WO2001014559A1 - Gene de regulation de la ramification des plantes, vecteur contenant ledit gene, micro-organisme transforme par ledit vecteur, et procede de regulation de la ramification des plantes utilisant ledit micro-organisme - Google Patents

Gene de regulation de la ramification des plantes, vecteur contenant ledit gene, micro-organisme transforme par ledit vecteur, et procede de regulation de la ramification des plantes utilisant ledit micro-organisme Download PDF

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Takuji Sasaki
Masayuki Nozue
Hidenari Shioiri
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Kumiai Chemical Industry Co., Ltd.
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    • Y02A40/10Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Definitions

  • Plant branching regulatory gene Plant branching regulatory gene, vector containing the gene, microorganism transformed with the vector, and method of regulating plant branching using the microorganism
  • the present invention relates to a plant branching regulation gene, a vector containing the gene, a microorganism transformed by the vector, and a method for regulating plant branching using the microorganism.
  • Conventional technology a plant branching regulation gene, a vector containing the gene, a microorganism transformed by the vector, and a method for regulating plant branching using the microorganism.
  • the maize tbI gene is known to control branching (J. Doebley et al., "Nature”, 485-488 (1997)), but it is a gene that suppresses branching.
  • a gene that promotes branching only the zinc finger gene has been reported so far (H. Takatsuji, "Plant Mol. Biol, (review)", in press (1999) and Hiroshi Takatsuji , “Chemistry and Biology", Vol. 37, pp. 287-289, (1999)).
  • promoting branching enhances the value of ornamental or agricultural plants, and is an important technology in the field of agriculture and horticulture.
  • the above-mentioned technology can be applied to all plants and does not necessarily show excellent results, it is strongly desired to develop a technology for promoting another new branch.
  • it is common practice to suppress plant growth and produce short stature dwarf plants, and it is also required to provide a technique that can easily perform this using genetic manipulation techniques.
  • the present invention has been made under the above-mentioned technical level, and an object thereof is to provide a technique for controlling branching of plants such as ornamental plants and agricultural plants. . Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted various searches to find a gene that controls plant branching, and found that the rice MADS box gene has an effect of regulating plant branching.
  • the present invention provides a plant branching regulatory gene comprising the rice MADS box gene or a gene homologous thereto.
  • the present invention also provides a vector incorporating the above gene and a microorganism transformed with the vector.
  • the present invention provides a method for regulating plant branching, comprising incorporating a rice MADS box gene or a gene homologous thereto into a vector and introducing the vector into a plant via a host microorganism. is there.
  • FIG. 1 is a diagram showing the first half of the construction order of the sense vector used in the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing the latter half of the construction order of the sense vector used in the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing the first half of the construction order of the antisense vector used in the present invention.
  • FIG. 4 is a diagram showing the latter half of the construction order of the antisense vector used in the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph showing the appearance of buckwheat into which the gene of the present invention has been introduced in sense and antisense directions.
  • FIG. 6 is a photograph comparing the appearance of buckwheat into which the gene of the present invention has been introduced in the sense and antisense directions and the appearance of untreated buckwheat.
  • FIG. 7 shows the results of genomic Southern hybridization of buckwheat (T 1) into which the gene of the present invention has been introduced in a sense orientation.
  • FIG. 8 is a view showing the results of genomic Southern hybridization of buckwheat (T 1) into which the gene of the present invention has been introduced in an antisense orientation.
  • FIG. 9 shows the results of electrophoresis in which it was confirmed that the gene of the present invention was integrated into the genome.
  • FIG. 10 is a diagram schematically showing the gene of the present invention in which the MADS gene is integrated in sense and antisense directions.
  • FIG. 11 shows the results of Southern hybridization analysis for confirming the direction of the cDNA integrated into the genome.
  • FIG. 12 is a photograph in which the appearance of Kalanchoe into which the gene of the present invention has been introduced in a sense orientation is compared with the appearance of GANS gene-introduced Kalanchoe and untreated Kalanchoe.
  • the gene used as a plant branching regulatory gene is rice M It contains the ADS box gene or a gene homologous thereto.
  • the rice MADS box gene has the following nucleotide sequence. c tcctcc tec tct tct tct tct tccac tag ctagt tcgtc ttcctcct tc age tagc t tg tagcagc taa ggt taggtcg ga tcgagat c gggatcggcc gccggcgagcggcgagcggc gaggatgggggg cgggggaagg tgcagc tgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt gacgt tc tec aagaggagga atggat tgct gaagaaggcg cacgagatc t ccgtccc
  • MADS of the MADS gene is an acronym for the gene M for yeast MCM1, M for plant AG AMOUS A, D for plant DEFICIENS, and S for human serum response factor SRF. It is found across species as having a sequence. These genes are transcription factor's (genes that regulate DNA so that DNA is transcribed into mRNA), similar to the homeotic genes of genes involved in morphogenesis of organisms.
  • MADS genes of plants other than rice are genes involved in flower morphogenesis, and nothing is known about regulating plant branching.
  • a plant branching regulatory gene (hereinafter, referred to as "the gene of the present invention") is incorporated into a vector, and this is introduced into a plant via a suitable host microorganism to regulate plant branching. More specifically, an expression plasmid is constructed by operably linking a promoter capable of functioning in plant cells with a gene of the present invention and a terminator capable of functioning in plant cells, and introducing this into a plant cell. To transform the plant cells.
  • Promoters used for the above purpose include, for example, C a MV 35 S A promoter and a nopaline synthase promoter can be used, but are not limited thereto.
  • enhancers can be used for high expression of gene products.
  • the enhancer for example, the enhancer contained in the sequence of the upstream region of the base sequence of the Ca MV35S promoter can be used. More than one enhancer can be used.
  • the terminator include a CaMV35S terminator and a nopaline synthase terminator, but are not limited thereto.
  • a selection marker gene can be used to facilitate selection of transformed microorganisms and transformed plants.
  • selection marker used examples include a neomycin phosphotransferase 2 (MPT 2) gene, a hygromycin phosphotransferase (HPT) gene, and the like.
  • MPT 2 neomycin phosphotransferase 2
  • HPT hygromycin phosphotransferase
  • a vector such as a PBI system or a pUC system can be preferably used.
  • pBI vectors include pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3, and pUC vectors, for example, pUCI 8, pUC19, pUC9 and the like.
  • vectors such as PTO K162 developed for transformation of monocotyledonous plants can also be used.
  • Examples of a method for transforming a plant with the above-described vector incorporating the gene of the present invention include an agrobacterium method, a polyethylene glycol method, an electoporation method, and a particle gun method.
  • the agrobacterium method is a method of introducing a gene into a plant cell by co-culturing an agrobacterium containing a vector having a recombinant gene with a cultured plant cell.
  • a method of spraying, applying, or injecting a solution containing agropacterium near the plant growth point is also useful. Can be used. At this time, it is preferable to damage the plant.
  • the regulation of branching according to the method of the present invention can be achieved by introducing a gene into a cell, tissue or organ, and directly introducing the gene into a plant or plant in which a method for regenerating the cell, tissue or organ has been established. Can be applied to any plant as long as it is possible. Specifically, an agrobacterium suspension having a vector incorporating the gene of the present invention at the callus or growth point is treated, or the vector incorporating the gene of the present invention is directly transferred to cells or cells by a particle gun method.
