JP4567933B2 - 植物の分枝調節遺伝子、当該遺伝子を含有するベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物並びに当該微生物を利用する植物の枝分かれの調節方法 - Google Patents
植物の分枝調節遺伝子、当該遺伝子を含有するベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物並びに当該微生物を利用する植物の枝分かれの調節方法 Download PDFInfo
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Description
技術分野
本発明は、植物の分枝調節遺伝子、当該遺伝子を含有するベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物並びに当該微生物を利用する植物の枝分かれの調節方法に関する。
従来の技術
観賞用植物や、農業用植物において、株分かれを多くすることは、鑑賞用植物の価値を高め、また農業用植物での収量を高めることができるので好ましいことである。従って、種々の植物について、分枝を多くするための技術が求められている。
分枝を制御する遺伝子としてトウモロコシのｔｂ！遺伝子が知られている（Ｊ．Ｄｏｅｂｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｎａｔｕｒｅ”，４８５−４８８（１９９７））が、これは分枝を抑制する遺伝子である。一方、分枝を促進する遺伝子としては、従来、ジンクフィンガー遺伝子が報告されているに過ぎなかった（Ｈ．Ｔａｋａｔｓｕｊｉ，”Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ｒｅｖｉｅｗ）”，ｉｎ ｐｒｅｓｓ （１９９９）および高辻博志、「化学と生物」、第３７巻、第２８７−２８９頁、（１９９９））。
上記のように、分枝を促進することは、観賞用植物あるいは農業用植物についての価値を高めるものであり、農園芸の分野での重要な技術といえる。しかしながら、前記の技術が全ての植物に適用でき、優れた結果を示すとまではいえない以上、別の新たな分枝を促進する技術の開発が強く望まれる。
また、別に植物の成長を抑え、背丈の低い矮性の植物を作出する事もよく行われており、これを遺伝子操作の手法を用いて簡単に行う技術の提供も求められている。
現在、このような植物の矮性を支配する遺伝子としては、シロイヌナズナの染色体ＤＮＡから得た遺伝子他いくつかが知られている程度である（特開平９−５６３８２号）。
本発明は、上記のような技術水準下に於いてなされたものであり、観賞用植物、農業用植物等の植物についてその分枝を調節する技術を提供することをその課題とするものである。
発明の開示
本発明者らは、植物の枝分かれを支配する遺伝子を見出すべく、種々検索を行っていたところ、イネＭＡＤＳボックス遺伝子に植物の枝分かれを調節する作用があることを見出した。
そして、この遺伝子をベクターに組み込み、これを適当な宿主微生物を介して導入した植物は、その発現方向に応じて枝分かれを促進したり、逆に矮性化することを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、イネのＭＡＤＳボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子を含むことを特徴とする植物の分枝調節遺伝子を提供するものである。
また本発明は、上記遺伝子を組み込んだベクターおよび当該ベクターで形質転換した微生物を提供するものである。
更に本発明は、イネＭＡＤＳボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子をベクターに組み込み、これを宿主微生物を介して植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれの調節方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、植物の分枝調節遺伝子として用いられる遺伝子は、イネのＭＡＤＳボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子を含むものである。イネのＭＡＤＳボックス遺伝子は、次の塩基配列で示されるものである。
また、上記遺伝子と相同な遺伝子とは、塩基配列の一部に置換、欠失、挿入等が存在する結果同一ではないが、その遺伝子の奏する機能において同等と見なせる範囲のものをいう。
上記遺伝子によりコードされるアミノ酸のうち、後記式で示されるペプチドの部分がトランスクリプションファクターとして枝別れを調節するものと解される。
ところで、ＭＡＤＳ遺伝子のＭＡＤＳは、酵母菌のＭＣＭ１のＭ、植物のＡＧＡＭＯＵＳのＡ、植物のＤＥＦＩＣＩＥＮＳのＤ、ヒト血清応答因子のＳＲＦのＳの遺伝子の頭文字であり、共通の塩基配列を有するものとして、種を超えて見つかっている。これらの遺伝子は生物の形態形成の関わっている遺伝子のホメオティック遺伝子と同様なトランスクリプション・ファクター（ＤＮＡがｍＲＮＡへ転写されるようにＤＮＡを制御する遺伝子）である。
そして、イネ以外の植物のＭＡＤＳ遺伝子は、そのほとんどが花の形態形成に関与する遺伝子であり、植物の枝分かれを調節することについては全く知られていないものである。
本発明において、植物の分枝調節遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）をベクターに組み込み、これを適当な宿主微生物を介して植物に導入し、植物の枝分かれを調節する。より具体的には、植物細胞内でも機能可能なプロモーターと本発明遺伝子及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で結合させてなる発現プラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより植物細胞を形質転換する。
上記の目的のために用いられるプロモーターとしては、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーターが利用できるが、これに限定されない。また、遺伝子産物の高発現のためにはエンハンサーを用いることが出来る。エンハンサーとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター塩基配列の上流領域の配列に含まれるエンハンサーが利用できる。エンハンサーは複数用いることができる。一方、ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素のターミネーターなどを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
本発明においては、形質転換微生物及び形質転換植物の選抜を容易にするために選抜マーカー遺伝子を利用することができる。
使用される選抜マーカーの例としては、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ２（ＭＰＴ２）遺伝子、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子などが利用可能である。
また、本発明方法において、本発明遺伝子を組み込むために用いられるベクターとしては、ｐＢＩ系、ｐＵＣ系などのベクターを好ましく用いることができる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３などが、ｐＵＣ系のベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。
更に、単子葉植物の形質転換用に開発されたｐＴＯＫ１６２等のベクターも利用できる。
上記の本発明遺伝子を組み込んだベクターで植物を形質転換する方法としては、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
形質転換方法のうち、アグロバクテリウム法は、組換え遺伝子を有するベクターを含むアグロバクテリウムを、植物の培養細胞との共存培養することにより植物細胞に遺伝子を導入する方法である。さらにより簡便な方法として、植物成長点付近へのアグロバクテリウムを含む液の散布または塗布、注入などの方法も利用できる。この際、植物体へ傷を付けることが好ましい。
本発明方法による枝分かれの調節は、細胞、組織、器官への遺伝子の導入が可能で、細胞、組織、器官の再分化方法が確立されている植物、もしくは植物体に直接遺伝子を導入することが可能なものであれば、いずれの植物にも適用できる。
具体的には、カルスや成長点に本発明遺伝子を組み込んだベクターを持つアグロバクテリウム懸濁液を処理するか、あるいは本発明遺伝子を組み込んだベクターをパーティクルガン法で直接的に細胞や組織に打ち込んだ後形質転換体を選抜し植物体へと育成することにより、例えば、キク、ユリ、カーネーション、チューリップ、バラ、ランなどの観賞用植物、ダイズ、ワタ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギなどの農業用植物の形質転換植物体を得ることができる。
