌的一类外泌型蛋白分子，通过植物病原互作可以改变寄主植物细胞的结构和防卫途径，可促进病原菌对寄主植物成功侵染及定殖或者触发寄主防卫反应。病原菌侵染寄主植物分泌的效应蛋白，通过靶定植物不同的抗病途径操控寄主抗性反应，促进病原菌侵染。基于此，通过揭示条锈菌的致病机制、鉴定条锈菌毒性效应蛋白，从而为利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料提供新思路和育种材料。
发明内容
本发明要解决的技术问题：传统抗病品种培育周期长，条锈菌毒性变异快，小麦条锈病持久防控尚存在诸多困难。针对现有技术存在的问题，本发明通过分子生物学和基因工程手段，利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料，为小麦条锈病防控提供新路径。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料的新的技术方案。本发明筛选鉴定出了小麦条锈致病菌侵染小麦的关键毒性效应蛋白，即本发明所述的病原菌致病因子。具体地，所述致病因子为小麦条锈菌效应蛋白Hasp170，所述效应蛋白Hasp170的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明通过试验揭示，所述效应蛋白Hasp170及其编码基因在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能。小麦条锈菌效应蛋白Hasp170编码基因的核苷酸序列具有如SEQ IDNO：2所示的开放阅读框。
进一步地，本发明提供所述的病原菌致病因子在小麦抗条锈品种培育中的应用。所述致病因子为小麦条锈菌效应蛋白Hasp170，所述效应蛋白Hasp170的氨基酸序列如SEQID NO：1所示。
基于本发明的记载，本发明首次提出致病因子小麦条锈菌效应蛋白Hasp170在小麦抗条锈品种培育中的应用，本领域普通技术人员结合现有技术，不难实现抗条锈小麦品种的培育工作。作为培育抗条锈小麦品种应用的优选实施方式，通过基因沉默抑制所述效应蛋白Hasp170表达，提高小麦对条锈菌的抗性。
本发明采用反向遗传学方法获知一种小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因。所述Hasp170基因编码小麦条锈菌效应蛋白Hasp170，核苷酸序列具有如SEQ ID NO：2所示的开放阅读框，所述效应蛋白Hasp170的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
进一步地，本发明提供所述的小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因在小麦抗条锈品种培育中的应用。
本领域普通技术人员结合现有技术，通过所述Hasp170基因沉默，提高小麦对条锈菌的抗性。
为利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料，本发明提供了一种小麦抗条锈品种培育方法。该方法是将小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因沉默片段转入小麦材料，得到沉默所述效应蛋白Hasp170基因的小麦品种，所述Hasp170基因沉默片段的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。
进一步地，作为小麦抗条锈品种培育方法的优选实施方式，所述方法构建包含小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因的表达载体；农杆菌介导转入小麦幼胚；得到所述效应蛋白Hasp170基因沉默的转基因小麦。
基于本发明的记载，本发明还请求保护一种表达载体，其含有小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因沉默片段，所述Hasp170基因沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
为了完整无异议地理解本发明的技术方案，需要补充说明的是，本发明所述小麦条锈菌效应蛋白用非倾斜字体“Hasp170”表示，小麦条锈菌效应蛋白基因用倾斜字体“Hasp170”表示。当然，本领域普通技术人员可以根据本发明的记载，可以清楚、完整地理解相关基因及其编码蛋白的含义与表述。
与现有技术相比，本发明“条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用”具有下述的有益效果或优点：
1）本发明首次揭示小麦条锈菌效应蛋白Hasp170在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能，是一种小麦条锈菌关键毒性效应蛋白。所述效应蛋白Hasp170具有如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。本发明通过解析其致病机理，为利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料奠定理论基础，对培育持久抗条锈病小麦品种具有重要的意义。
