CN100540665C - 调节植物分枝的基因,含有该基因的载体,被该载体转化的微生物,以及利用该微生物调节植物分枝的方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种调节观赏植物或农业植物分枝的技术以便促进分枝等来提高价值或产率。一种调节植物分枝的基因，该基因含有水稻MADS盒基因或一种与该基因同源的基因；一种携带所述基因的载体；和一种被所述载体转化的微生物和一种利用该微生物调节植物分枝的方法。

Description

调节植物分枝的基因，含有该基因的载体，被该载体转化的微生物，以及利用该微生物调节植物分枝的方法
技术领域
本发明涉及一种调节植物分枝的基因，一种含有该基因的载体，一种被该载体转化的微生物，以及一种利用该微生物调节植物分枝的方法。
发明背景
由于可以提高观赏植物的价值和农业植物的产率，所以促进观赏植物或农业植物的分枝是非常有益的。因此，需要一种调节各种植物分枝的技术。
已知玉米的tb1基因是一种调节分枝的基因(J.Doebley等，自然(Nature)，386，485-488(1997))。该基因是一种对分枝起抑制作用的基因。另外，只报道了锌指基因是一种促进分枝的基因[H.Takatsuji，植物分子生物学(综述)(PlantMol.Biol.(review))，39，1073-1078(1999)和Hiroshi Takatsuji，“Kagaku to Seibutsu”，第37卷，287-289页(1999)]。
如上所述，促进植物分枝能够提高观赏植物或农业植物的价值，因此这些技术在农业和花卉栽培领域中是非常有意义的技术。然而，不能就此得出这些技术适用于所有植物并带来巨大成果的结论。因此，急需另一种促进分枝的新技术。
此外，经常通过抑制植物生长来产生长度较短的矮生植物。因此，需要提供一种通过采用基因操作以一种简单方式进行抑制的技术。
目前，只知道数种基因包括分离自鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)的染色体DNA的基因是这种调节植物矮化的基因(日本专利公开号56382/1997)。
本发明已经在如上所述的目前的技术状态下得以完成。本发明的目的在于提供一种调节植物如观赏植物和农业植物分枝的技术。
本发明的公开
为了寻找调节植物分枝的基因，本发明人筛选了大量的基因。最终，本发明人发现水稻MADS盒基因具有一种调节植物分枝的功能。
另外，本发明人已经发现在通过一种合适的宿主微生物被含该基因的载体转化的植物中，促使分枝或矮化取决于基因的方向。因而，本发明得以完成。
具体地说，本发明提供了一种调节植物分枝的基因，其中该基因的特征在于含有水稻MADS盒基因或一种与该基因同源的基因。
本发明还提供了一种其中整合了该基因的载体和一种被该载体转化的微生物。
此外，本发明还提供了一种调节植物分枝的方法，其中该方法的特征在于将水稻MADS盒基因或一种与该基因同源的基因整合到一种载体中并通过一种宿主微生物将该载体转移到一种植物中。
附图的简要描述
图1描述了构建本发明有义载体的方法的前半部分。
图2描述了构建本发明有义载体的方法的后半部分。
图3描述了构建本发明反义载体的方法的前半部分。
图4描述了构建本发明反义载体的方法的后半部分。
图5是显示荞麦变种Shinano No.1外观的照片，其中本发明的基因朝有义和反义方向被引入。
图6是显示其中朝有义和反义方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1个体以及未处理的荞麦变种Shinano No.1之间的外观对比照片。
图7是一种显示荞麦变种Shinano No.1(T1)的基因组DNA杂交结果的图像，其中本发明的基因朝有义方向被引入。
图8是一种显示荞麦变种Shinano No.1(T1)的基因组DNA杂交结果的图像，其中本发明的基因朝反义方向被引入。
图9是一种显示电泳结果的图像，由此能够确认本发明基因在所述基因组中的整合。
图10是表示朝有义和反义方向整合的MADS基因的流程图。
图11是一种显示用于确认所述基因组中被整合的cDNA方向的DNA杂交分析结果的图像。
图12是显示其中朝有义方向引入本发明基因的大叶落地生根、其中引入了GUS基因的大叶落地生根和未处理的大叶落地生根之间的外观对比照片。
实施本发明的最佳方式
用作本发明的调节植物分枝的基因包括水稻MADS盒基因或一种与该基因同源的基因。水稻MADS盒基因具有下列核苷酸序列：
ctcctcctcc tcttcttctt cttccactag ctagttcgtc ttcctccttc agctagcttg
tagcagctaa ggttaggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc
gaggatgggg cgggggaagg tgcagctgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt
gacgttctcc aagaggagga atggattgct gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg
cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac
