CN117778456A - 调控甘蓝型油菜菌核病抗性的延伸因子BnELP2基因及应用 - Google Patents
调控甘蓝型油菜菌核病抗性的延伸因子BnELP2基因及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及调控油菜对菌核病抗性的延伸因子亚基BnELP2基因及应用。筛选到一种受菌核病菌诱导表达的延伸因子亚基BnELP2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。利用农杆菌介导的转化，获得BnELP2超量表达转基因株系和CRISPR/Cas9突变株系。对转基因材料进行核盘菌接种鉴定发现，BnELP2超量表达株系对菌核病抗性增强，而突变株系更感菌核病菌，表明BnELP2是油菜对菌核病抗性的正调控因子，在油菜菌核病抗性中起正向调控作用，超量表达该基因，能显著提高油菜对菌核病的抗性。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及调控甘蓝型油菜菌核病抗性的延伸因子BnELP2基因及应用。
背景技术
油菜是我国重要的油料作物之一，其种植面积和总产量均居油料作物之首。由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病是对油菜危害最严重的病害之一。核盘菌引起的菌核病主要危害油菜的茎、叶、花、角果及种子。菌核病是世界性真菌病害，在中国、欧洲、印度、澳大利亚及美国都有菌核病的发生(Zheng X.,Koopmann B.,Ulber B.,etal.A global survey on diseases and pests in oilseed rape—current challengesand innovative strategies of control.Frontiers in Agronomy,2020,2:590908)。有研究表明，美国每年因菌核病造成的作物损失超过2亿美元(Bolton M.D.,ThommaB.P.H.J.,Nelson B.D.Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary:biology andmolecular traits of a cosmopolitan pathogen.Mol Plant Pathol,2006,7)。在中国，菌核病造成的油菜产量损失一般在10％-30％左右(蔡俊松.重庆市油菜菌核病发生规律及菌核病菌多样性研究.西南大学,2020)，但也有部分年份受气候等条件影响受灾严重，如湖北鄂州市也曾连续两年所有地块均发生菌核病，其中2021年发病面积占到95.58％(吴江.鄂州市油菜菌核病偏重发生原因分析及防治对策.湖北植保,2022:54-55)。此外菌核病会导致油菜干物质积累减少，种子活力下降，出油率降低，发芽率降低等，从而降低其经济效益(李东锋；赵艳芬；王维峰；徐念宁；邵红梅；.制种甘蓝菌核病的发生与防治.种业导刊,2016)。
目前，对于核盘菌引起的作物病害控制主要有三种方法：化学防治、生物防治和农业防治。化学防治以喷洒化学杀菌剂为主要方法，对土壤中的菌核影响较小且环境污染严重，农业防治成本高且防治效果甚微，生物防治受环境影响实际效果稳定性低，培育作物抗病新品种才是最经济有效的途径，其中杂交育种耗时长且缺乏有效抗性遗传来源，而通过基因工程技术对农作物进行转基因育种则具有物种应用广泛、防治效果稳定、可对单个及多个效应基因进行操作和选择的优势。目前应用较多的基因编辑系统主要包括三类：锌指核酸酶(ZFNs)、类转录激活因子效应物核酸酶(TALENs)和CRISPR/Cas系统，其中CRISPR/Cas系统已成为作物基因功能研究和性状改良的重要方法。目前，已有科研工作者通过基因编辑技术出多种抗病性农作物，如抗虫棉花、抗稻瘟病水稻等。因此，通过基因编辑技术持续挖掘菌核病抗性基因，解析其抗病分子机制，可以为菌核病抗性品种选育提供理论指导和种质资源，对油菜的安全生产具有重要参考价值。