本発明においては、後記実施例で示すように、本発明遺伝子をセンス方向で植物中に組み込むか、アンチセンス方向で植物中に組み込むかによってその結果が大きく異なる。すなわち、センス方向で組み込んだ場合は、植物の分枝を促進するが、アンチセンス方向に組み込んだ場合は、植物の生長を抑制し、矮性化される。
産業上の利用可能性
本発明の植物の分枝調節遺伝子は、これを植物中に導入することにより、植物の分枝を促進したり、矮性化させることが可能となる。しかも、この性質はその子孫にも伝えられるものである。従って、本発明は、新しい性質を有する植物を作出するための技術であり、特に、観賞用植物や、農業用植物等の植物についてその分枝を増やし、観賞用植物の価値を高め、また農業用植物の収量を増大させるために有効である。
実施例
次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
実施例 １
（１）センス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだベクターの構築（図１および図２）：
センス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだベクターは、東洋紡（株）から入手したバイナリベクター（ｐＢＩ１２１）中のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を、次の方法によりイネＭＡＤＳボックス遺伝子（ＤＤＢＪアクセス番号ＡＢ００３３２５）のセンス方向ｃＤＮＡ（１．３ｋｂ）で置き換えることにより構築した。
すなわち、ＭＡＤＳボックス遺伝子をＳａｌＩの制限酵素切断部位とＮｏｔＩの制限酵素切断部位に５’から３’の方向で挿入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋Ｍプラスミド（農林水産省農業生物資源研究所のＤＮＡバンクから入手）をＳａｌＩで消化し、平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）化した後、さらにＳａｃＩで消化した。これを電気泳動にかけ、１．３ｋＢのＤＮＡ断片を回収した。
一方、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩの制限酵素切断部位に、ｐＢＩ１２１由来の３．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＧＵＳ遺伝子ならびにＮｏｓターミネーターを含む）を挿入したｐＵＣ１８プラスミド（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ製／東洋紡のｐＢＩ２２１に相当する）をＳｍａＩとＳａｃＩで消化した。これをアガロース電気泳動にかけ、４．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
先の１．３ｋｂの断片とこの４．０ｋｂの断片を結合させて、ｐＢＩ２２１−Ｍプラスミドとし、これを大腸菌（ＪＭ１０９）へ導入した。この大腸菌の陽性コロニーからｐＢＩ２２１−Ｍプラスミドを単離し、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化することで、１．３ｋｂのｃＤＮＡを回収した。このようにして得られたＢａｍＨＩとＳａｃＩ切断末端を持つｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化しＧＵＳ遺伝子を除去したｐＢＩ１２１プラスミドと接合させ、センス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだｐＢＩ１２１−ＭＳベクター（以下、「センスベクター」という）を得た。
（２）アンチセンス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだベクターの構築（図３および図４）：
ＧＵＳ遺伝子をアンチセンス方向のｃＤＮＡで置き換えたｐＢＩ１２１−ＭＡベクターは次の方法で作製した。まず、ＳａｌＩの制限酵素切断部位とＮｏｔＩの制限酵素切断部位にｃＤＮＡが５’から３’方向に挿入されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋−ＭプラスミドをＮｏｔＩで消化し、平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）化した後、さらにＫｐｎＩで消化した。これを電気泳動にかけ、１．３ｋＢのＤＮＡ断片を回収した。
一方、ｐＵＣ１８プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、平滑末端化した後、さらにＫｐｎＩで消化した。これを電気泳動にかけ、２．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これを先の１．３ｋｂの断片と結合させてｐＵＣ１８−Ｍプラスミドとした後、大腸菌（ＨＢ１０１）に導入した。この大腸菌の陽性コロニーからｐＵＣ１８−Ｍプラスミドを単離し、ＳａｃＩとＸｂａＩで消化することにより、ＳａｃＩとＸｂａＩの切断末端を持つ１．３ｋｂのｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをＳａｃＩとＸｂａＩで消化したｐＢＩ１２１ベクターに結合させることによりアンチセンス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだｐＢＩ１２１−ＭＡベクター（以下、「アンチセンスベクター」という）を得た。
（３）宿主微生物へのベクターの導入：
宿主微生物としては、東洋紡（株）から入手したアグロバクテリウム・チューメハシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４）を用いた。この微生物への上記（１）または（２）で得たベクターの導入は、既報の方法によっておこなった（Ｍ．Ｈｏｌｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ”，１６３，１８１−１８７（１９７８））。導入後の微生物は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）５０μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）１０μｇ／ｍｌならびにストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ） ５０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地で、２８℃、１８時間培養した。培養終了後、遠心分離により細胞を集め、水で洗浄した後、水に懸濁（１．０×１０８細胞／ｍｌ）して、植物への接種に使用した。
（４）植物への接種：
ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｖａｒ．Ｓｈｉｎａｎｏ ｉｃｈｉｇｏ）種子を次亜塩素酸ソーダで殺菌し、植木鉢中の土に播いた。鉢は２５℃の温度で、８時間明、１６時間暗の条件に置いた。播種４〜５日後、植物体の２枚の子葉が開き、７〜８ｃｍの高さになった時に、茎頂成長点に針で刺して小穴を開け、そこにベクターを保有するＡ・チューメハシエンスの水懸濁液（約１．０×１０８細胞／ｍｌ）を接種した。
接種したソバはおのおのを実生５０個体であり、これらを２２℃の温度、暗黒の条件下に３日間置いた後、グロースチャンバー内で、３０℃、約４，０００Ｌｕｘの照明を８時間あてて育てた。ソバは、約１．８ｍｍと０．６ｍｍの花柱の長さが違う２つのタイプの花をつけ（ヘテロスタイリズム；異花柱現象）、異なるタイプの花の間の授粉だけが受精する。したがって、種子（Ｔ１植物）を得るために、形質転換植物（Ｔ０）の花と、形質転換されていない植物の異なるタイプの花を授粉した。
センスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスが接種された５０の植物体の内、３３個体は分枝が促進されて、多くの枝が形成された。しかし、形質転換体の表現型の発現程度には植物間差があった。花の分化と構造においては変化は観察されなかった。
一方、アンチセンスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスが接種された５０個体の内、３０個体の植物は分枝も成長も抑えられた。この表現型の発現程度もまた上記の植物と同様に植物間で様々であった。これらの植物の花の発達と構造もまた見た目の変化はなかった。
図５（写真）に、センスおよびアンチセンス向きで本発明遺伝子が導入されたソバの外観を示す。図５中、（Ａ）の１は、無処理のソバ、（Ａ）の２は、ｐＢＩ１２１ベクター（ＧＵＳ遺伝子）を保有するＡ．チューメハシエンスで処理したソバ、（Ａ）の３は、センスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスで処理したソバ、（Ａ）の４は、アンチセンスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスで処理したソバであり、これらは処理１ケ月後に写真を撮影した。なお、写真中の棒は３０ｃｍの定規である。
