CN117467681A - 结缕草耐盐基因ZjCHI1及其植物表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结缕草耐盐基因ZjCHI1及其植物表达载体和应用。结缕草中一个新的耐盐基因ZjCHI1，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述的植物表达载体为将ZjCHI1基因上下游分别引入同源重组臂的PCR产物与经BamHI单酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA1305.1质粒进行同源重组反应得到。本发明提供的结缕草ZjCHI1是一个新的耐盐基因，该基因可提高植物耐盐性，可在创造耐盐新种质、植物品种改良中应用。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及结缕草耐盐基因ZjCHI1及其植物表达载体和应用。
背景技术
土壤盐碱化是一个世界性的问题，盐碱化地区由于盐碱含量高，严重限制植物的生长，但盐碱地是重要的后备土地资源，培育耐盐植物新品种，是盐碱地改良、开发利用的有效措施和重要途径。传统的杂交育种、辐射诱变育种等在抗逆植物新品种培育方面做出了巨大贡献，然而存在周期长、效率低等不足，近年来，随着分子生物学的迅速发展，挖掘优异抗逆基因，通过快速高效的基因工程技术，将优异基因在植物体内过量表达以提高植物抗逆性已成为现代育种的重要手段。
几丁质酶(Chitinase)是一类糖苷水解酶，研究表明，植物几丁质酶(Chitinase)是响应生物和非生物胁迫的一种重要蛋白，且在响应盐胁迫和耐盐性调控过程中有着重要的作用。研究发现，拟南芥几丁质酶的活性在紫外线、热休克、盐胁迫、机械损伤时被诱导(Lima et a1.,2002；Gerhardt et a1.,2004；Kwon et al.,2007)；四棱豆的几丁质酶(Class I，Chitinase)基因(ChitiWb1)在NaCl的胁迫下表达上调(Tateishi et al.,2001)；芥菜(Brassica juncea)几丁质酶基因(BjCHI)表达受NaCl的胁迫高度诱导(Wu etal.,2009)；将渗透调节蛋白(OLP)和几丁质酶基因(Chil1)遗传转化西红柿，发现转基因植株的脯氨酸含量、K+含量、相对含水量、叶绿素荧光、生物量和果实产量等都高于野生型(Kumar et al.,2016)。
本发明通过GWAS关联技术从结缕草中获得了一个耐盐候选几丁质酶基因ZjCHI1，该基因与粟米同源基因的同源性最高，为59.72％；与其他单子叶植物高粱、水稻、玉米和黍的同源性分别为56.18％、53.71％、52.30％与54.77％，与双子叶植物拟南芥和烟草的同源性均为44.17％。由此，我们获得的ZjCHI1是一个新的耐盐候选基因；本发明的动因就是：将结缕草ZjCHI1构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法进行遗传转化，获得具有耐盐特性的新种质；本专利对于优良植物新品种的培育及在生产中的广泛应用，具有重要意义。
参考文献：
Lima VM,Magioli C,Gerhardt LBDA,Tarre E,Menezes RMG(2002)Bean classⅣchitinase promoter is modulated during plant development and under ahioticstress.Physiol Plantamm,116(4):512-521.
Gerhardt LBDA,Magioli C,Perez ABUCM,Margis R,Sachetto-Martins G(2004)AtchitlV gene expression is stimulated under abiotic stresses and isspatially and temporally regulated during embryo development.Genet Mol Biol27:118-123.
Kwon YR,Kim SH,Jung MS,Kim MS,Oh JE(2007)Arabidopsis hot2 encodes anendochitinase-like protein that is essential for tolerance to heat,salt anddrought stresses.The Plant Journal 49:184-193.
Tateishi Y,Umemura Y,Esaka M(2001)A basic class I chitinaseexpressing in winged bean is up-regulated by osmotic stress.Biosci BiotechnolBiochem 65:1663-1668.
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Kumar SA,Kumari PH,Jawahar G,Prashanth S,Suravajhala P,et al.(2016)Beyond just being foot soldiers-osmotin like protein(OLP)and chitinase(Chi11)genes act as sentinels to confront salt,drought,and fungal stress tolerancein tomato.Environmental and Experimental Botany132:53-65.