tgactccagg atggacaaaa tccttgaacg ttatgagcgc tattcatatg ctgaaaaggc
tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaattggtgc catgaataca ggaaacttaa
ggcaaagatt gagaccatac aaaaatgtca caaacacctc atgggagagg atctagaatc
cctgaatctc aaagaactcc aacagctaga gcagcagctg gagagttcat tgaagcacat
aatatcaaga aagagccacc ttatgcttga gtccatttcc gagctgcaga aaaaggagag
gtcactgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaactg gtggagaggc agaagaatgt
gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc
ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg ctgagggatc agcaggcact
tcttccacca caaaatatct gctacccgcc ggtgatgatg ggcgagagaa atgatgcggc
ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtcttccgcc
atggatgctg agccacctca atgcttaaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag
ctgccgtatg caccgtgaat catgggagca accttgaatg aattgaagtc attggtatcg
atcctagcga taatatatat gattctccta aaatgaaatt gatctcaaaa aaacaaacct
agcgattaag ctattcttat atatgtgttt gcctgctgcc ccctacccta caggctacat
atgatttgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtctttgtg taatcatcag
cacgtaccta gtgcttccta ctgatatata tgcatgcaat tgtgtgcata taaatatatt
tgcatgccat gctcccgtga tggttaatt
此外，术语“与该基因同源的基因”包括一系列基因，由于在该核苷酸序列的一部分中发生取代、缺失、插入等，所以上述一系列基因与后一基因本身不完全相同但是可以设想这些基因所发挥的功能相同。
在由所述基因编码的氨基酸中，由以下序列表示的肽部分作为转录因子来调节分枝。
                                                          20
MetGlyArgGlyLysValGlnLeuLysArgIleGluAsnLysIleAsnArgGlnValThr
                                                          40
PheSerLysArgArgAsnGlyLeuLeuLysLysAlaHisGluIleSerValLeuCysAsp
                                                          60
AlaGluValAlaAlaIleValPheSerProLysGlyLysLeuTyrGluTyrAlaThrAsp
                                                          80
SerArgMetAspLysIleLeuGluArgTyrGluArgTyrSerTyrAlaGluLysAlaLeu
                                                         100
IleSerAlaGluSerGluSerGluGlyAsnTrpCysHisGluTyrArgLysLeuLysAla
                                                         120
LysIleGluThrIleGlnLysCysHisLysHisLeuMetGlyGluAspLeuGluSerLeu
                                                         140
AsnLeuLysGluLeuGlnGl nLeuGluGlnGlnLeuGluSerSerLeuLysHisIleIle
                                                          160
SerArgLysSerHisLeuMetLeuGluSerIleSerGluLeuGlnLysLysGluArgSer