この結果から、センス方向に本発明遺伝子を導入したソバ（（Ａ）の３）は枝分れが促進されているが、アンチセンス方向に本発明遺伝子を導入したソバ（（Ａ）の４）は枝分れが抑制されていた。
また、図５中の（Ｂ）は、センス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの中で、最も形質転換の表現形質（分枝度）の高いものを示す。この写真は植物が成長を終え、枯れた処理６カ月後に撮影した。
（５）なお、上記試験では、形質転換するために実生の茎頂成長点へＡ．チューメハシエンスを接種し、その後、実生からアグロバクテリアを除く操作は行なわなかった。それ故、接種したアグロバクテリアが残っていないかどうか、すなわち、形質転換植物の形態変化は、Ａ．チューメハシエンスの影響でないかどうかをＴ０植物とＴ１植物で次の方法により調べた。
接種後の全植物体（Ｔ０植物）を乳鉢で滅菌水と共に磨砕した。この磨砕液を、形質転換に用いたＡ．チューメハシエンスの生育することのできる抗生物質を含むＬＢ培地プレートに広げ、２８℃でインキュベートした。このプレート上に出現したコロニー数は接種後の時間が長くなるにつれて減少し、接種後１４日後では数コロニーしか出現しなくなった。大多数のアグロバクテリアは、おそらくソバ植物体の抵抗反応により排除されたものと思われる。
Ｔ１植物の場合は、種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液で殺菌し、その後無菌的に発芽、生育させた。その結果得られた実生を滅菌水と共に磨砕し、上記のように抗生物質含有ＬＢ培地プレートで培養した。コロニーは全く出現せず、Ｔ１植物には形質転換に使用したアグロバクテリアは全く存在していないことを確認した。
実施例 ２
形質転換ソバの子孫（Ｔ１）の表現型の確認：
ソバの花は異花柱現象を示し、異なるタイプの花の間でしか受精しない。そこで、形質転換されたソバ（Ｔ０）の花と無処理のソバの花とを授粉した。その結果得られた種子を播種し、生育させてＴ１植物の表現型を調べた（図６）。本発明遺伝子をセンス方向に導入したソバおよびアンチセンス方向に導入したソバの両者において、約半数の子孫個体（１０個体）にそれぞれのＴ０植物の形質が遺伝していた。すなわち、センス方向で本発明遺伝子を組み込んだソバの子孫は分枝が促進されていた（図６、（Ａ）の２）。それとは反対に、アンチセンス方向で本発明遺伝子を組み込んだソバの子孫は分枝が抑えられ、生育も抑えられた（図６、（Ｂ）の２）。このように、互いに反対方向の本発明遺伝子で形質転換したソバの表現型は、その子孫においても互いに反対の関係にあった。
実施例 ３
ゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことの確認：
（１）形質転換ソバの子孫（Ｔ１）からのゲノムＤＮＡの単離および精製：
実施例２で得た実生または成熟植物体から、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ ＤＮＡ抽出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、説明書の手順通りにゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは次の方法でさらに精製した。すなわち、ＤＮＡを５００μｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かし、２μｌのＲＮａｓｅ（日本ジーン、１０ｍｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃で４５分間インキュベートした。続いて、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、６０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０％ＳＤＳならびに５μｌのＰｒｏｔｅａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）からなる１００μｌの溶液を加え、５０℃で３時間インキュベートした。この溶液をフェノール、フェノール／クロロホルム混合液（１：１，ｖ／ｖ）そしてフェノールの順で抽出した。得られたＤＮＡ溶液からＤＮＡをエタノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗浄したして精製ゲノムＤＮＡを得た。
（２）ゲノムサザンハイブリダイゼーション
上記（１）で得た１５μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素（ＭＡＤＳ遺伝子ｃＤＮＡ中にその制限酵素サイトのない、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩを利用）で消化し、アガロース（１％）電気泳動後に、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋のナイロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ）に転写した。イネＭＡＤＳボックス遺伝子のｃＤＮＡ（１．３ｋｂ）とランダムプライマーラベリングキット（Ｔａｋａｒａ製）で３２Ｐでラベルしたプローブを作製し、セファデックスＧ−５０のカラムで精製した。ＤＮＡが転写されたナイロンメンブランを、最初、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳならびに２０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む５×ＳＳＰＥ溶液（０．１８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡからなるｐＨ７．７の溶液）中で、６５℃で１時間、プレハイブリダイゼーションを行なった。
その後、３２Ｐでラベルしたプローブをプレハイブリダイゼーション溶液中に添加し、６５℃で１８時間、ハイブリダイゼーションを行なった。メンブランを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＰＥ溶液中で２０℃で１０分間、２回洗浄した。つづいて、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＰＥ溶液中で６５℃で１５分間、１回洗浄し、最後に０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＰＥ溶液中で６５℃で１０分間、２回洗浄した。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡのバンドはイメージアナライザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で画像化した。この結果を図７および図８に示す。
図７は本発明遺伝子をセンス方向に導入したソバの子孫、図８は本発明遺伝子をアンチセンス方向に導入したソバの子孫についてであり、共に１は無処理ソバをＥｃｏＲＩ消化した後の結果、２は形質転換体をＥｃｏＲＩ消化した後の結果、３は形質転換体をＳａｃＩ消化した後の結果、４は形質転換体をＸｈｏＩ消化した後の結果、５は形質転換体をＳａｌＩ消化した後の結果をそれぞれ示す。
図７および図８から明らかなように、無処理のソバではバンドが認められないが、センス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの子孫（図７）、アンチセンス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの子孫（図８）の両ゲノムＤＮＡについて、すべてのレーンで唯一のハイブリダイズバンドが検出されたことから、分析したＴ１植物のゲノムにはｃＤＮＡが１コピーだけ導入されていることが示された。
実施例 ４
ゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことの確認：
ゲノム中に組み込まれたｃＤＮＡ増幅用に、Ｐ１およびＰ２の２種のＰＣＲプライマーを２つ設計した。
Ｐ１：５’−ＡＣＡＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣ−３’
Ｐ２：５’−ＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ−３’
このうち、Ｐ１は元のｐＢＩ１２１バイナリベクター中のＧＵＳ遺伝子の上流に位置するＣａＭＶ３５Ｓプロモータの３’末端配列に相当し、Ｐ２は、元のｐＢＩ１２１バイナリベクター中のＧＵＳ遺伝子の下流に位置するＴ−ＤＮＡのライトボーダー近傍の配列に相当している。
