CN113403209B - 天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用 - Google Patents

Abstract

发明公开了天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用，通过敲除天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力，或通过超量表达天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌的高温耐受能力，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；BbASP敲除菌株在26℃培养10d和20d，分生孢子产量均比野生型分别高72.57％和59.43％，宿主存活率降低，半致死时间缩短，虫菌体从死亡宿主中穿出的时间提前，BbASP超量表达菌株在32℃高温胁迫下，生长速率加快；分生孢子经43℃高温胁迫2h和4h后，萌发率分别提升7％和11.34％。

Description

天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用。

背景技术

我国属于传统农业大国，农业的持续发展离不开农药的使用。化学农药因为其杀虫效果好，见效快，使用简单等优点而被大面积应用,但化学农药的滥用会导致环境污染、农药残留、人畜误食中毒等危害,所以农业生产上对无公害或低毒农药的需求越来越高,其中生物农药是最有效的替代方案之一。球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种广谱性的昆虫病原真菌，易于培养，致病谱广，它能够侵染15个目149个科的700多种昆虫。由于它对昆虫的致死作用和广谱性，一直被认为可以当作一种农业友好型生物农药来研究。

球孢白僵菌作为生物农药具有以下优点：1、培养简单、繁殖迅速；2、寄主不易产生抗性；3、对人、畜、作物和生态环境安全无危害；4、持续作用时间长且可利用宿主重新繁殖扩散，所以球孢白僵菌在现代农业中的应用发展势态很好。球孢白僵菌可生长温度范围为5-30℃，最适生长温度是26℃左右，当环境温度高于30℃，其孢子萌发和生长均受到不同程度的抑制。所以在实际应用中易受温度这一环境因素的影响，极大地限制了昆虫病原真菌在田间的应用。因此，发掘球孢白僵菌高温胁迫耐受相关基因，解析其调控机制，并以之为靶点，对菌株进行优化改良从而提高菌株的抗逆性、扩大其应用具有重要意义。

天冬氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶，广泛存在于哺乳动物、植物、细菌、真菌以及病毒中。天冬氨酸蛋白酶主要发挥着降解蛋白、促进酶活化等功能。在人类病原真菌白色念珠菌中，天冬氨酸蛋白酶是重要的毒力因子之一，通过降解细胞表面结构，继而黏附和侵入宿主，并降解免疫防御有关的蛋白，在致病过程中发挥了重要的作用。课题组前期发现了一株对高温敏感的球孢白僵菌T-DNA插入突变体，在32℃高温下，该突变体菌落生长抑制率比野生型高，表明T-DNA插入破坏的基因可能参与球孢白僵菌对高温胁迫耐受的调控。通过YADE(Y-shaped adaptor dependant extension)法扩增此突变体T-DNA插入位点的侧翼序列发现该T-DNA插入破坏的基因为天冬氨酸蛋白酶(Aspartic protease)的编码基因，因此将该基因命名为BbASP。目前有关天冬氨酸蛋白酶调控菌株高温耐受的研究未见报道。如何通过基因工程的手段，改良现有的病原昆虫真菌，提高其毒力及抗逆性具有重要的意义和良好的前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用；本发明的目的之二在于提供一种提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力的方法；本发明的目的之三在于提供一种提高球孢白僵菌高温耐受能力的方法；本发明的目的之四在于提供一种球孢白僵菌突变株，本发明的目的之五在于提供一种球孢白僵菌改良株；本发明的目的之六在于提供一种真菌杀虫剂；本发明的目的之七在于提供所述的球孢白僵菌突变株或所述球孢白僵菌改良株在制备真菌杀虫剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用，通过敲除天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力，或通过超量表达天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌的高温耐受能力，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述高温为温度高于30℃的条件。

2、一种提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力的方法，通过敲除SEQ ID NO.20所示球孢白僵菌天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的第1468～2040位点之间的核苷酸序列，获得球孢白僵菌突变菌株，所述球孢白僵菌突变菌株具有提高的分生孢子产量和毒力。

优选的，所述敲除为通过同源重组置换的方式敲除。

优选的，所述通过同源重组置换的方式敲除是以除草剂抗性基因bar置换，所述bar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

3、一种提高球孢白僵菌高温耐受能力的方法，通过在球孢白僵菌中超量表达启动子pb3和天冬氨酸蛋白酶基因BbASP开放阅读框序列，获得球孢白僵菌突变菌株，所述球孢白僵菌突变菌株具有提高的高温耐受能力，所述高温耐受是在温度高于30℃的条件；所述启动子pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述BbASP开放阅读框序列为SEQ ID NO.4所示。

优选的，所述高温为高于30℃。

4、一种球孢白僵菌突变株，所述突变株敲除球孢白僵菌天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的第1468～2040位点之间的核苷酸序列，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

5、一种球孢白僵菌改良株，所述改良株为在通过在球孢白僵菌中超量表达天冬氨酸蛋白酶基因BbASP，天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP由启动子pb3调控表达，所述启动子pb3的核苷酸序列如SEQ IDNO.21所示。

6、一种真菌杀虫剂，含有所述的球孢白僵菌突变株或所述的球孢白僵菌改良株。

7、所述的球孢白僵菌突变株或所述球孢白僵菌改良株在制备真菌杀虫剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株中的应用，通过敲除天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力，或通过超量表达天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌的高温耐受能力，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

通过敲除天冬氨酸蛋白酶基因BbASP获得的球孢白僵菌突变菌株ΔBbasp，分生孢子产量增加和毒力增强。在CZM培养基上26℃培养时，培养时间为10d和20d，敲除菌株ΔBbasp的分生孢子产量均比野生型高，分别高72.57％(P<0.01)和59.43％(P<0.01)。26℃常温下，无论体壁浸染和体腔注射，敲除菌株ΔBbasp的宿主存活率曲线均低于球孢白僵菌野生型，26℃体壁浸染条件下敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(103h)较野生型(139.11h)缩短了36.11h(P<0.001)；26℃体腔注射条件下敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(71.07h)较野生型(75.04h)缩短了4h(P<0.01)。32℃高温体壁浸染和体腔注射条件下，敲除菌株ΔBbasp的宿主存活率曲线也低于球孢白僵菌野生型，经体壁浸染敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(192.90h)较野生型(226.54h)缩短了33.64h(P<0.01)；体腔注射条件下敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(142.33h)较野生型(147.84h)缩短了5.51h(P<0.05)。且26℃条件下体壁浸染和体腔注射条件下同时间死亡的试虫，敲除菌株ΔBbasp虫菌体穿出时间早于野生型。