发明内容
针对背景技术提出的培育耐盐植物新种质的问题，本发明的目的在于提供一个新的结缕草耐盐基因ZjCHI1及其应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的另一目的在于提供一种含有上述结缕草耐盐基因ZjCHI1的生物材料及其应用。
本发明的又一目的在于提供一种提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质的方法。本发明所构建的植物表达载体可直接用于农杆菌介导的植物遗传转化，创制耐盐新种质，可用于植物品种改良。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供一种结缕草耐盐基因ZjCHI1，该基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
第二方面，本发明提供含有上述结缕草耐盐基因ZjCHI1的生物材料；进一步的，所述的生物材料为重组载体、表达盒，转基因细胞系或重组菌。
进一步优选的，所述的重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
更进一步优选的，所述的重组表达载体为将上述的结缕草耐盐基因ZjCHI1插入植物表达载体构建得到的结缕草耐盐基因ZjCHI1植物表达载体。
更进一步优选的，所述的重组表达载体为将带有同源重组臂的ZjCHI1基因片段与线性化后的pCAMBIA1305.1表达载体质粒进行同源重组反应得到的结缕草耐盐基因ZjCHI1植物表达载体。具体的，载体构建是使用ClonExpress IIOne Step Cloning Kit(Vazyme,Nanjing)同源重组克隆法，以BamHI为单酶切位点，与pCAMBIA-1305表达载体质粒进行重组反应得到。
在本发明的具体实施方式中，所述结缕草耐盐基因ZjCHI1植物表达载体的构建方法包括如下步骤：
(1)以结缕草cDNA为模板，设计引物ZjCHI1-F和ZjCHI1-R，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；
上游引物ZjCHI1-F：5′-ATGGCGAATTCACCATGGCCGACGAAC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物ZjCHI1-R：5′-CTAGCAGGTGAGGTTGCCCCCCGGGTCG-3′(SEQ ID NO.3)，
(2)以提取的阳性质粒为模板，设计植物表达载体pCAMBIA1305.1的构建引物1305-ZjCHI1-F和1305-ZjCHI1-R，进行PCR反应，将PCR产物与经BamHI单酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA1305.1质粒进行同源重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pCAMBIA1305.1-ZjCHI1构建成功；
上游引物1305-ZjCHI1-F：5′-aggaccggtcccgggggatccATGGCGAATTCACCATGGC-3′(SEQ ID NO.4)，
下游引物1305-ZjCHI1-R：5′-gcccttgctcaccatggatccGCAGGTGAGGTTGCCCCC-3′(SEQ ID NO.5)。
第三方面，用于克隆上述结缕草耐盐基因ZjCHI1的引物对也属于本发明的保护范围，该引物对的上下游引物如下所示：
上游引物ZjCHI1-F：5′-ATGGCGAATTCACCATGGCCGACGAAC-3′，
下游引物ZjCHI1-R：5′-CTAGCAGGTGAGGTTGCCCCCCGGGTCG-3′。
第四方面，本发明提供一种提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质的方法，该方法为在植物中过表达上述的结缕草耐盐基因ZjCHI1以提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质。
第五方面，上述的结缕草耐盐基因ZjCHI1，上述的生物材料，或上述的引物对在提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质中的应用也属于本发明的保护范围。
进一步的，所述的植物或植物为双子叶植物或单子叶植物；具体的，所述的单子叶植物选自结缕草、粟米、高粱、水稻、玉米和黍；所述的双子叶植物选自棉花、烟草或拟南芥。
本发明的有益效果
1.本发明提供的结缕草ZjCHI1是一个新的耐盐基因，该基因可提高植物耐盐性；
2.本发明构建的结缕草ZjCHI1植物表达载体为首次报道，可直接用于农杆菌介导的遗传转化，创造耐盐新种质，提高植物的耐盐性，可进行植物品种改良。
附图说明
图1pCAMBIA1305.1-ZjCHI1植物载体构建。
图2植物表达载体pCAMBIA1305.1-ZjCHI1构建过程的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M1：Marker 5000；1：ZjCHI1；M2：Marker 5000；2：pCAMBIA1305.1质粒BamHI单酶切；3：pCAMBIA1305.1-ZjCHI1表达载体质粒电泳图。
图3转基因拟南芥(ZjCHI1)与野生型(WT)PCR鉴定。
图4野生型与转基因拟南芥幼苗期耐盐性评价(表型观测)；
其中，WT：野生型；1-4，1-5和1-6为过表达ZjCHI1转基因后代。
图5野生型与转基因拟南芥不同盐浓度处理下生物量测定比较；
