CN103173467A - 一种利用基因工程提高球孢白僵菌高渗、氧化胁迫抗性和毒力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高球孢白僵菌高渗、氧化胁迫抗性和毒力的方法，包括将bar表达元件序列置换球孢白僵菌的Bbtmp1基因编码区的部分序列，破坏球孢白僵菌的Bbtmp1基因，得到高渗、氧化胁迫抗性和毒力均提高的孢白僵菌突变菌株；本发明还提供了包含所述球孢白僵菌突变菌株的真菌杀虫剂以及所述球孢白僵菌突变菌株在制备真菌杀虫剂中的用途。

Description

一种利用基因工程提高球孢白僵菌高渗、氧化胁迫抗性和毒力的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及利用基因工程方法改良真菌性状。

背景技术

昆虫病原真菌是一类重要的昆虫病原微生物，是自然界控制昆虫种群的一类重要自然控制因子(Clarkson et al.，1996，Trends Microbiol.，4：197-203；Feng etal.，1994，Biocontrol Sci.Technol.，4：3-34；Roberts et al.，2004，Adv.Appl.Microbiol.，54：1-70)。其中白僵菌(Beauveria)、绿僵菌(Metarhizium)、棒束孢(Isaria)、轮枝孢(Verticillium)等丝孢类真菌由于其显著的流行潜力和生产的便利性，被广泛用于农、林以及卫生害虫的生物防治。而且，与细菌和病毒类昆虫病原微生物通过消化道侵染方式不同，昆虫病原真菌是唯一直接穿透体壁侵染昆虫的微生物，对于控制将口针直接插入植物韧皮部吸食汁液的刺吸式口器害虫如蚜虫、叶蝉、飞虱等具有独到优势(Hajek et al.，1994，Annu.Rev.Entomol.，39：293-322；St.Leger et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：6349-6354)。因此，开发和应用真菌杀虫剂受到国内外的广泛关注，目前全球注册登记的真菌制剂多达170余种，用于防治农、林以及卫生害虫(de Faria et al.，2007，Biol Control，43：237-256)。

然而，真菌制剂在田间应用时，往往受到紫外辐射、干旱、氧化、变化的温度等环境因素的影响，在很大程度上影响了真菌制剂应用效果的稳定性，限制了其应用范围(Braga et al.，Mycol.Res.，105：874-882；Hallsworth et al.，1994，Lett.Appl.Microbiol.，18：8-11；Rangel et al.，2004，J.Invertebr.Pathol.，87：77-83)。如昆虫病原真菌孢子萌发或侵染初期，需要较高的相对湿度(RH＞95％)和适宜的温度(25-28℃)，而田间的干燥环境和变化的温度往往难以满足侵染所需的适宜条件(Hallsworth et al.，Microbiology，141：1109-1115)。可见，揭示真菌制剂环境适应性的分子机制，利用基因工程提升真菌制剂的对环境的适应性或抗逆性，对促进真菌制剂应用具有重要意义。

近年来，随着病原真菌逆境适应性反应分子机理的重视，尝试利用基因工程改良菌株的抗性水平和毒力已成为可能。色素可以增强真菌在不良环境条件下的存活力和竞争力。罗伯茨绿僵菌(Metarhizium robertsii)产生暗绿色孢子，但不产生DHN黑色素，将真菌Alternaria alternate的DHN黑色素合成途径转入绿僵菌显著增强了菌株对紫外辐射和高温(35℃)的耐受力(Tseng et al.，2011，Appl Environ Microbiol，77：4508-4519)。同样，将来源于曲霉Aspergillusfumigatus的酪氨酸酶基因转入球孢白僵菌提高了色素沉积，增强了菌株对紫外辐射的耐受性(Shang et al.，2012，J Invertebr Pathol，109：105-109)。紫外辐射不仅损伤真菌DNA，而且产生活性氧使细胞处于高水平氧化胁迫(Lesser，1996，Limnol Oceanoge，41：271-283)。病原真菌在氧化胁迫下，产生一系列的抗氧化酶是防御细胞受到伤害的重要方式。这些抗氧化酶包括细胞质、线粒体和分泌到胞外的过氧化氢酶(Cat)、过氧化氢酶-过氧化物酶(Cat-Pox)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)及谷胱甘肽系统、过氧化氧化还原蛋白(Tsa)和硫氧还蛋白(Thioredoxin)系统等。在昆虫病原真菌球孢白僵菌中超量表达Mg-SOD编码基因，显著提高了病原菌清除活性氧的能力，增强了紫外耐受性和毒力(Xie et al.，2010，Appl Microbiol Biotechnol，86：1541-1553)。胞内碳水化合物的贮存与病原真菌热耐受性相关。抑制绿僵菌M.acridum海藻糖酶基因表达显著增强了菌株的热耐受性，但对菌株毒力没有影响(Leng et al.，2011，BMC Microbiology，doi：10.1186/1471-2180-11-32)。

