CN102942621B

CN102942621B - 植物抗白粉病相关蛋白TaCAF1及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN102942621B
Application number: CN201210425396.5A
Authority: CN
Inventors: 解超杰; 孙其信; 倪中福; 沈红霞; 王瑜晖; 宋娜; 辛明明
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2012-10-30
Filing date: 2012-10-30
Publication date: 2014-03-05
Anticipated expiration: 2032-10-30
Also published as: CN102942621A

Abstract

本发明公开了一种植物抗白粉病相关蛋白TaCAF1及其编码基因和应用。本发明提供了一种蛋白质，来自小麦，命名为TaCAF1蛋白，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病病抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述TaCAF1基因导入目的植物，得到白粉病抗性高于所述目的植物的转基因植物。本发明为后续研究TaCAF1基因功能及网络调控提供了研究材料，对于培育抗白粉病小麦具有重要价值。

Description

植物抗白粉病相关蛋白TaCAF1及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及一种植物抗白粉病相关蛋白TaCAF1及其编码基因和应用。

背景技术

小麦是我国的重要粮食作物，与国家粮食安全、国民经济发展、社会稳定和人民生活水平的提高有着密切的关系。小麦白粉病是一种世界性的小麦病害。随着矮杆、半矮秆小麦品种的推广和水肥条件的改善，种植密度加大，造成麦田郁闭，使得白粉病在我国造成的危害日益严重，发病面积和范围不断扩大，已由次要病害上升为主要病害，对我国的粮食生产及安全造成了严重威胁。

近年来，农业生物技术的飞速发展为利用遗传工程的手段开展小麦抗白粉病的遗传改良开辟了广阔的前景，其中基因枪介导法比较成熟，目前为止获得小麦转基因的报道中，基因枪法占90%左右。国内外均有报道通过基因枪法鉴定小麦基因对白粉病菌的抗病作用的相关研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物抗白粉病相关蛋白TaCAF1及其编码基因和应用。

本发明提供了一种蛋白质，来自小麦，命名为TaCAF1蛋白，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物白粉病病抗性相关的由序列1衍生的蛋白质。

为了使（a）中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1 标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

编码所述蛋白的基因（TaCAF1基因）也属于本发明的保护范围。

所述TaCAF1基因具体可为如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

1）序列表中序列2自5’端第45至第884位核苷酸所示的DNA分子；

2）序列表中序列2自5’端第10至第955位核苷酸所示的DNA分子；

3）序列表中序列2所示的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子；

5）与1）或2）或3）限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物白粉病抗性相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

含有所述TaCAF1基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。

所述重组质粒具体可为在pAHC25载体的多克隆位点插入所述TaCAF1基因得到的重组质粒。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，是将所述TaCAF1基因导入目的植物，得到白粉病抗性高于所述目的植物的转基因植物。所述TaCAF1基因具体可通过所述重组质粒导入所述目的植物。所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物优选为小麦，如小麦品种“京冬8号”。所述白粉病具体可为由白粉菌小种E09株系引起的白粉病。

本发明发现了TaCAF1基因与小麦抗白粉病的关系，即过量表达TaCAF1基因能够增加小麦对白粉菌的抗性。本发明为后续研究TaCAF1基因功能及网络调控提供了研究材料，对于培育抗白粉病小麦具有重要价值。

附图说明

图1为单子叶植物表达载体pAHC25的结构示意图。

图2为转基因小麦田间接种白粉菌鉴定结果；a：转基因植株；b：出发植株。

图3为白粉菌侵染GUS标记的阳性细胞的情况；a:白粉病菌成功侵入GUS阳性细胞后形成吸器（400×），统计为感病细胞；b:白粉菌附着胞未能侵入GUS阳性细胞，侵入钉被阻止于细胞壁加厚处（400×），统计为抗病细胞；hy:菌丝；ha:吸器；pa:乳突；AGT:附着胞芽管；c:接种孢子

图4为图3a的放大图。

图5为图3b的放大图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

单子叶植物表达载体pAHC25（pAHC25由pUC8改造而成，含有2个表达盒，第1个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、GUS、Nos终止子，GUS两端具有SmaI和SacI酶切位点，第2个表达盒具有玉米Ubiquitin启动子、Exon、Intron、Bar、Nos终止子；又称pAHC25质粒；结构示意图见图1，参考文献：Ubiquitin Promoter-basedvectors for high-level expression of selectable and/or screenable marker genesin monocotyledonous plants.Alan H.Christensen and Peter H.Quail,1995,Technical Note.，213-218。

