ES2380017T3 - Polinucleótidos y polipéptidos en plantas - Google Patents

Abstract

Planta transgénica que sobreexpresa un polinucleótido recombinante, en la que dicha planta transgénica tiene una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o planta de tipo salvaje, en la que el polinucleótido codifica recombinante codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de SEQ ID No: 328, proporcionando dicho polipéptido una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido.

Description

Polinucleótidos y polipéptidos en plantas

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere al campo de la biología vegetal, y a composiciones y procesos para modificar el fenotipo de una planta.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] Los rasgos de una planta, tales como sus características bioquímicas, de desarrollo o fenotípicos, se pueden controlar a través de un conjunto de procesos celulares. Una manera importante para manipular ese control es a través de factores de transcripción – proteínas que influyen en la expresión den un gen o grupos de genes concretos. Las plantas transformadas y transgénicas comprenden células que presentan niveles alterados de por lo menos un factor de transcripción seleccionado y pueden posee rasgos ventajosos o deseables. Las estrategias para manipular rasgos mediante la alteración del contenido de factores de transcripción de células vegetales pueden dar lugar por tanto a plantas y cultivos con propiedades comercialmente valiosas nuevas y/o mejoradas.

[0003] Los factores de transcripción pueden modular la expresión génica, incrementando o disminuyendo (induciendo o reprimiendo) la velocidad de transcripción. Esta modulación da lugar a niveles diferenciales de la expresión génica en varias fases de desarrollo, en diferentes tejidos y tipos de células, y en respuesta a diferentes estímulos exógenos (por ejemplo, medioambientales) y endógenos a través del ciclo vital del organismo.

[0004] Debido a que los factores de transcripción son elementos controladores clave de rutas biológicas, la alteración de los niveles de expresión de uno o más factores de transcripción puede cambiar las rutas biológicas completas en un organismo. Por ejemplo, la manipulación de los niveles de factores de transcripción seleccionados puede dar lugar a una expresión incrementada de proteínas económicamente útiles o biomoléculas en plantas o la mejora en otras características agriculturalmente relevantes. En cambio, la expresión bloqueada o reducida de un factor de transcripción puede reducir la biosíntesis de compuestos no deseados o la eliminación de un rasgo no deseable. Por lo tanto, la manipulación de los niveles de factores de transcripción en una planta ofrece un tremendo potencial en biotecnología agrícola para modificar los rasgos de una planta.

[0005] EP 1 033 405 A describe una secuencia que tiene aproximadamente una identidad del 53,6% con la SEQ ID NO:328 de la presente descripción. La base de datos EMBL de no. de acceso AP000604 es un ADN genómico de Arabidopsis thaliana, cromosoma 3, secuencia que corresponde con la SEQ ID NO:327 de la presente descripción.

[0006] Se han identificado polinucleótidos que codifican factores de transcripción, desarrollado numerosas plantas transgénicas utilizando estos polinucleótidos, y han analizado las plantas por una variedad de rasgos importantes. Al hacer esto, se han identificado secuencias de polinucleótidos y polipéptidos para producir plantas y cultivos comercialmente valiosos, así como procesos para fabricarlos y utilizarlos. A continuación, se describen otros aspectos y realizaciones de la invención y pueden derivar de las enseñanzas de esta descripción de forma global.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

[0007] La presente invención proporciona una planta transgénica que sobreexpresa un polinucleótido recombinante, en la que dicha planta transgénica tiene una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o planta de tipo salvaje, en la que el polinucleótido recombinante codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de la SEQ ID NO:328, proporcionando dicho polipéptido una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido.

[0008] En un aspecto, el polipéptido comprende un dominio conservado que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el dominio conservado de los residuos 5-50 del polipéptido de SEQ ID NO:328.

[0009] En un aspecto, dicho polipéptido comprende SEQ ID NO:328.

[0010] En una realización, en la planta transgénica de la invención, el polinucleótido recombinante comprende un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido unido operativamente a dicha secuencia de polinucleótido.

[0011] La presente invención proporciona además una célula vegetal huésped que comprende un cassette de expresión que sobreexpresa un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido, en el que dicho polipéptido es tal como se define anteriormente.

[0012] En otro aspecto, la planta trnasgénica de la invención comprende hipocótilos más largos y peciolos alargados en comparación con una planta no transgénica o planta de tipo salvaje.

