CN109913377A

CN109913377A - 基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途

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Publication number: CN109913377A
Application number: CN201811609712.8A
Authority: CN
Inventors: 冯明光; 王定一; 应盛华; 童森淼
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-12-27
Filing date: 2018-12-27
Publication date: 2019-06-21

Abstract

基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途，属于生物技术领域。其特征在于：菌株保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana。上述基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途，利用球孢白僵菌（Beauveria bassiana）基因组中CPF基因之一BbCPF1构建在该菌野生菌株中超表达的菌株，有效提高分生孢子对UVB紫外辐射的耐受力及受损失活孢子的自然可见光修复能力，可显著增强真菌杀虫剂抗紫外辐射的能力，因而具有重要的应用前景。

Description

基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途。

背景技术

真菌杀虫剂是替代化学杀虫剂的侵染性活体细胞制剂，具有杀虫谱宽、田间持效期长、不产生抗药性和环境友好等一系列优点。但是，分生孢子等剂型化的真菌细胞在田间应用时常遭受阳光紫外辐射的损伤而影响田间害虫防治效果的稳定性和持效性，突出表现在害虫易发且阳光辐射强烈的夏季，由此限制了真菌杀虫剂的应用季节和范围。阳光紫外辐射中包含UVC (< 290 nm)、UVB (290 - 320 nm)和UVA (320 - 400 nm)三种有害射线成分，共中最有害的UVC在阳光抵达地球表面之前即被大气臭氧层全部过滤去除，能够到达地球表面的有害射线主要是UVB，其次是UVA。因此，阳光UVB紫外辐射对剂型化真菌细胞的损伤最大，较大波长UVA的影响则相当有限。

真核细胞抵抗紫外辐射损伤的机制主要靠隐花色素/光裂合酶家族（英文缩写为CPF）成员的作用。CPF家族在丝状真菌中也广泛存在，成员数量及其功能因菌种而异。丝状真菌的相关研究报道常用UVC辐射的方式分析CPF成员缺失细胞对紫外辐射的敏感性及其受损伤DNA的修复能力变化，证明有的CPF成员可修复UVC辐射诱导产生和积累的环丁烷嘧啶二聚体DNA损伤，有的CPF成员则可修复同样诱导产生和积累的6-4嘧啶-嘧啶DNA损伤，但并非真菌所有CPF成员都具有如此的DNA损伤修复功能。值得注意的是，这些报道一般用地球表面并不存在的UVC辐射模拟研究CPF成员对紫外辐射损伤的抵抗力及其修复功能，罕见针对地球表面阳光中的主要有害射线UVB。

白僵菌（Beauveria）、绿僵菌（Metharhizium）等昆虫病原真菌的分生孢子制剂广泛用于农林害虫生物防治，采用生物技术方法提高这些真菌制剂抗紫外辐射的能力在害虫生物防治实践中具有重要意义和应用价值，但迄今未见成功利用内源CPF家族成员编码基因（简称CPF基因）提高生产菌株抗UVB紫外辐射的报道。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于设计提供一种基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途的技术方案，其BbCPF1基因的转录表达水平较野生菌株提高15倍，在正常培养条件下产生的分生孢子在UVB紫外辐射下失活50%和90%的辐射剂量较野生菌株分别提高54%和55%，在UVB致死剂量辐射下完全失活的分生孢子在可见光照射下被修复即恢复萌发的能力大幅增强；该发明在很大程度上克服了作为真菌杀虫剂有效成分的分生孢子在田间应用后对太阳光UVB紫外辐射的敏感性，可显著增强真菌杀虫剂抗紫外辐射的能力，因而具有重要的应用前景。

所述的基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于：菌株保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年9月10日，保藏编号：CGMCC No. 16362。

所述的基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）从球孢白僵菌野生菌株基因组DNA中克隆转录延伸因子基因Tef的强启动子Ptef,经限制性内切酶XmaI消化后插入p0380-bar质粒的相应酶切位点，构成内源靶标基因超表达的基础质粒p0380-Ptef-bar，其中bar为抗草丁膦的筛选标记基因；

2）从球孢白僵菌野生菌株基因组cDNA中克隆光修复基因BbCPF1的编码序列（基因组标记位点：BBA_01664），插入经限制内切酶XmaI和BamHI消化后p0380-Ptef-bar质粒的相应酶切位点之间，构建成BbCPF基因的超表达质粒p0380-Ptef-BbCPF-bar；