延伸因子复合体(elongator complex,ELP)是Otero等在研究酵母菌转录延伸调控因子时鉴定到能够和高度磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ紧密结合的蛋白质复合物并因此而得名(Wittschieben BO,Otero G,de Bizemont T,F et al.A novel histoneacetyltransferase is an integral subunit of elongating RNA polymerase IIholoenzyme.Mol Cell.1999Jul；4(1):123-8)。延伸因子复合物能与RNA聚合酶Ⅱ相互作用，可通过组蛋白乙酰转移酶活性促进转录延长，也参与多种细胞活动，包括tRNA修饰、组蛋白修饰、DNA去甲基化或甲基化、微管蛋白乙酰化和胞吐。植物中延伸因子复合物的突变会引起生长发育异常、非生物胁迫的抗性增强以及对病原体的抗性降低。有研究表明拟南芥和番茄中的ELP蛋白在植物免疫方面起正向调控作用。在番茄中异源过表达拟南芥AtELP3与AtELP4基因能显著增强植株对番茄细菌性斑点病的抗性，且不影响植株的正常生长发育，具有协调植株生长和抗病的良好潜力(Pereira JA,Yu F,Zhang Y,et al.TheArabidopsis elongator subunit ELP3 and ELP4 confer resistance to BacterialSpeck in tomato.Frontiers in Plant Science.2018,24(9):1066)。虽然在对拟南芥ELP的研究中发现该基因家族对植物免疫反应具有正向的调节作用，但目前对ELP2的抗病功能研究尚不深入，在其他植物特别是作物中的ELP功能报道较少，其中ELP2是否介导油菜对菌核病的抗性尚无报道，其功能有待进一步验证。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点和不足，提供了一个延伸因子复合体基因BnELP2在参与油菜抗菌核病中的应用，对该基因进行了功能验证和转化应用。该基因基于拟南芥同源序列比对，筛选出同源性最高的BnELP2序列，基因的核苷酸序列如SEQ IDNO：1所示，对该基因进行克隆并构建该基因的超表达载体和敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法在甘蓝型油菜Westar中进行超量表达及敲除表达，并接种核盘菌，分析了转基因植株的抗病性、叶片提取物对核盘菌生长的抑制作用、叶片内源活性氧的积累情况以及JA/ET和活性氧信号通路标志基因检测，快速鉴定其在油菜菌核病抗性中的功能，为油菜抗菌核病育种提供新的遗传资源。
本发明的技术方案如下所述：
申请人克隆得到一种调控油菜菌核病抗性的延伸因子BnELP2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
上述调控油菜菌核病抗性的油菜延伸因子BnELP2基因编码的蛋白质序列如SEQID NO:2所示。
本发明涉及的BnELP2基因在调控油菜菌核病抗性中的应用。
更详细的技术方案如下所述：
利用RT-qPCR方法分析油菜ELP基因家族受核盘菌诱导的表达模式，根据基因诱导表达情况，最终确定研究目的基因BnELP2(见图1)。
从甘蓝型油菜westar中提取其叶片RNA(利用Super总RNA提取试剂盒，购自Promega公司，美国)，利用反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司,美国)，将其反转录合成cDNA。反应条件为：70℃/5min、；25℃/5min；42℃/90min；70℃/10min。利用油菜基因组信息，合成扩增引物，正向引物BnELP2-full-F(5’TGGACCGGCATTATCTGCTC 3’)和反向引物BnELP2-full-R(5’GTACATGTCTCCAATTGTTACTGTT 3’)扩增出BnELP2基因的cDNA。PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃30sec，59℃30sec，72℃2min 50sec，28个循环；72℃延伸7min。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的基因ORF，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，编码824个氨基酸序列(SEQ ID NO:2所示序列)。