実施例３（１）で調製したゲノムＤＮＡ（１−２μｌ、５００ｎｇ）を最終容量が５０μｌの反応液（５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭのヌクレオチド、０．２μＭの上記プライマー、１．２５ユニットのＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ製）に添加した。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒、５８℃で４５秒、７２℃で９０秒を３０サイクル、その後７２℃で１０分間行なった。ＰＣＲ産物のアガロース（１％）ゲル電気泳動し、増幅反応後、反応液を直接電気泳動にかけ、泳動後エチジウムブロマイドで染色した。
この結果を図９に示す。この図中、１はＤＮＡサイズマーカー、２はセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターのＰＣＲ産物、３はセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物、４はアンチセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。
図９から、両ゲノムＤＮＡについて、期待されたサイズ（１．７ｋｂ）のＤＮＡ断片が増幅され、ｃＤＮＡの完全な配列が両方のＴ１植物に組み込まれていることが明らかとなった。
実施例 ５
ゲノム中に組み込まれたｃＤＮＡの方向性の確認：
本発明遺伝子（１．３ｋｂ）の５’末端から４７２ｂｐの部位にＸｂａＩの制限サイトが１ケ所存在する。ｃＤＮＡのこのＸｂａＩサイトとＰＣＲプライマーがアニールする部位から考えて、ＰＣＲ産物をＸｂａで消化すると、センス方向で挿入されている場合には、１．２ｋｂと０．５ｋｂのＤＮＡ断片が、アンチセンス方向の場合には、２つの８５０ｂｐの断片が生成すると期待される（図１０）。両者のＴ１植物のゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物と、形質転換に使用したｃＤＮＡを有する２つのバイナリベクターのＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化し、続いて３２ＰラベルしたｃＤＮＡプローブを使ってサザンハイブリダイズ分析を行った（図１１）。
図１１中、１は、アンチセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターのＰＣＲ産物、２はセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターのＰＣＲ産物、３はセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物、４はアンチセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。
図１１では、期待されるサイズのハイブリダイズバンドがそれぞれのサンプルて検出された。この結果は、センス及びアンチセンス方向で形質転換した植物（Ｔ１）のゲノム中に、ｃＤＮＡはそれぞれの期待された方向性をもって組み込まれていることを示している。
実施例 ６
カランコエへの本発明遺伝子の導入：
長さ１０〜１３ｃｍのカランコエ成熟葉を茎から切り取った。実体顕微鏡を用いて、この葉の周辺の切れ込みの一番奥にある分裂細胞のまわりの表皮細胞と葉肉細胞ならびに分裂細胞直上の表皮細胞に針で数カ所穴を開けた。
この葉に、実施例１（３）で得た、センス方向にＭＡＤＳ遺伝子を導入したアグロバクテリウム・チューメハシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の水懸濁液（１．０×１０８個／ｍｌ）をパスツールピペットを用い、１摘づつ１つの切れ込み部分に接種した。次いで室温に３０分間程度放置して乾かした。この葉をプラスチックケースに入れた湿ったバーミキュライトの上にのせ、蓋を閉めて２５℃でインキュベートした（明所８時間、暗所１６時間のサイクル）。
カランコエの葉の上記処理した部分より新しい芽と根が出、これが発達するので、４週間後に元の葉から切り離し、写真撮影した。対照としては、非形質転換体であるＡ・チューメハシエンスで処理したものおよびＭＡＤＳ遺伝子の代わりにＧＵＳ遺伝子（β−グルクロニダーゼ遺伝子）を導入したＡ・チューメハシエンスで処理したものを用いた。この結果を図１２に示す。
ＭＡＤＳボックス遺伝子で形質転換した株は根部付近から葉の展開が見られたが、対照の非形質転換体およびＭＡＤＳ遺伝子の代わりにＧＵＳ遺伝子を導入した株ではこのような現象は認められなかった。この結果は、ソバを用いた試験結果と同様に、該ＭＡＤＳボックス遺伝子が分枝を制御している遺伝子であることを示している。ソバだけでなく種の異なるカランコエでも、該ＭＡＤＳボックス遺伝子が分枝を促進したことから、該遺伝子は植物全般の分枝を制御できる遺伝子であると考えられる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明で用いるセンスベクターの構築順序の前半を示す図である。
第２図は本発明で用いるセンスベクターの構築順序の後半を示す図である。
第３図は本発明で用いるアンチセンスベクターの構築順序の前半を示す図である。
第４図は本発明で用いるアンチセンスベクターの構築順序の後半を示す図である。
第５図は本発明遺伝子をセンスおよびアンチセンス向きで導入したソバの外観を示す写真である。
第６図は本発明遺伝子をセンスおよびアンチセンス向きで導入したソバの外観と、無処理のソバの外観を対比した写真である。
第７図は本発明遺伝子をセンス向きで導入したソバ（Ｔ１）のゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
第８図は本発明遺伝子をアンチセンス向きで導入したソバ（Ｔ１）のゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
第９図はゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことを確認した電気泳動の結果を示す図である。
第１０図はＭＡＤＳ遺伝子がセンスおよびアンチセンス方向に組み込まれた本発明遺伝子を模式的に示した図である。
第１１図はゲノム中に組み込まれたｃＤＮＡの方向性を確認するためのサザンハイブリダイズ分析の結果を示す図である。
第１２図は本発明遺伝子をセンス向きで導入したカランコエの外観を、ＧＵＳ遺伝子導入カランコエおよび無処理カランコエの外観と対比した写真である。
本発明は、植物の分枝調節遺伝子、当該遺伝子を含有するベクターおよび当該ベクターにより形質転換された微生物並びに当該微生物を利用する植物の枝分かれの調節方法に関する。
従来の技術
観賞用植物や、農業用植物において、株分かれを多くすることは、鑑賞用植物の価値を高め、また農業用植物での収量を高めることができるので好ましいことである。従って、種々の植物について、分枝を多くするための技術が求められている。
分枝を制御する遺伝子としてトウモロコシのｔｂ！遺伝子が知られている（Ｊ．Ｄｏｅｂｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｎａｔｕｒｅ”，４８５−４８８（１９９７））が、これは分枝を抑制する遺伝子である。一方、分枝を促進する遺伝子としては、従来、ジンクフィンガー遺伝子が報告されているに過ぎなかった（Ｈ．Ｔａｋａｔｓｕｊｉ，”Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（ｒｅｖｉｅｗ）”，ｉｎ ｐｒｅｓｓ （１９９９）および高辻博志、「化学と生物」、第３７巻、第２８７−２８９頁、（１９９９））。
上記のように、分枝を促進することは、観賞用植物あるいは農業用植物についての価値を高めるものであり、農園芸の分野での重要な技術といえる。しかしながら、前記の技術が全ての植物に適用でき、優れた結果を示すとまではいえない以上、別の新たな分枝を促進する技術の開発が強く望まれる。
また、別に植物の成長を抑え、背丈の低い矮性の植物を作出する事もよく行われており、これを遺伝子操作の手法を用いて簡単に行う技術の提供も求められている。
現在、このような植物の矮性を支配する遺伝子としては、シロイヌナズナの染色体ＤＮＡから得た遺伝子他いくつかが知られている程度である（特開平９−５６３８２号）。
本発明は、上記のような技術水準下に於いてなされたものであり、観賞用植物、農業用植物等の植物についてその分枝を調節する技術を提供することをその課題とするものである。
発明の開示
本発明者らは、植物の枝分かれを支配する遺伝子を見出すべく、種々検索を行っていたところ、イネＭＡＤＳボックス遺伝子に植物の枝分かれを調節する作用があることを見出した。
そして、この遺伝子をベクターに組み込み、これを適当な宿主微生物を介して導入した植物は、その発現方向に応じて枝分かれを促進したり、逆に矮性化することを見出し、本発明を完成した。
すなわち本発明は、イネのＭＡＤＳボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子を含むことを特徴とする植物の分枝調節遺伝子を提供するものである。
また本発明は、上記遺伝子を組み込んだベクターおよび当該ベクターで形質転換した微生物を提供するものである。
更に本発明は、イネＭＡＤＳボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子をベクターに組み込み、これを宿主微生物を介して植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれの調節方法を提供するものである。