3）将2）中所构建超表达质粒在大肠杆菌Escherichia coli DH5a中扩增后，用农杆菌介导的真菌转化法转入球孢白僵菌野生菌株中；

4）经草丁膦抗性筛选的疑似转化菌株在正常条件下培养3天，提取RNA反转录成cDNA，用实时定量PCR（qPCR）方法测定BbCPF1基因在各cDNA样品中相对于野生菌株的转录水平，转录表达水平最高的转化子即为球孢白僵菌抗紫外辐射菌株。

所述的基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株的构建方法，其特征在于：将步骤2）构建的超表达载体转入害虫生防真菌的方法为：农杆菌介导法转化、原生质体转化、芽生孢子转化或电击转化。

所述的基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于：用于提高真菌杀虫剂对阳光紫外辐射的抵抗力与田间害虫防治的稳定性及持效性。

上述一种基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株及其构建方法和用途，优点在于利用球孢白僵菌内源强启动子Ptef驱动BbCPF1基因在球孢白僵菌野生株中高表达，使BbCPF1在筛选获得的工程菌株中的转录表达水平较野生菌株提高15倍，工程菌株所产分生孢子抗UVB紫外辐射的能力提高50%以上，其在UVB致死或过致死剂量辐射下完全失活的分生孢子在可见光下暴露1～3小时的修复率即恢复萌发率达32～56%。本发明基于内源光修复基因BbCPF1超表达的工程菌株，可用于抗紫外辐射真菌杀虫剂的研发，因而对具有重要的应用价值和前景。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：高表达BbCPF1基因的球孢白僵菌工程菌株构建方法

步骤1：目标基因超表达基础质粒的构建。利用自行设计的如下配对引物，

F: CCACCATGTTGGGCCCGGCGCGCCTACTGCCGCAAGCAATTCTTTA

R: CAGGTCGACGGATCCCCGGGTTTGAAGGTGTTTGTGAT

从球孢白僵菌野生菌株（中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心编号：CGMCCNo.13566，以下简称野生菌株）基因组DNA中扩增内源强启动子Ptef的1369 bp序列，经XmaI酶切后插入插入先期构建的基础质粒p0380-bar的XmaI位点，即成基因超表达基础质粒p0380-Ptef-bar。

步骤2：光修复基因BbCPF1超表达质粒的构建。将野生菌株含10⁷个分生孢子/mL的悬液100 mL均匀涂抹在贴玻璃纸的萨氏培养基平板上，在25℃和光周期12:12的最适条件下培养4天，取培养物液氮研磨至粉末状。在RNAiso^TM Plus Reagent (TaKaRa, 中国大连)作用下，自液氮研磨物中提取提取总RNA，继而用试剂盒PrimeScript RT reagent kit(TaKaRa)将总RNA反转录为cDNA。利用自行设计的如下配对引物，从cDNA

F: CAAACACCTTCAAACCCGGGATGGCGCCTCGTGCAACGAAGCG

R: GGCTGCAGGTCGACGGAT CCCTACGCCACAGCCGCCTTGTACGCA

中扩增BbCPF1基因1764 bp的编码序列（基因组标记位点：BBA_01664），经XmaI/BamHI酶切后插入p0380-Ptef-bar的相应酶切位点，即成BbCPF1超表达质粒p0380-Ptef-BbCPF1-bar。

步骤3：高表达BbCPF1转基因菌株的构建与筛选。运用农杆菌介导法，将p0380-Ptef-BbCPF1-bar质粒转化到野生菌株中表达，经草丁膦 (200 mg/mL)抗性筛选获得疑似转化子。将所获若干疑似转化子在萨氏培养基平板上涂板培养3天后，按步骤2所述方法提取总RNA并反转录成cDNA。以此cDNA为模板，以b肌动蛋白基因作为内参，用自行设计的配对引物（TACTGCCGCAAGCAATTCTTTA / CTACGCCACAGCCGCCTTGTACGCA）进行荧光实时定量PCR分析，检测目标基因BbCPF1在各疑似转化子中相对于野生菌株的表达水平。由此筛选出的工程菌株，BbCPF1在三个重复样品测定中的表达水平分别较野生菌株提高15.2、14.9和15.6倍，平均提高15.2倍。