本发明以pCBC-DT1DT2(载体抗性为氯霉素)为基因编辑中间载体(图2中的A图)，pKSE401(载体抗性为卡那霉素)为基因编辑终载体(图2中的B图)，pGWB418(载体抗性为卡那霉素和壮观霉素)为过表达终载体(见图2中的C图)，分别构建了该基因的超量表达载体pGWB418-BnELP2和CRISPR/Cas9-Bnelp2基因敲除载体，申请人利用农杆菌侵染下胚轴的方法将这两个载体分别转化到甘蓝型油菜westar中，直至得到再生的分化苗，通过CTAB法提取野生型甘蓝型油菜为对照与转基因油菜株系叶片基因组DNA，基因编辑株系以U626-IDF(5’TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC 3’)和U629-IDR(5’AGCCCTCTTCTTTCGATCCATCAAC3’)为引物，过表达株系选择JD418-F(5’ATGTGATATCTCCACTGACGTA 3’)和JDELP2-R(5’ACAATTGCTTTGGAGTCAGC3’)为引物进行PCR扩增，筛选出该基因的超表达的阳性株系和CRISPR/Cas9敲除阳性株系，通过RT-qPCR随后对阳性材料分别进行表达量检测和测序分析。其中ELP2-4、ELP2-5、ELP2-7、ELP2-10、ELP2-14、ELP2-23和ELP2-24材料BnELP2转录水平相比野生型显著上调(图3-A)。基因编辑材料elp2-39和elp2-77编辑类型为单碱基插入，elp2-50为4碱基缺失(图3-B)。将上述转基因材料自交繁种获得高世代作为后续试验材料。
本发明对BnELP2转基因材料(超量表达株系和CRISPR/Cas9突变株系)进行离体叶片接种核盘菌实验和叶片提取物培养核盘菌实验，发现与对照材料相比，BnELP2超量表达材料对菌核病抗性明显提高，elp2突变体更感菌核病菌(图4和图5)。在接种菌核病菌36小时后，使用二氨基联苯胺(DAB)对野生型及转基因株系接菌叶片位置进行了DAB染色实验，观察叶片中H2O2积累情况，结果说明过表达BnELP2可提高油菜叶片在核盘菌侵染时H2O2积累量，而敲除BnELP2使油菜在核盘菌侵染时H2O2积累量下降(图6)，进一步RT-qPCR发现BnELP2可通过抑制过氧化氢酶BnCAT1和BnCAT2的转录来提高油菜叶片中H2O2积累量(图7)。抗病相关基因BnLOX2、BnOPR1、BnPDF1的表达水平在BnELP2超量表达材料中显著高于对照材料(图8)。由此可见，BnELP2正调控油菜对菌核病的抗性。
本发明的优点：
本发明通过对油菜延伸因子复合体基因受菌核病诱导表达模式进行分析，从中筛选并鉴定得到BnELP2基因，同时发现BnELP2是油菜抗菌核病的正调控因子，BnELP2基因的表达量提高可以调控JA/ET通路标志基因BnLOX2、BnOPR1、BnPDF1和H2O2降解基因BnCAT1和BnCAT2来参与油菜对核盘菌的抗性。通过遗传转化，超量表达该基因获得抗菌核病的油菜新品系，BnELP2可以作为油菜抗性材料的潜在标志基因。
附图说明
图1：Westar接种核盘菌后BnELPs表达模式分析。附图标记说明：图1为野生型甘蓝型油菜离体叶片接种核盘菌0、6、12、24、36、48、72小时后RT-qPCR结果。结果表明，BnELP2可能是介导油菜抗核盘菌的关键亚基。
图2：构建BnELP2超表达载体和CRISPR/Cas9基因敲除载体所用载体图谱。附图标记说明：图2中的A图是pCBC-DT1DT2载体图谱。图2中的B图是pKSE401载体图谱。图2中的C图是pGWB418载体图谱。
图3：转基因材料表达量和测序分析结果。附图标记说明：图3中的A图是T0代BnELP2过表达材料表达量检测结果。图3中的B图是T0代BnELP2基因编辑材料测序比对分析。选择ELP2-4、ELP2-5、ELP2-7、ELP2-10、ELP2-14、ELP2-23、ELP2-24过表达转基因株系和基因编辑材料elp2-39、elp2-77和elp2-50进行后续研究。
图4：转基因油菜苗期离体叶片接种核盘菌36h菌斑情况。附图标记说明：图4中A图为对照材料和转基因材料接种核盘菌36h后的表型观察。图4中B图为菌斑面积统计结果。结果表明，与对照材料相比，BnELP2超量表达更抗菌核病，而Bnelp2突变体则更感菌核病。
图5：转基因株系叶片提取物培养核盘菌48h生长情况。附图标记说明：图5中A图为油菜叶片提取物培养核盘菌48h后菌斑情况。图5中B图为菌斑面积统计结果。图5中C图为体式显微镜下油菜叶片提取物培养核盘菌48h后局部菌斑生长情况。结果表明，与对照材料相比，BnELP2超量表达材料叶片提取物可显著抑制核盘菌的生长，进一步证明了BnELP2正向调控油菜对核盘菌的抗性。