発明を実施するための最良の形態
本発明において、植物の分枝調節遺伝子として用いられる遺伝子は、イネのＭＡＤＳボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子を含むものである。イネのＭＡＤＳボックス遺伝子は、次の塩基配列で示されるものである。
上記遺伝子によりコードされるアミノ酸のうち、後記式で示されるペプチドの部分がトランスクリプションファクターとして枝別れを調節するものと解される。
そして、イネ以外の植物のＭＡＤＳ遺伝子は、そのほとんどが花の形態形成に関与する遺伝子であり、植物の枝分かれを調節することについては全く知られていないものである。
本発明において、植物の分枝調節遺伝子（以下、「本発明遺伝子」という）をベクターに組み込み、これを適当な宿主微生物を介して植物に導入し、植物の枝分かれを調節する。より具体的には、植物細胞内でも機能可能なプロモーターと本発明遺伝子及び植物細胞内で機能可能なターミネーターを機能可能な形で結合させてなる発現プラスミドを構築し、これを植物細胞に導入することにより植物細胞を形質転換する。
上記の目的のために用いられるプロモーターとしては、例えばＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ノパリン合成酵素のプロモーターが利用できるが、これに限定されない。また、遺伝子産物の高発現のためにはエンハンサーを用いることが出来る。エンハンサーとしては、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター塩基配列の上流領域の配列に含まれるエンハンサーが利用できる。エンハンサーは複数用いることができる。一方、ターミネーターとしては、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素のターミネーターなどを挙げることができるが、これに限定されるものではない。
本発明においては、形質転換微生物及び形質転換植物の選抜を容易にするために選抜マーカー遺伝子を利用することができる。
使用される選抜マーカーの例としては、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ２（ＭＰＴ２）遺伝子、ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子などが利用可能である。
また、本発明方法において、本発明遺伝子を組み込むために用いられるベクターとしては、ｐＢＩ系、ｐＵＣ系などのベクターを好ましく用いることができる。ｐＢＩ系のベクターとしては、例えば、ｐＢＩ１２１、ｐＢＩ１０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３などが、ｐＵＣ系のベクターとしては、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ９などが挙げられる。
更に、単子葉植物の形質転換用に開発されたｐＴＯＫ１６２等のベクターも利用できる。
上記の本発明遺伝子を組み込んだベクターで植物を形質転換する方法としては、アグロバクテリウム法、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等を使用することができる。
形質転換方法のうち、アグロバクテリウム法は、組換え遺伝子を有するベクターを含むアグロバクテリウムを、植物の培養細胞との共存培養することにより植物細胞に遺伝子を導入する方法である。さらにより簡便な方法として、植物成長点付近へのアグロバクテリウムを含む液の散布または塗布、注入などの方法も利用できる。この際、植物体へ傷を付けることが好ましい。
本発明方法による枝分かれの調節は、細胞、組織、器官への遺伝子の導入が可能で、細胞、組織、器官の再分化方法が確立されている植物、もしくは植物体に直接遺伝子を導入することが可能なものであれば、いずれの植物にも適用できる。
具体的には、カルスや成長点に本発明遺伝子を組み込んだベクターを持つアグロバクテリウム懸濁液を処理するか、あるいは本発明遺伝子を組み込んだベクターをパーティクルガン法で直接的に細胞や組織に打ち込んだ後形質転換体を選抜し植物体へと育成することにより、例えば、キク、ユリ、カーネーション、チューリップ、バラ、ランなどの観賞用植物、ダイズ、ワタ、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギなどの農業用植物の形質転換植物体を得ることができる。
本発明においては、後記実施例で示すように、本発明遺伝子をセンス方向で植物中に組み込むか、アンチセンス方向で植物中に組み込むかによってその結果が大きく異なる。すなわち、センス方向で組み込んだ場合は、植物の分枝を促進するが、アンチセンス方向に組み込んだ場合は、植物の生長を抑制し、矮性化される。
産業上の利用可能性
本発明の植物の分枝調節遺伝子は、これを植物中に導入することにより、植物の分枝を促進したり、矮性化させることが可能となる。しかも、この性質はその子孫にも伝えられるものである。従って、本発明は、新しい性質を有する植物を作出するための技術であり、特に、観賞用植物や、農業用植物等の植物についてその分枝を増やし、観賞用植物の価値を高め、また農業用植物の収量を増大させるために有効である。
実施例
次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
実施例 １
（１）センス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだベクターの構築（図１および図２）：
センス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだベクターは、東洋紡（株）から入手したバイナリベクター（ｐＢＩ１２１）中のβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子を、次の方法によりイネＭＡＤＳボックス遺伝子（ＤＤＢＪアクセス番号ＡＢ００３３２５）のセンス方向ｃＤＮＡ（１．３ｋｂ）で置き換えることにより構築した。
すなわち、ＭＡＤＳボックス遺伝子をＳａｌＩの制限酵素切断部位とＮｏｔＩの制限酵素切断部位に５’から３’の方向で挿入したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋Ｍプラスミド（農林水産省農業生物資源研究所のＤＮＡバンクから入手）をＳａｌＩで消化し、平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）化した後、さらにＳａｃＩで消化した。これを電気泳動にかけ、１．３ｋＢのＤＮＡ断片を回収した。
一方、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩの制限酵素切断部位に、ｐＢＩ１２１由来の３．１ｋｂのＤＮＡ断片（ＣａＭＶ３５ＳプロモーターおよびＧＵＳ遺伝子ならびにＮｏｓターミネーターを含む）を挿入したｐＵＣ１８プラスミド（Ｎｉｐｐｏｎ Ｇｅｎｅ製／東洋紡のｐＢＩ２２１に相当する）をＳｍａＩとＳａｃＩで消化した。これをアガロース電気泳動にかけ、４．０ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。
先の１．３ｋｂの断片とこの４．０ｋｂの断片を結合させて、ｐＢＩ２２１−Ｍプラスミドとし、これを大腸菌（ＪＭ１０９）へ導入した。この大腸菌の陽性コロニーからｐＢＩ２２１−Ｍプラスミドを単離し、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化することで、１．３ｋｂのｃＤＮＡを回収した。このようにして得られたＢａｍＨＩとＳａｃＩ切断末端を持つｃＤＮＡを、ＢａｍＨＩとＳａｃＩで消化しＧＵＳ遺伝子を除去したｐＢＩ１２１プラスミドと接合させ、センス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだｐＢＩ１２１−ＭＳベクター（以下、「センスベクター」という）を得た。
（２）アンチセンス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだベクターの構築（図３および図４）：
ＧＵＳ遺伝子をアンチセンス方向のｃＤＮＡで置き換えたｐＢＩ１２１−ＭＡベクターは次の方法で作製した。まず、ＳａｌＩの制限酵素切断部位とＮｏｔＩの制限酵素切断部位にｃＤＮＡが５’から３’方向に挿入されているｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋−ＭプラスミドをＮｏｔＩで消化し、平滑末端（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ）化した後、さらにＫｐｎＩで消化した。これを電気泳動にかけ、１．３ｋＢのＤＮＡ断片を回収した。