[0013] La planta trnasgénica de la invención se puede seleccionar del grupo que consiste en: soja, patata, algodón, colza oleaginosa, canola, girasol, alfalfa, trébol, plátano, mora, arándano, fresa, frambuesa, cantalupo, zanahoria, coliflor, café, pepino, berenjena, uvas, melón dulce, lechuga, mango, melón, cebolla, papaya, guisantes, pimientos, piña, calabaza, espinaca, calabacín, tabaco, tomate, tomatillo, sandía, drutas rosáceas, árboles frutales, crucíferas, cebada; trigo, maíz, máiz dulce, arroz, centeno; caña de azúcar, césped; mijo; sorgo; grosella; aguacate; cítricos, naranjas, limones, pomelo, mandarinas, alcachofa, cerezas; nuez, cacahuete; endibia; puerro; arrurruz, remolacha, mandioca, nabo, rábano, batata, boniato; judías, pino, álamo, eucalipto y menta.

[0014] La presente invención proporciona además una parte de planta de la planta transgénica de la invención definida anteriormente que comprende un cassette de expresión que comprende el polinucleótido recombinante, en la que la parte de planta se selecciona entre fruto, hoja, raíz, tejido vegetal, incluyendo tejido vascular o fundamental,

o células vegetales. La invención proporciona además una semilla de la planta transgénica de la invención definida anteriormente, en la que dicha semilla comprende un cassette de expresión que comprende el polinucleótido recombinante.

[0015] La presente invención proporciona un proceso para producir una planta transgénica de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el proceso las etapas: (a) producir un cassette de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de la SEQ ID NO:328; (b) introducir el cassette de expresión en la planta; y (c) identificar y seleccionar una planta con producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o una planta de tipo salvaje.

[0016] La presente invención también proporciona un proceso para producir una planta transgénica que tiene el rasgo alterado de producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o una planta de tipo salvaje, comprendiendo el proceso las etapas: (a) proporcionar un vector de expresión que comprende: (i) un polinucleótido recombinante que el polinucleótido recombinante codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de SEQ ID NO:328; y (ii) por lo menos un elemento regulador que flanquea la secuencia de polinucleótido, siendo dicho por lo menos un elemento regulador efectivo en el control de la expresión de dicho polinucleótido recombinante en una planta diana; (b) introducir el vector de expresión en una célula vegetal, produciendo así una célula vegetal transgénica; (c) crecer la célula vegetal transgénica en una planta transgénica y permitir que la planta transgénica sobreexprese un polipéptido codificado por el polinucleótido recombinante, teniendo dicho polipéptido la propiedad de producción mejorada en una planta en comparación con una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido; y (d) identificar por lo menos una planta transgénica con dicha producción mejorada mediante la comparación de dicha planta transgénica con por lo menos una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido.

[0017] La presente invención proporciona además la utilización de un polinucleótido recombinante que el polinucleótido recombinante codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de SEQ ID NO:328, para producir una planta transgénica que tiene una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido. Opcionalmente, el polinucleótido comprende un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido unido operativamente a dicha secuencia de polinucleótidos.

Breve descripción del listado de secuencias y figuras

[0018] El listado de secuencias proporciona secuencias de polinucleótidos y polipétidos de ejemplo. Los rasgos asociados con la utilización de las secuencias se incluyen en los ejemplos.

La figura 1 muestra una evaluación conservativa de relaciones filogenéticas entre las órdenes de plantas con flores (modificado de Angiosperm Phylogeny Group (1998) Ann. Missouri Bot. Gard. 84: 1-49). Las plantas con un solo cotiledón (monocotiledóneas) son un clado monofilético anidado dentro de por lo menos dos linajes principales de dicotiledóneas; las eudicotiledóneas se dividen además en rósidas y astérides. Arabidopsis es una eucotiledónea rósida dentro del orden de las brasicáceas; el arroz es un miembro de las monocotiledóneas del orden poales. La figura 1 se ha adaptado de Daly y col. (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333.

La figura 2 muestra un dendograma filogenético que representa las relaciones de la taxonomía de las plantas superiores, incluyendo clados que contienen el tomate y Arabidopsis, adaptado de Ku y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 9121-9126; y Chase y col. (1993) Ann. Missouri Bot. Gard. 80: 528-580.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES DE EJEMPLO

[0019] En un importante aspecto, la presente invención se refiere a la utilización de polinucleótidos y polipéptidos, por ejemplo, para modificar fenotipos de plantas, en particular los asociados con la mejora del estrés por sequía. A lo largo de toda esta descripción, se hace referencia a diferentes fuentes de información. Las fuentes de información incluyen artículos de revistas científicas, documentos de patentes, libros de texto, y direcciones de páginas inactivas del explorador de la Red, por ejemplo. Se puede contar con y usar los contenidos y las enseñanzas de todas y cada una de las fuentes de información para hacer y usar las realizaciones de la invención.