2）本发明利用反向遗传学方法分析效应蛋白Hasp170基因，所述Hasp170基因在条锈菌侵染小麦前期诱导表达，能够抑制由促凋亡蛋白BAX诱导的细胞坏死，采用病毒介导的基因沉默技术沉默Hasp170基因，确定Hasp170基因为条锈菌的一个毒性因子，在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能。
3）本发明在提高小麦抗病性方面意义重大。借助基因工程技术，通过小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因沉默，可提高小麦对条锈病的抗性，本发明为从分子生物学角度开展小麦抗条锈品种培育提供了新的解决思路。
4）本发明明确了一种小麦抗条锈品种培育方法。该方法是将小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因沉默片段转入小麦材料，得到沉默所述效应蛋白Hasp170基因的小麦品种。经验证，采用本发明方法获得的转基因小麦对条锈菌主要的流行小种CYR32表现出抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将本发明实施例中所涉及附图做简单的说明，显而易见地，所列出的附图仅仅是本发明实施例的一部分内容的呈现。
图1是本发明“条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用”的技术路线图。
图2是本发明实施例所述小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因的表达谱分析图。
图3是本发明实施例所述小麦条锈菌效应蛋白Hasp170抑制由BAX诱导的细胞死亡示意图。其中，a为抑制由BAX诱导烟草细胞死亡图（叶片已用酒精完成脱色）；b为注射农杆菌的位置示意图；EV为带有空载体的农杆菌注射位点；Avr1b为可以抑制由BAX诱导的细胞坏死，带有效应蛋白Avr1b的农杆菌注射位点；PVX-170为带有效应蛋白Hasp170的农杆菌注射位点；EV+BAX为阴性对照，带有空载体的农杆菌与带有BAX的农杆菌共注射位点；Avr1b+BAX为阳性对照，带有效应蛋白Avr1b的农杆菌与带有BAX的农杆菌共注射位点；PVX-170+BAX为实验组，带有效应蛋白Hasp70的农杆菌与带有BAX的农杆菌共注射位点。
图4是本发明实施例所述小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因沉默表型结果图。左图中，BSMV:TaPDS为接种带有小麦八氢番茄红素脱氢酶基因TaPDS沉默片段的大麦条纹花叶病毒后的小麦叶片；BSMV:00为接种大麦条纹花叶空病毒的后小麦叶片；BSMV:Hasp170-1为接种带有效应蛋白基因Hasp170沉默片段1的大麦条纹花叶病毒后的小麦叶片；BSMV:Hasp170-2为接种带有效应蛋白基因Hasp170沉默片段2的大麦条纹花叶病毒后的小麦叶片。右图中，BSMV:00为在接种大麦条纹花叶空病毒的小麦叶片上，再接种条锈菌CYR32亲和小种；BSMV:Hasp170-1为在接种带有效应蛋白基因Hasp170沉默片段1的大麦条纹花叶病毒的小麦叶片上，再接种条锈菌CYR32亲和小种；BSMV:Hasp170-2为在接种带有效应蛋白基因Hasp170沉默片段2的大麦条纹花叶病毒后的小麦叶片上，再接种条锈菌CYR32亲和小种。
图5是本发明实施例T3代Hasp170沉默的转基因小麦PCR检测结果图。其中，M为DNAMarker；WT为野生型；H2O为水；PC为阳性对照。
图6是本发明实施例T3代Hasp170沉默的转基因小麦接种条锈菌主要流行小种CYR32表型结果图。其中，WT为野生型；KD为RNAi转基因沉默植株；HR为过敏性坏死；Hasp170-KD#L3为效应蛋白Hasp170的T3代RNAi转基因沉默植株第3个株系；Hasp170-KD#L22为效应蛋白Hasp170的T3代RNAi转基因沉默植株第22个株系。
具体实施方式
图1给出了本发明“条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用”的技术路线图。本发明实施例提供了小麦条锈菌效应蛋白Hasp170毒性功能的验证方法，包括：
S101，进行实时荧光定量PCR检测，确定小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因在条锈菌侵染小麦的不同侵染时间的表达量；
S102，通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在烟草上瞬时表达效应蛋白Hasp170，明确效应蛋白Hasp170能否抑制BAX诱导的细胞死亡；
S103，利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默效应蛋白基因Hasp170，明确其毒性功能；
S104，获取Hasp170沉默的转基因小麦，对获得的T3代转基因小麦进行分子检测；
S105，对T3代转基因植株接种条锈菌主要流行小种CYR32，鉴定转基因植株对条锈菌流行小种CYR32的抗性，确定Hasp170沉默的转基因小麦的抗条锈特性。
本发明实施例进一步提供了小麦条锈菌效应蛋白Hasp170毒性功能的鉴定方法，包括：