小麦品种“京冬8号”（高感白粉病小麦）：北京市通州区种子公司。

实施例中所用的小麦白粉病致病菌为白粉菌小种E09，学名为禾布氏白粉菌（Blumeria graminis f.sp.tritici)：张连松，华为，关海英，李根桥，张宏涛，解超杰，杨作民，孙其信，刘志勇野生二粒小麦导入普通小麦的抗白粉病基因MlWE29分子标记定位。作物学报2009,35(6):998-1005。

实施例1、TaCAF1蛋白及其编码基因的发现

以小麦“京冬8号”的感病材料及其近等基因系含Pm30基因的抗病材料的小麦叶片接种白粉菌0h和12h后构建差异表达谱，获得差异表达的预测为探针序列，在NCBI网站上对小麦已知序列进行BLAST，根据检索结果设计特异引物，最终获得具有完整ORF结构的DNA序列。以7天叶龄的小麦京冬8号抗病材料（含Pm30基因）为模板，提取RNA后反转录成cDNA，采用PCR方法获得目标片段并进行克隆测序。

最终发现了序列表的序列1所示的蛋白质，将其命名为TaCAF1蛋白。将编码TaCAF1蛋白的基因命名为TaCAF1基因，如序列表的序列2自5’末端第45-884位核苷酸所示。

实施例2、转基因小麦的获得和鉴定

一、重组表达载体的构建

1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。

2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，用CAF1-F和CAF1-L组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

CAF1-F：5’-TCCCCCGGGGAGGAGAAGCTCGAATCTTTGAT-3’(下划线标注SmaI酶切识别序列)；

CAF1-L：5’-CGAGCTCATCACACATTCACCAGACAGGT-3’（下划线标注SacI酶切识别序列）。

3、用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。

4、用限制性内切酶SmaI和SacI双酶切pAHC25载体，回收载体骨架（约7818bp）。

5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pAHC25-CAF1。根据测序结果，对重组质粒进行结构描述如下：将pAHC25载体SmaI和SacI酶切位点之间的GUS基因取代为了序列表的序列2自5’末端第10至955位核苷酸所示的双链DNA分子。

二、转基因小麦的获得

1、将小麦品种“京冬8号”的幼胚愈伤组织作为基因枪轰击的受体，用基因枪将重组质粒pAHC25-CAF1轰击到愈伤组织。

（1）将愈伤组织在高渗透培养基(MS培养基+200mM/L甘露醇+200mM/L山梨醇)上渗透处理4-6h（25℃，暗培养）：将愈伤组织放置在培养皿中央直径约2.5cm范围内，每盘培养皿50块愈伤组织。

（2）用重组质粒pAHC25-CAF1包裹直径110μm金粉，采用PDS-1000/He基因枪(Bio-Red公司生产)，选择1100Psi的可裂膜，载样距靶材料6cm进行轰击。

（3）轰击后的愈伤组织继续在原培养基上培养16-18h（25℃，暗培养）。

2、将愈伤组织转移到SD0培养基（MS培养基＋150mg/L天冬门酰胺）上恢复培养1周（25℃，暗培养）。

3、将愈伤组织转移到SD2培养基（MS培养基+150mg/L天冬门酰胺+2mg/L 2,4-D)上，继续恢复培养2周（25℃，暗培养）。

4、将愈伤组织转移到分化筛选培养基（1/2MS培养基+1mg/L a-萘乙酸+5mg/L反玉米素+0.5mg/L除草剂Basta）上，24-26℃光照培养14-21d。

5、将愈伤组织分化小苗后转移到生根壮苗培养基（1/2MS培养基+1mg/L a-萘乙酸）上，24-26℃光照培养14-28天，获得生根的再生植株。

6、将苗高7-8cm且根系发达的植株移栽到花盆，在温室中培养，成活的植株即为T₀代。

7、将T₀代植株自交并收获种子（T₁代种子），将T₁代种子培育为T₁代植株，将T₁代植株自交并收获T₂代种子，将T₂代种子培育为T₂代植株。

8、分别将T₁代植株和T₂代植株进行如下鉴定：

在4叶期，每株植株取1个叶片提取基因组DNA，将基因组DNA作为模板，采用CAF1-F和CAF1-L组成的引物对PCR鉴定TaCAF1基因，显示约0.96k条带的为阳性植株。其中T₂代植株PCR鉴定均为阳性的T₁代植株为纯合的转TaCAF1基因植株。