其中，WT：野生型；1-4，1-5和1-6为过表达ZjCHI1转基因后代。
具体实施方式
下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
实施例1.结缕草ZjCHI1基因的克隆
以结缕草种源材料‘Z011’为材料，选取健康的匍匐茎剪成含2-3个节的小段，通过水培法于1/2Hongland营养液水培30天后，转入含340mM NaCl的1/2Hongland营养液中处理24h，取0.1g幼嫩叶片，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书方法，提取叶片总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)取1μg总RNA反转录成cDNA，用RNase消化cDNA产物，运用primer 5软件设计引物扩增ZjCHI1；
上游引物ZjCHI1-F：5′-ATGGCGAATTCACCATGGCCGACGAAC-3′(SEQ ID NO.2)；
下游引物ZjCHI1-R：5′-CTAGCAGGTGAGGTTGCCCCCCGGGTCG-3′(SEQ ID NO.3)。
以提取的叶片cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，ZjCHI1-F、ZjCHI1-R引物各2.5μL(10μmol·L-1)，dNTP mix 1.0μL(10.0mmol·L-1)，TaqDNA Polymerase 0.5μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.5μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，用T4 DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5α感受态细胞，序列测定为SEQ ID NO.1。
实施例2.植物表达载体pCAMBIA1305.1-ZjCHI1的构建
根据ZjCHI1全长基因序列设计引物进行PCR反应，以上述实施例1中阳性质粒为模板，在ZjCHI1基因的上游和下游分别引入同源重组臂，
上游引物1305-ZjCHI1-F：5′-aggaccggtcccgggggatccATGGCGAATTCACCATGGC-3′(SEQ ID NO.4)；
下游引物1305-ZjCHI1-R：5′-gcccttgctcaccatggatccGCAGGTGAGGTTGCCCCC-3′(SEQ ID NO.5)。
用高保真酶(PrimeSTARTM HSDNA Polymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HS PCR Buffer 5.0μL，1305-ZjCHI1-F、1305-ZjCHI1-R引物各2.5μL(10μmol·L-1)，dNTP mix 1.0μL(10.0mmol·L-1)，PrimeSTARTM HSDNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.6μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收。
取质粒pCAMBIA1305.1用BamHI单酶切，酶切体系(40μL)：10×Buffer 4.0μL，质粒2.0ug，BamHI 2.5μL，加ddH2O到总体积40μL；37℃反应2h，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pCAMBIA1305.1。将PCR产物与经BamHI单酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA1305.1质粒进行LR重组反应，反应体系(20μL)：pCAMBIA1305.1线性化载体0.03pmol，ZjCHI1插入片段0.06pmol，5×Buffer 4.0μL，Exnase II 2.0μL，加ddH2O到总体积20μL；37℃反应30min，降至4℃冷却。取10μL重组产物转化DH5α感受态细胞，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pCAMBIA1305.1-ZjCHI1，电泳和测序验证。植物表达载体pCAMBIA1305.1-ZjCHI1构建成功(图1、图2)。
实施例3.植物表达载体pCAMBIA-1305-ZjCHI1遗传转化拟南芥及其耐盐性鉴定
①采用冻融法将ZjCHI1基因的超表达载体pCAMBIA-1305-ZjCHI1转化农杆菌菌株EHA105：吸取构建好的表达载体质粒5μg，加入到100μl农杆菌感受态中并混匀；将感受态细胞依次4℃冰浴5min，液氮冷冻5min，37℃水浴5min，4℃冰浴5min后，加入600μl LB液体培养基，置于28℃摇床中培养3h；将培养好的感受态细胞6000rpm离心，留100μl上清重悬沉淀，涂布于LB/Kan+/Rif+固体培养基上，28℃培养2d，挑取单克隆进行检测筛选。将获得的阳性克隆保存于-80℃，用于下一步的拟南芥转化。