图6：离体叶片接种核盘菌36h后DAB染色。附图标记说明：图6为离体叶片接种核盘菌36h后H2O2含量检测，可以验证过表达株系表现的抗病性是否与活性氧的积累有关。结果表明，BnELP2的过表达可提高油菜叶片在核盘菌侵染时H2O2积累量，而BnELP2的缺失使油菜在核盘菌侵染时H2O2积累量下降。
图7：BnELP2转基因株系ROS相关基因表达量分析。附图标记说明：图7是接菌36h的野生型及转基因株系进行ROS合成降解基因的表达量检测果。图7中A图为ROS合成降解基因BnCAT1表达情况。图7中B图为ROS合成降解基因BnCAT2表达情况。结果显示：BnELP2通过抑制过氧化氢酶BnCAT1和BnCAT2来提高油菜中活性氧积累量，从而提高油菜对核盘菌的抗性。
图8：对照材料与转基因材料接种核盘菌36h后抗病相关基因表达分析。附图标记说明：图8是接种核盘菌36h后，抗病相关基因LOX2、OPR1和PDF1在对照材料以及转基因材料中表达水平的检测结果。结果显示：BnELP2的过表达可提高JA合成相关基因BnLOX2、BnOPR1以及植保素BnPDF1的转录水平，从而提高甘蓝型油菜对核盘菌的抗性。
具体实施方式
对序列表的序列的说明
SEQ ID NO：1是本发明克隆的油菜BnELP2基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO：2是BnELP2基因编码的蛋白质序列。
以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有BnELP2基因完整编码区段的cDNA段，以及验证BnELP2基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。
实施例1：BnELP2基因的分离与克隆
1、油菜RNA提取与反转录
以甘蓝型油菜westar品种(湖北大学作物遗传实验室提供)作为实验材料，采用植物RNA提取试剂盒(MiniBEST Plant RNA Extraction Kit)提取总RNA，使用方法参照TaKaRa PrimeScript TMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书。
cDNA的合成是利用IIQ RT SuperMix for qRNA(+gDNA wiper)试剂盒(购自Vazyme公司，中国)进行的，根据RNA浓度，计算2000ng RNA所需的量，加入无酶管中，并补充无酶水至5μl将上述无酶管放于PCR仪中70℃变性5分钟，随后立马放置冰上，加入5μLBuffer Mix Oligo，Enzyme Mix和无酶水混合液，总体积10μL。反转录PCR体系为：70℃/5min、；25℃/5min；42℃/90min；70℃/10min。
2、BnELP2基因受核盘菌诱导表达模式分析
打孔取6mm核盘菌菌丝块(湖北大学作物遗传实验室保存)放置于PDA平板中活化，当菌丝即将扩展至平板边缘时，放置于新的PDA平板中活化，22℃暗培养40h左右。清洗并消毒保鲜盒，在保鲜盒底部放置吸水纸，用于叶片储藏及培养，每个保鲜盒加入等量无菌水，封口备用。选取油菜倒数第二片展开、大小相同的6叶期新叶，放置于保鲜盒中，叶柄处用脱脂棉球保水，取6mm左右靠近平板边缘的新生菌丝块，避开主叶脉，朝下倒置在叶片同一位置，均匀等量喷水保湿，22℃暗培养，接种后分不同时间点取接种叶片抽提总RNA，反转录成cDNA作为模板。采用实时定量RT-qPCR分析试剂盒(Geeen PCR Master Mix，参照试剂盒使用说明书操作)，在BIO-Rad CFX Connect(BIO-Rad公司制造)荧光定量PCR仪上进行反应，反应中所需引物如下：内参引物Q-BnActin7F(5’TCTTCCTCACGCTATCCTCCG3’)、内参引物Q-BnActin7R(5’AGCCGTCTCCAGCTCTTGC3’)、Q-BnELP1-F(5’ATGAGATCTTGAAACTGGCGTA3’)、Q-BnELP1-R(5’GCAAATTAACTCCACCGCTTAT3’)、Q-BnELP2-F(5’TGGACCGGCATTATCTGCTC 3’)、Q-BnELP2-R(5’GTACATGTCTCCAATTGTTACTGTT3’)、Q-BnELP3-F(5’CGGCGAATCGAAAAAGCAACCAC3’)、Q-BnELP3-R ( 5’TCCGGCAAGCCTGGGTTTTAATC3’ )Q-BnELP4-F( 5’CCGCATCGCCATCCAGTCATTC 3’)、Q-BnELP4-R(5’CGCCATGTGCTGCAGTCTTGTTGAG3’)、Q-BnELP6-F(5’CTAGCCTTAGGGTTAGATGAGC3’)、Q-BnELP6-R(5’GACAGATTGCATCCGAGTTTAC3’)。