[0020] Debe indicarse que, tal como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen las referencias plurales salvo que se indique de otra forma claramente en el contexto. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a “una planta” incluye una pluralidad de dichas plantas, y una referencia a “un estrés” es una referencia a uno o más estreses y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, etc.

[0021] Las secuencias de polinucleótidos descritas aquí codifican polipéptidos que son miembros de familias de factores de transcripción conocidos, incluyendo familias de factores de transcripción de plantas, tal como se describe en las Tablas 4-9. En general, los factores de transcripción codificados por las presentes secuencias están implicados en la diferenciación y proliferación celular y la regulación del crecimiento. Por consiguiente, un experto en la materia reconocería que mediante la expresión de las presentes secuencias en una planta, se puede cambiar la expresión de genes autólogos o inducen la expresión de genes introducidos. Al afectar la expresión de secuencias autólogas similares en una planta que tiene la actividad biológica de las presentes secuencias, o al introducir las presentes secuencias en una planta, se puede alterar un fenotipo de planta a uno con rasgos mejorados. Las secuencias también se pueden utilizar para transformar una planta e introducir rasgos deseados no hallados en el cultivar o cepa de tipo salvaje. A continuación se pueden seleccionar las plantas para aquellas que producen el grado más deseable de sobreexpresión o subexpresión de genes diana de interés y la mejora de rasgos coincidentes.

[0022] Las secuencias pueden ser de cualquier especie, particularmente especies de plantas, en una forma natural

o de cualquier origen ya sea natural, sintética, semisintética o recombinante. Las secuencias también pueden incluir fragmentos de las presentes secuencias de aminoácidos. Cuando se menciona “secuencia de aminoácidos” para referirse a una secuencia de aminoácidos de una molécula proteica natural, “secuencia de aminoácidos” y términos similares no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada con la molécula proteica indicada.

[0023] Tal como un experto en la materia reconoce, los factores de transcripción se pueden identificar por la presencia de una región o dominio de similitud o identidad estructural con una secuencia consenso específica o la presencia de un sitio de unión a ADN consenso específico o motivo de un sitio de unión a ADN específico (véase, por ejemplo, Riechmann et al. (2000) Science 290: 2105-2110). Los factores de transcripción de una planta pueden pertenecer a una de las siguientes familias de factores de transcripción: la familia del factor de transcripción del dominio AP2 (APETALA2) (Riechmann y Meyerowitz (1998) Biol. Chem. 379: 633-646); la familia del factor de transcripción MYB (ENBib; Martin y Paz-Ares (1997) Trends Genet. 13: 67-73); la familia del factor de transcripción del dominio MADS (Riechmann y Meyerowitz (1997) Biol. Chem. 378: 1079-1101); la familia de la proteína WRKY (Ishiguro y Nakamura (1994) Mol. Gen. Genet. 244: 563-571); la familia de proteína de repetición ankyrin (Zhang et al. (1992) Plant Cell 4: 1575-1588); la familia de proteínas de dedos de zinc (Z) (Klug y Schwabe (1995) FASEB J. 9: 597-604); Takatsuji (1998) Cell. Mol. Life Sci. 54:582-596); la familia de proteínas homeobox (HB) (Buerglin (1994) en Guidebook to the Homeobox Genes, Duboule (ed.) Oxford University Press); las proteínas de unión a elemento CAAT (Forsburg y Guarente (1989) Genes Dev. 3: 1166-1178); proteínas de unión a promotor escuamosa (SPB) (Klein et al. (1996) Mol. Gen. Genet. 1996 250: 7-16); la familia de proteínas NAM (Souer et al. (1996) Cell 85: 159170); las proteínas IAA/AUX (Abel et al. (1995) J. Mol. Biol. 251: 533-549); la familia de proteínas HLH/MYC (Littlewood et al. (1994) Prot. Profile 1: 639-709); la familia de proteínas de unión a ADN (DBP) (Tucker et al. (1994) EMBO J. 13: 2994-3002); la familia de factores de transcripción bZIP (Foster et al. (1994) FASEB J. 8: 192-200); la familia de proteínas de unión a Box P (la BPF-1) (da Costa e Silva et al. (1993) Plant J. 4: 125-135); la familia del grupo de movilidad elevada (HMG) (Bustin y Reeves (1996) Prog. Nucl. Acids Res. Mol. Biol. 54: 35-100); la familia “espantapájaros” (SCR) (Di Laurenzio et al. (1996) Cell 86: 423-433); la familia GF14 (Wu et al. (1997) Plant Physiol.