三、转空载体小麦的获得

将pAHC25载体代替重组质粒pAHC25-CAF1进行步骤二的操作，得到转空载体植株。

四、转基因小麦和转空载体小麦的抗病性鉴定

在纯合的转TaCAF1基因植株的T₂代植株生长至一叶一心期时，将繁菌盆（繁菌盆的制备方法：将白粉病致病菌接种小麦品种“京冬8号”，培养至该植株上白粉病致病菌的分生孢子已充分发生）置于待鉴定幼苗四周，通过人工拂掸进行接种，重复接种多次，使白粉菌侵染转基因小麦叶片。接种后15天后，观察小麦白粉菌的发病情况（照片见图2）。进行三次重复实验，每次重复实验中，转基因植株和出发植株各采用20株。

将转空载体植株的T₂代植株和小麦品种“京冬8号”（出发植株）同样进行上述实验。

接种15天后，转基因植株的旗叶发病率平均值为63%，出发植株的旗叶发病率平均值为80%，转空载体植株的旗叶发病率平均值为82%。发病的转基因植株中，旗叶发病级别为1-2级的比例（平均值）为77%。发病的出发植株中，旗叶发病级别为1-2级的比例（平均值）为10%。发病的转空载体植株中，旗叶发病级别为1-2级的比例（平均值）为11%。

旗叶发病级别的评级方式采用6级标准(Liu et al.1999)，免疫（0）、过敏性坏死（0）、高抗（1）、中抗（2）、中感（3）和高感（4），具体见表2。

表2 小麦白粉病苗期反应型分级标准

五、瞬时表达实验

1、将小麦品种“京冬8号”种子培养在恒温培养箱中培养7天（每天24℃光照14h、18℃黑暗10h），取幼苗展开的第一片叶片。将叶片剪成约2.5cm长，背面朝上置于1%的琼脂板中，两端用透明胶轻轻粘牢，防止因轰击而移动位置，每皿放置5-6片。

2、分组处理

实验组：将pAHC25载体和重组质粒pAHC25-CAF1以1:2的质量比混合，将混合质粒通过基因枪轰击步骤1得到的叶片；

对照组：将pAHC25载体通过基因枪轰击步骤1得到的叶片；

基因枪轰击结束后，培养15小时（25℃，暗培养）后在叶片上接种小麦白粉病致病菌（接种密度以保证每个叶片表皮细胞上有1个致病菌孢子为宜）并继续采用原培养条件进行培养，接种致病菌48小时后将叶片从琼脂板上取下放入含10mL X-gluc染色液的15mL离心管中，抽真空10min后37℃放置24小时，最后用70%乙醇脱去叶绿素后进行观察。

小麦对白粉病的抗性与白粉病致病菌在侵染的过程中能否成功形成吸器有关，吸器是白粉菌吸收营养继续生长并形成次级菌丝和菌落的必需结构。因此将GUS阳性细胞中白粉病菌成功侵入表皮细胞后形成吸器的细胞统计为感病细胞（图3a），白粉菌附着胞未能侵入并形成吸器的细胞统计为抗病细胞（图3b）。图3的放大图见图4和图5。

进行三次重复实验。

侵入频率=三次重复实验统计的感病细胞总数占三次重复实验统计的细胞总数的百分比。

实验组和对照组的侵入频率见表3。

表3 实验组和对照组的侵入频率

	侵入频率(%)	三次重复实验统计细胞的总数	P
				对照组	54.75±0.6	810
实验组	37.27±3.2	532	0.01

Claims

1.一种培育转基因植物的方法，是将如下1）至3）中任一所述的DNA分子导入目的植物中，得到白粉病抗性高于所述目的植物的转基因植物：

3）序列表中序列2所示的DNA分子。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述1）至3）中任一所述的DNA分子通过如下a）或b）所述重组表达载体导入所述目的植物：

a）含有所述1）至3）中任一所述的DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

b）所述重组表达载体为在pAHC25载体的多克隆位点插入所述1）至3）中任一所述的DNA分子得到的重组质粒。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述单子叶植物为小麦。

5.如权利要求1、2或4中任一所述的方法，其特征在于：所述白粉病是由白粉菌小种E09引起的。