结果显示，BnELP2显著受到核盘菌诱导上调表达，暗示BnELP2可能参与油菜对核盘菌的抗性响应。
3、BnELP2基因序列获得
以上述cDNA为模板，利用正向引物BnELP2-full-F(5’TGGACCGGCATTATCTGCTC3’)和反向引物BnELP2-full-R(5’GTACATGTCTCCAATTGTTACTGTT3’)来扩增目的基因。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性20sec，56～60℃退火30sec，72℃延伸90sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。将扩增获得的PCR产物连入pGEM-T载体(购自Promega公司，美国)，筛选阳性克隆并测序，将阳性菌株保存在-80℃。获得所需的BnELP2基因的开放阅读框(ORF)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。通过BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)确定BnELP2基因的开放阅读框(ORF)所对应的824个氨基酸，由此推测BnELP2基因编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO：2所示。
实施例2：BnELP2超量表达以及CRISPR/Cas9基因敲除载体构建
1、超量表达载体的构建
在液体LB培养基中(添加50mg/L卡那霉素)活化pGWB418菌株，提取质粒后，用AfeⅠ和SacⅠ进行双酶切，将酶切产物纯化回收后于-20℃保存备用。利用同源重组酶(购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司)将上述酶切回收的带接头的BnELP2目的片段与线性化载体pGWB418进行进行Infusion连接，得到重组载体(pGWB418-BnELP2)，具体的反应体系为：1.0μL双酶切后线性化pGWB418载体，1.0μL 5×CEⅡBuffer，0.5μL ExnaseⅡ同源重组酶，1μL带载体接头BnELP2的PCR纯化回收产物，用无菌ddH2O补足体积至5.0μL。37℃反应40min后，进行大肠杆菌热激转化，所用菌株为大肠杆菌DH5α。具体转化流程为：将-80℃保藏的大肠杆菌DH5α感受态细胞冰浴溶化，向5μL连接反应中加入50μL感受态细胞，轻轻混匀，冰上放置10min；冰浴结束后，42℃水浴90sec，然后迅速置于冰上2min；加入200μL LB液体培养基，于37℃，200rpm，复苏培养50min；复苏完成后，将菌液均匀涂在LB的固体培养基(添加50mg/L卡那霉素)上，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆，选择2-3个阳性克隆测序，保存没有任何突变的菌株及相应质粒，命名为重组质粒pGWB418-BnELP2。将测序正确的重组质粒pGWB418-BnELP2通过化学转化法转入农杆菌GV3101感受态，挑取单菌落于YEP液体培养基(YEP液体培养基为常用培养基，本实施例中添加了30mg/L利福平和50mg/L卡那霉素),28℃振荡培养24-36h，PCR检测后，阳性菌株加适量甘油于-80℃保存备用。
2、CRISPR/Cas9基因敲除载体构建