                                                         180
LeuGlnGluGluAsnLysAlaLeuGlnLysGluLeuValGluArgGlnLysAsnValArg
                                                         200
GlyGlnGlnGlnValGlyGlnTrpAspGlnThrGlnValGlnAlaGlnAlaGlnAlaGln
                                                         220
ProGlnAlaGlnThrSerSerSerSerSerSerMetLeuArgAspGlnGlnAlaLeuLeu
                                                         240
ProProGlnAsnIleCysTyrProProValMetMetGlyGluArgAsnAspAlaAlaAla
                                                         260
AlaAlaAlaValAlaAlaGlnGlyGlnValGlnLeuArgIleGlyGlyLeuProProTrp
                  267
MetLeuSerHisLeuAsnAla
因此，术语MADS基因的“MADS”是指酵母MCM1的“M”，“A”植物AGAMOUS的“A”，植物DEFICIENS的“D”和人血清反应因子SRF的“S”的首字母缩拼词。因而不管物种的类型如何，都发现MADS盒基因具有一个共同的核苷酸序列。这些基因是转录因子(调节DNA以便将DNA转录成mRNA的基因)，如一种与生物形态有关的基因，即同源异性基因。
另外，大多数除水稻以外的植物的MADS基因与花朵形态有关，但它们中没有一种被得知与调节植物分枝有关。
根据本发明，调节植物分枝的基因(被称作“本发明的基因”)被整合到一种载体中，然后通过一种合适的宿主微生物将该载体引入一种植物中来调节植物分枝。更具体地说，一种植物细胞是通过以下步骤进行转化的：将一个能够在植物细胞中发挥功能的启动子、本发明的基因和一个能够在植物细胞中发挥功能的终止子以这样一种方式接合，所述方式使得所获得的接合物具有构建一种表达质粒的功能，然后将该表达质粒引入所述的植物细胞中。
可以使用例如一种CaMV35S启动子和一种胭脂氨酸合酶的启动子作为用于所述目的的启动子，而没有具体的限制。另外，一种增强子可被用于基因产物的高表达。例如，可以使用含在CaMV35S启动子的核苷酸序列的上游区域序列中的增强子作为这种增强子。可以使用多种这样的增强子。另外，所述终止子包括但不限于CaMV35S终止子和一种胭脂氨酸合酶的终止子。
根据本发明，可以利用一种用于迅速筛选所产生的转化微生物和转化植物的选择标记基因。
可以使用包括例如新霉素磷酸转移酶2(MPT2)基因和潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因在内的选择标记。
可以优选地使用pBI系列和pUC系列的载体作为用于按照本发明的方法整合本发明基因的载体。pBI系列的载体包括例如pBI121、pBI101、pBI101.2和pBI101.3，而pUC系列的载体包括例如pUC18、pUC19和pUC9。
另外，还可以使用被研制用于单子叶植物转化的载体如pTOK162。
作为利用其中整合了本发明基因的载体转化植物的方法，可以使用以下方法：根癌土壤杆菌方法、聚乙二醇方法、电穿孔方法和基因枪方法等。
在所述转化方法中，根癌土壤杆菌方法是一种通过在同时存在植物培养细胞的条件下培养携带含有重组基因的载体的根癌土壤杆菌而将基因引入植物细胞中的方法。作为一种比较简单的方法，可以使用在植物生长点附近喷淋或涂覆或注射一种含有根癌土壤杆菌的溶液的方法。然后，优选地是在植物体上造成刮痕。
通过本发明的方法进行分枝调节适用于具有其中可以引入所述基因并且为此已经建立了再分化方法的细胞、组织或器官的任何植物，或其中可以直接将基因引入植物体的任何植物。
具体地说，观赏植物如菊花、百合花、康乃馨、郁金香、玫瑰花和兰花以及农业植物如大豆、棉花、水稻、玉米、小麦和大麦的转化植物可以通过以下方法来得到：采用携带了其中整合了本发明基因的载体的根癌土壤杆菌的悬浮液处理植物的愈伤组织或生长点或将其中整合了本发明基因的载体直接注射到植物细胞或组织中然后筛选和培养转化体。
如下列实施例所述，本发明的结果根据本发明基因是朝有义方向整合到植物中还是朝反义方向整合到植物中而发生多样性变化。换言之，当所述基因朝有义方向被整合时，植物的分枝得到促进，而当所述基因朝反义方向被整合时，植物的生长则受到抑制而矮化。
工业实用性
当本发明调节植物分枝的基因被引入植物中时，该基因能够促进植物分枝或矮化。另外，所产生的性状可以遗传给子代。因此，本发明是一种创造具有这种新表型植物的技术；特别是，本发明能有效用于提高植物如观赏植物和农业植物分枝的水平从而提高观赏植物的价值或农业植物的产率。
实施例
下面将通过实施例对本发明进行更加详细的描述。但本发明决不局限于这些实施例。
实施例1
(1)一种其中朝有义方向整合了水稻MADS盒基因的载体的构建