  • transformants After being implanted into the tissue, transformants are selected and grown into plants, for example, ornamental plants such as chrysanthemums, lilies, carnations, tulips, roses, orchids, soybeans, petals, rice, corn, Transgenic plants of agricultural plants such as wheat and cereal can be obtained.
  • ornamental plants such as chrysanthemums, lilies, carnations, tulips, roses, orchids, soybeans, petals, rice, corn
  • Transgenic plants of agricultural plants such as wheat and cereal can be obtained.
  • the present invention is a technique for producing a plant having a new property.
  • the number of branches of an ornamental plant or an agricultural plant is increased, and the value of the ornamental plant is increased. It is effective for increasing the yield of working plants.
  • a vector incorporating the rice MADS box gene in the sense direction was obtained by replacing the / 3-Darctic nidase (GUS) gene in a binary vector (pBI121) obtained from Toyobo by the following method. It was constructed by replacing the sense direction cDNA (1.3 kb) of the MADS box gene (DDBJ access number AB0303325).
  • pBluescript SK + M plasmid in which the MA DS box gene was inserted in the 5 'to 3' direction at the restriction sites of Sa II and Not I in the direction of restriction enzyme was digested with SaII, blunt-ended, and further digested with SacI. This was subjected to electrophoresis, and a 1.3 kB DNA fragment was recovered.
  • a 3.1 kb DNA fragment derived from pBI121 (containing the CaMV35S promoter, GUS gene and Nos terminator) was placed at the restriction sites of Hindlll and EcoRI.
  • P UCI8 plasmid (corresponding to Toyobo's pBI221 from Nippon Gene) into which the DNA was inserted was digested with Smal and Sacl. This was subjected to agarose electrophoresis, and a 4.0 kb DNA fragment was recovered.
  • pBI221-M plasmid The 1.3 kb fragment and the 4.0 kb fragment were ligated to obtain a pBI221-M plasmid, which was introduced into E. coli (JM109). From the positive colonies of E. coli, pBI221-M plasmid was isolated and digested with BamHI and SacI to recover 1.3 kb cDNA. The thus obtained cDNA having BamHI and SacI digested ends is digested with BamHI and SacI to obtain GU. This was ligated with the pBI122 plasmid from which the S gene had been removed to obtain a pBII21-MS vector (hereinafter, referred to as "sense vector J”) in which the rice MADS box gene was inserted in the sense direction.
  • sense vector J pBII21-MS vector
  • the pBI121-MA vector in which the GUS gene was replaced with cDNA in the antisense direction was prepared by the following method. First, p BI uescript SK + — M plasmid with cDNA inserted in the 5 'to 3' direction at the SaII restriction site and the NotI restriction site was digested with NotI. After blunt-end, it was further digested with KpnI. This was subjected to electrophoresis, and a 1.3 k ⁇ DNA fragment was recovered.
  • the pUC18 plasmid was digested with BamHI, blunt-ended, and further digested with KpnI. This was subjected to electrophoresis, and a 2.6 kb DNA fragment was recovered. This was ligated with the above 1.3 kb fragment to obtain pUCI8-M plasmid, which was then introduced into E. coli (HB101).
  • the pUC18-1M plasmid was isolated from the positive colonies of E. coli and digested with SacI and XbaI to obtain 1.31 ⁇
  • This cDNA was ligated to the pBI121 vector digested with SacI and XbaI to obtain a pBI122-MA vector (hereinafter, referred to as "anti- Sense vector).
  • A. tumefaciens LBA4444 obtained from Toyobo Co., Ltd. was used as the host microorganism.
  • the introduction of the vector obtained in the above (1) or (2) into this microorganism was carried out by the method described previously (M. Holster et al., "Mol. Gen. Gene", 163, 18-187 (1978). )).
  • Microorganisms after introduction were kanamycin (50 mg / mI) and rifampicillin (rifampicin).
  • the cells were cultured in an LB medium supplemented with 50 ⁇ g / ml of cin) I and streptomycin (strep totnycin) at 28 ° C. for 18 hours. After completion of the culture, by centrifugation collected Li cells, washed with water, suspended in water (1 .0 X 1 0 ⁇ cells / / m I) and which was used to inoculate the plant.
  • Each inoculated buckwheat is 50 seedlings, and after placing them at a temperature of 22 ° C and in the dark for 3 days, in a growth chamber, at 30 ° C, about 4,000 Grew up with Lu X lighting for 8 hours.
  • Buckwheat has two types of flowers with different style lengths of about 1.8 mm and 0.6 mm (heterostyrism; heterophyllism), and only pollination between flowers of different types is fertilized. Therefore, in order to obtain seeds (T1 plants), flowers of transgenic plants (T 0) and flowers of different types of untransformed plants were pollinated.
  • Figure 5 shows that the gene of the present invention was introduced in the sense and antisense orientations.
  • the appearance of buckwheat is shown.
  • 1 in (A) is untreated buckwheat
  • 2 in (A) is A. harboring the pBI122 vector (GUS gene)
  • buckwheat treated with Tumehaciens
  • (A ) 3 is buckwheat treated with A. tumehasiensis carrying a sense vector
  • (A) 4 is buckwheat treated with A. tumehasienci carrying an antisense vector. Months later I took a picture.
  • the bar in the photo is a 30 cm ruler.
  • FIG. 5 shows the buckwheat having the highest expression phenotype (degree of branching) among the buckwheat having the gene of the present invention inserted in the sense orientation. This picture was taken six months after the plants had grown and withered.
  • Figure 6 In both buckwheat in which the present invention gene was introduced in the sense direction and buckwheat in which the present invention gene was introduced in the antisense direction, about half of the progeny individuals (10 individuals) had the trait of each T 0 plant.
  • T 1 Nuclear Phytopure DNA extraction kit (Amersham Pharmacia Biotec) from the seedling or mature plant obtained in Example 2 ) was used to extract genomic DNA according to the instructions.
  • the extracted DNA was further purified by the following method. That is, dissolve the DNA in 10 mM Tris-HCI buffer (pH 8.0) containing 500 I of ImM EDTA, and combine with 2 I RNase (Nippon Gene, lOmg / ml). And incubated at 37 ° C for 45 minutes.
  • the DNA-transferred membrane was first purified with 5 XD enhardt's, 5 XSSPE solution containing 0.5% SDS and 20 g / mI salmon sperm DNA (0.1 M NaCI, 1 M The prehybridization was carried out at 65 ° C. for 1 hour in a solution of pH 7.7 consisting of 0 mM sodium phosphate and 1 m MEDTA.
  • the probe labeled with 32 P was added to the prehybridization solution, and hybridization was performed at 65 ° C. for 18 hours.
  • the membrane was washed twice in a 2 XSSPE solution containing 0.1% SDS at 20 ° C for 10 minutes. Then, wash once in a 1 XSSPE solution containing 0.1% SDS at 65 ° C for 15 minutes, and finally wash in a 0.1 XSSPE solution containing 0.1% SDS with 6.5 10 Washed twice for 2 minutes.
  • the DNA band hybridized with the probe was imaged using an image analyzer (Molecular Dynamics). The results are shown in FIGS. 7 and 8.
  • FIG. 7 shows progeny of buckwheat into which the gene of the present invention was introduced in the sense direction
  • FIG. 8 shows the gene of the present invention.