通过超量表达天冬氨酸蛋白酶基因BbASP获得的球孢白僵菌改良株OEBbasp，耐受高温能力增强。32℃高温胁迫下，超量菌株OEBbasp菌落直径略大于野生型，抑制率(47％)较野生型低约2％左右，OEBbasp的生长速率比野生型快。OEBbasp的分生孢子经43℃高温胁迫2h和4h后，超量菌株OEBbasp的萌发率分别较野生型提升7％(P<0.01)和11.34％(P<0.01)。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为分生孢子(A)及菌丝(B)BbASP基因在高温胁迫下的表达分析；

图2为pK₂-bar载体示意图；

图3为BbASP基因同源敲除载体构建示意图(A)及酶切验证图(B)；

图4为pK₂-PtrpC-sur-TtrpC载体示意图；

图5为BbASP基因回复互补载体构建示意图(A)和酶切验证结果(B)；

图6为BbASP基因超量表达载体构建图(A)及酶切验证结果(B)；

图7为BbASP基因同源敲除、回复互补菌株的筛选验证图((A)同源敲除及回复互补菌株PCR验证结果，泳道1-3分别为野生型、敲除菌株、回复菌株，M：Marker 2000；(B)southern blot验证结果，泳道1-3分别为野生型WT、敲除菌株ΔBbasp、回复菌株ΔBbasp::Bbasp；(C)实时荧光定量PCR验证结果；(D)Real-time PCR验证结果，泳道1-3分别为野生型、敲除菌株、回复菌株)；

图8为超量表达改良株的筛选(A：超量转化子PCR验证结果，泳道1-10：超量表达转化子，WT：球孢白僵菌野生型，M：Marker 2000；B：超量表达转化子中BbASP基因表达量分析；C：southern blot验证结果，泳道1为3号超量转化子。)；

图9为高温胁迫下各菌株的菌落生长(A)和相对生长抑制率(B)(星号表示单因素ANOVA计算出的显著差异，“***”表示差异极显著，P<0.001。)；

图10为各菌株常温下的孢子萌发率(A)和常温下的萌发中时(B)及经高温胁迫后的孢子萌发率(C)；

图11为各菌株常温及高温胁迫下10d及20d产孢量；

图12为不同生测条件下试虫存活率及半致死时间；

图13为不同生物测试条件下同时间死亡试虫菌丝穿出时间。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1、BbASP基因克隆

根据NCBI中上的天冬氨酸蛋白酶序列设计上下游引物：

ASP-F：5'-ATGTCGCTCAGAAACATCGTC-3'(SEQ ID NO.1)；

ASP-R：5'-TTACTTGAGATTAGCGAAGCCC-3'(SEQ ID NO.2)；

以野生型球孢白僵菌(Beauveria Bassiana)Bb0062的基因组DNA为模板，用

Max DNA Polymerase进行PCR扩增，产物经凝胶电泳验证大小正确后进行胶回收，然后将片段连接到克隆载体pEASY-Blunt上，酶切及测序验证正确后，即得到BbASP基因。

BbASP基因组DNA全长1208bp(SEQ ID NO.3)，含两个内含子，ORF序列全长1068bp(SEQ ID NO.4)，编码355个氨基酸(SEQ ID NO.5)，预测的蛋白分子量为37.5kDa。

实施例2、BbASP基因在高温胁迫下的表达分析

采用A、B两种培养方式，检测常温(26℃)及高温(32℃)胁迫下，球孢白僵菌分生孢子和菌丝中BbASP基因的表达量的差异。

(A)取50μL浓度为1×10⁷conidia/mL的球孢白僵菌野生型菌株孢悬液于CZM固体培养基上，分26℃和32℃分别培养14d后提取分生孢子RNA并反转录为cDNA后以γ-Actin基因为内标检测BbASP基因的表达量，以无胁迫为对照；

(B)取50μL浓度为1×10⁷conidia/mL的球孢白僵菌野生型菌株孢悬液加入1/4SDY液体培养基中，26℃、200rpm摇床培养3d后，用32℃、胁迫4h，提取菌丝RNA并反转录为cDNA后以γ-Actin基因为内标检测BbASP基因的表达量，以无胁迫为对照。

实时荧光定量PCR反应体系(10μL)：iQ SYBR Green Supermix(BIO-RAD)5μL，引物各0.5μL，反转录后的cDNA作模板1μL，无菌水3μL。实时荧光定量PCR程序如下：95℃，3min；95℃，10s，56℃，30s，72℃，20s，39个循环；溶解曲线从65℃至95℃，每个循环增加0.5℃，反应5s。内参基因为球孢白僵菌γ-Actin基因。所用qRT-PCR引物为：

BbASP-F：5'-AATCTGGCCACTGATTCGGG-3'(SEQ ID NO.6)；

BbASP-R：5'-AATCGTAGGGGAGTTGCTGC-3'(SEQ ID NO.7)；

γ-Actin-F：5'-TTGGTGCGAAACTTCAGCGTCTAGTC-3'(SEQ ID NO.8)；

γ-Actin-R：5'-TCCAGCAAATGTGGATCTCCAAGCAG-3'(SEQ ID NO.9)；

结果如图1所示，高温胁迫下分生孢子中BbASP基因表达量相较于无胁迫的对照上调了4.54倍(图1，A)；高温胁迫下菌丝中BbASP基因表达量相较于无胁迫的对照上调了0.7倍(图1，B)。以上结果表明，BbASP基因的表达受高温胁迫诱导。

实施例3、BbASP基因同源敲除载体的构建

同源敲除骨架载体选用pK₂-PtrpC-bar-TtrpC(简称pK₂-bar)，是由本实验室在骨架载体pK₂的基础上改造获得，pK₂-PtrpC-bar-TtrpC载体示意图如图2所示，bar为草丁膦抗性基因，bar基因核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，分别在BbASP基因ORF区域5'端和3'端选择一段序列作为同源臂，设计引物，下划线代表酶切位点：

LB-F：5'-CGGAATTCGCATGCTCACTTTGCAACTTC-3'(EcoRⅠ，SEQ ID NO.11)；

LB-R：5'-CGGAATTCCGATGACTGACGCTGAATTG-3'(EcoRⅠ，SEQ ID NO.12)；

RB-F：5'-GCTCTAGAGGTCAAGTTTATCGCGACGTC-3'(XbaⅠ，SEQ ID NO.13)；

RB-R：5'-CCCAAGCTTCTTTGCAGCAATCCATGAGTC-3'(HindⅢ，SEQ ID NO.14)；

分别扩增BbASP基因左右臂片段，左右同源臂长度分别为BbASPLB：731bp，BbASPRB：812bp。左臂BbASPLB用EcoRⅠ单酶切并连接至载体pK₂-bar上，构建成pK₂-BbASPLB-bar。再将右臂BbASPRB用XbaⅠ和HindⅢ双酶切并连接至pK₂-BbASPLB-bar载体上，酶切和测序验证，验证引物为：