其中朝有义方向整合了水稻MADS盒基因的载体通过以下方法来构建：按照以下方法用水稻MADS盒基因(DDBJ登记号AB003325)的有义-定向的cDNA(1.3kb)取代一种双载体(pBI121)中的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因，所述载体从Toyobo Co.，Ltd.购得。
其中在限制SalI切割位点和限制NotI切割位点从5’到3’方向插入了MADS盒基因的pBiuescriptSK+M质粒(获自于农业、林业和渔业部，国家农业生物科学研究所的DNA库)被SalI消化并被平端化，然后进一步用SacI消化。对所产生的产物进行电泳以便回收1.3kb的DNA片段。
另一方面，其中在限制HindIII切割位点和EcoRI切割位点插入了得自pBI121的3.1kb DNA片段(含有CaMV35S启动子和GUS基因和Nos终止子)的pUC18质粒(由Nippon Gene/对应于由Toyobo Co.，Ltd.制备的pBI221制得)被SmaI和SacI消化。对所产生的产物进行琼脂糖凝胶电泳以便回收4.0kb的DNA片段。
通过将所述1.3kb片段和产生的4.0kb片段连接在一起，然后将该连接物引入大肠杆菌(JM109)中来制备pBI221-M质粒。从大肠杆菌的阳性菌落中分离出pBI221-M质粒并用BamHI和SacI消化以便回收1.3kb的cDNA。将以这种方式回收的具有BamHI和SacI切割位点的cDNA与预先被BamHI和SacI消化去除了GUS基因的pBI121质粒接合，得到其中朝有义方向整合了水稻MADS盒基因的pBI121-MS载体(下文中被称作“有义载体”)。
(2)一种其中朝反义方向整合了水稻MADS盒基因的载体的构建(图3和图4)
通过以下方法制备其中GUS基因被cDNA朝反义方向取代的pBI121-MA载体。首先，其中在限制SalI切割位点和限制NotI切割位点以5’到3’方向插入了所述cDNA的pBluescriptSK+M质粒被NotI消化并被平端化，接着用KpnI消化。对所产生的产物进行电泳以便回收1.3kb的DNA片段。
另一方面，pUC18质粒被BamHI消化，然后被平端化，接着用KpnI消化。对产物进行电泳以便回收2.6kb的DNA片段。将该片段与所述1.3kb片段接合来制备pUC18-M质粒，然后将该质粒引入大肠杆菌(HB101)中。从大肠杆菌的阳性菌落中分离出pUC18-M质粒并用SacI和XbaI消化以便回收具有SacI和XbaI切割位点的1.3kb cDNA。将该cDNA与预先被SacI和XbaI消化的pBI 121载体接合，得到其中朝反义方向整合了水稻MADS盒基因的pBI 121-MA载体(下文中被称作“反义载体”)。
(3)载体引入宿主微生物中
使用获自于Toyobo Co.，Ltd.的根癌土壤杆菌LBA 4404作为宿主微生物。通过已经报道过的方法(M.Holster等，分子遗传学基因(Mol.Gen.Gene)163，181-187(1978))完成由上述(1)或(2)获得的载体向所述微生物中的引入。引入后，在补加了50μg/ml卡那霉素和10μg/ml利福平和50μg/ml链霉素的LB培养基中于28℃下将所述微生物培养18小时。培养结束后，通过离心收集细胞，用水冲洗后悬浮在水中(1.0×108细胞/ml)，用于接种到植物中。
(4)接种到植物中
荞麦变种Shinano No.1的种子采用次氯酸钠进行杀菌后被种植在栽培盆中的土壤中。将该栽培盆放置在下列条件下：于25℃下在光亮处放置8小时然后在暗处放置16小时。种植4至5天后，所述植物的两片叶子打开。恰在该植物达到7至8厘米的高度时，用针在茎顶端的芽分生组织上刺一个小孔，将携带所述载体的根癌土壤杆菌的水悬浮液(约1.0×108细胞/ml)接种到所述小孔中。
对50株荞麦变种Shinano No.1的幼苗个体进行接种，然后于22℃下在完全黑暗中放置3天。接着，在培养室中将所述个体植物在30℃下于大约4000勒克斯的光照下培养8小时。在荞麦变种ShinanoNo.1中，具有不同长度，即大约1.8mm和大约0.6mm的两种类型的花开放(异长花柱现象：具有不同外观的现象)。在不同类型的花之间进行的授粉会导致受精。因此，为了获得种子(T1植物)，在所述转化植物(T0)的花和未转化植物的一种不同类型的花之间进行授粉。
在50株接种了携带所述有义载体的根癌土壤杆菌的植物中，33株植物个体的分枝得到了促进，因而形成了许多分枝。然而，在所述植构方面的变化。
在50株接种了携带所述反义载体的根癌土壤杆菌的植物中，30株植物个体的分枝和生长受到了抑制。如上所述，在所述植物中，表型的表达水平不同。没有观察到这些植物的花在发育和结构方面的明显变化。
图5(照片)显示了其中朝有义和反义方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1的表观。在图5(A)中，符号“1”表示未被处理的荞麦变种Shinano No.1；符号“2”表示用携带pBI121载体(GUS基因)的根癌土壤杆菌处理的荞麦变种Shinano No.1；符号“3”表示用携带有义载体的根癌土壤杆菌处理的荞麦变种Shinano No.1；符号“4”表示用携带反义载体的根癌土壤杆菌处理的荞麦变种ShinanoNo.1。这些照片是在处理后一个月拍照的。另外，照片中的棒状物是一把30cm长度的尺子。