  • 1 is the result of EcoRI digestion of untreated buckwheat
  • 2 is the result of EcoRI digestion of the transformant
  • 3 is the result of EcoRI digestion. Shows the result after digestion of the transformant with XhoI
  • 5 shows the result after digestion of the transformant with XalI
  • 5 shows the result after digestion of the transformant with SalI.
  • Two PCR primers, P1 and P2, were designed for amplification of the cDNA integrated into the genome.
  • P1 5'—ACAATCCCACTATCCTTCGC-3 'P2: 5'-GTCACGACGTTGT AA AACGA-3 'PI is the C a MV35 located upstream of the GUS gene in the original pBI121 binary vector.
  • P2 corresponds to the sequence near the light border of T-DNA located downstream of the GUS gene in the original pBI121 binary vector.
  • the genomic DNA (1-2 I, 500 ng) prepared in Example 3 (1) was mixed with a reaction solution (50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 1.5 mm MM g Ch, 200 M nucleotides, 0.2 / z M of the above primers, and 1.25 units of Taq polymerase (Takara). Were performed for 30 seconds at 94 ° C, 45 seconds at 58 ° C, 30 seconds at 72 ° C, and then 10 minutes at 72 ° C. The gel was electrophoresed on a gel (1%), and after the amplification reaction, the reaction solution was directly subjected to electrophoresis. After the electrophoresis, the reaction solution was stained with ethidium gel.
  • a reaction solution 50 mM KCI, 10 mM Tris-HCI (pH 8.3), 1.5 mm MM g Ch, 200 M nucleotides, 0.2 / z M of the above primers, and 1.25 units of Taq
  • FIG. 1 is a DNA size marker
  • 2 is a PCR product of a vector in which the gene of the present invention is inserted in the sense direction
  • 3 is a PCR product of genomic DNA derived from a plant transformed with the gene of the present invention in the sense direction
  • 4 is The PCR product of the plant-derived genomic DNA transformed with the gene of the present invention in the antisense direction is shown. From FIG. 9, it was revealed that a DNA fragment of the expected size (1.7 kb) was amplified for both genome DNAs, and that the complete sequence of the cDNA was integrated into both T1 plants.
  • Example 5 is a DNA fragment of the expected size (1.7 kb) was amplified for both genome DNAs, and that the complete sequence of the cDNA was integrated into both T1 plants.
  • FIG. 11 1 is the PCR product of the vector in which the gene of the present invention is inserted in the antisense direction
  • 2 is the PCR product of the vector in which the gene of the present invention is inserted in the sense direction
  • 3 is the gene of the present invention in the sense direction.
  • 4 represents a PCR product of a plant-derived genomic DNA transformed with the gene of the present invention in the antisense direction.
  • the expected size of the hybridized band was detected in each sample. This result indicates that the cDNA was integrated in the genome of the plant (T 1) transformed in the sense and antisense directions with the expected orientation.
  • Example 6 Example 6
  • Mature Kalanchoe leaves of 10 to 13 cm in length were cut from stems. Using a stereomicroscope, needles were used to make several holes in the epidermal cells and mesophyll cells around the dividing cells at the innermost part of the cut around the leaves and the epidermal cells immediately above the dividing cells.
  • A. tumefaciens having the MADS gene introduced in the sense direction obtained in Example 1 (3) (1.0 X) was added to the leaves. 1 0 8 m I) using Pasutsurupipe' Bok was inoculated into 1 hysterectomy Dzu' one notch portion. Then, it was left to dry at room temperature for about 30 minutes. The leaves were placed on a wet vermiculite placed in a plastic case, the lid was closed, and the plate was incubated at 25 ° C (8 hours light, 16 hours dark).
  • the MADS box gene is a gene that controls branching, similar to the test result using buckwheat.
  • MADS box not only for buckwheat but also for different kinds of kalanchoe Since the gene promoted branching, it is considered that the gene is a gene that can control branching of plants in general.