目前，有关通过破坏穿膜蛋白编码基因或改变穿膜蛋白基因表达方式增强菌株抗逆性和毒力的研究尚无报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种分离的球孢白僵菌Bbtmp1基因，所述Bbtmp1基因是穿膜蛋白编码基因，定位于线粒体膜，具有如SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供一种提高球孢白僵菌高渗、氧化胁迫抗性和毒力的方法，通过破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因或改变球孢白僵菌Bbtmp1基因表达方式，获得球孢白僵菌突变菌株，提高球孢白僵菌对高渗胁迫和氧化胁迫的耐受性与毒力。其中优选的方法为通过同源重组破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因编码区的部分序列，获得Bbtmp1基因破坏的球孢白僵菌突变菌株。

本发明的再一个目的是提供一种通过基因工程方法构建的球孢白僵菌突变菌株，通过下述步骤获得所述突变菌株：

1)从野生型球孢白僵菌中分离球孢白僵菌Bbtmp1基因；

2)以基因工程方法破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因或改变球孢白僵菌Bbtmp1基因表达方式，获得重组表达载体；

3)将步骤2)获得的重组表达载体转入球孢白僵菌野生菌株，破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因，获得球孢白僵菌突变菌株，所述突变菌株具有提高的对高渗胁迫和氧化胁迫的耐受性与毒力。

优选地，利用除草剂抗性基因bar置换Bbtmp1基因的部分编码区，构建同源重组表达载体而破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因。

本发明的目的还在于提供一种真菌杀虫剂，其含本发明所述的球孢白僵菌突变菌株。

本发明也提供Bbtmp1基因在制备真菌杀虫剂中的用途。

本发明获得了一个球孢白僵菌穿膜蛋白编码基因，该编码蛋白在N-端含有AMP-binding Domain，在C-端含有FAD/NAD(P)-binding Domain，且定位于球孢白僵菌线粒体膜。利用同源重组破坏该穿膜蛋白编码基因，获得的突变菌株提高了球孢白僵菌对高渗和氧化胁迫的抗性和毒力。可用于制备真菌杀虫剂。

附图说明

图1：利用YADE法扩增Bbtmp1的上游邻近序列。

其中，A、B、C分别为三次YADE扩增结果，箭头所指扩增的目标片段。M，DNA marker 15(MBI Fermentas)；1-7泳道分别为用EcoR I、Xba I、NcoI、Bgl II、Xho I、Sca I和EcoRV酶切基因组DNA为模板的扩增结果。

图2：Bbtmp1预测的穿膜结构及活性区域。

利用穿膜蛋白预测软件TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测Bbtmp1含有5个穿膜结构。其中，A：模拟的穿膜结构数量及结构域位置；B：模拟的穿膜蛋白跨膜的二级结构。

图3：Bbtmp1亚细胞定位。

其中，图A：Bbtmp1::eGFP融合表达载体pBARGPE1-Bbtmp1::GFP；B：转化子中GFP荧光与线粒体荧光专一染色剂MitoTracker Red荧光的激光共聚焦显微镜照片。该结果表明，GFP荧光与MitoTracker Red完全重合，即Bbtmp1定位于线粒体。

图4：pK2-gusT载体图谱。

其中，PtrpC和TtrpC为来源于构巢曲霉色氨酸合成酶基因启动子和终止子；GUS为β-葡萄糖苷酸酶基因。

图5：同源重组破坏Bbtmp1基因策略、载体图谱及基因破坏突变体筛选。其中，A是同源重组破坏Bbtmp1策略；小箭头及字母和数字表示引物及引物位置；B是同源重组表达载体图谱；C是PCR筛选转化子；其中，M：DNA marker(MBI Fermentas)；WT：野生菌株；Control：随机插入表达载体转化子；Δtmp1：Bbtmp1基因破坏突变体。