P1-F：5'-GACAATGTCTCACTCCAAGC-3'(SEQ ID NO.15)；

P1-R：5'-GTCGTCTATGGCACCAATGG-3'(SEQ ID NO.16)；

证实同源敲除载体pK₂-BbASPLB-bar-BbASPRB构建成功。

BbASP基因同源敲除载体构建示意图如图3，A所示，左右臂酶切验证结果如图3，B所示，切下了731bp的BbASP LB(泳道1)和812bp的BbASPRB(泳道2)2个片段，说明成功构建BbASP基因的同源敲除载体。

实施例4、BbASP基因回复互补载体的构建

回复互补骨架载体选用pK₂-Ptrpc-sur-Ttrpc(简称pK₂-sur)，是由本实验室在骨架载体pK₂的基础上改造获得，pK₂-Ptrpc-sur-Ttrpc载体示意图如图4所示，sur为氯嘧磺隆抗性基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。选取BbASP基因(1208bp，SEQ ID NO.4)及其启动子和终止子共2993bp，以引物：

PH-F：5'-CCCAAGCTTCTACCAGTACGTCCTTGTTCC-3'(Hind III，SEQ ID NO.18)；

PH-R：5'-CCCAAGCTTGTGCAACAACATTGGAGTGCC-3'(Hind III，SEQ ID NO.19)；

扩增得到目的片段(PBbASPT，SEQ ID NO.20)，凝胶电泳验证大小正确后回收目的条带，用限制性内切酶Hind III分别酶切片段PBbASPT和载体pK₂-sur上后，通过T4 DNALigase连接(连接体系见Takara T4 DNA Ligase说明书)，连接产物经大肠杆菌遗传转化，Hind III酶切和测序验证后，BbASP基因回复互补载体pK₂-sur-PBbASPT构建成功，BbASP基因回复互补载体构建示意图和酶切验证，结果如图5所示。

实施例5、BbASP基因超量表达载体的构建

超量表达骨架载体选用pK₂-sur-pb₃(11926bp)，pb3为超量启动子其核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。pK2-sur-pb3载体是将pb3基因插入pK2-sur载体的BamHⅠ酶切位点之间所得。设计引物：

PO-F：5'-CGGGATCCATGTCGCTCAGAAACATCGTC-3'(BamHⅠ，SEQ ID NO.22)；PO-R：5'-GATATCTTACTTGAGATTAGCGAAGCCC-3'(EcoRⅤ，SEQ ID NO.23)；

以球孢白僵菌野生型cDNA为模板，扩增BbASP基因ORF(1068bp，SEQ ID NO.3)，用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅤ分别酶切目的片段和pK₂-sur-pb₃载体后，验证并回收，通过T4DNA Ligase连接(连接体系见Takara T4 DNA Ligase说明书)，连接产物经大肠杆菌遗传转化，酶切和测序验证后，BbASP基因超量表达载体pK₂-sur-pb₃-BbASP构建成功，BbASP基因超量表达载体构建图及酶切验证，结果如图6所示。

实施例6、球孢白僵菌的遗传转化及转基因菌株的筛选

将实施例3～5制备的BbASP基因同源敲除载体、回复互补载体和超量表达载体分别通过电击法遗传转化根癌农杆菌AGL-1感受态细胞。

将上述转化后的农杆菌经YEB液体培养基扩大培养后，提取质粒，PCR检测呈阳性后，在农杆菌的介导下对球孢白僵菌进行遗传转化。

BbASP基因同源敲除菌株(ΔBbasp)及回复菌株(ΔBbasp::Bbasp)筛选：

采用农杆菌介导的转化方法将BbASP基因同源敲除载体转入球孢白僵菌野生型中，若发生同源重组则bar基因与BbASP基因左右臂之间的573bp发生互换，导致BbASP基因被破坏。因为同源敲除菌株含有bar基因，故可以在含有PPT(草丁膦)抗性的筛选培养基中生长。用筛选引物P1-F/P1-R进行验证，同源敲除菌株仅能扩增出长度为1.9kb的条带，而野生型仅能扩增出约945bp的条带(图7，A)。

然后通过农杆菌介导的方式将构建成功的pK₂-sur-PBbASPT回复互补载体转入BbASP基因同源敲除菌株中，由于同源敲除菌株含有bar抗性基因，回复互补载体含有sur抗性基因，因此用添加了PPT和SUR的培养基进行筛选。用特异性引物P1-F/P1-R进行验证，正确的回复互补突变株应扩增出1.9kb和945bp的两条带(图7，A)。同时以敲除的563bp序列作为探针进行southern blot验证，野生型菌株以及回复菌株能出现条带，同源敲除菌株在相同位置不能杂交出条带(图7，B)。对同源敲除菌株和回复菌株进行Real-time PCR检测发现回复菌株和野生型菌株中BbASP基因表达量相近，同源敲除菌株中BbASP基因无表达(图7，C、D)。

BbASP基因超量表达突变株(OEBbasp)筛选：

采用农杆菌介导的转化方法将超量表达载体pK₂-sur-pb₃-BbASP转入球孢白僵菌野生型菌株中，如果转化成功，则菌株含有sur抗性基因，故用在含有SUR抗性的培养基上进行筛选。以

pb₃-F：5'-AGCAAGATGGCCAGACATGG-3'(SEQ ID NO.24)；

PO-R(SEQ ID NO.23)为筛选引物，以菌丝制成简易模板对转化菌株进行筛选验证，成功转化株能扩增出一条大小约1.5kb的条带而野生型不能扩增出条带(图8，A)。选取能扩增出的10个转化子，提取RNA并反转录为cDNA，检测转化子中BbASP基因表达量，其中3号转化株其BbASP基因表达量为野生型的147倍(图8，B)，选择此菌株作为后续研究超量表达突变株。同时，以超量片段为探针，选取3号转化子进行southern blot验证，结果如图8，C所示。