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Description

明 細 書 植物の分枝調節遺伝子、 当該遺伝子を含有するベクターおよび当該ベクターによ り形質転換された微生物並びに当該微生物を利用する植物の枝分かれの調節方法
技術分野
本発明は、 植物の分枝調節遺伝子、 当該遺伝子を含有するベクターおよび当該 ベクターにより形質転換された微生物並びに当該微生物を利用する植物の枝分か れの調節方法に関する。 従来の技術
観賞用植物や、 農業用植物において、 株分かれを多くすることは、 鑑賞用植物 の価値を高め、 また農業用植物での収量を高めることができるので好ましいこと である。 従って、 種々の植物について、 分枝を多くするための技術が求められて いる。
分枝を制御する遺伝子としてトウモロコシの t b I遺伝子が知られている (J. Doebley et al. , "Nature", 485-488 (1997)) が、 これは分枝を抑制する遺伝子 である。 一方、 分枝を促進する遺伝子としては、 従来、 ジンクフィンガー遺伝子 が報告されているに過ぎなかった ( H.Takatsuj i, "Plant Mol. Biol, (review)", in press (1999)および高辻博志、 「化学と生物」、 第 3 7巻、 第 2 8 7 — 2 8 9 頁、 ( 1 9 9 9 ))。
上記のように、 分枝を促進することは、 観賞用植物あるいは農業用植物につい ての価値を高めるものであり、 農園芸の分野での重要な技術といえる。 しかしな がら、 前記の技術が全ての植物に適用でき、 優れた結果を示すとまではいえない 以上、 別の新たな分枝を促進する技術の開発が強く望まれる。 また、 別に植物の成長を抑え、 背丈の低い矮性の植物を作出する事もよく行わ れており、 これを遺伝子操作の手法を用いて簡単に行う技術の提供も求められて いる。
現在、 このような植物の矮性を支配する遺伝子としては、 シロイヌナズナの染 色体 D N Aから得た遺伝子他いくつかが知られている程度である (特開平 9 一 5 6 3 8 2号)。
本発明は、上記のような技術水準下に於いてなされたものであり、観賞用植物、 農業用植物等の植物についてその分枝を調節する技術を提供することをその課題 とするものである。 発明の開示
本発明者らは、 植物の枝分かれを支配する遺伝子を見出すべく、 種々検索を行 つていたところ、 イネ M A D Sボックス遺伝子に植物の枝分かれを調節する作用 があることを見出した。
そして、 この遺伝子をベクターに組み込み、 これを適当な宿主微生物を介して 導入した植物は、 その発現方向に応じて枝分かれを促進したり、 逆に矮性化する ことを見出し、 本発明を完成した。
すなわち本発明は、 イネの M A D Sボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子 を含むことを特徴とする植物の分枝調節遺伝子を提供するものである。
また本発明は、 上記遺伝子を組み込んだベクターおよび当該ベクターで形質転 換した微生物を提供するものである。
更に本発明は、 イネ M A D Sボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子をべク ターに組み込み、 これを宿主微生物を介して植物に導入することを特徴とする植 物の枝分かれの調節方法を提供するものである。 図面の簡単な説明
第 1 図は本発明で用いるセンスベクターの構築順序の前半を示す図である。 第 2図は本発明で用いるセンスベクターの構築順序の後半を示す図である。 第 3図は本発明で用いるアンチセンスベクターの構築順序の前半を示す図であ る。
第 4図は本発明で用いるアンチセンスベクターの構築順序の後半を示す図であ る。
第 5図は本発明遺伝子をセンスおよびアンチセンス向きで導入したソバの外観 を示す写真である。
第 6図は本発明遺伝子をセンスおよびアンチセンス向きで導入したソバの外観 と、 無処理のソバの外観を対比した写真である。
第 7図は本発明遺伝子をセンス向きで導入したソバ (T 1 ) のゲノムサザンハ イブリダイゼーションの結果を示す図である。
第 8図は本発明遺伝子をアンチセンス向きで導入したソバ (T 1 ) のゲノムサ ザンハイブリダィゼーシヨンの結果を示す図である。
第 9図はゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことを確認した電気泳動の結 果を示す図である。
第 1 0図は M A D S遺伝子がセンスおよびアンチセンス方向に組み込まれた本 発明遺伝子を模式的に示した図である。
第 1 1 図はゲノム中に組み込まれた c D N Aの方向性を確認するためのサザン ハイブリダィズ分析の結果を示す図である。
第 1 2図は本発明遺伝子をセンス向きで導入したカランコェの外観を、 G U S 遺伝子導入カランコェおよび無処理カランコェの外観と対比した写真である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 植物の分枝調節遺伝子として用いられる遺伝子は、 イネの M A D Sボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子を含むものである。 イネの M A D Sボックス遺伝子は、 次の塩基配列で示されるものである。 c tcctcc tec tct tct tct t c t tccac tag ctagt tcgtc ttcctcct tc age tagc t tg tagcagc taa ggt taggtcg ga tcgagat c gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc gaggatgggg cgggggaagg tgcagc tgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt gacgt tc tec aagaggagga atggat tgct gaagaaggcg cacgagatc t ccgtcc tc tg cgacgccgag gtcgccgcca tcgtct tctc ccccaagggc aagc tc tacg agtacgccac tgac tccagg a tggacaaaa tec t tgaacg t ta tgagcgc tat t ca ta tg c tgaaaaggc tct tat t tea gc tgaatccg agagtgaggg aaa t tggtgc catgaa taca ggaaact taa ggcaaaga 11 gagaccatac aaaaatgtca caaacacc tc a tgggagagg ate tagaatc cc tgaatc tc aaagaac tec aacagc taga gcagcagc tg gagagt teat tgaagcaca t aata tcaaga aagagccacc t tatgcttga gtccat 11 cc gage tgcaga aaaaggagag gtcac tgcag gaggagaaca aggc tctgca gaaggaac tg gtggagaggc agaagaa tgt gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc ccaaccccaa gcccagacaa gc tcctcctc ctcc tccatg c tgaggga tc agcaggcac t tct tccacca caaaatatc t gc tacccgcc ggtga tga tg ggcgagagaa a tga tgcggc ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaactc cgcatcggag gtc t tccgcc atgga tgctg agccacc tea atgct taaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag c tgccgta tg caccgtgaa t ca tgggagca acc t tgaatg aa t tgaagtc a t tggta tcg a tec tagcga taa ta ta ta t gat tctccta aaatgaaa 11 gate tcaaaa aaacaaacc t agcga t taag c tat tct tat atatgtgt 11 gcctgctgcc ccc tacccta caggctacat a tgat t tgca agaaa t taa t ta tgagcaag gat cagga tg tgtc 11 tgtg taa tcatcag cacgtacc ta gtgc t tec ta c tgatatata tgca tgcaat tgtgtgcata taaa tatat t tgcatgcca t gc tcccgtga tggt taatt また、 上記遺伝子と相同な遺伝子とは、 塩基配列の一部に置換、 欠失、 挿入等 が存在する結果同一ではないが、 その遺伝子の奏する機能において同等と見なせ る範囲のものをいう。 上記遺伝子によりコードされるアミノ酸のうち、 後記式で示されるペプチドの 部分がトランスクリブションファクタ一として枝別れを調節するものと解され る。