图6：Bbtmp1回复互补表达载体图谱及转化子筛选。

其中，A是回复互补表达载体pCB1536-Bbtmp1图谱；B是PCR扩增验证Bbtmp1成功整合到Bbtmp1基因破坏突变体基因组中；其中M：DNA marker(MBIFermentas)；WT：野生菌株；Δtmp1：Bbtmp1基因破坏突变体；Δtmp1::tmp1：Bbtmp1回复互补转化子；C是以actin基因为参比基因，RT-PCR扩增验证Bbtmp1在回复互补转化子中正常转录；其中，WT：野生菌株；Δtmp1：Bbtmp1基因破坏突变体；Δtmp1::tmp1：Bbtmp1回复互补转化子。

图7：超量表达Bbtmp1表达载体图谱及转化子筛选。

其中，A：超量表达Bbtmp1表达载体图谱；B：以actin编码基因为内标，Real-time RT-PCR筛选超量表达Bbtmp1转化子；其中，WT：野生菌株；1-10：超量表达Bbtmp1转化子。

图8：Bbtmp1基因破坏增强菌株对高渗和氧化胁迫的抗性。

分别点滴接种2.0μl分生孢子悬液(浓度为1×10⁷/ml)于含有1.0M山梨醇、0.8M NaCl、0.63mM H₂O₂和2.07mM维生素K13(menadione)的察氏培养基(Czapek-Dox agar)平板(直径为90mm)中央，于26℃恒温培养7天。结果表明，破坏Bbtmp1基因增强菌株对高渗和氧化胁迫的耐受性，而超量表达Bbtmp1则增强了菌株对高渗和氧化胁迫的敏感性。其中，WT：野生菌株；Δtmp1：Bbtmp1破坏突变体；Δtmp1::tmp1：Bbtmp1回复互补转化子；over-Δtmp1：超量表达Bbtmp1转化子；control：同源重组元件随机整合转化子对照。

图9：野生菌株(WT)和Bbtmp1基因破坏突变体(Δtmp1)分生子萌发率趋势。接种新鲜分生孢子于SDY液体培养基于26℃、180rpm振荡培养。培养9小时后，间隔1小时取样于显微镜下观察统计孢子萌发率，每次统计不少于300个孢子，芽管长于孢子直径的一半视为萌发。

图10：Bbtmp1基因破坏提高菌株的毒力。

其中，上图为通过“经典”的体壁接种方式接种浓度为2×10⁷/ml的分生孢子后试虫的存活率趋势；下图为微量注射2μl浓度为2×10⁷/ml的分生孢子到试虫血腔后，试虫的存活率趋势。试虫为3龄大蜡螟幼虫；试验重复3次。其中，WT：野生菌株；Δtmp1：Bbtmp1破坏突变体；Δtmp1::tmp1：Bbtmp1回复互补转化子；over-Δtmp1：超量表达Bbtmp1转化子；control：0.05％Tween-80。

具体实施方式

通过以下实施例可以进一步理解本发明的优点和特点，不应该理解为是对本发明范围的限制。

以下实施例中所用仪器和试剂，除特殊说明以外均为普通市售。

【实施例1】

1.Bbtmp1基因克隆

利用EcoR I、Xba I、Nco I、Bgl II、Xho I、Sca I和EcoR V七种内切酶酶切球孢白僵菌基因组DNA，链接相应接头序列(参考肖月华等，2002，遗传学报，29(1)：62～66)。然后根据本发明人研究获得的EST序列(SEQ ID NO.36)设计引物，依次利用YADE(Y形接头延伸)法延伸EST上、下游序列。

其中延伸部分上游序列的引物分别为：

第一次YADE：

P1：5′-AGACTGTGCTCAACGCCATG-3′(SEQ ID NO.1)

P2：5′-AGGACCTGGGCATGATTCTC-3′(SEQ ID NO.2)

第二次YADE：

P3：5′-ATGGCGTTGAGCACAGTCTT-3′(SEQ ID NO.3)

P4：5′-ATGAACCGGTGCGACTGCTC-3′(SEQ ID NO.4)

第三次YADE：

P5：5′-GCTGGAGTTGCCAAGTCTAT-3′(SEQ ID NO.5)

P6：5′-AGCCCTATGCACACACTCTT-3′(SEQ ID NO.6)

接头引物(Adaptor prime)：P7：5′-cggtaggatccccagaac-3′(SEQ ID NO.7)

线形扩增程序为：10×ExTaq PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mmol·L^-1dNTP2μl，5μmol·L^-1的线形扩增引物1μl，连接产物1μl，Ex Taq 0.7U(热启动时加入)，用水补足至25μl体系。线形扩增程序为：94℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃3min，40个循环；72℃延伸10min。指数扩增体系为：10×ExTaqPCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mmol·L^-1dNTP 2μl，5μmol·L^-1的指数扩增引物和接头引物各2μl，线形扩增产物1μl，Ex Taq 0.7U(热启动时加入)，用水补足至25μl体系。扩增程序为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物在1.0％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳(如图1所示)，回收扩增片段并克隆测序。