所述结果表明朝有义方向引入了本发明基因的荞麦变种ShinanoNo.1的分枝得到了促进(图5(A)中的3)而朝反义方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1的分枝受到了抑制(图5(A)中的4)
另外，图5(B)显示了在朝有义方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1中，朝有义方向和以最高转化表达表型(分枝水平)引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1。照片是在处理后6个月植物生长停止并枯萎后拍照的。
(5)在上述试验中，将根癌土壤杆菌接种到幼苗茎顶端上的芽分生组织中来进行转化，不需要用于从幼苗上去除土壤杆菌的后续去除步骤。然后，通过以下方法检测T0植物和T1植物，以便确定接种的土壤杆菌是否仍存在，也就是说被转化植物是否由于根癌土壤杆菌的作用而发生了形态学上的改变。
接种后，将植物(T0植物)整体放在一个研钵中用无菌水进行研磨。将研磨的植物溶液平铺在含有一种抗生素的LB培养基平板上进行28℃培养，该培养基能够培养用于转化的根癌土壤杆菌。随着接种后时间的推移，出现在平板上的菌落数目有所减少。接种后的第14天，只有数个菌落出现。这表明大量的土壤杆菌可能通过植物荞麦变种Shinano No.1的抗性反应而被消灭。
对于T1植物，其种子采用次氯酸钠进行灭菌后在无菌状态下进行发芽和生长。如上所述，将如此获得的幼苗用无菌水进行研磨，然后在含有一种抗生素的LB培养基平板上进行培养。完全没有菌落出现，这证实了用于转化的任何土壤杆菌在T1植物中完全不存在。
实施例2
被转化的荞麦变种Shinano No.1的子代(T1)的表型的确认
荞麦变种Shinano No.1的花产生异长花柱现象，因此授粉只在不同类型的花之间进行。所以，荞麦变种Shinano No.1(T0)的花和野生型荞麦变种Shinano No.1的花被授粉。栽培由此获得的种子来检查T1植物的表型(图6)。在朝有义方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1和朝反义方向引入了本发明基因的荞麦变种ShinanoNo.1中，将近半数的子代个体(10株个体)分别遗传了T0植物的表型。换句话说，在朝有义方向引入了本发明基因的荞麦变种ShinanoNo.1的子代中分枝得到了促进(图6(A)中的2)。相反，在朝反义方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1的子代中分枝和生长受到了抑制(图6(B)中的2)。如上所述，从其子代方面来看，朝彼此相反的方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1的表型也具有彼此相反的关系。
实施例3
本发明基因在基因组中整合的确认
(1)从转化的荞麦变种Shinano No.1的子代(T1)中分离和纯化基因组DNA
按照产品说明书使用Nuclear Phytopure DNA提取试剂盒(Amersham Pharmacia Biotec)从实施例2中获得的成熟植物的种子中提取基因组DNA。提取的DNA通过以下方法得到进一步纯化。具体(Amersham Pharmacia Biotec)从实施例2中获得的成熟植物的种子中提取基因组DNA。提取的DNA通过以下方法得到进一步纯化。具体地说，将DNA溶解在含有500μl 1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，然后与2μl的RNA酶(Nippon Gene；10mg/ml)共同在37℃下温育45分钟。接着加入100μl含有60mM Tris-HCl缓冲液(pH7.8)、60mM EDTA、30％SDS和5μl蛋白酶K(10mg/ml)的溶液，在50℃下继续温育3小时。按照顺序用苯酚、苯酚/氯仿混合物溶液(1∶1，v/v)和苯酚提取所述溶液。采用乙醇从得到的DNA溶液中沉淀出DNA，用70％的乙醇冲洗后得到纯化的基因组DNA。
(2)基因组的DNA杂交
在上述(1)中得到的15μg基因组DNA用限制性核酸内切酶进行消化(利用EcoRI，SacI，XhoI和SalI，其在MADS基因的cDNA中没有限制性位点)，接着进行琼脂糖(1％)凝胶电泳，然后在HybondN+尼龙膜(Amersham Pharmacia Biotec)上进行印迹。通过利用水稻MADS盒基因的cDNA(1.3kb)和随机引物标记试剂盒(由Takara生产)制备用32P标记的探针，该探针在Sephadex G-50色谱柱上进行纯化。其上印迹了DNA的尼龙膜首先在含有5×Denhardt溶液，0.5％SDS和20μg/ml鲑精DNA的5×SSPE溶液(溶液的酸碱度为pH7.7，含有0.18M NaCl，10mM磷酸钠，1mM EDTA)中于65℃下进行1小时的预杂交。