20
MetGlyArgGlyLysValGl nLeuLysArgl leGl uAsnLysl l eAsnArgGlnValThr
40 PheSerLysArgArgAsnGlyLeuLeuLysLysAlaHisGlul leSerValLeuCysAsp
60
AlaGluValA!aAlal leValPheSerProLysGlyLysLeuTyrGluTyrAlaThrAsp
80 SerArgMetAspLys I I eLeuGluArgTy rGluArgTyrSerTyrAI aGI uLysAI aLeu
100
I l eSerAl aGluSerGluSerGluGlyAsnTrpCysHisGl uTyrArgLysLeuLysAla
120
Lys I I eGI uThr I I eGI nLysCysHi sLysHi sLeuMetGI yGI uAspLeuGI uSerLeu
140 AsnLeuLysGl uLeuGl nGl nLeuGluGl nGl nLeuGluSerSerLeuLysHis l lei I e
160
SerArgLysSerHi sLeuMetLeuGluSerl leSerGluLeuGl nLysLysGluArgSer
180 LeuGI nGI uGI uAsnLysAI aLeuGI nLysGI uLeuVal Gl uArgGI nLysAsnVa lArg
200 n
220
240
ProProGI nAsnl I eCysTyrProProVal et etGI yGI uArgAsnAspAI aAI aAI a
260
AlaAlaAlaValAlaAlaGl nGlyGlnValGlnLeuArgl l eGlyGlyLeuProProTrp
267
MetLeuSerHisLeuAsnAla ところで、 M A D S遺伝子の M A D Sは、 酵母菌の M C M 1の M、 植物の AG A M O U Sの A、 植物の D E F I C I E N Sの D、 ヒ卜血清応答因子の S R Fの Sの遺伝子の頭文字であり、 共通の塩基配列を有するものとして、 種を超えて見 つかっている。 これらの遺伝子は生物の形態形成の関わっている遺伝子のホメォ ティック遺伝子と同様な卜ランスクリプシヨン ' ファクター (D N Aが m R N A へ転写されるように D N Aを制御する遺伝子) である。
そして、 イネ以外の植物の M A D S遺伝子は、 そのほとんどが花の形態形成に 関与する遺伝子であり、 植物の枝分かれを調節することについては全く知られて いないものである。
本発明において、 植物の分枝調節遺伝子 (以下、 「本発明遺伝子」 という) を ベクターに組み込み、 これを適当な宿主微生物を介して植物に導入し、 植物の枝 分かれを調節する。 より具体的には、 植物細胞内でも機能可能なプロモーターと 本発明遺伝子及び植物細胞内で機能可能なターミネータ一を機能可能な形で結合 させてなる発現プラスミドを構築し、 これを植物細胞に導入することにより植物 細胞を形質転換する。
上記の目的のために用いられるプロモーターとしては、 例えば C a M V 3 5 S プロモーター、 ノパリン合成酵素のプロモーターが利用できるが、 これに限定さ れない。 また、 遺伝子産物の高発現のためにはェンハンサーを用いることが出来 る。 ェンハンサ一としては、 例えば、 C a M V 3 5 Sプロモーター塩基配列の上 流領域の配列に含まれるェンハンサ一が利用できる。 ェンハンサ一は複数用いる ことができる。一方、 ターミネータ一としては、 C a M V 3 5 Sターミネータ一、 ノパリン合成酵素のターミネータ一などを挙げることができるが、 これに限定さ れるものではない。
本発明においては、 形質転換微生物及び形質転換植物の選抜を容易にするため に選抜マーカー遺伝子を利用することができる。
使用される選抜マーカーの例としては、 ネオマイシンフォスフォトランスフエ ラーゼ 2 ( M P T 2 ) 遺伝子、 ハイグロマイシンフォスフォトランスフェラーゼ ( H P T ) 遺伝子などが利用可能である。
また、 本発明方法において、 本発明遺伝子を組み込むために用いられるベクタ 一としては、 P B I系、 p U C系などのベクターを好ましく用いることができる。 p B I系のベクターとしては、 例えば、 p B I 1 2 1 、 p B I 1 0 1 、 p B I 1 0 1 . 2、 p B I 1 0 1 . 3などが、 p U C系のベクターとしては、 例えば、 p U C I 8、 p U C 1 9、 p U C 9などが挙げられる。
更に、 単子葉植物の形質転換用に開発された P T O K 1 6 2等のベクターも利 用できる。
上記の本発明遺伝子を組み込んだベクターで植物を形質転換する方法として は、 ァグロパクテリゥ厶法、 ポリエチレングリコール法、 エレクト口ポレーショ ン法、 パーティクルガン法等を使用することができる。
形質転換方法のうち、 ァグロバクテリウ厶法は、 組換え遺伝子を有するベクタ 一を含むァグロパクテリゥ厶を、 植物の培養細胞との共存培養することにより植 物細胞に遺伝子を導入する方法である。 さらにより簡便な方法として、 植物成長 点付近へのァグロパクテリゥ厶を含む液の散布または塗布、 注入などの方法も利 用できる。 この際、 植物体へ傷を付けることが好ましい。
本発明方法による枝分かれの調節は、 細胞、 組織、 器官への遺伝子の導入が可 能で、 細胞、 組織、 器官の再分化方法が確立されている植物、 もしくは植物体に 直接遺伝子を導入することが可能なものであれば、いずれの植物にも適用できる。 具体的には、 カルスや成長点に本発明遺伝子を組み込んだベクターを持つァグ ロバクテリウ厶懸濁液を処理するか、 あるいは本発明遺伝子を組み込んだベクタ 一をパーティクルガン法で直接的に細胞や組織に打ち込んだ後形質転換体を選抜 し植物体へと育成することにより、 例えば、 キク、 ユリ、 カーネーション、 チュ 一リップ、 バラ、 ランなどの観賞用植物、 ダイズ、 ヮタ、 イネ、 トウモロコシ、 コムギ、 才才厶ギなどの農業用植物の形質転換植物体を得ることができる。
本発明においては、 後記実施例で示すように、 本発明遺伝子をセンス方向で植 物中に組み込むか、 アンチセンス方向で植物中に組み込むかによつてその結果が 大きく異なる。 すなわち、 センス方向で組み込んだ場合は、 植物の分枝を促進す るが、 アンチセンス方向に組み込んだ場合は、 植物の生長を抑制し、 矮性化され る。 産業上の利用可能性
本発明の植物の分枝調節遺伝子は、 これを植物中に導入することにより、 植物 の分枝を促進したり、 矮性化させることが可能となる。 しかも、 この性質はその 子孫にも伝えられるものである。 従って、 本発明は、 新しい性質を有する植物を 作出するための技術であり、 特に、 観賞用植物や、 農業用植物等の植物について その分枝を増やし、 観賞用植物の価値を高め、 また農業用植物の収量を増大させ るために有効である。 実施例
次に実施例を挙げ本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれら実施例に何 ら制約されるものではない。 実 施 例 1
( 1 ) センス方向にイネ M A D Sボックス遺伝子を組み込んだベクターの構築 (図 1および図 2 ) :
センス方向にイネ M A D Sボックス遺伝子を組み込んだベクターは、 東洋紡 (株) から入手したバイナリベクター (p B I 1 2 1 ) 中の /3—ダルク口ニダ一 ゼ (G U S) 遺伝子を、 次の方法によりイネ M A D Sボックス遺伝子 (D D B J アクセス番号 A B 0 0 3 3 2 5 ) のセンス方向 c D N A ( 1 . 3 k b ) で置き換 えることにより構築した。
すなわち、 MA D Sボックス遺伝子を S a I I の制限酵素切断部位と N o t I の制限酵素切断部位に 5 'から 3 'の方向で挿入した p B l u e s c r i p t S K + Mプラスミ ド (鏖林水産省廣業生物資源研究所の D N Aバンクから入手) を S a I Iで消化し、 平滑末端 (blunt- end) ィ匕した後、 さらに S a c Iで消化した。 これを電気泳動にかけ、 1 . 3 k Bの D N A断片を回収した。
—方、 H i n d l l l と E c o R I の制限酵素切断部位に、 p B I 1 2 1 由来の 3. 1 k bの D N A断片 (C a M V 3 5 Sプロモーターおよび G U S遺伝子なら びに N o sターミネータ一を含む) を挿入した p U C I 8プラスミ ド (N i p p o n G e n e製 東洋紡の p B I 2 2 1 に相当する) を S m a l と S a c lで 消化した。 これをァガロース電気泳動にかけ、 4. 0 k bの D N A断片を回収し た。