实施例7、BbASP突变体菌株在高温胁迫下的表型分析

BbASP基因影响高温胁迫下菌落的生长

将球孢白僵菌野生型WT、敲除菌株ΔBbasp、回复菌株ΔBbasp::Bbasp、超量菌株OEBbasp在CZM培养基培养14d后，配制各菌株的孢子悬液(1×10⁷conidia/mL)，取2μL孢悬液接种至CZM培养基中央，分别在26℃和32℃恒温培养条件下培养8d，观测菌落直径并统计相对生长抑制率(Relative growth inhibition)RGI，计算方式：相对抑制率RGI＝(无胁迫菌落直径-胁迫下菌落直径)/无胁迫菌落直径，每组数据三次重复。

结果表明，26℃条件下，敲除菌株ΔBbasp、回复菌株ΔBbasp::Bbasp、超量菌株OEBbasp菌落生长状况与野生型无明显差异(图9，A)，由此推测该基因不会影响常温条件下球孢白僵菌菌落的生长。

而在32℃高温胁迫下，敲除菌株ΔBbasp的菌落直径明显比野生型小，培养8d后敲除菌株ΔBbasp相对生长抑制率(61％)较野生型(49％)增加约12％(P<0.01)；回复菌株ΔBbasp::Bbasp与野生型生长状况一致；超量表达该基因后菌株生长速率最快，超量菌株OEBbasp菌落直径略大于野生型，抑制率(47％)较野生型低约2％左右(图9，B)。结果表明，BbASP基因影响高温胁迫下球孢白僵菌菌落的生长，影响球孢白僵菌高温耐受。

BbASP基因影响高温胁迫下分生孢子萌发率

为验证球孢白僵菌缺失BbASP基因是否会对其分生孢子的萌发造成影响，配制球孢白僵菌野生型WT、敲除菌株ΔBbasp、回复菌株ΔBbasp::Bbasp、超量菌株OEBbasp孢悬液(1×10⁸conidia/ml)，取100μl涂于CZM板上，26℃恒温培养箱培养8h后，每隔2h观测一次孢子萌发情况，直到20h各突变体完全萌发，每次统计100个孢子为一个重复，每种菌株取三个重复，用Graphpad prism 5软件绘制菌株萌发率曲线。

结果发现在26℃正常培养条件下，18h后四种菌株的分生孢子萌发率基本一致,均趋近100％(图10，A)，通过SPSS软件分析26℃常温条件下各菌株分生孢子萌发中时GT50，发现四种菌株分生孢子萌发中时也基本相同，都趋近于11h(图10，B)。

此外取各菌株分生孢子悬液(1×108conidia/mL，100μL)经43℃高温胁迫2h和4h后涂布于PDA培养基上，于26℃恒温培养基培养20h后统计萌发率，每次统计100个孢子为一个重复，每种菌株取三个重复，对照组为26℃处理正常培养条件。结果如图10，C所示，经43℃胁迫后四种菌株分生孢子萌发率明显下降，其中胁迫2h和4h下，敲除菌株ΔBbasp下降最为明显，较野生型分别下降7.33％(P<0.01)和48.66％(P<0.001)，回复菌株ΔBbasp::Bbasp的分生孢子经高温胁迫后的萌发率与野生型无明显差异，其超量菌株OEBbasp萌发率分别提升7％(P<0.01)和11.34％(P<0.01)。

结果表明，在26℃常温下，敲除菌株ΔBbasp的分生孢子的萌发率和野生型无太大差别，BbASP基因不影响常温下球孢白僵菌的分生孢子萌发；在43℃胁迫下，敲除菌株ΔBbasp的分生孢子的耐高温能力明显低于野生型，超量菌株OEBbasp的分生孢子的耐高温能力高于野生型，BbASP基因影响高温胁迫下球孢白僵菌的分生孢子萌发。

BbASP基因影响球孢白僵菌分生孢子的产量

为了进一步探索BbASP在高温下对球孢白僵菌生长发育的影响，统计CZM培养基上10d和20d时常温和高温下野生型及三种突变株分生孢子的产量，具体方法为：将CZM培养基中培养14d球孢白僵菌野生型、ΔBbASP、ΔBbASP::BbASP、OEBbASP菌株配制成孢悬液(1×10⁷conidia/mL)，取65μL孢悬液加入25mL未凝固的CZM固体培养基中，充分混匀后倒入无菌培养皿，每菌三个重复，于26℃及32℃下分别培养10d和20d。待10d和20d后，用10mm打孔器在每个培养基上随机取三个样，加入3mL Tween-80(0.05％v/v)中，充分涡旋混匀，用血球孢计数板统计孢子数。

结果发现如图11所示，在CZM培养基上26℃常温条件时，无论10d还是20d，敲除菌株ΔBbasp的分生孢子产量均比野生型高，分别高72.57％(P<0.01)和59.43％(P<0.01)，而回复互补突变株在CZM培养基中10d和20d分生孢子产量与野生型没有明显的差异，超量表达突变株在CZM培养基中10d分生孢子产量与野生型没有明显的差异，超量表达突变株在CZM培养基中20d分生孢子产量较野生型降低(图11，A、B)。在32℃高温条件下，敲除菌株ΔBbasp并没有出现这种差异，无论10d还是20d，敲除菌株ΔBbasp的分生孢子产量较野生型无明显差异，而回复菌株ΔBbasp::Bbasp、超量菌株OEBbasp在32℃条件下CZM培养基中10d和20d分生孢子产量较野生型有明显下降(图11，C、D)，怀疑是其T-DNA插入位点破坏基因引起。结果表明，BbASP影响球孢白僵菌分生孢子的产量，且受高温影响。

实施例8、BbASP基因对球孢白僵菌毒力的影响

BbASP基因影响球孢白僵菌的毒力

真菌的致病力是检测杀虫真菌效果的重要指标，为此我们分别检测了26℃和32℃条件下体壁浸染和体腔注射两种接种方式处理的各菌株毒力，所用试虫为三龄大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫。

体壁侵染的方式如下：取CZM培养基上培养14d的球孢白僵菌野生型、ΔBbASP、ΔBbASP::BbASP、OEBbASP分生孢子，配置15mL孢悬液(1×10⁷conidia/mL)，以Tween-80(0.05％v/v)为阴性对照。将35只大蜡螟浸泡于分生孢子悬液中，轻摇15s，以铁丝滤网过滤掉多余菌液，每种菌株三个重复。大蜡螟浸染后放置于150mm无菌培养皿中，分别放置于26℃及32℃培养箱中培养，将棉花团加湿后放于培养皿中以保持湿度，从72h开始计算大蜡螟死亡数，之后每隔24h计数一次。用Graphpad prism 5软件绘制菌株宿主存活率曲线，用SPSS软件计算各菌株半致死时间LT₅₀。