依次通过YADE法延伸已知序列的邻接序列，拼接延伸序列，获得Bbtmp1基因序列7003bp(SEQ ID NO.8)。

用1/4SDAY液体培养基培养球孢白僵菌菌丝从中提取总RNA，根据基因组序列设计上游引物，按大连宝生物公司(TaKaRa)3′-Full RACE Core Set试剂盒扩增Bbtmp1cDNA序列。RNA提取按照EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德生物科技有限公司)方法进行。3′-Full RACE参照试剂盒方法进行。扩增引物为：

P8：5′-TAATCCTTGGACGCTGCGAC-3′(SEQ ID NO.9)

P9：5′-CAAGAGCCTTCTTGTCCGTC-3′(SEQ ID NO.10)

1.0％琼脂糖凝胶电泳，回收扩增片段并克隆测序，获得Bbtmp1全长cDNA序列3018bp(SEQ ID NO.11)。

2.Bbtmp1亚细胞定位

据Bbtmp1 cDNA序列，推测该基因编码1005个氨基酸的多肽(SEQ ID NO.12)。NCBI分析发现，Bbtmp1蛋白在N-端含有一个保守的AMP-binding domain，C段含有一个FAD/NAD(P)-binding domain(如图2所示)。利用穿膜结构预测软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析发现，Bbtmp1含有5个保守的穿膜结构(如图2所示)。

利用蛋白亚细胞定位软件http://abi.inf.uni-tuebingen.de/Services/SherLoc/预测(预测方法选择“SherLoc(Fungal，9 localization))”，结果表明，Bbtmp1定位于线粒体的分值最高(Score 0.46)。为验证预测结果，发明人利用重叠PCR将绿色荧光蛋白基因eGFP融合在Bbtmp1编码区3′端，构建了融合表达基因。以球孢白僵菌基因组DNA为模板，利用引物P10/P11扩增Bbtmp1基因(包含启动子序列和编码区)，约6kb；以质粒pEGF-C1(CLONTECH)为模板，利用引物P12/P13扩增eGFP编码区(约730bp)。然后分别以Bbtmp1和eGFP互为引物扩增，融合Bbtmp1与eGFP。扩增体系如下：10×LA Taq PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mmol·L^-1dNTP 2μl，Bbtmp1和eGFP片段各200ng，LA Taq 0.7U(热启动时加入)，用水补足至25μl体系。扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃45s，72℃3min，20个循环；72℃延伸10min。然后以1μl扩增产物为模板，利用引物P10和P13扩增Bbtmp1::eGFP融合片段。扩增体系如下：10×LA TaqPCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mmol·L^-1dNTP 2μl，5μmol·L^-1引物P10和P13各1μl，上述扩增产物1μl，LA Taq 0.7U(热启动时加入)，用水补足至25μl体系。扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物在1.0％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳，回收扩增片段并克隆测序。

扩增用引物序列如下：

P10：5′-ttgggggaggtggtgcgggt-3′(SEQ ID NO.13)

P11：

5′-TCCTCGCCCTTGCTCACCATgcccgagccGCTATCCCAAATAGCTCCAT-3(SEQ ID NO.14)

P12：5′-ggctcgggcatggtgagcaagggcgagga-3′(SEQ ID NO.15)

P13：5′-ctattaCTTGTACAGCTCGT-3′(SEQ ID NO.16)

用NdeI和BamHI酶切质粒pBARGPE1(Fungal Genetics Stock Center)去除真菌组成型启动子gpdA promoter，然后用T4 DNA聚合酶(IBM)补平后连接，形成不含启动子gpdA promoter的pBARGPE1。将测序正确的扩增产物Bbtmp1::eGFP两端用T4DNA聚合酶(IBM)补平，然后连接于用SmaI/EcoRV酶切后用碱性磷酸酶去磷酸化的pBARGPE1。载体图谱见图3A。融合表达载体用高频电击转化球孢白僵菌。转化方法参照文献(Jin et al.，2008，Biotechnol Lett，30：1379-1383)。筛选草甘膦抗性菌落，提取DNA，利用引物P10/P13扩增融合基因验证转化子。