先の 1 . 3 k bの断片とこの 4.0 k bの断片を結合させて、 p B I 2 2 1 — M プラスミドとし、 これを大腸菌 ( J M 1 0 9 ) へ導入した。 この大腸菌の陽性コ ロニーから p B I 2 2 1 — Mプラスミ ドを単離し、 B am H I と S a c Iで消化 することで、 1 . 3 k bの c D N Aを回収した。 このようにして得られた B a m H I と S a c I切断末端を持つ c D N Aを、 B a m H I と S a c l で消化し G U S遺伝子を除去した p B I 1 2 1 プラスミドと接合させ、 センス方向にイネ M A D Sボックス遺伝子を組み込んだ p B I I 2 1 — M Sベクター (以下、 「センス ベクター J という) を得た。
( 2 ) アンチセンス方向にイネ M A D Sボックス遺伝子を組み込んだベクターの 構築 (図 3および図 4) :
G U S遺伝子をアンチセンス方向の c D N Aで置き換えた p B I 1 2 1 - M A ベクターは次の方法で作製した。 まず、 S a I Iの制限酵素切断部位と N o t I の制限酵素切断部位に c D N Aが 5 'から 3 '方向に挿入されている p B I u e s c r i p t S K+— Mプラスミ ドを N o t Iで消化し、 平滑末端 ( b l u n t — e n d ) 化した後、 さらに K p n Iで消化した。 これを電気泳動にかけ、 1 . 3 k Βの D N A断片を回収した。
—方、 p U C 1 8プラスミドを B amH Iで消化し、 平滑末端化した後、 さら に K p n Iで消化した。 これを電気泳動にかけ、 2. 6 k bの D N A断片を回収 した。 これを先の 1 . 3 k bの断片と結合させて p U C I 8— Mプラスミ ドとし た後、 大腸菌 (H B 1 0 1 ) に導入した。 この大腸菌の陽性コロニーから p U C 1 8一 Mプラスミドを単離し、 S a c I と X b a Iで消化することにより、 S a c I と X b a I の切断末端を持つ 1 . 3 1< |3の0 0 を得た。 この c D N Aを S a c I と X b a Iで消化した p B I 1 2 1 ベクターに結合させることによリア ンチセンス方向にイネ M A D Sボックス遺伝子を組み込んだ p B I 1 2 1 - M A ベクター (以下、 「アンチセンスベクター」 という) を得た。
( 3 ) 宿主微生物へのベクターの導入:
宿主微生物としては、 東洋紡 (株) から入手したァグロバクテリウ厶 ·チュー メハシエンス (A. tumefaciens) L B A 4 4 0 4 ) を用いた。 この微生物への上 記 ( 1 ) または (2 ) で得たベクターの導入は、 既報の方法によっておこなった (M. Holster et al . , "Mol . Gen. Gene" , 163, 18卜 187 (1978) )。 導入後の微生 物は、 カナマイシン (kanamycin) 5 0 M g /m I , リファンピシリン ( r i f amp i cin) I ならびにストレプトマイシン (strep totnycin) 5 0 μ g / m I を加えた L B培地で、 2 8°C、 1 8時間培養した。 培養終了後、 遠心分離に よリ細胞を集め、 水で洗浄した後、 水に懸濁 ( 1 .0 X 1 0β細胞/ /m I ) して、 植物への接種に使用した。
(4 ) 植物への接種:
ソノ、' (Fagopy rum escu I entum var. Sh i nano i ch i go) 種子を次亜塩素酸ソータ で殺菌し、 植木鉢中の土に播いた。 鉢は 2 5°Cの温度で、 8時間明、 1 6時間暗 の条件に置いた。 播種 4 ~ 5日後、 植物体の 2枚の子葉が開き、 7 ~ 8 c mの高 さになった時に、 茎頂成長点に針で刺して小穴を開け、 そこにベクターを保有す る A .チューメハシエンスの水懸濁液(約 1 . 0 X 1 08細胞 m I )を接種した。 接種したソバはおのおのを実生 5 0個体であり、 これらを 2 2 °Cの温度、 暗黒 の条件下に 3日間置いた後、 グロースチャンバ一内で、 3 0°C、 約 4 , 0 0 0 L u Xの照明を 8時間あてて育てた。 ソバは、 約 1 · 8 mmと 0. 6 mmの花柱の長 さが違う 2つのタイプの花をつけ (ヘテロスタイリズム ;異花柱現象)、 異なる タイプの花の間の授粉だけが受精する。 したがって、 種子 (T 1植物) を得るた めに、 形質転換植物 (T 0 ) の花と、 形質転換されていない植物の異なるタイプ の花を授粉した。
センスベクターを保有する A.チューメハシエンスが接種された 5 0の植物体 の内、 3 3個体は分枝が促進されて、 多くの枝が形成された。 しかし、 形質転換 体の表現型の発現程度には植物間差があった。 花の分化と構造においては変化は 観察されなかった。
—方、 アンチセンスベクターを保有する A.チューメ八シエンスが接種された 5 0個体の内、 3 0個体の植物は分枝も成長も抑えられた。 この表現型の発現程 度もまた上記の植物と同様に植物間で様々であった。 これらの植物の花の発達と 構造もまた見た目の変化はなかった。
図 5 (写真) に、 センスおよびアンチセンス向きで本発明遺伝子が導入された ソバの外観を示す。 図 5中、 ( A ) の 1 は、 無処理のソバ、 ( A ) の 2は、 p B I 1 2 1 ベクター (G U S遺伝子) を保有する A .チューメハシエンスで処理し たソバ、 (A ) の 3は、 センスベクターを保有する A .チューメハシエンスで処 理したソバ、 (A ) の 4は、 アンチセンスベクターを保有する A .チューメハシ エンスで処理したソバであり、 これらは処理 1ヶ月後に写真を撮影した。 なお、 写真中の棒は 3 0 c mの定規である。
この結果から、 センス方向に本発明遺伝子を導入したソバ ((A ) の 3 ) は枝 分れが促進されているが、 アンチセンス方向に本発明遺伝子を導入したソバ ( ( A ) の 4 ) は枝分れが抑制されていた。
また、 図 5中の (B ) は、 センス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの中で、 最も形質転換の表現形質 (分枝度) の高いものを示す。 この写真は植物が成長を 終え、 枯れた処理 6力月後に撮影した。
( 5 ) なお、 上記試験では、 形質転換するために実生の茎頂成長点へ A .チュー メハシエンスを接種し、 その後、 実生からァグロバクテリアを除く操作は行なわ なかった。 それ故、 接種したァグロバクテリアが残っていないかどうか、 すなわ ち、 形質転換植物の形態変化は、 A .チューメ八シエンスの影響でないかどうか を T 0植物と T 1植物で次の方法により調べた。
接種後の全植物体(T 0植物)を乳鉢で滅菌水と共に磨砕した。 この磨砕液を、 形質転換に用いた A .チューメハシエンスの生育することのできる抗生物質を含 む L B培地プレー卜に広げ、 2 8 °Cでインキュベートした。 このプレー卜上に出 現したコロニー数は接種後の時間が長くなるにつれて減少し、 接種後 1 4日後で は数コロニーしか出現しなくなった。 大多数のァグロバクテリアは、 おそらくソ バ植物体の抵抗反応により排除されたものと思われる。
T 1植物の場合は、 種子を次亜塩素酸ナトリウム溶液で殺菌し、 その後無菌的 に発芽、 生育させた。 その結果得られた実生を滅菌水と共に磨砕し、 上記のよう に抗生物質含有 L B培地プレー卜で培養した。 コロニーは全く出現せず、 T 1植 物には形質転換に使用したァグロバクテリアは全く存在していないことを確認し た。 実 施 例 2
形質耘換ソバの子孫 (T 1 ) の表現型の確認:
ソバの花は異花柱現象を示し、 異なるタイプの花の間でしか受精しない。 そこ で、 形質転換されたソバ (T O) の花と無処理のソバの花とを授粉した。 その結 果得られた種子を播種し、 生育させて T 1植物の表現型を調べた (図 6)。 本発 明遺伝子をセンス方向に導入したソバおよびアンチセンス方向に導入したソバの 両者において、 約半数の子孫個体 ( 1 0個体) にそれぞれの T 0植物の形質が遺 伝していた。 すなわち、 センス方向で本発明遺伝子を組み込んだソバの子孫は分 枝が促進されていた (図 6、 ( A) の 2 )。 それとは反対に、 アンチセンス方向 で本発明遺伝子を組み込んだソバの子孫は分枝が抑えられ、生育も抑えられた(図 6、 ( B ) の 2 )。 このように、 互いに反対方向の本発明遺伝子で形質転換した ソバの表現型は、 その子孫においても互いに反対の関係にあった。 実 施 例 3
ゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことの確認:
( 1 ) 形質転換ソバの子孫 (T 1 ) からのゲノム D N Aの単離および精製: 実施例 2で得た実生または成熟植物体から、 N u c l e a r P h y t o p u r e D N A抽出キッ卜 (Am e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c ) を使用し、 説明書の手順通りにゲノム D N Aを抽出した。 抽出した D N Aは 次の方法でさらに精製した。 すなわち、 D N Aを 5 0 0 Iの I mM E D T A を含む 1 0 mM T r i s — H C I緩衝液 ( p H 8. 0 ) に溶かし、 2 I の R N a s e (日本ジーン、 l O m g/m l ) と一緒に 3 7°Cで 4 5分間インキュべ 一卜した。 続いて、 6 0 mM T r i s — H C I緩衝液 ( p H 7 · 8 )、 6 0 m E D T A、 3 0 % S D Sならびに 5 i l の P r o t e a s e K ( 1 0 m g /m I )からなる 1 0 0 t Iの溶液を加え、 5 0 °Cで 3時間インキュべ一卜した。 この溶液をフエノール、 フエノールノクロ口ホルム混合液 ( 1 : 1 , v Z v ) そ してフエノールの順で抽出した。 得られた D N A溶液から D N Aをエタノールで 沈澱させ、 7 0 %エタノールで洗浄したして精製ゲノム D N Aを得た。
( 2 ) ゲノムサザンハイブリダィゼーシヨン
上記 ( 1 ) で得た 1 5 fx gのゲノム D N Aを制限酵素 (M A D S遺伝子 c D N A中にその制限酵素サイ卜のない、 E c o R I 、 S a c l 、 X h o l 、 S a l I を利用) で消化し、 ァガロース ( 1 %) 電気泳動後に、 H y b o n d N +のナ イロンメンブラン 、 Am e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c ) に 転写した。 イネ M A D Sボックス遺伝子の c D N A ( 1 . 3 k b ) とランダ厶プ ライマーラベリングキット (T a k a r a製) で32 Pでラベルしたプローブを作 製し、 セフアデックス G— 5 0のカラムで精製した。 D N Aが転写されたナイ口 ンメンブランを、 最初、 5 X D e n h a r d t ' s、 0. 5 % S D Sならびに 2 0 g /m I のサケ精子 D N Aを含む 5 X S S P E溶液 ( 0. 1 8 M N a C I 、 1 0 mMリン酸ナトリウム、 1 m M E D T Aからなる p H 7. 7の溶液) 中で、 6 5 °Cで 1時間、 プレハイブリダィゼーシヨンを行なった。
その後、 32 Pでラベルしたプローブをプレハイブリダィゼーシヨン溶液中に添 加し、 6 5 °Cで 1 8時間、 ハイブリダィゼーシヨンを行なった。 メンブランを 0. 1 % S D Sを含む 2 X S S P E溶液中で 2 0 °Cで 1 0分間、 2回洗浄した。 つづ いて、 0. 1 % S D Sを含む 1 X S S P E溶液中で 6 5 °Cで 1 5分間、 1 回洗浄 し、 最後に 0. 1 % S D Sを含む 0. 1 X S S P E溶液中で 6 5 で 1 0分間、 2 回洗浄した。 プローブとハイプリダイズした D N Aのバンドはイメージアナライ ザ一 (M o l e c u l a r D y n a m i c s ) で画像化した。 この結果を図 7 および図 8に示す。
図 7は本発明遺伝子をセンス方向に導入したソバの子孫、 図 8は本発明遺伝子 をアンチセンス方向に導入したソバの子孫についてであり、 共に 1 は無処理ソバ を E c o R I消化した後の結果、 2は形質転換体を E c o R I消化した後の結果、 3は形質転換体を S a c I消化した後の結果、 4は形質転換体を X h o I消化し た後の結果、 5は形質転換体を S a l I消化した後の結果をそれぞれ示す。
図 7および図 8から明らかなように、 無処理のソバではバンドが認められない が、 センス向きに本発明遺伝子を挿入したソバの子孫 (図 7)、 アンチセンス向 きに本発明遺伝子を挿入したソバの子孫 (図 8 ) の両ゲノム D N Aについて、 す ベてのレーンで唯一のハイブリダイズバンドが検出されたことから、 分析した T 1植物のゲノムには c D N Aが 1 コピーだけ導入されていることが示された。 実 施 例 4
ゲノム中に本発明遺伝子が組み込まれたことの確認:
ゲノム中に組み込まれた c D N A増幅用に、 P 1 および P 2の 2種の P C Rプ ライマ一を 2つ設計した。
P 1 : 5 '— A C A A T C C C A C T A T C C T T C G C - 3 ' P 2 : 5 ' - G T C A C G A C G T T G T AA A A C G A - 3 ' このうち、 P I は元の p B I 1 2 1バイナリベクター中の G U S遺伝子の上流 に位置する C a M V 3 5 Sプロモータの 3 '末端配列に相当し、 P 2は、 元の p B I 1 2 1バイナリベクター中の G U S遺伝子の下流に位置する T一 D N Aのラ ィ 卜ボーダー近傍の配列に相当している。
実施例 3 ( 1 ) で調製したゲノム D N A ( 1 — 2 I 、 5 0 0 n g ) を最終容 量が 5 0 μ I の反応液 (5 0 mM K C I , 1 0 m M T r i s — H C I ( p H 8. 3)、 1 . 5 m M M g C h、 2 0 0 Mのヌクレオチド、 0. 2 /z Mの上記 プライマー、 1 . 2 5ユニットの T a q p o l y m e r a s e ( T a k a r a 製) に添加した。 P C R反応は、 9 4 °Cで 3 0秒、 5 8 °Cで 4 5秒、 7 2 °Cで 9 0秒を 3 0サイクル、 その後 7 2°Cで 1 0分間行なった。 P C R産物のァガロー ス ( 1 % ) ゲル電気泳動し、 増幅反応後、 反応液を直接電気泳動にかけ、 泳動後 ェチジゥ厶ブ口マイドで染色した。
この結果を図 9に示す。 この図中、 1 は D N Aサイズマーカー、 2はセンス方 向で本発明遺伝子が挿入されたベクターの P C R産物、 3はセンス方向の本発明 遺伝子で形質転換した植物由来ゲノム D N Aの P C R産物、 4はアンチセンス方 向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノム D N Aの P C R産物を示す。 図 9から、 両ゲノム D N Aについて、 期待されたサイズ ( 1 . 7 k b ) の D N A断片が増幅され、 c D N Aの完全な配列が両方の T 1植物に組み込まれている ことが明らかとなった。 実 施 例 5
ゲノム中に組み込まれた c D Ν Αの方向性の確認:
本発明遺伝子 ( 1 . 3 k b ) の 5 '末端から 4 7 2 b pの部位に X b a Iの制限 サイ卜が 1ケ所存在する。 c D N Aのこの X b a Iサイ卜と P C Rプライマーが ァニールする部位から考えて、 P C R産物を X b aで消化すると、 センス方向で 挿入されている場合には、 1 . 2 k bと 0 . 5 k bの D N A断片が、 アンチセンス 方向の場合には、 2つの 8 5 0 b pの断片が生成すると期待される (図 1 0 )。 両者の T 1植物のゲノム D N Aの P C R産物と、 形質転換に使用した c D N Aを 有する 2つのバイナリベクターの P C R産物を X b a Iで消化し、 続いて" Pラ ベルした c D N Aプローブを使ってサザンハイブリダィズ分析を行った (図 1
1 ) o
図 1 1 中、 1 は、 アンチセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターの P C R産物、 2はセンス方向で本発明遺伝子が挿入されたベクターの P C R産物、 3はセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノム D N Aの P C R産 物、 4はアンチセンス方向の本発明遺伝子で形質転換した植物由来ゲノム D N A の P C R産物を示す。 図 1 1では、 期待されるサイズのハイブリダィズバンドがそれぞれのサンプル て検出された。この結果は、センス及びアンチセンス方向で形質転換した植物(T 1 ) のゲノム中に、 c D N Aはそれぞれの期待された方向性をもって組み込まれ ていることを示している。 実 施 例 6
カランコェへの本発明遺伝子の導入:
長さ 1 0〜 1 3 c mのカランコェ成熟葉を茎から切り取った。 実体顕微鏡を用 いて、 この葉の周辺の切れ込みの一番奥にある分裂細胞のまわりの表皮細胞と葉 肉細胞ならびに分裂細胞直上の表皮細胞に針で数力所穴を開けた。