114: 1421-1431); la familia polycomb (PCOMB) (Goodrich et al. (1997) Nature 386: 44-51); la familia ramificada teosinte (TEO) (Luo et al. (1996) Nature 383: 794-799); la familia ABI3 (Giraudat et al. (1992) Plant Cell 4: 12511261); la familia de la triple hélice (TH) (Dehesh et al. (1990) Science 250: 1397-1399); la familia EIL (Chao et al. (1997) Cell 89: 1133-44); la familia AT-HOOK (Reeves y Nissen (1990) J. Biol. Chem. 265: 8573-8582); la familia S1FA (Zhou et al. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 1165-1169); la familia bZIPT2 (Lu y Ferl (1995) Plant Physiol. 109: 723); la familia YABBY (Bowman et al. (1999) Development 126: 2387-96); la familia PAZ (Bohmert et al. (1998) EMBO J. 17: 170-80); una familia de factores de transcripción diversos (MISC), incluyendo la familia DPBF (Kim et al. (1997) Plant J. 11: 1237-1251) y la familia SPF1 (Ishiguro y Nakamura (1994) Mol. Gen. Genet. 244: 563-571); la familia GARP (Hall et al. (1998) Plant Cell 10: 925-936), la familia TUBBY (Boggin et al (1999) Science 286 : 21192125), la familia de choque térmico (Wu (1995) Annu. Rev. Cell Dev, Biol. 11: 441-469), la familia ENBP (Christiansen et al. (1996) Plant Mol. Biol. 32: 809-821), la familia de ANILLO-zinc (Jensen et al. (1998) FEBS Letters

436: 283-287), la familia PDBP (Janik et al. (1989) Virology 168: 320-329), la familia PCF (Cubas et al. Plant J. (1999) 18: 215-22), la familia SRS (relacionada con SHI) (Fridborg et al. (1999) Plant Cell 11: 1019-1032), la familia CPP (similar a polycomb rica en cisteína) (Cvitanich et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 8163-8168), la familia ARF (factor de respuesta a auxina) (Ulmasov et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 5844-5849), la familia SWI/SNF (Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23: 255-275), la familia ACBF (Seguin et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35: 281-291), la familia PCGL (similar a CG-1) (da Costa e Silva et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25: 921-924) la familia ARID (Vazquez et al. (1999) Development 126: 733-742), la familia Jumonji (Balciunas et al. (2000), Trends Biochem. Sci. 25: 274-276), la familia bZIPNIN (Schauser et al. (1999) Nature 402: 191-195), la familia E2F (Kaelin et al. (1992) Cell 70: 351-364) y la familia similar a GRF (Knaap et al. (2000) Plant Physiol. 122: 695-704). Tal como se indica en cualquier parte de la lista anterior y tal como se conoce en la técnica, los factores de transcripción se han clasificado a veces por la clase, familia y subfamilia según su contenido estructural y motivo del sitio de unión a ADN consenso, por ejemplo. Muchas de las clases y muchas de las familias y subfamilias se indican aquí. La lista proporcionada aquí es simplemente un ejemplo de los tipos de factores de transcripción y el conocimiento disponible con respecto a las secuencias consenso y los motivos de unión a ADN consenso que ayudan a definirlos tal como se conoce por los expertos en la materia. Un factor de transcripción puede incluir, pero sin limitación, cualquier polipéptido que puede activar o reprimir la transcripción de un único gen o grupo de genes. Este grupo de polipéptidos incluye, pero sin limitación, proteínas de unión a ADN, proteínas de unión a proteínas de unión a ADN, proteína quinasas, proteína fosfatasas, proteína metiltransferasas, proteínas de unión a GTP y receptores, y similares.