亚细胞定位观察。材料分别为在SDY培养4天的菌丝和芽生孢子。即接种分生孢子于装有100ml的SDY液体培养基的三角瓶(250ml)中，分生孢子终浓度为1×10⁷ml^-1。将接种后的三角瓶于180rpm、26℃振荡培养4天。收集菌丝和芽生孢子，灭菌水洗涤去除培养基成分，用线粒体专一荧光染色剂MitoTracker Red(Sigma)染色菌丝和芽生孢子，然后置于玻片上于激光共聚焦显微镜下双荧光观察GFP荧光和线粒体荧光，结果发现在菌丝和芽生孢子中，GFP荧光和线粒体荧光(MitoTracker Red)完全重合(如图3B所示)。该结果证明Bbtmp1定位于线粒体。

【实施例2】

1.利用同源重组破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因

构建Bbtmp1同源重组表达载体策略如下：利用bar基因的表达元件(SEQ IDNO.37)置换Bbtmp1基因的部分编码区。即在bar表达元件两端衔接Bbtmp1的侧翼序列构成同源重组表达载体，经遗传转化导入球孢白僵菌，通过载体两侧衔接的Bbtmp1侧翼序列与球孢白僵菌基因组中的同源序列进行双交换，置换部分Bbtmp1部分编码区(273bp)，达到破坏目的基因的目的(如图5A所示)，其中，bar表达元件序列置换球孢白僵菌Bbtmp1基因编码区的部分序列后的基因序列如SEQ ID NO.35所示。

具体操作如下：

根据Bbtmp1序列和草甘膦抗性基因bar表达元件序列设计引物L1、L2、R1、R2、B1和B2，分别扩增Bbtmp1 5′端和3′端序列和bar基因表达元件序列，采用重叠PCR技术融合上述元件，克隆到利用gus基因置换潮霉素抗性基因hyg的pPk2(Fungal Genetics Stock Center；McCluskey，2003，Adv.Appl.Microbiol.，52：245-262)载体上(PK2-gusT，如图4所示)。即以球孢白僵菌基因组DNA为模板，利用引物L1/L2和R1/R2扩增Bbtmp1 5′端(874bp)和3′端(937bp)序列，在L1引物5′-端引入HindIII位点，在L2引物5′-端引入部分bar基因元件序列，在R1引物5′端引入bar元件部分下游序列，在R2引物5′端引入XbaI位点。

然后分别以Bbtmp1基因5′端序列(L)、bar元件和Bbtmp1基因3′端序列(R)互为引物扩增，融合L::bar::R元件。扩增体系如下：10×LA Taq PCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mmol·L^-1dNTP 2μl，L、bar和R片段各200ng，LA Taq 0.7U(热启动时加入)，用水补足至25μl体系。扩增程序为：94℃5min；94℃30s，56℃45s，72℃3min，20个循环；72℃延伸10min。然后以1μl扩增产物为模板，利用引物L1和R2扩增L::bar::R融合片段。扩增体系如下：10×LA TaqPCR Buffer(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mmol·L^-1dNTP 2μl，5μmol·L^-1引物L1和R2各1μl，上述扩增产物1μl，LA Taq 0.7U(热启动时加入)，用水补足至25μl体系。扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。扩增产物在1.0％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳，回收扩增片段测序验证。然后用HindIII和XbaI酶切融合片段，连接于用相同酶切后的PK2-gusT，形成同源重组表达载体PK1-gusT-Bbtmp1(图5B)。

将表达载体PK1-gusT-Bbtmp1转入根癌农杆菌AGL-1，转化参照Fang et al.方法(Fang et al.，2004，J.Invertebr.Pathol.，85：18-24)。然后利用根癌农杆菌介导法转化球孢白僵菌分生孢子(Fang et al.，2004，J.Invertebr.Pathol.，85：18-24)。在含60ppm除草剂草甘膦(glufosinate)的察氏培养基(Czapek-Dox agar)平板上筛选抗性菌落。提取抗性转化子DNA，利用引物S1/S2扩增筛选基因破坏突变体，若随机插入转化子则扩增出部分同源重组元件(1.1kb)和野生型基因部分片段(422bp)两条带，而基因破坏转化子只扩增出部分同源重组元件片段(1.1kb)一条带，而野生菌株则只存在野生型带(422bp)。根据该方案，筛选到2个基因破坏突变体(图5C)。

L1：5′-CCCAAGCTTatcatgatggcgacctctat-3′(SEQ ID NO.17)

L2：5′-TCAATGTCATCTTCTGTCGACatgacgagggtgccaccatt-3′(SEQ IDNO.18)