この葉に、 実施例 1 ( 3 ) で得た、 センス方向に M A D S遺伝子を導入したァ グロバクテリウ厶 ·チューメハシエンス (A. t ume f ac i e ns ) の水懸濁液 ( 1 . 0 X 1 0 8個 m I ) をパスツールピぺッ 卜を用い、 1摘づっ 1 つの切れ込み部分に 接種した。 次いで室温に 3 0分間程度放置して乾かした。 この葉をプラスチック ケースに入れた湿ったバーミキユラィ卜の上にのせ、 蓋を閉めて 2 5 °Cでインキ ュベー卜した (明所 8時間、 暗所 1 6時間のサイクル)。
カランコェの葉の上記処理した部分よリ新しい芽と根が出、 これが発達するの で、 4週間後に元の葉から切り離し、 写真撮影した。 対照としては、 非形質転換 体である A ·チューメハシエンスで処理したものおよび M A D S遺伝子の代わり に G U S遺伝子 ( ;8—ダルクロニダーゼ遺伝子) を導入した A ■チューメハシェ ンスで処理したものを用いた。 この結果を図 1 2に示す。
M A D Sボックス遺伝子で形質転換した株は根部付近から葉の展開が見られた が、 対照の非形質転換体および M A D S遺伝子の代わりに G U S遺伝子を導入し た株ではこのような現象は認められなかった。 この結果は、 ソバを用いた試験結 果と同様に、 該 M A D Sボックス遺伝子が分枝を制御している遺伝子であること を示している。 ソバだけでなく種の異なるカランコェでも、 該 M A D Sボックス 遺伝子が分枝を促進したことから、 該遺伝子は植物全般の分枝を制御できる遺伝 子であると考えられる。

Claims

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で表されるものである請求項第 1項記載の植物の分枝調節遺伝子。
4. イネの M A D Sボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子を含有するべク ター。
5. イネの M A D Sボックス遺伝子が次の塩基配列、
c tcctcctcc tcttcttctt cttccactag c tagt tcgtc ttcctccttc agctagcttg tagcagctaa ggt taggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc gaggatgggg cgggggaagg tgcagc tgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt gacgt tc tec aagaggagga atggat tgc t gaagaaggcg cacgagatc t ccgtcctctg cgacgccgag gtcgccgcca tcgtct tctc ccccaagggc aagc tc tacg agtacgccac tgac tccagg atggacaa.aa tec t tgaacg t tatgagcgc ta t tea ta tg c tgaaaaggc tct tat ttca gc tgaatccg agagtgaggg aaat tggtgc catgaataca ggaaac t taa ggcaaaga 11 gagacca tac aaaaa tgtca caaacacc tc a tgggagagg a tc tagaat c cc tgaatc tc aaagaac tec aacagc taga gcagcagc tg gagagt tea t tgaagcaca t aa ta tcaaga aagagccacc ttatgct tga gtccatttcc gage tgcaga aaaaggagag gtcac tgcag gaggagaaca aggctc tgca gaaggaac tg gtggagaggc agaagaatgt gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc ccaaccccaa gcccagacaa gc tcctcctc ctcc tccatg c tgagggatc agcaggcac t tc t tccacca caaaatatc t gc tacccgcc ggtga tga tg ggcgagagaa atgatgcggc ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaac tc cgca tcggag gtct tccgcc atggatgc tg agccacc tea atgct taaga tgatcatcgt cgtcgt cgtc ggccaaacag c tgccgtatg caccgtgaat catgggagca acct tgaatg aat tgaagtc at tggtatcg atcc tagcga taata ta ta t gat tctccta aaatgaaat t gate tcaaaa aaacaaacc t agcga t taag ctattct tat a ta tgtgt 11 gcc tgc tgcc ccc taccc ta caggc tacat a tgat t tgca agaaa t taa t ta tgagcaag ga tcagga tg tgt c 11 tgtg taa tcatcag cacgtacc ta gtgct tccta c tgatatata tgcatgcaat tgtgtgca ta taaatatat t tgcatgcca t gc tcccgtga tggt taa 11
で表されるものである請求項第 4項記載のベクター。
6. イネ M A D Sボックス遺伝子またはこれと相同な遺伝子をベクターに組み 込み、 これを宿主微生物を介して植物に導入することを特徴とする植物の枝分か れの調節方法。
7. イネの M A D Sボックス遺伝子が次の塩基配列、
c tcctcctcc tcttcttct t ct tccac tag ctagt tcgtc t tcctcct tc age tagct tg tagcagc taa ggt taggtcg gatcgagatc gggatcggcc gccggcgagc ggcgagcggc gagga tgggg cgggggaagg tgcagc tgaa gcggatagag aacaagatca acaggcaggt gacgttctcc aagaggagga atggat tgc t gaagaaggcg cacgagatct ccgtcctctg cgacgccgag gtcgccgcca tcgtcttctc ccccaagggc aagctctacg agtacgccac tgactccagg atggacaaaa tec t tgaacg t tatgagcgc tat tcatatg ctgaaaaggc tcttatttca gctgaatccg agagtgaggg aaat tggtgc catgaataca ggaaacttaa ggcaaagat t gagaccatac aaaaatgtca caaacacc tc a tgggagagg atctagaatc cctgaatctc aaagaac tec aacagctaga gcagcagctg gagagt teat tgaagcacat aatatcaaga aagagccacc t tatgc t tga gtccat t tec gage tgcaga aaaaggagag gtcac tgcag gaggagaaca aggctctgca gaaggaac tg gtggagaggc agaagaatgt gaggggccag cagcaagtag ggcagtggga ccaaacccag gtccaggccc aggcccaagc ccaaccccaa gcccagacaa gctcctcctc ctcctccatg c tgagggatc agcaggcac t tcttccacca caaaatatct gc tacccgcc ggtgatgatg ggcgagagaa atgatgcggc ggcggcggcg gcggtggcgg cgcagggcca ggtgcaac tc cgcatcggag gtcttccgcc atggatgctg agccacc tea atgc t taaga tgatcatcgt cgtcgtcgtc ggccaaacag ctgccgtatg caccgtgaat catgggagca accttgaatg aat tgaagtc attggtatcg atcctagcga taatatatat gat tctccta aaatgaaat t gatctcaaaa aaacaaacc t agcgat taag ctattcttat atatgtgtt t gcctgctgcc ccctacccta caggctacat atgat t tgca agaaattaat tatgagcaag gatcaggatg tgtc 11 tgtg taatcatcag cacgtacc ta gtgct tccta ctgatatata tgcatgcaat tgtgtgcata taaatatat t tgcatgccat gc tcccgtga tggt taat t
で表されるものである植物。
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