体腔注射方法如下：取各菌株分生孢子配制成孢悬液(1×10⁶conidia/mL)，同样以Tween-80(0.05％v/v)为阴性对照。用1mL注射器对大蜡螟进行注射，注射位置为第二腹足与第三腹足之间，用微量进样器每只注射5μL。每菌株三个重复，每个重复35只大蜡螟。注射完成后同样置于150mm无菌培养皿中，分别于26℃及32℃培养箱中培养，48h后开始计算死亡数，每隔12h计数一次。用Graphpad prism 5软件绘制菌株宿主存活率曲线，用SPSS软件计算各菌株半致死时间。

结果显示，26℃常温下，无论体壁浸染和体腔注射，敲除菌株ΔBbasp的宿主存活率曲线均低于球孢白僵菌野生型WT(图12，A、C)，通过分析四种菌株侵染大蜡螟半致死时间(LT₅₀)发现，26℃体壁浸染条件下敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(103h)较野生型(139.11h)缩短了36.11h(P<0.001)(图12，B)；26℃体腔注射条件下敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(71.07h)较野生型(75.04h)缩短了4h(P<0.01)(图12，D)。

32℃高温体壁浸染和体腔注射条件下，敲除菌株ΔBbasp的宿主存活率曲线也低于球孢白僵菌野生型WT(图12，E、G)，经体壁浸染敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(192.90h)较野生型(226.54h)缩短了33.64h(P<0.01)(图12，F)；体腔注射条件下敲除菌株ΔBbasp的LT₅₀(142.33h)较野生型(147.84h)缩短了5.51h(P<0.05)(图12，H)。

结果表明，破坏BbASP基因导致菌株毒力明显上升，其中常温26℃或者高温32℃体壁浸染的方式下敲除突变体ΔBbasp菌株毒力较野生型均有大幅度上升，常温26℃或者高温32℃体腔注射的条件下敲除突变体ΔBbasp菌株毒力较野生型略有升高，BbASP基因参与了球孢白僵菌毒力的调控。

BbASP基因影响宿主死亡后菌丝穿出

根据生测实验发现，敲除菌株ΔBbasp的毒力高于野生型WT，我们选取了体壁浸染和体腔注射两种生物测方式下同等时间死亡的试虫，观察其白僵菌穿出时间，每隔24h观察一次，拍照记录。结果发现26℃条件下体壁浸染和体腔注射条件下同时间死亡的试虫，敲除菌株ΔBbasp虫菌体穿出时间早于野生型(图13，A、B)。由于32℃高温条件下球孢白僵菌生长受到抑制，不论体壁浸染还是体腔注射的方法生物测试，虫菌体均无法穿出(图13，C、D)，说明BbASP基因影响宿主死亡后虫菌体的穿出。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌菌株 中的应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcgctca gaaacatcgt c 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttacttgaga ttagcgaagc cc 22