基于qRT-PCR以延伸因子基因TaEF1-α为内参，利用小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因的特异引物进行实时定量PCR，确定小麦条锈菌Hasp170基因在条锈菌侵染小麦的不同侵染时间的表达量；
通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在烟草瞬时表达小麦条锈菌效应蛋白Hasp170，24h后，在烟草叶片的原位置注射含有BAX的农杆菌，5天后，观察小麦条锈菌效应蛋白Hasp170能否抑制BAX诱导的细胞死亡；
利用病毒诱导的基因沉默技术特异性的瞬时沉默小麦条锈菌效应蛋白基因Hasp170，于二叶接种病毒第10天检测在沉默TaPDS后小麦叶片上是否呈现出漂白状，若是，则表示病毒接种成功；于四叶接种小麦条锈菌新鲜孢子接种后第12天检测叶片表面出现孢子堆数量，并查看接菌叶片是否出现坏死；
将小麦条锈菌效应蛋白Hasp170沉默基因片段构建至植物干扰载体，利用农杆菌介导的遗传转化，获得Hasp170沉默的转基因植株，并验证转基因沉默植株对条锈菌主要的流行小种CYR32抗性情况。
现结合实施例1-5对小麦条锈菌效应蛋白Hasp170毒性功能的验证方法、鉴定方法进行详细说明。
实施例1
本实施例描述小麦条锈菌效应蛋白基因Hasp170的分离克隆。
收集条锈菌生理小种CYR32的夏孢子，采用RNA提取试剂盒（购自北京华越洋生物科技有限公司）提取CYR32夏孢子的总RNA。
利用重组逆转录酶M-MuLV RT（购自Thermo scientific公司）将CYR32夏孢子的总RNA逆转录合成cDNA第一链，反应条件为：42℃，30min；75℃，5min。以此为模板，利用Hasp170基因特异性引物Hasp170-cDNA-F（5' ATGCAGATTTGCCGCCTCATTA 3'）与Hasp170-cDNA-R（5' TCAGGCAAGTTTTCGTCTTTTTGGT 3'）进行PCR扩增，扩增出含有Hasp170基因全长编码框的DNA片段。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃ 30sec，58℃ 1min，72℃ 3min，40个循环；72℃补充延伸10min。
将获得的PCR扩增产物进行T连接，构建到pMD™19 (Simple)载体（购自TaKaRa公司），转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（购自上海唯地生物技术有限公司），筛选检测出阳性克隆并过夜摇菌，提取质粒命名为T-Hasp170，委托擎科生物技术有限公司测序，得到如SEQID NO：2所示的核苷酸序列。
将上述获得的核苷酸序列在NCBI网站中（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行Blastx搜索，得到如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。
实施例2
本实施例描述小麦条锈菌效应蛋白基因Hasp170的表达谱分析。
以正常土培的小麦品种Fielder为材料，在小麦幼苗二叶一心期采用毛笔接种的方法接种条锈菌生理小种CYR32并进行保湿，接种后6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、120小时、168小时取样，并液氮保存。
待14天后确认小麦叶片表型（叶片表现为产生大量夏孢子），提取样品总RNA，并使用实施例1中提取的CYR32夏孢子RNA，进行逆转录，获得cDNA模板（提取方法和逆转录过程与实施例1相同）。采用实时荧光定量PCR技术，分析Hasp170基因在条锈菌侵染小麦过程中的表达谱。
以提取的不同时间点样品的小麦-条锈菌互作cDNA为模板，以小麦延伸因子基因为内参基因（TaEF-qRT-F：5' TGGTGTCATCAAGCCTGGTATGGT 3'和TaEF-qRT-R：5'ACTCATGGTGCATCTCAACGGACT 3'），利用Hasp170基因特异性引物（Hasp170-qRT-F：5'TAGACAACGAGAATGGAAAG 3'和Hasp170-qRT-R：5' TGGTAAGGTATTTGAAGCC 3'）进行实时荧光定量PCR，反应条件为：95℃预变性3min；95℃ 15sec，60℃ 30sec，72℃ 45sec，40个循环。
图2呈现了小麦品种Fielder接种条锈菌生理小种CYR32后，小麦条锈菌效应蛋白基因Hasp170在条锈菌侵染不同时间点的表达谱。小麦条锈菌效应蛋白Hasp170在条锈菌侵染24h表达量达到最高，说明小麦条锈菌效应蛋白Hasp170在条锈菌侵染小麦前期发挥毒性功能。由此可以获知，Hasp170基因在条锈菌侵染小麦的前期诱导表达，可能是一个与条锈菌致病相关的基因。
实施例3
本实施例描述小麦条锈菌效应蛋白Hasp170抑制由促凋亡蛋白BAX（BCL2-associated X）诱导的细胞死亡。
以测序正确的T-Hasp170质粒为模板，通过同源重组的方法将Hasp170全长基因构建到pGR106载体，形成pGR106-Hasp170重组质粒并测序。