一方、ｐＵＣ１８プラスミドをＢａｍＨＩで消化し、平滑末端化した後、さらにＫｐｎＩで消化した。これを電気泳動にかけ、２．６ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これを先の１．３ｋｂの断片と結合させてｐＵＣ１８−Ｍプラスミドとした後、大腸菌（ＨＢ１０１）に導入した。この大腸菌の陽性コロニーからｐＵＣ１８−Ｍプラスミドを単離し、ＳａｃＩとＸｂａＩで消化することにより、ＳａｃＩとＸｂａＩの切断末端を持つ１．３ｋｂのｃＤＮＡを得た。このｃＤＮＡをＳａｃＩとＸｂａＩで消化したｐＢＩ１２１ベクターに結合させることによりアンチセンス方向にイネＭＡＤＳボックス遺伝子を組み込んだｐＢＩ１２１−ＭＡベクター（以下、「アンチセンスベクター」という）を得た。
（３）宿主微生物へのベクターの導入：
宿主微生物としては、東洋紡（株）から入手したアグロバクテリウム・チューメハシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４）を用いた。この微生物への上記（１）または（２）で得たベクターの導入は、既報の方法によっておこなった（Ｍ．Ｈｏｌｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅ”，１６３，１８１−１８７（１９７８））。導入後の微生物は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）５０μｇ／ｍｌ、リファンピシリン（ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ）１０μｇ／ｍｌならびにストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ） ５０μｇ／ｍｌを加えたＬＢ培地で、２８℃、１８時間培養した。培養終了後、遠心分離により細胞を集め、水で洗浄した後、水に懸濁（１．０×１０８細胞／ｍｌ）して、植物への接種に使用した。
（４）植物への接種：
ソバ（Ｆａｇｏｐｙｒｕｍ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ ｖａｒ．Ｓｈｉｎａｎｏ ｉｃｈｉｇｏ）種子を次亜塩素酸ソーダで殺菌し、植木鉢中の土に播いた。鉢は２５℃の温度で、８時間明、１６時間暗の条件に置いた。播種４〜５日後、植物体の２枚の子葉が開き、７〜８ｃｍの高さになった時に、茎頂成長点に針で刺して小穴を開け、そこにベクターを保有するＡ・チューメハシエンスの水懸濁液（約１．０×１０８細胞／ｍｌ）を接種した。
接種したソバはおのおのを実生５０個体であり、これらを２２℃の温度、暗黒の条件下に３日間置いた後、グロースチャンバー内で、３０℃、約４，０００Ｌｕｘの照明を８時間あてて育てた。ソバは、約１．８ｍｍと０．６ｍｍの花柱の長さが違う２つのタイプの花をつけ（ヘテロスタイリズム；異花柱現象）、異なるタイプの花の間の授粉だけが受精する。したがって、種子（Ｔ１植物）を得るために、形質転換植物（Ｔ０）の花と、形質転換されていない植物の異なるタイプの花を授粉した。
センスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスが接種された５０の植物体の内、３３個体は分枝が促進されて、多くの枝が形成された。しかし、形質転換体の表現型の発現程度には植物間差があった。花の分化と構造においては変化は観察されなかった。
一方、アンチセンスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスが接種された５０個体の内、３０個体の植物は分枝も成長も抑えられた。この表現型の発現程度もまた上記の植物と同様に植物間で様々であった。これらの植物の花の発達と構造もまた見た目の変化はなかった。
図５（写真）に、センスおよびアンチセンス向きで本発明遺伝子が導入されたソバの外観を示す。図５中、（Ａ）の１は、無処理のソバ、（Ａ）の２は、ｐＢＩ１２１ベクター（ＧＵＳ遺伝子）を保有するＡ．チューメハシエンスで処理したソバ、（Ａ）の３は、センスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスで処理したソバ、（Ａ）の４は、アンチセンスベクターを保有するＡ．チューメハシエンスで処理したソバであり、これらは処理１ケ月後に写真を撮影した。なお、写真中の棒は３０ｃｍの定規である。
この結果から、センス方向に本発明遺伝子を導入したソバ（（Ａ）の３）は枝分れが促進されているが、アンチセンス方向に本発明遺伝子を導入したソバ（（Ａ）の４）は枝分れが抑制されていた。
また、図５中の（Ｂ）は、センス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの中で、最も形質転換の表現形質（分枝度）の高いものを示す。この写真は植物が成長を終え、枯れた処理６カ月後に撮影した。
（５）なお、上記試験では、形質転換するために実生の茎頂成長点へＡ．チューメハシエンスを接種し、その後、実生からアグロバクテリアを除く操作は行なわなかった。それ故、接種したアグロバクテリアが残っていないかどうか、すなわち、形質転換植物の形態変化は、Ａ．チューメハシエンスの影響でないかどうかをＴ０植物とＴ１植物で次の方法により調べた。
接種後の全植物体（Ｔ０植物）を乳鉢で滅菌水と共に磨砕した。この磨砕液を、形質転換に用いたＡ．チューメハシエンスの生育することのできる抗生物質を含むＬＢ培地プレートに広げ、２８℃でインキュベートした。このプレート上に出現したコロニー数は接種後の時間が長くなるにつれて減少し、接種後１４日後では数コロニーしか出現しなくなった。大多数のアグロバクテリアは、おそらくソバ植物体の抵抗反応により排除されたものと思われる。
Ｔ１植物の場合は、種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液で殺菌し、その後無菌的に発芽、生育させた。その結果得られた実生を滅菌水と共に磨砕し、上記のように抗生物質含有ＬＢ培地プレートで培養した。コロニーは全く出現せず、Ｔ１植物には形質転換に使用したアグロバクテリアは全く存在していないことを確認した。
実施例 ２
形質転換ソバの子孫（Ｔ１）の表現型の確認：
ソバの花は異花柱現象を示し、異なるタイプの花の間でしか受精しない。そこで、形質転換されたソバ（Ｔ０）の花と無処理のソバの花とを授粉した。その結果得られた種子を播種し、生育させてＴ１植物の表現型を調べた（図６）。本発明遺伝子をセンス方向に導入したソバおよびアンチセンス方向に導入したソバの両者において、約半数の子孫個体（１０個体）にそれぞれのＴ０植物の形質が遺伝していた。すなわち、センス方向で本発明遺伝子を組み込んだソバの子孫は分枝が促進されていた（図６、（Ａ）の２）。それとは反対に、アンチセンス方向で本発明遺伝子を組み込んだソバの子孫は分枝が抑えられ、生育も抑えられた（図６、（Ｂ）の２）。このように、互いに反対方向の本発明遺伝子で形質転換したソバの表現型は、その子孫においても互いに反対の関係にあった。
実施例 ３
ゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことの確認：
（１）形質転換ソバの子孫（Ｔ１）からのゲノムＤＮＡの単離および精製：
実施例２で得た実生または成熟植物体から、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｈｙｔｏｐｕｒｅ ＤＮＡ抽出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用し、説明書の手順通りにゲノムＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡは次の方法でさらに精製した。すなわち、ＤＮＡを５００μｌの１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かし、２μｌのＲＮａｓｅ（日本ジーン、１０ｍｇ／ｍｌ）と一緒に３７℃で４５分間インキュベートした。続いて、６０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、６０ｍＭ ＥＤＴＡ、３０％ＳＤＳならびに５μｌのＰｒｏｔｅａｓｅ Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ）からなる１００μｌの溶液を加え、５０℃で３時間インキュベートした。この溶液をフェノール、フェノール／クロロホルム混合液（１：１，ｖ／ｖ）そしてフェノールの順で抽出した。得られたＤＮＡ溶液からＤＮＡをエタノールで沈澱させ、７０％エタノールで洗浄したして精製ゲノムＤＮＡを得た。
（２）ゲノムサザンハイブリダイゼーション
上記（１）で得た１５μｇのゲノムＤＮＡを制限酵素（ＭＡＤＳ遺伝子ｃＤＮＡ中にその制限酵素サイトのない、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＸｈｏＩ、ＳａｌＩを利用）で消化し、アガロース（１％）電気泳動後に、Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋のナイロンメンブラン（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃ）に転写した。イネＭＡＤＳボックス遺伝子のｃＤＮＡ（１．３ｋｂ）とランダムプライマーラベリングキット（Ｔａｋａｒａ製）で３２Ｐでラベルしたプローブを作製し、セファデックスＧ−５０のカラムで精製した。ＤＮＡが転写されたナイロンメンブランを、最初、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．５％ＳＤＳならびに２０μｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含む５×ＳＳＰＥ溶液（０．１８Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡからなるｐＨ７．７の溶液）中で、６５℃で１時間、プレハイブリダイゼーションを行なった。