<210> 3

<211> 1208

<212> DNA

<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 3

atgtcgctca gaaacatcgt cgcctgccta gccgcggctc tagccgtcgc cgcagactcg 60

tcgcacccga tgcattataa aaaggtagat gcagaaactg ccaaaagcgt tgctgccgtt 120

agaaaccatg cgtcgggacg cgatggagcg cttgtgaatg agcaggtaag ttgagttgct 180

tgggctcatt tcaggcttcg accaattgaa cggttgctaa gtctatacaa cttcagggat 240

tctggttctc ccacttcacc gttggcgcca gcgaaaacct cgaactcctg attgacactg 300

gctcgtccga tgccatgctg aaccctggtg tctacaagcc cagctctacc tctgaggacc 360

taaaacgtcg attcagcatt tcatatgcga cgacgaaccc cgatggcacg ggaaccctat 420

ccgtgagtgc tccaaattga atgctacaac gaaacgtgcg tatcttgctt ctctaacagt 480

cctcttccta ggccttcggt caagtttatc gcgacgtcat cacccagctc ggtgccaacc 540

ttgtcgtccc gcagcaagcc attggtgcca tagacgaccc caaaacgcca gccacgtttc 600

cccgtgatgg cctcattggc tacgccggca aaggcggcgc tgccctgcgc gagagctcct 660

tcttcttctc cctctgcgcg tccaacgccc tcaccgagtg ccgattcggc ctcgccctcc 720

gcaccgacgg cactggccag ctgcactacg gcactgtcgt aaaggaggag tttgacggcg 780

agctcaccac cgtcgacctg accggctact ggtccatcaa cggcggcgtc accgtcaacg 840

gcaaggtcat tgccgacaat ctcaatctgg ccactgattc gggtacgact gtcatctttg 900

gcccaacgag cgtggtcaga gaagtctaca agtccgccgg catcaccgag gtctcgacag 960

caaacggcat cgaaggacac tacagctgca gcaactcccc tacgattggc ttcaacctcg 1020

gcggcaagaa cttcaatatt gaccccaagg cgcttgcctt taagaaggag ggcgacaatt 1080

gcaccgctag cctcatgggc acccaagact ttggcagcat gtggctcgtt ggtcaggcct 1140

ttttccaagg tcgctacatc gaccacaatg gttctgggaa aaccatgggc ttcgctaatc 1200

tcaagtaa 1208

<210> 4

<211> 1068

<212> DNA

<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 4

atgtcgctca gaaacatcgt cgcctgccta gccgcggctc tagccgtcgc cgcagactcg 60

tcgcacccga tgcattataa aaaggtagat gcagaaactg ccaaaagcgt tgctgccgtt 120

agaaaccatg cgtcgggacg cgatggagcg cttgtgaatg agcagggatt ctggttctcc 180

cacttcaccg ttggcgccag cgaaaacctc gaactcctga ttgacactgg ctcgtccgat 240

gccatgctga accctggtgt ctacaagccc agctctacct ctgaggacct aaaacgtcga 300

ttcagcattt catatgcgac gacgaacccc gatggcacgg gaaccctatc cgccttcggt 360

caagtttatc gcgacgtcat cacccagctc ggtgccaacc ttgtcgtccc gcagcaagcc 420

attggtgcca tagacgaccc caaaacgcca gccacgtttc cccgtgatgg cctcattggc 480

tacgccggca aaggcggcgc tgccctgcgc gagagctcct tcttcttctc cctctgcgcg 540

tccaacgccc tcaccgagtg ccgattcggc ctcgccctcc gcaccgacgg cactggccag 600

ctgcactacg gcactgtcgt aaaggaggag tttgacggcg agctcaccac cgtcgacctg 660

accggctact ggtccatcaa cggcggcgtc accgtcaacg gcaaggtcat tgccgacaat 720

ctcaatctgg ccactgattc gggtacgact gtcatctttg gcccaacgag cgtggtcaga 780

gaagtctaca agtccgccgg catcaccgag gtctcgacag caaacggcat cgaaggacac 840

tacagctgca gcaactcccc tacgattggc ttcaacctcg gcggcaagaa cttcaatatt 900

gaccccaagg cgcttgcctt taagaaggag ggcgacaatt gcaccgctag cctcatgggc 960

acccaagact ttggcagcat gtggctcgtt ggtcaggcct ttttccaagg tcgctacatc 1020

gaccacaatg gttctgggaa aaccatgggc ttcgctaatc tcaagtaa 1068

<210> 5

<211> 355

<212> PRT

<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 5

Met Ser Leu Arg Asn Ile Val Ala Cys Leu Ala Ala Ala Leu Ala Val

1 5 10 15

Ala Ala Asp Ser Ser His Pro Met His Tyr Lys Lys Val Asp Ala Glu

20 25 30

Thr Ala Lys Ser Val Ala Ala Val Arg Asn His Ala Ser Gly Arg Asp

35 40 45

Gly Ala Leu Val Asn Glu Gln Gly Phe Trp Phe Ser His Phe Thr Val

50 55 60

Gly Ala Ser Glu Asn Leu Glu Leu Leu Ile Asp Thr Gly Ser Ser Asp

65 70 75 80

Ala Met Leu Asn Pro Gly Val Tyr Lys Pro Ser Ser Thr Ser Glu Asp

85 90 95

Leu Lys Arg Arg Phe Ser Ile Ser Tyr Ala Thr Thr Asn Pro Asp Gly

100 105 110

Thr Gly Thr Leu Ser Ala Phe Gly Gln Val Tyr Arg Asp Val Ile Thr

115 120 125

Gln Leu Gly Ala Asn Leu Val Val Pro Gln Gln Ala Ile Gly Ala Ile

130 135 140

Asp Asp Pro Lys Thr Pro Ala Thr Phe Pro Arg Asp Gly Leu Ile Gly

145 150 155 160

Tyr Ala Gly Lys Gly Gly Ala Ala Leu Arg Glu Ser Ser Phe Phe Phe

165 170 175

Ser Leu Cys Ala Ser Asn Ala Leu Thr Glu Cys Arg Phe Gly Leu Ala

180 185 190

Leu Arg Thr Asp Gly Thr Gly Gln Leu His Tyr Gly Thr Val Val Lys

195 200 205

Glu Glu Phe Asp Gly Glu Leu Thr Thr Val Asp Leu Thr Gly Tyr Trp

210 215 220

Ser Ile Asn Gly Gly Val Thr Val Asn Gly Lys Val Ile Ala Asp Asn

225 230 235 240

Leu Asn Leu Ala Thr Asp Ser Gly Thr Thr Val Ile Phe Gly Pro Thr

245 250 255

Ser Val Val Arg Glu Val Tyr Lys Ser Ala Gly Ile Thr Glu Val Ser

260 265 270

Thr Ala Asn Gly Ile Glu Gly His Tyr Ser Cys Ser Asn Ser Pro Thr

275 280 285

Ile Gly Phe Asn Leu Gly Gly Lys Asn Phe Asn Ile Asp Pro Lys Ala

290 295 300

Leu Ala Phe Lys Lys Glu Gly Asp Asn Cys Thr Ala Ser Leu Met Gly

305 310 315 320

Thr Gln Asp Phe Gly Ser Met Trp Leu Val Gly Gln Ala Phe Phe Gln

325 330 335

Gly Arg Tyr Ile Asp His Asn Gly Ser Gly Lys Thr Met Gly Phe Ala

340 345 350

Asn Leu Lys

355

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aatctggcca ctgattcggg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aatcgtaggg gagttgctgc 20

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttggtgcgaa acttcagcgt ctagtc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tccagcaaat gtggatctcc aagcag 26

<210> 10

<211> 558

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tctagtatga gcccagaacg acgcccggcc gacatccgcc gtgccaccga ggcggacatg 60

ccggcggtct gcaccatcgt caaccactac atcgagacaa gcacggtcaa cttccgtacc 120

gagccgcagg aaccgcagga gtggacggac gacctcgtcc gtctgcggga gcgctatccc 180

tggctcgtcg ccgaggtgga cggcgaggtc gccggcatcg cctacgcggg cccctggaag 240

gcacgcaacg cctacgactg gacggccgag tcgaccgtgt acgtctcccc ccgccaccag 300

cggacgggac tgggctccac gctctacacc cacctgctga agtccctgga ggcacagggc 360

ttcaagagcg tggtcgctgt catcgggctg cccaacgacc cgagcgtgcg catgcacgag 420

gcgctcggat atgccccccg cggcatgctg cgggcggccg gcttcaagca cgggaactgg 480

catgacgtgg gtttctggca gctggacttc agcctgccgg taccgccccg tccggtcctg 540

cccgtcaccg agatctaa 558

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cggaattcgc atgctcactt tgcaacttc 29

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggaattccg atgactgacg ctgaattg 28

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctctagagg tcaagtttat cgcgacgtc 29

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

cccaagcttc tttgcagcaa tccatgagtc 30

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gacaatgtct cactccaagc 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gtcgtctatg gcaccaatgg 20