根据从BnPIR数据库获取的甘蓝型油菜BnELP2基因序列，利用华中农业大作物遗传改良国家重点实验室开发的CRISPR-P 2.0(CRISPR-P v2.0(hzau.edu.cn))分别筛选2个评分最高且特异性最强的gRNA：elp2-gRNA1(5’TGTGAGCTTAAAGGCCACA3’)，elp2-gRNA2：(5’GAAGATTGGGTCTATTCCG3’)。根据gRNA合成扩增引物：elp2-BsF(5’ATATATGGTCTCGATTGTGTGAGCTTAAAGGCCACAGTT3’)、elp2-BsR(5’ATTATTGGTCTCGAAACCGGAATAGACCCAATCTTCCAA3’)、elp2-F(5’TGTGTGAGCTTAAAGGCCACATTTAGAGCTAGAAATAGC3’)、elp2-R(5’AACCGGAATAGACCCAATCTTCCAATCTCTTAGTCGACTCTAC3’)。以中间载体pCBC-DT1T2为模板，四条引物混合扩增，保存产物酶切酶连使用。使用BsaI内切酶和T4连接酶将上一步PCR产物与pKSE401载体37℃酶切酶连12h。将上述反应产物热激转化大肠杆菌DH5α，挑单克隆进行阳性检测并测序，保存阳性菌株和质粒，并将阳性质粒转化农杆菌GV3101感受态。挑取单菌落于相应抗性YEP液体培养基中,28℃振荡培养36-48h，PCR检测后，阳性菌株加适量甘油于-80℃保存备用。
实施例3：油菜遗传转化
通过农杆菌介导的下胚轴侵染法将重组质粒(即过量表达载体和敲除载体),筛选并分化成苗，具体步骤如下：
1.发苗：选取颗粒饱满、活性良好的Westar种子，装入EP管，超净工作台中添加升汞消毒4min后倒出并回收升汞，添加75％乙醇消毒2min后倒出，无菌水清洗2min，重复3次，使用无菌镊子将处理后种子均匀放置于M0培养基中，24℃黑暗条件培养5天。
2.农杆菌的活化：发苗两天后，在添加相应抗生素的YEP培养基上培养农杆菌，28℃培养48h；挑取单菌落至5ml YEP培养液中，28℃震荡培养36h；随后吸取1mL菌液至45mLYEP培养液，28℃震荡培养12h。之后4000rpm 4℃离心，收集菌体，然后使用DM培养液重悬农杆菌并稀释至OD600在0.7左右。
3.侵染及共培养：在超净工作台中切取培养好的下胚轴，8-10mM为宜，切段过程中添加DM培养液保持湿润。随后将其浸泡入配置好的农杆菌菌液，侵染20min，期间使用无菌镊子轻柔搅拌，充分浸染。最后吸出菌液，将下胚轴转移至滤纸吸去多余菌液，并放至M1培养基，24℃黑暗条件培养36h。
4.选择培养：将M1中下胚轴转移至M2培养基，24℃16h光照8h黑暗培养12天。
5.分化培养：去除M2中褐色下胚轴，将状态良好的下胚轴转移至M3培养基，24℃16h光照8h黑暗培养，12天重复一次，直至发芽。
6.生根培养：待出现芽点后，将嫩芽上的愈伤组织切除干净，插入M4培养基中，24℃16h光照8h黑暗培养直至生根。
本发明的实施例中涉及的油菜遗传转化的专用培养基、抗生素和激素配方及其配制：
培养基配方及配制方法：
1.M0发苗培养基
MS 4.405g；
琼脂 7.0g；
逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL，调PH至5.8-6.0，分装至每个发苗盒50mL，置于高压灭菌锅121℃，20min灭菌。
2.M1共培养培养基
固体粉末逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL，定容后加入再2,4-D(1mg/ml)和KT(1mg/ml)，调PH至5.8-6.0，置于高压灭菌锅121℃，20min灭菌后于超净工作台内加入AS(100mM/mL)后分装至培养皿中。
3.M2筛选培养基
固体粉末逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL，定容后加入再2,4-D(1mg/ml)和KT(1mg/ml)，调PH至5.8-6.0，置于高压灭菌锅121℃，20min灭菌后于超净工作台内加入TMT(50mg/ml)、Kan(50mg/ml)和AgNO3后分装至培养皿中。
4.M3分化培养基
固体粉末逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL，调PH至5.8-6.0，置于高压灭菌锅115℃，15min灭菌后于超净工作台内加入TMT(50mg/ml)、ZT(0.5mg/mL)和IAA(1mg/mL)后分装至培养皿中。
5.M4生根培养基
MS 2.202g；
琼脂 7g；
逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL，调PH至5.8-6.0，分装至每个锥形瓶中50mL，置于高压灭菌锅121℃，20min灭菌。