その後、３２Ｐでラベルしたプローブをプレハイブリダイゼーション溶液中に添加し、６５℃で１８時間、ハイブリダイゼーションを行なった。メンブランを０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＰＥ溶液中で２０℃で１０分間、２回洗浄した。つづいて、０．１％ＳＤＳを含む１×ＳＳＰＥ溶液中で６５℃で１５分間、１回洗浄し、最後に０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＰＥ溶液中で６５℃で１０分間、２回洗浄した。プローブとハイブリダイズしたＤＮＡのバンドはイメージアナライザー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）で画像化した。この結果を図７および図８に示す。
図７は本発明遺伝子をセンス方向に導入したソバの子孫、図８は本発明遺伝子をアンチセンス方向に導入したソバの子孫についてであり、共に１は無処理ソバをＥｃｏＲＩ消化した後の結果、２は形質転換体をＥｃｏＲＩ消化した後の結果、３は形質転換体をＳａｃＩ消化した後の結果、４は形質転換体をＸｈｏＩ消化した後の結果、５は形質転換体をＳａｌＩ消化した後の結果をそれぞれ示す。
図７および図８から明らかなように、無処理のソバではバンドが認められないが、センス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの子孫（図７）、アンチセンス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの子孫（図８）の両ゲノムＤＮＡについて、すべてのレーンで唯一のハイブリダイズバンドが検出されたことから、分析したＴ１植物のゲノムにはｃＤＮＡが１コピーだけ導入されていることが示された。
実施例 ４
ゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことの確認：
ゲノム中に組み込まれたｃＤＮＡ増幅用に、Ｐ１およびＰ２の２種のＰＣＲプライマーを２つ設計した。
Ｐ１：５’−ＡＣＡＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣ−３’
Ｐ２：５’−ＧＴＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡ−３’
このうち、Ｐ１は元のｐＢＩ１２１バイナリベクター中のＧＵＳ遺伝子の上流に位置するＣａＭＶ３５Ｓプロモータの３’末端配列に相当し、Ｐ２は、元のｐＢＩ１２１バイナリベクター中のＧＵＳ遺伝子の下流に位置するＴ−ＤＮＡのライトボーダー近傍の配列に相当している。
実施例３（１）で調製したゲノムＤＮＡ（１−２μｌ、５００ｎｇ）を最終容量が５０μｌの反応液（５０ｍＭ ＫＣｌ，１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００μＭのヌクレオチド、０．２μＭの上記プライマー、１．２５ユニットのＴａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｔａｋａｒａ製）に添加した。ＰＣＲ反応は、９４℃で３０秒、５８℃で４５秒、７２℃で９０秒を３０サイクル、その後７２℃で１０分間行なった。ＰＣＲ産物のアガロース（１％）ゲル電気泳動し、増幅反応後、反応液を直接電気泳動にかけ、泳動後エチジウムブロマイドで染色した。
この結果を図９に示す。この図中、１はＤＮＡサイズマーカー、２はセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターのＰＣＲ産物、３はセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物、４はアンチセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。
図９から、両ゲノムＤＮＡについて、期待されたサイズ（１．７ｋｂ）のＤＮＡ断片が増幅され、ｃＤＮＡの完全な配列が両方のＴ１植物に組み込まれていることが明らかとなった。
実施例 ５
ゲノム中に組み込まれたｃＤＮＡの方向性の確認：
本発明遺伝子（１．３ｋｂ）の５’末端から４７２ｂｐの部位にＸｂａＩの制限サイトが１ケ所存在する。ｃＤＮＡのこのＸｂａＩサイトとＰＣＲプライマーがアニールする部位から考えて、ＰＣＲ産物をＸｂａで消化すると、センス方向で挿入されている場合には、１．２ｋｂと０．５ｋｂのＤＮＡ断片が、アンチセンス方向の場合には、２つの８５０ｂｐの断片が生成すると期待される（図１０）。両者のＴ１植物のゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物と、形質転換に使用したｃＤＮＡを有する２つのバイナリベクターのＰＣＲ産物をＸｂａＩで消化し、続いて３２ＰラベルしたｃＤＮＡプローブを使ってサザンハイブリダイズ分析を行った（図１１）。
図１１中、１は、アンチセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターのＰＣＲ産物、２はセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターのＰＣＲ産物、３はセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物、４はアンチセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノムＤＮＡのＰＣＲ産物を示す。
図１１では、期待されるサイズのハイブリダイズバンドがそれぞれのサンプルて検出された。この結果は、センス及びアンチセンス方向で形質転換した植物（Ｔ１）のゲノム中に、ｃＤＮＡはそれぞれの期待された方向性をもって組み込まれていることを示している。
実施例 ６
カランコエへの本発明遺伝子の導入：
長さ１０〜１３ｃｍのカランコエ成熟葉を茎から切り取った。実体顕微鏡を用いて、この葉の周辺の切れ込みの一番奥にある分裂細胞のまわりの表皮細胞と葉肉細胞ならびに分裂細胞直上の表皮細胞に針で数カ所穴を開けた。
この葉に、実施例１（３）で得た、センス方向にＭＡＤＳ遺伝子を導入したアグロバクテリウム・チューメハシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の水懸濁液（１．０×１０８個／ｍｌ）をパスツールピペットを用い、１摘づつ１つの切れ込み部分に接種した。次いで室温に３０分間程度放置して乾かした。この葉をプラスチックケースに入れた湿ったバーミキュライトの上にのせ、蓋を閉めて２５℃でインキュベートした（明所８時間、暗所１６時間のサイクル）。
カランコエの葉の上記処理した部分より新しい芽と根が出、これが発達するので、４週間後に元の葉から切り離し、写真撮影した。対照としては、非形質転換体であるＡ・チューメハシエンスで処理したものおよびＭＡＤＳ遺伝子の代わりにＧＵＳ遺伝子（β−グルクロニダーゼ遺伝子）を導入したＡ・チューメハシエンスで処理したものを用いた。この結果を図１２に示す。
ＭＡＤＳボックス遺伝子で形質転換した株は根部付近から葉の展開が見られたが、対照の非形質転換体およびＭＡＤＳ遺伝子の代わりにＧＵＳ遺伝子を導入した株ではこのような現象は認められなかった。この結果は、ソバを用いた試験結果と同様に、該ＭＡＤＳボックス遺伝子が分枝を制御している遺伝子であることを示している。ソバだけでなく種の異なるカランコエでも、該ＭＡＤＳボックス遺伝子が分枝を促進したことから、該遺伝子は植物全般の分枝を制御できる遺伝子であると考えられる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明で用いるセンスベクターの構築順序の前半を示す図である。
第２図は本発明で用いるセンスベクターの構築順序の後半を示す図である。
第３図は本発明で用いるアンチセンスベクターの構築順序の前半を示す図である。
第４図は本発明で用いるアンチセンスベクターの構築順序の後半を示す図である。
第５図は本発明遺伝子をセンスおよびアンチセンス向きで導入したソバの外観を示す写真である。
第６図は本発明遺伝子をセンスおよびアンチセンス向きで導入したソバの外観と、無処理のソバの外観を対比した写真である。
第７図は本発明遺伝子をセンス向きで導入したソバ（Ｔ１）のゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
第８図は本発明遺伝子をアンチセンス向きで導入したソバ（Ｔ１）のゲノムサザンハイブリダイゼーションの結果を示す図である。