R1：5′-TGCCCGTCACCGAGATCTAATAGtcaataccatgagcagacat-3′(SEQ IDNO.19)

R2：5′-GCTCTAGAcgttgagaagcaccaccacgga-3′(SEQ ID NO.20)

B1：5′-GTCGACAGAAGATGACATTGA-3′(SEQ ID NO.21)

B2：5′-CTATTAGATCTCGGTGACGGGCA-3′(SEQ ID NO.22)

S1：5′-atctctctcaagattctcat-3′(SEQ ID NO.23)

S2：5′-tacacattgttattaggagt-3′(SEQ ID NO.24)

2.回复互补Bbtmp1基因破坏突变体

以球孢白僵菌基因组DNA为模板，利用引物Re1/Re2(分别在Re1和Re2的5′-端引入SnaBI和XbaI酶切位点，引物序列附后)扩增Bbtmp1基因(包括启动子序列、编码区和终止子序列)。用SnaBI和XbaI酶切扩增片段，克隆到用相同酶切的载体pCB1536(Fungal Genetics Stock Center)上，形成载体pBC1536-Bbtmp1(如图6A所示)，该载体携带除草剂氯嘧磺隆(chlorimuron ethyl)抗性基因sur。利用高频电击介导法将载体转入Bbtmp1基因破坏突变体。白僵菌转化方法参照文献(Jin et al.，2008，Biotechnol Lett，30：1379-1383)，转化后在含有chlorimuron ethyl的察氏培养基(Czapek-Dox agar)上筛选抗性菌落，提取DNA，利用引物S1/S2验证转化子。若将Bbtmp1成功导入Bbtmp1基因破坏突变体，则扩增出两条带，一条为含有bar基因的部分同源重组元件(1.1kb)，另一条为野生型基因部分片段(422bp)(如图6B所示)。利用RT-PCR验证表明，转化子中Bbtmp1正常转录。RT-PCR操作如下：接种分生孢子于1/4SDAY液体培养基中培养48小时，收集菌丝提取RNA，反转录后合成cDNA第一链。以野生菌株为对照进行RT-PCR表达分析。RNA提取按照EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德生物科技有限公司)方法进行。紫外分光光度计定量RNA。取2μg RNA利用oligo(dT)引物反转录成cDNA第一链，反转录采照试剂盒(oligo(dT)-primed cDNA synthesis kit(MBI Fermentas)说明书。将合成的cDNA第一链稀释成10ng/μl，以actin(Gen-Bank ID：HQ232398)为参比基因进行RT-PCR检测Bbtmp1在转化子中的转录。扩增体系如下：10×EX Taq PCRBuffer(含Mg²⁺)2.5μl，2.5mmol·L^-1dNTP 2μl，5μmol·L^-1引物各1μl，稀释的cDNA一链模板1μl，EX Taq 0.7U，用水补足至25μl体系。扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，25个循环；72℃延伸10min。扩增产物在1.0％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测Bbtmp1的转录情况。扩增actin和Bbtmp1的引物对分别为actin-F/actin-R和tmp1-F/tmp1-R，引物序列附后。结果表明，Bbtmp1在回复互补转化子中能够正常转录(如图6C所示)。

Re1：5′-CCTACGTATACAGCTGCAATGATTGGCT-3′(SEQ ID NO.25)

Re2：5′-GCTCTAGATCCTTGTCTGGTAGGCGTAG-3′(SEQ ID NO.26)

tmp1-F：5′-ATCGCGACGCTCTTTAACCG-3′(SEQ ID NO.27)

tmp1-R：5′-GCTATCCCAAATAGCTCCAT-3′(SEQ ID NO.28)

actin-F：5′-TTGGTGCGAAACTTCAGCGTCTAGTC-3′(SEQ ID NO.29)

actin-R：5′-TCCAGCAAATGTGGATCTCCAAGCAG-3′(SEQ ID NO.30)

3.超量表达Bbtmp1基因

以球孢白僵菌基因组DNA为模板，利用引物Ov1/Ov2(分别在Ov1和Ov2的5′-端引入EcoRI和EcoRV酶切位点，引物序列附后)扩增Bbtmp1基因的编码区。用EcoRI和EcoRV酶切扩增片段，克隆到用相同酶切的载体pBARGPE1(Fungal Genetics Stock Center)，置于该载体中真菌组成型表达启动子gpdA promoter(来源于构巢曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶基因)控制下，形成超量表达载体pBARGPE1-Bbtmp1(如图7A所示)。该载体携带除草剂草甘膦(glufosinate)抗性基因bar。利用高频电击介导法将载体转入球孢白僵菌野生菌株。白僵菌转化的方法参照文献(Jin et al.，2008，Biotechnol Lett，30：1379-1383)。转化后在含有60ppm除草剂草甘膦(glufosinate)的察氏培养基(Czapek-Dox agar)平板上筛选抗性菌落，提取DNA，利用引物B1/B2扩增验证转化子，并利用Real-timeRT-PCR筛选转录水平显著提高的转化子。