将pGR106-Hasp170重组质粒进行农杆菌GV3101（p19）感受态细胞（购自上海唯地生物技术有限公司）转化，将正确的农杆菌菌落在LB液体培养基里（40μg/mL利福平和50μg/mL卡那霉素）置于28℃培养大约48h。用10mL 10mM的MgCl2溶液处理农杆菌菌液。用10mM的MgCl2溶液稀释至OD600为0.3，取1mL注射器将稀释好的菌液注射至烟草叶片中。五天后观察烟草叶片是否发生坏死。
如图3所示，通过农杆菌介导的瞬时表达系统，在烟草上瞬时表达效应蛋白（Hasp170）24h后，在烟草叶片的原位置注射含有BAX的农杆菌，5d后观察到效应蛋白Hasp170能够抑制BAX诱导的细胞死亡。由此可以获知，小麦条锈菌效应蛋白Hasp170能够明显抑制由BAX诱导的烟草细胞死亡，表明效应蛋白Hasp170能够抑制植物的免疫反应。
实施例4
本实施例描述瞬时沉默小麦条锈菌效应蛋白基因Hasp170减弱条锈菌的致病力。
通过序列比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）及特异性分析，Hasp170基因具有两个特异性较高的基因片段，一个是位于N段的一段序列特异性较高的基因片段1（核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示），一个是另一段序列特异性较高的基因片段2（核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示）。以此两段特异性基因片段为基础构建小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因瞬时沉默载体BSMV:γ（BSMV:00）。Hasp170基因沉默载体的构建过程参照实施例3。
将大麦条纹花叶病毒（BSMV）组装的3个部分α，β，γ，γ-Hasp170，γ-TaPDS分别进行线性化。将线性化的DNA片段进行体外转录成RNA，体外转录过程中使用RiboMAXTM LargeScale Production System-T7试剂盒（购自Promega公司），反应体系为：37℃，1h；70℃，5min。
接毒时首先对照组将α、β、γ以相同比例（各10µL）加入到200~300µL的FES缓冲液中，利用摩擦接种法将液体接种到小麦二叶上，摩擦三次。实验组将α，β，重组的γ-Hasp170或者γ-TaPDS，以相同方式进行接毒。然后，将接毒的小麦苗置于25-28℃培养箱培养10天，待其出现病毒症状。接种10天后可以观察到接毒叶片上有明显的条纹状褪绿，则证明病毒接种成功。将带有病毒的小麦苗接种小麦条锈菌CYR32，接菌的方法参照实施例2。接菌14天后，小麦叶片出现症状。
如图4所示，瞬时沉默小麦条锈菌效应蛋白基因Hasp170后，产孢减少，叶片坏死面积增加，条锈菌的致病力明显减弱，表明效应蛋白Hasp170是条锈菌的一个毒性因子。
实施例5
本实施例描述小麦条锈菌效应蛋白基因Hasp170沉默表达转基因小麦的培育和其抗病性鉴定。
Hasp170基因特异片段的分析过程与沉默载体的构建过程参照实施例4。将其特异片段（核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）通过同源重组方式各插入pK7GWIWG2D(II)载体的2个位置（一个片段为正向插入，另一个为反向互补插入，从而可以形成发卡结构）。将测序正确的重组质粒转化农杆菌EHA105菌株。
通过农杆菌介导的转化法将Hasp170基因沉默载体导入小麦品种Fielder受体材料，经过卡纳霉素抗性愈伤组织的筛选、预再生、再生、生根等步骤产生T0代RNAi转基因植株。选取两个独立的Hasp170基因沉默的转基因纯合株系（L3和L22）进行抗条锈病鉴定，CYR32病菌接种方法参照实施例2。
图5为T3代小麦条锈菌基因Hasp170沉默纯合植株株系L3和L22的DNA分子检测图。图6为T3代小麦条锈菌基因Hasp170沉默纯合植株株系L3和L22接种条锈菌CYR32后，条锈菌致病性明显减弱，表明效应蛋白Hasp170为条锈菌一个重要的毒性因子。
综上，本发明公开了一种小麦条锈菌效应蛋白Hasp170的毒性功能及其应用，小麦条锈菌效应蛋白Hasp170的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明揭示了在条锈菌与小麦互作中的关键效应蛋白基因Hasp170，具有如SEQ ID NO：2所示的开放阅读框。将关键效应蛋白基因Hasp170构建至植物干扰载体上，利用农杆菌介导的遗传转化，获得了Hasp170沉默的转基因植株，并验证了转基因植株对条锈菌主要的流行小种CYR32表现出抗性。本发明利用反向遗传学方法分析效应蛋白Hasp170基因，Hasp170基因在条锈菌侵染小麦前期诱导表达，能够抑制由促凋亡蛋白BAX（BCL2-associated X）诱导的细胞坏死，采用病毒介导的基因沉默技术沉默Hasp170基因，确定Hasp170基因在条锈菌侵染小麦过程中发挥毒性功能，并利用该效应蛋白创制了抗锈的RNAi干扰材料，为利用病原菌致病因子创制小麦抗病材料奠定理论基础。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 西北农林科技大学深圳研究院