<210> 17

<211> 2048

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

acgactgaga acagattcga aatgcttcgt actgttggcc gcaaagccct gaggggctca 60

tccaagggat gttctcgaac catctcgact ctcaagcccg ccacggcaac tattgccaag 120

cccggcagca ggaccctttc gacgccagcg acggcaacag caacgtaagt cagaatcacg 180

agcgagcgaa caaacaggca gagttacaaa cgccatcact acgccttgtc ttttcgtctc 240

tgttacgtgt cgccaccccc atgcgagcta cacgtctgcg cctgaagtca caaggcttgc 300

aatttcatga cgatgaacaa cactgacact tctgttacag agcacctcga actaagccca 360

gcgccagctt caatgctcgc cgcgatcccc agcctctggt caaccctcgc tcaggtgagg 420

cagacgaatc gtaagttgcg ccaacaccgc tcctacaccg ccaagaccca taccgccgtc 480

gcatttggac aagcacaaga ctgatttgac cgtggcatag attcattggc aagacgggag 540

gagagatttt ccacgagatg atgctgaggc aaaacgtcaa gcatatctgt aagcgtctaa 600

ttctacaaat tcctaccctc gatttcaacc acatattcaa ccacatattc tgacacatga 660

gtcacagtcg gttaccctgg cggtgctatc cttcccgtgt tcgacgcgat ctacaactcg 720

aagcacatcg actttgttct gcccaagcat gagcaaggcg ccggccacat ggcagagggc 780

tatgctcgcg cttcaggcaa acccggcgtt gttctcgtca cctccggccc cggtgccaca 840

aatgtcatca ctcccatggc cgacgctctt gccgacggta cacctctggt tgtattctca 900

ggacaggttg ttacctctga tattggaagc gacgccttcc aggaggccga cgtcataggc 960

atctcccggt cttgcaccaa gtggaacgtc atggttaaga gcgctgacga gctcccgagg 1020

agaattaacg aggcctttga gattgccacc agtgggcgac ctgggcctgt cttggtcgat 1080

ctgcccaagg acgtcacggc tagtgtgctg aggagggcta tccccaccga gacctcgatt 1140

ccctctatta gcgcagcagc acgggctgtc caagaggcag gccgaaagca gcttgagcac 1200

tccatcaaac gcgtagccga tctcgtcaac attgccaaga agcccgtcat atatgccggc 1260

caaggtgtca ttttgtcgga aggcggcgtt gaacttctca aggcgcttgc cgacaaggcc 1320

tcgattcctg tcaccaccac tctgcatggt ctgggagcct ttgacgagct cgacgagaag 1380

gcactgcaca tgcttggtat gcacggttcg gcttatgcca acatgtccat gcaagaggcc 1440

gatttgatca ttgcccttgg tggccgcttc gatgaccgtg tcactggcag catccccaaa 1500

tttgctcctg ccgccaagct agctgctgct gaaggacgcg gaggtattgt ccacttcgag 1560

attatgccca agaacatcaa caaggtcgtc caagcaacag aggccattga gggcgacgtt 1620

gcttcgaact tgaagctgtt gctccccaag attgaacaac gatccatgac cgatcgcaag 1680

gagtggttcg accagatcaa ggagtggaag gagaagtggc ctctgtcaca ttatgagagg 1740

gccgagcgta gtggtctcat caagcctcag actctgatcg aggagctgag caacctgact 1800

gctgaccgca aggacatgac ctacatcaca accggtgttg gccagcacca aatgtggaca 1860

gcacaacatt tcaggtggag gcacccacgg tccatgatca cctctggcgg tttgggaacc 1920

atgggatatg gtctgccggc agcgattggc gccaaggttg ctaggccaga tgctttggtc 1980

attgacgtcg acggcgacgc atcgttcaac atgactctga cagagctttc gacggcggca 2040

cagttcaa 2048

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

cccaagcttc taccagtacg tccttgttcc 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cccaagcttg tgcaacaaca ttggagtgcc 30

<210> 20

<211> 2993

<212> DNA

<213> 球孢白僵菌(Beauveria bassiana)