然后，将用32P标记的探针加到预杂交溶液中，于65℃下杂交18小时。所述膜用含有0.1％SDS的2×SSPE溶液于20℃下冲洗两次，历时10分钟。接着所述膜用含有0.1％SDS的1×SSPE溶液于65℃下冲洗一次，历时15分钟。最后，所述膜用含有0.1％SDS的0.1×SSPE溶液于65℃下冲洗两次，历时10分钟。与所述探针杂交的DNA带通过图像分析仪(Molecular Dynamics)被成像。结果见图7和图8。图7显示了其中朝有义方向引入了本发明基因的荞麦变种ShinanoNo.1的子代；图8显示了其中朝反义方向引入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1的子代。在这两个图中，泳道1显示了未处理的道4显示了转化体用XhoI消化后的结果；和泳道5显示了转化体用SalI消化后的结果。
图7和图8明显地表明，没有观察到未处理的荞麦变种ShinanoNo.1的电泳带。然而，对于朝有义方向插入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1的子代的基因组DNA(图7)和朝反义方向插入了本发明基因的荞麦变种Shinano No.1的子代的基因组DNA(图8)这两者中的每种基因组DNA，在所有泳道中只检测到了一条杂交带。因此，这表明所述cDNA的一个拷贝被引入到被分析的T1植物的基因组中。
实施例4
本发明的基因整合到基因组中的确认
为了扩增整合到基因组中的cDNA，设计了两种PCR引物，即P1和P2。
P1：5’-ACAATCCCACTATCCTTCGC-3’
P2：5’-GTCACGACGTTGTAAAACGA-3’
特别是，P1对应于位于原始pBI121双载体中GUS基因上游的CaMV35S启动子的3’端序列；P2对应于接近位于原始pBI121双载体中GUS基因下游的T-DNA右边缘的序列。
实施例3(1)中制备的基因组DNA(1-2μl，500ng)被加到终体积为50μl的反应溶液(50mM KCl，10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.3)，1.5mM MgCl2，200μM各种脱氧核苷酸，0.2μM引物和1.25单位的Taq DNA聚合酶(由Takara制备))中。PCR反应按照以下条件进行：94℃持续30秒钟，58℃持续45秒钟和72℃持续90秒钟，循环30次，然后72℃持续10分钟。对该PCR产物进行琼脂糖(1％)凝胶电泳。扩增后，将反应溶液直接上样到电泳凝胶上，电泳结束后用溴化乙锭将电泳凝胶染色。
结果见图9。在该图中，泳道1显示DNA大小标记；泳道2显示其中朝有义方向插入了本发明基因的载体的PCR产物；泳道3显示基因组DNA的PCR产物，该基因组DNA源于被有义定向的本发明基因转化的植物；和泳道4显示基因组DNA的PCR产物，该基因组DNA源于被反义定向的本发明基因转化的植物。
图9清楚地表明在两种基因组DNA中扩增了预测大小(1.7kb)的DNA片段以及cDNA的完整序列被整合到两种T1植物中。
实施例5
cDNA整合到基因组中的方向的确认
从本发明的基因(1.3kb)的5’端起472bp的位置存在一个限制XbaI位点。通过考虑cDNA的XbaI位点和PCR引物退火的位点，预测用XbaI消化所述PCR产物，当朝有义方向插入时将产生1.2kb和0.5kb的DNA片段，当朝反义方向插入时将产生850bp的两个片段(图10)。具有从两种T1植物中得到的基因组DNA的PCR产物和具有携带用于转化的cDNA的两个双载体的PCR产物用XbaI消化并利用32P-标记的cDNA探针进行DNA杂交分析(图11)。
图11中，“1”表示具有朝反义方向插入了本发明基因的载体的PCR产物；“2”表示具有朝有义方向插入了本发明基因的载体的PCR产物；“3”表示源于被反义定向的本发明基因转化的植物的基因组DNA的PCR产物；和“4”表示源于被有义定向的本发明基因转化的植物的基因组DNA的PCR产物。
在图11中，在个体样品中检测到了预测大小的杂交带。结果表明cDNA朝预测的方向被整合到朝有义方向和反义方向转化的植物(T1)的基因组中。
实施例6
本发明的基因向大叶落地生根中的引入
从茎上切下10cm到13cm长的大叶落地生根成熟叶子。利用立体显微镜，在所述叶子边缘上的缺口最深处的分裂细胞周围的表皮细胞和叶肉细胞以及正好位于所述分裂细胞之上的表皮细胞上刺数个孔。
利用巴氏滴管将数滴实施例1(3)中获得的其中朝有义方向引入了MADS基因的根癌土壤杆菌的水悬浮液(1.0x108细胞/ml)接种到每个缺口部位。然后，在室温下将所述叶子干燥大约30分钟。将所述叶子放置在塑料盒中的湿蛭石上，盖上盖子后在25℃下进行培养(光亮处8小时盒暗处16小时为一个周期)。
从大叶落地生根的处理部位长出新芽和根。生长4个星期后从原始叶子上切下这些芽和根并且进行拍照。用非转化的根癌土壤杆菌处理的叶子和用其中引入GUS基因(β-葡糖醛酸糖苷酶基因)代替MADS基因的根癌土壤杆菌处理的叶子被用作对照。结果见图12。
观察到在用MADS盒基因转化的本体的根部长出了叶子。然而，在非转化的对照和其中引入GUS基因代替MADS基因的本体中没有观察到这种现象。所述结果表明MADS盒基因是一种调节分枝的基因，这与利用荞麦变种Shinano No.1得到的试验结果一致。由于MADS盒基因不但可调节荞麦变种Shinano No.1的分枝而且还可调节不同品种的大叶落地生根的分枝，该基因被认为是一种能够调节一般植物分枝的基因。
序列表
<110>Kojima，Mineo
Kumiai Chemical Industry Co.，Ltd.