6.DM培养液
固体粉末逐次溶解，然后加蒸馏水定容到1000mL，定容后加入再2,4-D(1mg/ml)和KT(1mg/ml)，调PH至5.8-6.0后分装至每个培养瓶中50mL，置于高压灭菌锅121℃，20min灭菌后。
7.YEP培养基
加蒸馏水定容到1000mL，置于高压灭菌锅121℃，20min灭菌后分装。注：液体YEP培养基不需要添加琼脂。
抗生素配方：
1.卡那霉素(Kan，50mg/ml)：称取卡那霉素粉末0.5g，加入去离子水10ml充分溶解，过滤后分装至无菌EP管中，于-20℃冰箱保存。
2.氨苄青霉素(Amp，50mg/ml)：称取氨苄青霉素干粉0.5g，加入去离子水10ml充分溶解，过滤除菌后进行分装，保存于-20℃冰箱。
3.特美汀(TMT，200mg/l)：用注射器在无菌条件下注射4ml的无菌去离子水于1.6g未开封的瓶装特美汀粉末中，吸打混匀后吸出，再加入无菌去离子水4ml充分混匀，直接分装至无菌EP管中，最后放置于-20℃冰箱保存。
4.利福平(Rif，30mg/ml)：称取利福平干粉0.5g，加入DMSO 10ml充分溶解，过滤除菌后分装至无菌EP管中，-20℃冰箱保存。
5.壮观霉素(spec，50mg/ml)：称取卡那霉素干粉0.5g，用无菌去离子水10ml充分溶解，过滤除菌后进行分装于无菌EP管中，保存于-20℃冰箱。
激素配方：
1.乙酰丁香酮(As，100mM/mL)：称取乙酰丁香酮粉末0.196g，加入DMSO 10mL充分溶解，过滤除菌后分装至无菌EP管中，最后放于-20℃冰箱保存。
2.植物生长素(2,4-D，1mg/mL)：称取2,4-D 100mg，加入1N KOH 1mL震荡5min，然后加入无菌去离子水10mL，振摇至2,4-D充分溶解，最后用无菌去离子水定容至100mL，4℃冰箱保存。
3.激动素(KT，1mg/mL)：称取KT干粉100mg，然后加入1mL 1N KOH震荡至KT完全溶解，然后加ddH2O定容至100mL，4℃保存。
4.萘乙酸(NAA，1mg/ml)：称取NAA 100mg，加入1N KOH 1mL震荡至NAA完全溶解，再加入无菌去离子水定容至100mL，于4℃冰箱避光保存。
5.玉米素(ZT，0.5mg/mL)：无菌操作下每管5mg先加入95％乙醇，完全溶解后再加入无菌去离子水定容至10mL，然后过滤除菌，保存于-20℃冰箱。
5.吲哚乙酸(IAA，1mg/mL)：称取IAA干粉100mg溶于5ml的无水乙醇中，加入无菌去离子水定容至100mL，然后过滤除菌，最后保存于-20℃冰箱。
实施例4：转基因材料核盘菌的接种鉴定
1.离体叶片接种核盘菌：将核盘菌菌块放于PDA平板中培养活化，当菌丝即将扩展至平板边缘时，取6mm靠近平板边缘的新生菌丝块，放置于新的PDA平板中活化，22℃暗培养40h左右。清洗并消毒保鲜盒，在保鲜盒底部放置吸水纸，用于叶片储藏及培养，每个保鲜盒加入等量无菌水，封口备用。选取油菜倒数第二片展开、大小相同的6叶期新叶，放置于保鲜盒中，叶柄处用脱脂棉球保水，取6mm左右靠近平板边缘的新生菌丝块，避开主叶脉，朝下倒置在叶片同一位置，均匀等量喷水保湿，22℃暗培养，定期观察并记录核盘菌侵染情况，每个株系设置3个生物学重复。
2.DAB染色：选取菌丝扩展边缘同等大小的接菌36h的叶片，放置于50mL浓度为1mg/mL二氨基联苯胺溶液中，抽真空，静置20分钟，然后置于28℃培养箱中孵育8h，再浸泡在丙酮：甲醇1：1溶液中脱色8h，期间更换丙酮甲醇混合液1-2次，制片，最后用体视显微镜拍照并记录，以褐色深浅作为活性氧含量依据，每个株系设置3个生物学重复。
3.叶片提取物抗核盘菌实验：取2g同一部位、同等大小的叶片研磨至粉末状，加入30mL提取液混匀，提取液配方如下(1L用量)：MES(195.24g/mol)10.65g；Tris(121.14g/mol)12.14g；EDTA(372.24g/mol)0.03g；NaCl(58.44g/mol)1.74g。室温4500rpm离心30min；吸取上清并使用细菌滤膜除菌，以1：1比例加入PDA培养基保存。利用打孔器沿菌丝边缘打取6mm新生菌丝块，菌丝朝下放置于PDA培养基中央，以菌丝扩展面积作为抗核盘菌依据。
Claims (1)
1.延伸因子复合体BnELP2基因在调控油菜菌核病抗性中的应用。
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