第９図はゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことを確認した電気泳動の結果を示す図である。
第１０図はＭＡＤＳ遺伝子がセンスおよびアンチセンス方向に組み込まれた本発明遺伝子を模式的に示した図である。
第１１図はゲノム中に組み込まれたｃＤＮＡの方向性を確認するためのサザンハイブリダイズ分析の結果を示す図である。
第１２図は本発明遺伝子をセンス向きで導入したカランコエの外観を、ＧＵＳ遺伝子導入カランコエおよび無処理カランコエの外観と対比した写真である。
Claims (8)
- 次のペプチド
MetGlyArgGlyLysValGlnLeuLysArgIleGluAsnLysIleAsnArgGlnValThr
PheSerLysArgArgAsnGlyLeuLeuLysLysAlaHisGluIleSerValLeuCysAsp
AlaGluValAlaAlaIleValPheSerProLysGlyLysLeuTyrGluTyrAlaThrAsp
SerArgMetAspLysIleLeuGluArgTyrGluArgTyrSerTyrAlaGluLysAlaLeu
IleSerAlaGluSerGluSerGluGlyAsnTrpCysHisGluTyrArgLysLeuLysAla
LysIleGluThrIleGlnLysCysHisLysHisLeuMetGlyGluAspLeuGluSerLeu
AsnLeuLysGluLeuGlnGlnLeuGluGlnGlnLeuGluSerSerLeuLysHisIleIle
SerArgLysSerHisLeuMetLeuGluSerIleSerGluLeuGlnLysLysGluArgSer
LeuGlnGluGluAsnLysAlaLeuGlnLysGluLeuValGluArgGlnLysAsnValArg
GlyGlnGlnGlnValGlyGlnTrpAspGlnThrGlnValGlnAlaGlnAlaGlnAlaGln
ProGlnAlaGlnThrSerSerSerSerSerSerMetLeuArgAspGlnGlnAlaLeuLeu
ProProGlnAsnIleCysTyrProProValMetMetGlyGluArgAsnAspAlaAlaAla
AlaAlaAlaValAlaAlaGlnGlyGlnValGlnLeuArgIleGlyGlyLeuProProTrp
MetLeuSerHisLeuAsnAla
をコードする遺伝子を植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれの調節方法。 - 次のアミノ酸配列
MetGlyArgGlyLysValGlnLeuLysArgIleGluAsnLysIleAsnArgGlnValThr
PheSerLysArgArgAsnGlyLeuLeuLysLysAlaHisGluIleSerValLeuCysAsp
AlaGluValAlaAlaIleValPheSerProLysGlyLysLeuTyrGluTyrAlaThrAsp
SerArgMetAspLysIleLeuGluArgTyrGluArgTyrSerTyrAlaGluLysAlaLeu
IleSerAlaGluSerGluSerGluGlyAsnTrpCysHisGluTyrArgLysLeuLysAla
LysIleGluThrIleGlnLysCysHisLysHisLeuMetGlyGluAspLeuGluSerLeu
AsnLeuLysGluLeuGlnGlnLeuGluGlnGlnLeuGluSerSerLeuLysHisIleIle
SerArgLysSerHisLeuMetLeuGluSerIleSerGluLeuGlnLysLysGluArgSer
LeuGlnGluGluAsnLysAlaLeuGlnLysGluLeuValGluArgGlnLysAsnValArg
GlyGlnGlnGlnValGlyGlnTrpAspGlnThrGlnValGlnAlaGlnAlaGlnAlaGln
ProGlnAlaGlnThrSerSerSerSerSerSerMetLeuArgAspGlnGlnAlaLeuLeu
ProProGlnAsnIleCysTyrProProValMetMetGlyGluArgAsnAspAlaAlaAla
AlaAlaAlaValAlaAlaGlnGlyGlnValGlnLeuArgIleGlyGlyLeuProProTrp
MetLeuSerHisLeuAsnAla
において１〜数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列からなるペプチドをコードする遺伝子を植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれの調節方法。 - 次の塩基配列
ctcctcctcc tcttcttctt cttccactag ctagttcgtc ttcctccttc agctagcttg
tagcagctaa ggttaggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc
gaggatgggg cgggggaagg tgcagctgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt
gacgttctcc aagaggagga atggattgct gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg
cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac
tgactccagg atggacaaaa tccttgaacg ttatgagcgc tattcatatg ctgaaaaggc
tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaattggtgc catgaataca ggaaacttaa
ggcaaagatt gagaccatac aaaaatgtca caaacacctc atgggagagg atctagaatc
cctgaatctc aaagaactcc aacagctaga gcagcagctg gagagttcat tgaagcacat
aatatcaaga aagagccacc ttatgcttga gtccatttcc gagctgcaga aaaaggagag
gtcactgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaactg gtggagaggc agaagaatgt
gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc
ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg ctgagggatc agcaggcact
tcttccacca caaaatatct gctacccgcc ggtgatgatg ggcgagagaa atgatgcggc
ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtcttccgcc
atggatgctg agccacctca atgcttaaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag
ctgccgtatg caccgtgaat catgggagca accttgaatg aattgaagtc attggtatcg
atcctagcga taatatatat gattctccta aaatgaaatt gatctcaaaa aaacaaacct
agcgattaag ctattcttat atatgtgttt gcctgctgcc ccctacccta caggctacat
atgatttgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtctttgtg taatcatcag
cacgtaccta gtgcttccta ctgatatata tgcatgcaat tgtgtgcata taaatatatt
tgcatgccat gctcccgtga tggttaatt
で表される遺伝子を植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれの調節方法。 - 請求項１〜３に記載の遺伝子をベクターに組み込み、これを宿主微生物を介して植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれの調節方法。
- 請求項１〜３に記載の遺伝子をセンス方向で植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれを促進する方法。
- 請求項１〜３に記載の遺伝子をアンチセンス方向で植物に導入することを特徴とする植物の枝分かれを抑制する方法。
- 請求項５に記載の方法で形質転換されることにより枝分かれが促進されている植物。
- 請求項６に記載の方法で形質転換されることにより枝分かれが抑制されている植物。
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