<120>调节植物分枝的MADS盒基因
<130>9910033
<140>
<141>
<160>2
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>1289
<212>DNA
<213>稻
<400>1
ctcctcctcc tcttcttctt cttccactag ctagttcgtc ttcctccttc agctagcttg 60
tagcagctaa ggttaggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc 120
gaggatgggg cgggggaagg tgcagctgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt 180
gacgttctcc aagaggagga atggattgct gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg 240
cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac 300
tgactccagg atggacaaaa tccttgaacg ttatgagcgc tattcatatg ctgaaaaggc 360
tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaattggtgc catgaataca ggaaacttaa 420
ggcaaagatt gagaccatac aaaaatgtca caaacacctc atgggagagg atctagaatc 480
cctgaatctc aaagaactcc aacagctaga gcagcagctg gagagttcat tgaagcacat 540
aatatcaaga aagagccacc ttatgcttga gtccatttcc gagctgcaga aaaaggagag 600
gtcactgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaactg gtggagaggc agaagaatgt 660
gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc 720
ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg ctgagggatc agcaggcact 780
tcttccacca caaaatatct gctacccgcc ggtgatgatg ggcgagagaa atgatgcggc 840
ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtcttccgcc 900
atggatgctg agccacctca atgcttaaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag 960
ctgccgtatg caccgtgaat catgggagca accttgaatg aattgaagtc attggtatcg 1020
atcctagcga taatatatat gattctccta aaatgaaatt gatctcaaaa aaacaaacct 1080
agcgattaag ctattcttat atatgtgttt gcctgctgcc ccctacccta caggctacat 1140
atgatttgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtctttgtg taatcatcag 1200
cacgtaccta gtgcttccta ctgatatata tgcatgcaat tgtgtgcata taaatatatt 1260
tgcatgccat gctcccgtga tggttaatt                                   1289
<210>2
<211>267
<212>PRT
<213>稻
<220>
<221>域
<222>(1)..(57)
<223>MADS域
<220>
<221>域
<222>(92)..(158)
<223>K域
<400>2
Met Gly Arg Gly Lys Val Gln Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn
  1               5                  10                  15
Arg Gln Val Thr Phe Ser Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala
             20                  25                  30
His Glu Ile Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Ala Ile Val Phe
         35                  40                  45
Ser Pro Lys Gly Lys Leu Tyr Glu Tyr Ala Thr Asp Ser Arg Met Asp
     50                  55                  60
Lys Ile Leu Glu Arg Tyr Glu Arg Tyr Ser Tyr Ala Glu Lys Ala Leu
 65                  70                  75                  80
Ile Ser Ala Glu Ser Glu Ser Glu Gly Asn Trp Cys His Glu Tyr Arg
                 85                  90                  95
Lys Leu Lys Ala Lys Ile Glu Thr Ile Gln Lys Cys His Lys His Leu
            100                 105                 110
Met Gly Glu Asp Leu Glu Ser Leu Asn Leu Lys Glu Leu Gln Gln Leu
        115                 120                 125
Glu Gln Gln Leu Glu Ser Ser Leu Lys His Ile Ile Ser Arg Lys Ser
    130                 135                 140
His Leu Met Leu Glu Ser Ile Ser Glu Leu Gln Lys Lys Glu Arg Ser
145                 150                 155                 160
Leu Gln Glu Glu Asn Lys Ala Leu Gln Lys Glu Leu Val Glu Arg Gln
                165                 170                 175
Lys Asn Val Arg Gly Gln Gln Gln Val Gly Gln Trp Asp Gln Thr Gln
            180                 185                 190
Val Gln Ala Gln Ala Gln Ala Gln Pro Gln Ala Gln Thr Ser Ser Ser
        195                 200                 205
Ser Ser Ser Met Leu Arg Asp Gln Gln Ala Leu Leu Pro Pro Gln Asn
    210                 215                 220
Ile Cys Tyr Pro Pro Val Met Met Gly Glu Arg Asn Asp Ala Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ala Ala Ala Val Ala Ala Gln Gly Gln Val Gln Leu Arg Ile Gly Gly
                245                 250                 255
Leu Pro Pro Trp Met Leu Ser His Leu Asn Ala
            260                 265

Claims (5)

1.一种调节植物分枝的基因，该基因由水稻MADS盒基因组成，该基因编码下列肽：
MetGlyArgGlyLysValGlnLeuLysArgIleGluAsnLysIleAsnArgGlnValThr
PheSerLysArgArgAsnGlyLeuLeuLysLysAlaHisGluIleSerValLeuCysAsp
AlaGluValAlaAlaIleValPheSerProLysGlyLysLeuTyrGluTyrAlaThrAsp
SerArgMetAspLysIleLeuGluArgTyrGluArgTyrSerTyrAlaGluLysAlaLeu
IleSerAlaGluSerGluSerGluGlyAsnTrpCysHisGluTyrArgLysLeuLysAla
LysIleGluThrIleGlnLysCysHisLysHisLeuMetGlyGluAspLeuGluSerLeu
AsnLeuLysGluLeuGlnGlnLeuGluGlnGlnLeuGluSerSerLeuLysHisIleIle
SerArgLysSerHisLeuMetLeuGluSerIleSerGluLeuGlnLysLysGluArgSer
LeuGlnGluGluAsnLysAlaLeuGlnLysGluLeuValGluArgGlnLysAsnValArg
GlyGlnGlnGlnValGlyGlnTrpAspGlnThrGlnValGlnAlaGlnAlaGlnAlaGln
ProGlnAlaGlnThrSerSerSerSerSerSerMetLeuArgAspGlnGlnAlaLeuLeu