<120> 条锈菌效应蛋白及其在抗病调控中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 256
<212> PRT
<213> 效应蛋白Hasp170基因(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
Met Gln Ile Cys Arg Leu Ile Thr Ile Leu Gly Phe Cys Leu Ser Gln
1 5 10 15
Ala Leu Ala Gln Val Gly Pro Glu Leu Asp Ala Ala Ile Lys Ser Phe
20 25 30
Val Gln Asp Leu Ala Glu Pro Asn Val Arg Ala Gly Leu Pro Ile Glu
35 40 45
Thr Thr Arg Phe Asn Asp Ala Leu His Asp Gln Leu His Gly Asp Asn
50 55 60
Pro Arg Glu Ile Arg Glu Thr Leu Phe Ser Lys Phe Lys Pro Phe Gln
65 70 75 80
Glu Gly His Glu Leu Asn Ala Ala Ala Phe Ala Asp Ser Arg Ala Asn
85 90 95
Tyr Asp Asp Thr Leu Arg Thr Lys Glu Leu Lys Ala His Pro Glu Leu
100 105 110
Leu Ala Asp Arg Leu Asp Thr Tyr Arg Asn Ser Met Tyr Ser Arg Leu
115 120 125
Phe Asp Ile Leu Asp Asn Glu Asn Gly Lys Phe Asn Ala Glu Ser Leu
130 135 140
Ala Thr Ala Arg Lys Glu Leu Asn Asn Leu Leu Ser Asn Gln Phe Pro
145 150 155 160
Glu Glu Ser Lys Tyr Lys Thr Ile Thr Ser Tyr Pro Asp Ser Gln Met
165 170 175
Ala Gly Phe Lys Tyr Leu Thr Met Glu Gln Val Asp Lys Ala Leu Lys
180 185 190
Glu Thr Asn Val Pro Asp Ala Lys Ser Ile Asn Gly Glu Ala Thr Lys
195 200 205
Gly Phe Lys Ser Phe Ile Asn Ser His Leu Ile Glu Lys Glu Gly Arg
210 215 220
Pro Gln Phe Glu Glu Met Glu Lys Ala Ala Phe Glu Ala Lys Glu Lys
225 230 235 240
Ala Ala Ser Glu Glu Lys Glu Asn Ala Pro Lys Arg Arg Lys Leu Ala
245 250 255
<210> 2
<211> 771
<212> DNA
<213> 效应蛋白Hasp170基因(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 2
atgcagattt gccgcctcat taccatcctg ggcttctgcc tctcacaggc acttgcacaa 60
gtcggccctg agttggatgc agcaatcaaa tcatttgtcc aggacctcgc cgagcccaat 120
gttagagcgg gactacccat cgaaacgaca agattcaatg atgcgttgca tgatcaattg 180
catggagaca accctcgcga gatcagggaa acccttttct cgaaattcaa gccattccag 240
gagggccacg agctgaacgc agcggctttt gcggatagcc gtgctaacta tgacgatact 300
cttcgcacga aagaactcaa ggcacatccc gaattactgg ccgaccgatt ggatacatac 360
cgaaattcca tgtactcccg actctttgac attctagaca acgagaatgg aaagttcaat 420
gcagaatccc tggcaacggc ccgtaaagaa ctaaacaacc tgctaagcaa tcaatttccc 480
gaagaatcca aatacaaaac tatcacttcc tacccggatt ctcaaatggc cggcttcaaa 540
taccttacca tggagcaggt agacaaggcg ttgaaagaga ctaacgttcc tgacgccaaa 600
tccatcaatg gcgaggccac aaagggcttt aagtcattca tcaacagtca cctcattgaa 660
aaagaaggtc gtccccaatt tgaggaaatg gagaaagcag cattcgaggc caaagagaaa 720