[0024] Además de los procesos para modificadar un fenotipo de una planta mediante la utilización de uno o más polinucleótidos y polipéptidos descritos aquí, los polinucleótidos y polipéptidos presentan una variedad de usos adicionales. Estos usos incluyen su uso en la producción recombinante (es decir, expresión) de proteínas; como reguladores de la expresión génica en plantas, como sondas de diagnóstico para la presencia de ácidos nucleicos complementarios o parcialmente complementarios (incluyendo para la detección de ácidos nucleicos codificantes naturales); como sustratos para reacciones posteriores, por ejemplo, reacciones de mutación, reacciones PCR, o similares; como sustratos para la clonación, por ejemplo, incluyendo reacciones de digestión o unión; y para identificar moduladores exógenos o endógenos de los factores de transcripción.

Definiciones

[0025] “Molécula de ácido nucleico” se refiere a un oligonucleótido, polinucleótido o cualquier fragmento de los mismos. Puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético, de doble cadena o una cadena, y combinado con hidratos de carbono, lípidos, proteínas u otros materiales para llevar a cabo una actividad particular tal como transformación o formación de una composición útil tal como un ácido nucleico peptídico (PNA).

[0026] “Polinucleótido” es una molécula de ácido nucleico que comprende una pluralidad de nucleótidos polimerizados, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15 nucléotidos polimerizados consecutivos, opcionalnmente por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos consecutivos, por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos consecutivos. Un polinucleótido puede ser un ácido nucleico, oligonucleótido, nucleótido o cualquier fragmento de los mismos. En muchos casos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (o proteína) o un dominio o fragmento del mismo. Además, el polinucleótido puede comprender un promotor, un intrón, una región potenciadora, un sitio de poliadenilación, un sitio de inicio de la traducción, regiones 5’ o 3’ no traducidas, un gen indicador, un marcador seleccionable, o similares. El polinucleótido puede ser ADN o ARN de una cadena o de doble cadena. El polinucleótido comprende opcionalmente bases modificadas o una cadena principal modificada. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN o ARN genómico, un transcrito (tal como un ARNm), un ADNc, un producto de la PCR, un ADN clonado, un ADN o ARN sintético, o similares. El polinucleótido puede estar combinado con hidratos de carbono, lípidos, proteínas u otros materiales para realizar una actividad particular tal como una transformación o formar una composición útil tal como un ácido nucleico-peptídico (PNA). El polinucleótido puede comprender una secuencia en orientación de sentido directo o sentido contrario. “Oligonucleótido” es sustancialmente equivalente a los términos amplímero, cebador, oligómero, elemento, diana y sonda y es preferiblemente monocatenario.

[0027] “Gen” o “secuencia génica” se refiere a la secuencia codificante parcial o completa de un gen, su complemento y sus regiones 5’ o 3’ no traducidas. Un gen también es una unidad funcional de herencia, y en términos físicos es un segmento o secuencia particular de nucleótidos a lo largo de una molécula de ADN (o ARN, en el caso de virus de ARN) implicada en la producción de una cadena de polipéptido. Esta última se puede someter a un procesamiento posterior tal como corte y empalme, y plegado para obtener una proteína o polipéptido funcional. Un gen se puede aislar parcialmente o puede encontrarse con un genoma del organismo. A modo de ejemplo, un gen de un factor de transcripción codifica un polipéptido de factor de transcripción, que puede ser funcional o requiere procesamiento para funcionar como un iniciador de la transcripción.

[0028] Desde un punto de vista operativo, los genes se pueden definir por el ensayo cis-trans, un ensayo genético que determina si hay dos mutaciones en el mismo gen y esto se puede usar para determinar los límites de la unidad genéticamente activa (Rieger y col. (1976) “Glossary of Genetics and Cytogenetics: Classical and Molecular”, 4ª ed., Springer Verlag. Berlín). Un gen en general incluye regiones que preceden (“líderes”; en la dirección 5’) y que siguen (“remolques”; dirección 3’) a la región codificante. Un gen puede incluir también secuencias no codificantes, intercaladas, denominadas “intrones” localizadas entre segmentos codificantes individuales denominados “exones”. La mayoría de los genes tienen una región promotora asociada, una secuencia 5’ reguladora del codón de inicio de la transcripción (hay algunos genes que no tienen un promotor identificable). La función de un gen también puede ser regulada por potenciadores, operadores y otros elementos reguladores.

[0029] “Un polinucleótido recombinante” es un polinucleótido que no está en su estado natural, por ejemplo, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que no se encuentra en la naturaleza, o el polinucleótido está en un contexto distinto del que se encuentra de forma natural, por ejemplo, separado de secuencias de nucleótidos de las que normalmente está próximo en la naturaleza, o secuencias de nucleótidos adyacentes (o contiguas) con las que normalmente no está próximo. Por ejemplo, la secuencia en cuestión se puede clonar en un vector, o recombinar de otra forma con uno o más ácidos nucleicos adicionales.