ProProGlnAsnIleCysTyrProProValMetMetGlyGluArgAsnAspAlaAlaAla
AlaAlaAlaValAlaAlaGlnGlyGlnValGlnLeuArgIleGlyGlyLeuProProTrp
MetLeuSerHisLeuAsnAla。
2.根据权利要求1所述的调节植物分枝的基因，其中水稻MADS盒基因由下列核苷酸序列来表示：
ctcctcctcc tcttcttctt cttccactag ctagttcgtc ttcctccttc agctagcttg
tagcagctaa ggttaggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc
gaggatgggg cgggggaagg tgcagctgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt
gacgttctcc aagaggagga atggattgct gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg
cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac
tgactccagg atggacaaaa tccttgaacg ttatgagcgc tattcatatg ctgaaaaggc
tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaattggtgc catgaataca ggaaacttaa
ggcaaagatt gagaccatac aaaaatgtca caaacacctc atgggagagg atctagaatc
cctgaatctc aaagaactcc aacagctaga gcagcagctg gagagttcat tgaagcacat
aatatcaaga aagagccacc ttatgcttga gtccatttcc gagctgcaga aaaaggagag
gtcactgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaactg gtggagaggc agaagaatgt
gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc
ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg ctgagggatc agcaggcact
tcttccacca caaaatatct gctacccgcc ggtgatgatg ggcgagagaa atgatgcggc
ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtcttccgcc
atggatgctg agccacctca atgcttaaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag
ctgccgtatg caccgtgaat catgggagca accttgaatg aattgaagtc attggtatcg
atcctagcga taatatatat gattctccta aaatgaaatt gatctcaaaa aaacaaacct
agcgattaag ctattcttat atatgtgttt gcctgctgcc ccctacccta caggctacat
atgatttgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtctttgtg taatcatcag
cacgtaccta gtgcttccta ctgatatata tgcatgcaat tgtgtgcata taaatatatt
tgcatgccat gctcccgtga tggttaatt。
3.一种含有水稻MADS盒基因的载体，其中水稻MADS盒基因由下列核苷酸序列来表示：
ctcctcctcc tcttcttctt cttccactag ctagttcgtc ttcctccttc agctagcttg
tagcagctaa ggttaggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc
gaggatgggg cgggggaagg tgcagctgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt
gacgttctcc aagaggagga atggattgct gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg
cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac
tgactccagg atggacaaaa tccttgaacg ttatgagcgc tattcatatg ctgaaaaggc
tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaattggtgc catgaataca ggaaacttaa
ggcaaagatt gagaccatac aaaaatgtca caaacacctc atgggagagg atctagaatc
cctgaatctc aaagaactcc aacagctaga gcagcagctg gagagttcat tgaagcacat
aatatcaaga aagagccacc ttatgcttga gtccatttcc gagctgcaga aaaaggagag
gtcactgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaactg gtggagaggc agaagaatgt
gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc
ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg ctgagggatc agcaggcact
tcttccacca caaaatatct gctacccgcc ggtgatgatg ggcgagagaa atgatgcggc
ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtcttccgcc
atggatgctg agccacctca atgcttaaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag
ctgccgtatg caccgtgaat catgggagca accttgaatg aattgaagtc attggtatcg
atcctagcga taatatatat gattctccta aaatgaaatt gatctcaaaa aaacaaacct
agcgattaag ctattcttat atatgtgttt gcctgctgcc ccctacccta caggctacat
atgatttgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtctttgtg taatcatcag
cacgtaccta gtgcttccta ctgatatata tgcatgcaat tgtgtgcata taaatatatt
tgcatgccat gctcccgtga tggttaatt。
4.一种调节植物分枝的方法，其特征在于将权利要求3的载体引入一种植物中或将权利要求1或2的基因整合到一种载体中并通过一种宿主微生物将所述载体引入一种植物中。
5.一种植物细胞，该植物细胞中的水稻MADS盒基因由下列核苷酸序列表示：
ctcctcctcc tcttcttctt cttccactag ctagttcgtc ttcctccttc agctagcttg
tagcagctaa ggttaggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc
gaggatgggg cgggggaagg tgcagctgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt
gacgttctcc aagaggagga atggattgct gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg
cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac
tgactccagg atggacaaaa tccttgaacg ttatgagcgc tattcatatg ctgaaaaggc
tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaattggtgc catgaataca ggaaacttaa
ggcaaagatt gagaccatac aaaaatgtca caaacacctc atgggagagg atctagaatc
cctgaatctc aaagaactcc aacagctaga gcagcagctg gagagttcat tgaagcacat
aatatcaaga aagagccacc ttatgcttga gtccatttcc gagctgcaga aaaaggagag
gtcactgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaactg gtggagaggc agaagaatgt
gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc
ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg ctgagggatc agcaggcact
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ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtcttccgcc
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agcgattaag ctattcttat atatgtgttt gcctgctgcc ccctacccta caggctacat
atgatttgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtctttgtg taatcatcag
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