Real-time RT-PCR具体操作如下：1/4SDY液体培养基中培养转化子48小时，收集菌丝提取RNA，反转录后合成cDNA第一链。以野生菌株为对照进行Real-time RT-PCR表达分析。RNA提取按照EASYspin植物RNA快速提取试剂盒(北京艾德生物科技有限公司)方法进行。紫外分光光度计定量RNA。取2μgRNA利用oligo(dT)引物反转录成cDNA第一链，反转录按照试剂盒(oligo(dT)-primed cDNA synthesis kit(MBI Fermentas)说明书进行。将合成的cDNA第一链稀释成10ng/μl，以actin(Gen-Bank ID：HQ232398)和β-tubulin(GenBank ID：DQ079603)为参比基因，利用Real-time RT-PCR分析Bbtmp1在转化子中的表达水平。Real-time RT-PCR按照quantitative real-time PCR kit(Bio-Rad)方法进行。利用CFX Manager software(Bio-Rad，USA)软件分析目的基因Bbtmp1相对于参比基因的表达水平。扩增各基因的引物同上(2.回复互补Bbtmp1基因破坏突变体)。结果表明，相对于野生菌株(WT)，大部分超量表达转化子中Bbtmp1的转录水平显著提高(图7B)。筛选转录水平显著提高的转化子进行进一步研究。

Ov1：5′-GGAATTCAAGACGTATATATGGTGCGA-3′(SEQ ID NO.31)

Ov2：5′-GCGATATCATTTAGCTATCCCAAATAGCT-3′(SEQ ID NO.32)

tmp1-F：5′-ATCGCGACGCTCTTTAACCG-3′(SEQ ID NO.27)

tmp1-R：5′-GCTATCCCAAATAGCTCCAT-3′(SEQ ID NO.28)

actin-F：5′-TTGGTGCGAAACTTCAGCGTCTAGTC-3′(SEQ ID NO.29)

actin-R：5′-TCCAGCAAATGTGGATCTCCAAGCAG-3′(SEQ ID NO.30)

tubulin-F：5′-TACTCTACGATTCGTCAAGT-3′(SEQ ID NO.33)

tubulin-R：5′-TGCTGGAACAGAGCCGTCTT-3′(SEQ ID NO.34)

【实施例3】

1.Bbtmp1对球孢白僵菌高渗和氧化胁迫耐受性的影响

收集在SADY上于26℃培养12天的新鲜分生孢子，利用灭菌的0.05％Tween-80配成浓度为1×10⁷/ml的分生孢子悬液。取2.0μl分生孢子悬液点滴接种于含有1.0M山梨醇、0.8M NaCl与不同浓度氧化剂H₂O₂和维生素K13(menadione)的察氏培养基(Czapek-Dox agar)平板(直径为90mm)中央，于26℃恒温培养7天，分析Bbtmp1破坏突变体(Δtmp1)、Bbtmp1回复互补转化子(Δtmp1::tmp1)、超量表达Bbtmp1转化子(over-Δtmp1)、同源重组元件随机整合转化子对照(control)和野生菌株(WT)对高渗和不同氧化剂的敏感性。结果发现，相对于野生菌株(WT)，Bbtmp1破坏突变体(Δtmp1)对高渗和氧化胁迫的敏感性降低，即对高渗和氧化胁迫的耐受性或抗性增强；而超量表达Bbtmp1转化子(over-Δtmp1)对高渗和氧化胁迫的敏感性增强，即对高渗和氧化胁迫高度敏感；而Bbtmp1回复互补转化子(Δtmp1::tmp1)和同源重组元件随机整合转化子对照(control)对高渗和氧化胁迫的敏感性与野生菌株没有明显差异(如图8所示)。H₂O₂和维生素K13(menadione)对野生菌株、Δtmp1突变体和超量表达Bbtmp1转化子的最低抑制浓度分别为5.76mM和0.037mM、6.91mM和0.044mM、4.64mM和0.032mM。