②拟南芥转化采用蘸花法：将Columbia(Col-0)野生型拟南芥栽培于含1：1(w:w)的蛭石和营养土的培养容器中。在23℃，光照/黑暗时间为10h/14h条件下培养3周左右，待其盛花期时进行侵染；取保存的农杆菌在LB/Kan+/Rif+固体培养基上划板培养，至长出单克隆后挑取5-8个单克隆，接种于150mL LB/Kan+/Rif+液体培养基中，28℃下培养约16h；将培养好的菌液5000rpm离心10min，用含50g/L蔗糖、200ul/L Silwet L-77的1/2MS转化液悬浮沉淀至完全悬起；将含农杆菌的悬浮液浸泡野生型拟南芥花序1min，稍晾干后用保鲜膜包裹，在培养室暗培养12h后，打开保鲜膜于光下培养。约2-3周后，收取侵染后T0代成熟种子并晾干，保存于4℃，用于下一步筛选工作。
③种子消毒后播种：将收到的T0代的种子放入1.5mL离心管中，加入75％酒精1mL，振荡灭菌15min，在超净台中用灭菌的枪头吸出75％酒精，加入1mL无水乙醇，摇匀后将种子吸出打在无菌滤纸上吹干，然后把滤纸对折，轻轻敲击滤纸将种子均匀撒播到筛选培养基(1/2MS+25mg/L潮霉素+25mg/L氨苄青霉素)筛选培养10天，然后将抗性苗移栽到土中，用保鲜膜覆膜1周左右保湿；待抗性苗7～8片叶，提取拟南芥叶片DNA，PCR(引物1305-ZjCHI1-F，1305-ZjCHI1-R)鉴定(图3)。
④耐盐评价：经PCR鉴定的T1代转基因苗继续生长，采收T2代种子。对野生型和T2代抗性转基因拟南芥置于盐处理(0mM NaCl+MS培养基，125mM NaCl+MS培养基，150mM NaCl+MS培养基，175mM NaCl+MS培养基)生长14天，发现3个转ZjCHI1基因拟南芥的生长明显优于野生型拟南芥(图4，图5)，耐盐性显著提高。
综上所述，本发明构建了含有耐盐基因的植物表达载体pCAMBIA-1305-ZjCHI1，其中ZjCHI1首次报道。所构建的载体可导入植物中，提高植物的耐盐特性。
结缕草‘Z011’ZjCHI1基因(SEQ ID NO.1)
Claims (10)
1.结缕草耐盐基因ZjCHI1，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.含有权利要求1所述结缕草耐盐基因ZjCHI1的生物材料，其特征在于，所述的生物材料为重组载体、表达盒或重组菌。
3.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述的重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
4.根据权利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述的重组表达载体为将权利要求1所述的结缕草耐盐基因ZjCHI1插入植物表达载体构建得到的结缕草耐盐基因ZjCHI1植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于，所述的重组表达载体为将带有同源重组臂的ZjCHI1基因片段与线性化后的pCAMBIA1305.1表达载体质粒进行同源重组反应得到的结缕草耐盐基因ZjCHI1植物表达载体。
6.根据权利要求4或5所述的生物材料，其特征在于，所述结缕草耐盐基因ZjCHI1植物表达载体的构建方法包括如下步骤：
(1)以结缕草cDNA为模板，设计引物ZjCHI1-F和ZjCHI1-R，进行PCR反应，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒；
上游引物ZjCHI1-F：5′-ATGGCGAATTCACCATGGCCGACGAAC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物ZjCHI1-R：5′-CTAGCAGGTGAGGTTGCCCCCCGGGTCG-3′(SEQ ID NO.3)，
(2)以提取的阳性质粒为模板，设计植物表达载体pCAMBIA1305.1的构建引物1305-ZjCHI1-F和1305-ZjCHI1-R，进行PCR反应，将PCR产物与经BamHI单酶切线性化后的植物表达载体pCAMBIA1305.1质粒进行同源重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pCAMBIA1305.1-ZjCHI1构建成功；
上游引物1305-ZjCHI1-F：5′-aggaccggtcccgggggatccATGGCGAATTCACCATGGC-3′(SEQID NO.4)，
下游引物1305-ZjCHI1-R：5′-gcccttgctcaccatggatccGCAGGTGAGGTTGCCCCC-3′(SEQID NO.5)。
7.用于克隆权利要求所述结缕草耐盐基因ZjCHI1的引物对，其特征在于，该引物对的上下游引物如下所示：
上游引物ZjCHI1-F：5′-ATGGCGAATTCACCATGGCCGACGAAC-3′，
下游引物ZjCHI1-R：5′-CTAGCAGGTGAGGTTGCCCCCCGGGTCG-3′。
8.一种提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质的方法，其特征在于，在植物中过表达权利要求1所述的结缕草耐盐基因ZjCHI1以提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质。
9.权利要求1中所述的结缕草耐盐基因ZjCHI1，权利要求2-6中任一所述的生物材料，或权利要求7中所述的引物对在提高植物耐盐性或培育耐盐植物新种质中的应用。
10.如权利要求8中所述的方法，或权利要求9中所述的应用，其特征在于，所述的植物或植物为双子叶植物或单子叶植物；
所述的单子叶植物选自结缕草、粟米、高粱、水稻、玉米和黍；
所述的双子叶植物选自棉花、烟草或拟南芥。
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