以下通过相应的试验进一步说明本发明的有益效果。

试验一：BbCPF1超表达菌株与野生菌株的抗UVB紫外辐射能力测定

将所获BbCPF1超表达15倍的遗传改良菌株（以下简称改良菌株）和野生菌株在萨氏培养基平板上涂板接种并正常培养8天，收获各菌株分生孢子粉悬于含0.2%蛋白胨和2%蔗糖的0.02%吐温80液中，标定孢子悬液的浓度至10⁷个孢子/mL。按本实验室先期建立的方法，将10 mL孢子悬液滴于玻片中央并均匀涂抹在直径约10 mm区域内。然后，将载菌玻片置于法国产Bio-Sun⁺⁺ UV Chamber (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, France)的样品台（12 ´ 16 cm）上，进行梯度度剂量0.1-0.7 kJ/m²（kJ为能量单位千焦耳）的UVB紫外辐射（加权平均辐射波长为312 nm），以不辐射作为对照，每个剂量重复三次，辐射剂量由内置微处理器每秒中自动调控4次，调控误差为千分之一（厂商用户指南）。辐射后的载菌玻片置于培养皿内在25℃下保湿培养24小时，在显微镜下观察萌发孢子数和未萌发孢子数，计算不同辐射剂量下的孢子萌发率即残存率。

所获观察结果列于表1，可见野生菌株的分生孢子在5 kJ/m²的辐射剂量下已全部失活，其孢子残存率随辐射剂量衰变的趋势明显快于改良菌株。通过模型拟合孢子残存率随辐射剂量衰变的趋势，并根据拟合的趋势插值估算各菌株分生孢子失活50%和90%所需的UVB辐射剂量LD₅₀和LD₉₀及其95%置信区间。结果（表2）显示，改良菌株的LD₅₀和LD₉₀分别较野生菌株提高54%和55%。根据两样本95%置信区间不重叠的显著性差异原则，改良菌株LD₅₀或LD₉₀的95%置信区间下限远大于野生菌株LD₅₀和LD₉₀的95%置信区间上限，说明改良菌株抗UVB紫外辐射能力的大幅提高在统计学上是可靠的(P < 0.05)。

试验二：改良菌株与野生菌株对UVB紫外辐射损伤的光修复能力测定

将改良菌株与野生菌株含10⁷个孢子/mL的悬液100 mL等量均匀涂抹在萨氏培养基平板上，风干数分钟后置于Bio-Sun⁺⁺ UV Chamber样本台上，接受致死剂量5 kJ/m² 和过致死剂量6和 7 kJ/m²的UVB辐射。取出各菌株平皿，在25℃光照培养箱中分别暴光1和3小时（光修复处理），再转入25℃培养箱中分别全黑暗培养23和21小时，并以辐射后直接在25℃下暗培养24小时作为对照处理，各处理均设三个重复。然后，在显微镜下镜检各菌株在各处理中萌发和未萌发的孢子数而计算萌发率及标准差，以改良菌株与野生菌株之间光修复后孢子萌发率之差，作为超表达BbCPF1对分生孢子紫外损伤修复效果的评价。

如表3所示，野生菌株分生孢子在三个致死或过致死剂量的UVB辐射后均全部失活，而改良菌株仅在最高过致死剂量下才全部失活。经5 和6 kJ/m²辐射的改良菌株孢子在光修复1小时后的萌发率分别较野生菌株提高56.4%和42.4%，经7 kJ/m²辐射的改良菌株孢子在光修复3小时后的萌发率较野生菌株提高32%。结果表明，改良菌株分生孢对UVB紫外损伤的光可见修复效果大幅提升，表现为损伤修复快和修复率高，由此更加突出了BbCPF1基因超表达抗紫外损伤的效果。

Claims

1. 基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于：菌株保藏名称为：球孢白僵菌Beauveria bassiana；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年9月10日，保藏编号：CGMCC No. 16362。

2.如权利要求1所述的基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

4）经草丁膦抗性筛选的疑似转化菌株在正常条件下培养3天，提取RNA反转录成cDNA，用实时定量PCR（qPCR）方法测定BbCPF1基因在各cDNA样品中相对于野生菌株的转录水平，转录表达水平最高的转化子即球孢白僵菌抗紫外辐射菌株。

3.如权利要求2所述的基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株的构建方法，其特征在于：将步骤2）构建的超表达载体转入害虫生防真菌的方法为：农杆菌介导法转化方法、原生质体转化方法、芽生孢子转化方法或电击转化方法。

4.如权利要求1所述的基于内源光修复基因BbCPF1超表达的球孢白僵菌抗紫外辐射菌株，其特征在于用于提高真菌杀虫剂对阳光紫外辐射的抵抗力与田间害虫防治的稳定性及持效性。