gctgcatctg aggaaaaaga gaatgcacca aaaagacgaa aacttgcctg a 771
<210> 3
<211> 247
<212> DNA
<213> 效应蛋白Hasp170基因(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 3
ctagacaacg agaatggaaa gttcaatgca gaatccctgg caacggcccg taaagaacta 60
aacaacctgc taagcaatca atttcccgaa gaatccaaat acaaaactat cacttcctac 120
ccggattctc aaatggccgg cttcaaatac cttaccatgg agcaggtaga caaggcgttg 180
aaagagacta acgttcctga cgccaaatcc atcaatggcg aggccacaaa gggctttaag 240
tcattca 247
<210> 4
<211> 201
<212> DNA
<213> 效应蛋白Hasp170基因(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 4
aaatcatttg tccaggacct cgccgagccc aatgttagag cgggactacc catcgaaacg 60
acaagattca atgatgcgtt gcatgatcaa ttgcatggag acaaccctcg cgagatcagg 120
gaaacccttt tctcgaaatt caagccattc caggagggcc acgagctgaa cgcagcggct 180
tttgcggata gccgtgctaa c 201
<210> 5
<211> 201
<212> DNA
<213> 效应蛋白Hasp170基因(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 5
aaggcacatc ccgaattact ggccgaccga ttggatacat accgaaattc catgtactcc 60
cgactctttg acattctaga caacgagaat ggaaagttca atgcagaatc cctggcaacg 120
gcccgtaaag aactaaacaa cctgctaagc aatcaatttc ccgaagaatc caaatacaaa 180
actatcactt cctacccgga t 201

Claims (10)

1.一种病原菌致病因子，其特征在于，所述致病因子为小麦条锈菌效应蛋白Hasp170，所述效应蛋白Hasp170的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.根据权利要求1所述的病原菌致病因子，其特征在于，所述效应蛋白Hasp170及其编码基因在条锈菌与小麦互作过程中发挥毒性功能。
3.权利要求1所述的病原菌致病因子在小麦抗条锈品种培育中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过基因沉默抑制所述效应蛋白Hasp170表达，提高小麦对条锈菌的抗性。
5.一种小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因，其特征在于，所述Hasp170基因编码小麦条锈菌效应蛋白Hasp170，核苷酸序列具有如SEQ ID NO：2所示的开放阅读框，所述效应蛋白Hasp170的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
6.权利要求5所述的小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因在小麦抗条锈品种培育中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述Hasp170基因沉默，提高小麦对条锈菌的抗性。
8.一种小麦抗条锈品种培育方法，其特征在于，将小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因沉默片段转入小麦材料，得到沉默所述效应蛋白Hasp170基因的小麦品种，所述Hasp170基因沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
9.根据权利要求8所述的小麦抗条锈品种培育方法，其特征在于，构建包含小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因的表达载体；农杆菌介导转入小麦幼胚；得到所述效应蛋白Hasp170基因沉默的转基因小麦。
10.一种表达载体，其特征在于，含有小麦条锈菌效应蛋白Hasp170基因沉默片段，所述Hasp170基因沉默片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
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