<400> 20

ctaccagtac gtccttgttc ctctctggag cccgtctctg agcagagctg agcagagcag 60

agcagagcag agcgggggac gtatcttaag gggggggggt gggggggggg cgtcaactct 120

aacagtaata caagattctc tgtcctcgac accaacatga ttggcttcgc cgagatcccc 180

aagggcgctc aaggcaaaat gcacgagtac ctttttcctt tactggaact ggcggaaggc 240

acgtcgaata tacaatgacc atgctcggtc gtctaccgcg gttactttga tatcatgagc 300

catcccagct ctgacagttg ggtctcgttg cggcggcagc accgccatcc tcaacatgaa 360

cgctgcgtgc accatttgcc tgccctcatt gctgtgagtt gacgactgcg aagacggatc 420

taatcccaaa actcaccccc aagtatcggt gcaataacca tgacaaccca cccccttagc 480

aatagaaacc aatttgctaa tgagcggctg ttttcatcta gtcgatcacg ttagcggcaa 540

gtttcgggtc aagtttggca tgcagcggag agttctgccc taaagagtag gaacgtgttg 600

tggcatgtat catggcttct tctttttctt tctttttttt tttttttctc tttttttctt 660

catggttctt tgcagagccg tctggttggt gtcctcaatc gtttgcgcag cttcagtgtc 720

ccccgatgga ggaggggcat gctcactttg caacttcatc ctaaagaaca tcaacttact 780

tgttcacctc caggggctag ctttctcctt tttgtttgtt ctggttattt ctttgaaaaa 840

ccaaatgtcg aaaaaaatct tggatcaacg caaggtgtga aacacattgg gactaataag 900

tcggtcaaag actctcccag ccttcccttc gggtcttgcc tcccgcatca ttttttagcg 960

cagcacacgg taacgccact cctcggacgt cggcaacagt caacctgcca gatgtggaag 1020

gtcgggcaga cttacaaaac tagttcaact agtgcatgga attttcctgc ctccctcttg 1080

gttacgcgaa ccggctctcc tcccccggta cagcgcggct tacagaagag cccgtcatct 1140

ggtctagagc ttgggctctc cgccagtata catttgtgtg atccgccatc aggctataac 1200

ttgtgtgtct ctctcgttgg catgcagcac tgctcacatt gccgtcttgc gcgcgggccg 1260

cttttaggtt tgccggccga cacgttgtca aactttatag agggtcaact cgatggacaa 1320

tgtctcactc caagcacaaa tcctcgccac aaaagcaatc tctcaccctc cctggttgta 1380

gcatatctcc tgaaaaactt ttttctgatg tcgcgggttg ccatctgaaa aaaaaaaaaa 1440

aaaaaaacaa ttcagcgtca gtcatcgatt gtcatctaca gtgcgagtcg atcttgtgct 1500

gcatcgagaa ggtcaacacg gcatcgtcca caatcaatgc aacgccggcg acgctacaca 1560

aggaagcggt ttcatgcatg tgttcatgta tagtcaacta tatatcccca actctctccc 1620

ctccaaactc tatcagacag cgattcctcg tttcccgcat tgtcaccaca aggtctcgtc 1680

atcatgtcgc tcagaaacat cgtcgcctgc ctagccgcgg ctctagccgt cgccgcagac 1740

tcgtcgcacc cgatgcatta taaaaaggta gatgcagaaa ctgccaaaag cgttgctgcc 1800

gttagaaacc atgcgtcggg acgcgatgga gcgcttgtga atgagcaggg attctggttc 1860

tcccacttca ccgttggcgc cagcgaaaac ctcgaactcc tgattgacac tggctcgtcc 1920

gatgccatgc tgaaccctgg tgtctacaag cccagctcta cctctgagga cctaaaacgt 1980

cgattcagca tttcatatgc gacgacgaac cccgatggca cgggaaccct atccgccttc 2040

ggtcaagttt atcgcgacgt catcacccag ctcggtgcca accttgtcgt cccgcagcaa 2100

gccattggtg ccatagacga ccccaaaacg ccagccacgt ttccccgtga tggcctcatt 2160

ggctacgccg gcaaaggcgg cgctgccctg cgcgagagct ccttcttctt ctccctctgc 2220

gcgtccaacg ccctcaccga gtgccgattc ggcctcgccc tccgcaccga cggcactggc 2280

cagctgcact acggcactgt cgtaaaggag gagtttgacg gcgagctcac caccgtcgac 2340

ctgaccggct actggtccat caacggcggc gtcaccgtca acggcaaggt cattgccgac 2400

aatctcaatc tggccactga ttcgggtacg actgtcatct ttggcccaac gagcgtggtc 2460

agagaagtct acaagtccgc cggcatcacc gaggtctcga cagcaaacgg catcgaagga 2520

cactacagct gcagcaactc ccctacgatt ggcttcaacc tcggcggcaa gaacttcaat 2580

attgacccca aggcgcttgc ctttaagaag gagggcgaca attgcaccgc tagcctcatg 2640

ggcacccaag actttggcag catgtggctc gttggtcagg cctttttcca aggtcgctac 2700

atcgaccaca atggttctgg gaaaaccatg ggcttcgcta atctcaagta agcgggtcat 2760

taccaaaaaa aaaaaaaagg cgtatataac tatgcatgct ctaatgttta tggaaatgcc 2820

aagagtacat agactcatgg attgctgcaa agaaaacagg tgcccaacgg tcctcgggct 2880

tttacaaagt tccttccctc gaactttccg actgcgtata tatatataca aaagactaaa 2940

gagcgtgtcg cttcgcttga accgatgtag gaggcactcc aatgttgttg cac 2993

<210> 21

<211> 1153

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gttgggtatg ctccggcgcg accgagcaag atggccagac atgggatcaa aattagttga 60

ttcgcctttt tgcttggaca aagattacga gagcagtgag tgccatccca gtggtcaacc 120

atggcaattc cgtcttggcc cacgaggcac tcaacgaact tttgctagtc aggaggaggt 180

tggaacaagg ggaagctcgt ccatttgcat cattgatgac caagagatta gtcgacgagc 240

aggatcttgg ccgttcacag taataagcaa agacttattt ttttgcgtag cgggcaagcg 300

agatggcggc caaagtttgc gcagacacac acacgggttg acaggttgcc cgcacgcagg 360

caggcaacac gaagcttggg agctcgacgt cagtaaagtg ggggagggga agcaaccaga 420

acaagagcaa gtaagtggga tgaagcttgc tgcaacggaa gctcgagcgt cgatggagct 480

gtattgacag gtgaatacag atggattcat tgtgttgtga tagaagccaa agaacctgtg 540

tggctaattg accaggatag ctatcactaa atatgtactc aagcatcgag ggtgatatgt 600

actgttgtga cgacgagcgt tgcccctctg cccctccatg gggacctgca gcaacttgag 660

ccagcccact ggtcgagtaa ataggtatga gcaaggcggt gctggaggag ggggcgacaa 720

tcagaccagc gcctgcaact ctgcccctaa aaacaacctc agtggctgtt gacgaccttc 780

tagcgcatgt ttttcagtga caatggcctt ttttaccctt gctctggcag agccccagaa 840

tccgtgccca cgactacaaa accatttgcc cgcccctctt ccgccgccgc gacacccttt 900

ttcttctctc catatacctc atcctcgaat cgaaagacca aaagtgagtt ttcccattcg 960

ttccattcca tctcgagctt cattgctgct tcttctccct cgtcatctac ccctccatag 1020

ctccctcacc agagaagctg caccgttttc ccctcaacga ccccgccatc cgccaccaaa 1080

cagctacccc tcgctaacca ccaaacgcct caacaggttt atctcttcca cctcaccctt 1140

ttaatcaata aca 1153

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgggatccat gtcgctcaga aacatcgtc 29

<210> 23

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gatatcttac ttgagattag cgaagccc 28

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agcaagatgg ccagacatgg 20

Claims (9)

1.天冬氨酸蛋白酶基因在改良球孢白僵菌（Beauveria Bassiana）品种中的应用，其特征在于：通过敲除天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力，或通过超量表达天冬氨酸蛋白酶基因BbASP提高球孢白僵菌的高温耐受能力，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述高温为温度高于30℃的条件。

2.一种提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力的方法，其特征在于：通过敲除SEQ IDNO.20所示球孢白僵菌天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的第14682040位点之间的核苷酸序列，获得球孢白僵菌突变菌株，所述球孢白僵菌突变菌株具有提高的分生孢子产量和毒力。

3.根据权利要求2所述的提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力的方法，其特征在于：所述敲除为通过同源重组置换的方式敲除。

4.根据权利要求3所述的提高球孢白僵菌分生孢子产量和毒力的方法，其特征在于：所述通过同源重组置换的方式敲除是以除草剂抗性基因bar置换，所述bar基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

5.一种提高球孢白僵菌高温耐受能力的方法，其特征在于：通过在球孢白僵菌中超量表达启动子pb3和天冬氨酸蛋白酶基因BbASP开放阅读框序列，获得球孢白僵菌突变菌株，所述球孢白僵菌突变菌株具有提高的高温耐受能力，所述高温耐受是在温度高于30℃的条件；所述启动子pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，所述BbASP开放阅读框序列为SEQID NO.4所示。

6.一种球孢白僵菌突变株，其特征在于：所述突变株敲除球孢白僵菌天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的第14682040位点之间的核苷酸序列，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。

7.一种球孢白僵菌改良株，其特征在于：所述改良株为在通过在球孢白僵菌中超量表达天冬氨酸蛋白酶基因BbASP，天冬氨酸蛋白酶基因BbASP的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示，所述天冬氨酸蛋白酶基因BbASP由启动子pb3调控表达，所述启动子pb3的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示。

8.一种真菌杀虫剂，含有权利要求6所述的球孢白僵菌突变株或权利要求7所述的球孢白僵菌改良株。

9.权利要求6所述的球孢白僵菌突变株或权利要求7所述球孢白僵菌改良株在制备真菌杀虫剂中的应用。

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