2.Bbtmp1对球孢白僵菌活力的影响

收集在SADY上于26℃培养12天的新鲜分生孢子，接种于SDY液体培养基，调整终浓度为1×10⁷/ml。于26℃、180rpm振荡培养。培养9小时后，间隔1小时取样于显微镜下观察统计孢子萌发率，每次统计不少于300个孢子。芽管长于孢子直径的一半视为萌发。结果发现，Bbtmp1破坏显著提高了孢子活力。取样时间区间(9-15h)内，基因破坏突变体(ΔBbtmp1)的孢子萌发率显著高于野生菌株(WT)(如图9所示)。基因破坏突变体(ΔBbtmp1)孢子萌发一半(50％)的时间(GT₅₀)为9.6h，比野生菌株(WT)(12.1h)缩短了2.5h。

3.Bbtmp1对球孢白僵菌毒力的影响

收集在SADY上于26℃培养12天的新鲜分生孢子，利用灭菌的0.05％Tween-80配成浓度为2×10⁷/ml的分生孢子悬液，采用两种方式接种3龄大蜡螟幼虫：1)“经典”的体壁接种法：将试虫浸于分生孢子悬浮液2秒钟，用吸水纸吸去多余水分，每处理不少于30头虫。以0.05％Tween-80处理为对照。试验重复3次。2)注射接种法：采用微量注射仪将分生孢子通过第二腹足注射到昆虫血腔，每头注射2.0μl，每处理不少于30头虫。以注射2.0μl 0.05％Tween-80的试虫为对照。试验重复3次。试虫接种后置于灭菌培养皿，于25℃条件下饲喂，每天统计死亡率。结果发现，两种接种方法后，在统计时间内基因破坏突变体(Δtmp1)处理的试虫存活率趋势显著低于野生菌株处理(WT)，即基因破坏突变体(Δtmp1)引起昆虫的死亡率明显加快，毒力显著提高(图10A)。“经典”体壁接种后，Δtmp1引起的半致死时间(LT₅₀)为80.2h，比野生菌株(WT)(112.8h)缩短了32.6h；注射接种后，Δtmp1引起的半致死时间(LT₅₀)为56.4h，比野生菌株(WT)(66.2h)缩短了9.8h。超量表达Bbtmp1转化子(over-tmp1)处理后的试虫存活率趋势明显高于野生菌株(WT)，即over-tmp1致死昆虫的速度减弱，毒力降低(图10B)。“经典”体壁侵染方式接种后，over-tmp1引起的半致死时间(LT₅₀)为118h，比野生菌株(WT)(112.8h)延长了5.2h；注射接种后，over-tmp1引起的半致死时间(LT₅₀)为70.6h，比野生菌株(WT)(66.2h)延长了4.4h。而Bbtmp1回复互补转化子(Δtmp1::tmp1)和同源重组元件随机整合转化子对照(control)的存活率趋势及半致死时间与野生菌株没有明显差异。该结果表明，Bbtmp1负调节球孢白僵菌毒力。

Claims (7)

1.一种分离的Bbtmp1基因，所述Bbtmp1基因编码球孢白僵菌穿膜蛋白且定位于球孢白僵菌线粒体膜，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

2.一种提高球孢白僵菌对高渗、氧化胁迫抗性和毒力的方法，通过破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因或改变球孢白僵菌Bbtmp1基因表达方式，获得球孢白僵菌突变菌株，提高球孢白僵菌对高渗胁迫和氧化胁迫的耐受性与毒力。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，利用除草剂抗性基因bar置换Bbtmp1基因的部分编码区，构建同源重组表达载体而破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因。

4.一种通过基因工程方法构建的球孢白僵菌突变菌株，其特征在于，通过下述步骤获得所述突变菌株：

1)从野生型球孢白僵菌中分离球孢白僵菌Bbtmp1基因；

2)以基因工程方法破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因或改变球孢白僵菌Bbtmp1基因表达方式，获得重组表达载体；

3)将步骤2)获得的重组表达载体转入球孢白僵菌野生菌株，破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因，获得球孢白僵菌突变菌株，所述突变菌株具有提高的对高渗胁迫和氧化胁迫的耐受性与毒力。

5.如权利要求4所述的球孢白僵菌突变菌株，其特征在于，所述步骤2)中，利用除草剂抗性基因bar置换Bbtmp1基因的部分编码区，构建同源重组表达载体而破坏球孢白僵菌Bbtmp1基因。

6.一种真菌杀虫剂，含有权利要求4或5所述的球孢白僵菌突变菌株。

7.如权利要求1所述的Bbtmp1基因在制备真菌杀虫剂中的用途。

Images