[0030] Un “polinucleótido aislado” es un polinucleótido, sea natural o recombinante, que está presente fuera de la célula en la que normalmente se encuentra en la naturaleza, sea purificado o no. Opcionalmente, un polinucleótido aislado se somete a uno o más procedimientos de enriquecimiento o purificación, por ejemplo, lisis celular, extracción, centrifugación, precipitación, o similares.

[0031] Un “polipéptido” es una secuencia de aminoácidos que comprende una pluralidad de residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos, por ejemplo, por lo menos aproximadamente 15 residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos, opcionalmente por lo menos aproximadamente 30 residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos, por lo menos aproximadamente 50 residuos de aminoácidos polimerizados consecutivos. En muchos casos, un polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos polimerizados que es un factor de transcripción o un dominio o parte o un fragmento del mismo. Además, el polipéptido puede comprender: 1) un dominio de localización; 2) un dominio de activación; 3) un dominio de represión; 4) un dominio de oligomerización; o 5) un dominio de unión a ADN, o similares. El polipéptido comprende opcionalmente residuos de aminoácidos modificados, residuos de aminoácidos naturales que no codifican un codón,

o residuos de aminoácidos no naturales.

[0032] “Proteína” se refiere a una secuencia de aminoácidos, oligopéptido, péptido, polipéptido o partes de los mismos sean naturales o sintéticos.

[0033] “Parte”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier parte de una proteína usada para cualquier propósito, pero en especial para el cribado de una biblioteca de moléculas que se unen específicamente a esa parte o para la producción de anticuerpos.

[0034] Un “polipéptido recombinante” es un polipéptido producido por la traducción de un polinucleótido recombinante. Un “polipéptido sintético” es un polipéptido creado por polimerización consecutiva de residuos de aminoácidos aislados usando procedimientos conocidos en la técnica. Un “polipéptido aislado”, sea un polipéptido natural o recombinante, está más enriquecido en (o fuera de) una célula que el polipéptido en su estado natural en una célula salvaje, por ejemplo enriquecido en más de aproximadamente 5%, o más de aproximadamente un 20%, o más de aproximadamente un 50%, es decir, alternativamente indicado como: 105%, 110%, 120%, 150% o más enriquecido con respecto al tipo salvaje normalizado a 100%. Dicho enriquecimiento no es el resultado de una respuesta natural de una planta tipo salvaje. Alternativa o adicionalmente, el polipéptido aislado se separa de otros componentes celulares con los que está normalmente asociado, por ejemplo, por cualquiera de los diferentes procedimientos de purificación de proteínas del presente documento.

[0035] “Homología” se refiere a la similitud de secuencia entre una secuencia de referencia y por lo menos un fragmento de un inserto de clon secuenciado nuevo o su secuencia de aminoácidos codificada.

[0036] "Complejo de hibridación" se refiere a un complejo entre dos moléculas de ácido nucleico por la formación de enlaces de hidrógeno entre purinas y pirimidinas.

[0037] “Identidad” o “similitud” se refieren a la similitud de secuencias entre dos secuencias de polinucleótidos o entre dos secuencias de polipéptidos, siendo la identidad la comparación más rigurosa. Las frases “porcentaje de identidad” y “% de identidad” se refieren al porcentaje de similitud de secuencia encontrado en una comparación de dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. “Similitud de secuencia” se refiere al porcentaje de similitud en la secuencia de pares de bases (determinado por cualquier proceso adecuado) entre dos o más secuencias de polinucleótidos. Dos o más secuencias pueden tener una similitud en cualquier punto de 0100%, o cualquier valor entero entre estos. La identidad o similitud se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se pueden alinear para los propósitos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base de nucleótido o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El grado de similitud o identidad entre secuencias de polinucleótidos es una función del número de nucléotidos idénticos o emparejamientos en posiciones compartidas por las secuencias de polinucleótidos. El grado de identidad de una secuencia de polipéptido es una función del número de aminoácidos idénticos en las posiciones compartidas por las secuencias de polipéptidos. El grado de homología o similitud de secuencias de polipéptidos es una función del número de aminoácidos en las posiciones compartidas por las secuencias de polipéptidos.

[0038] La expresión “patrón consenso de aminoácidos” se refiere a la parte o a la subsecuencia de una secuencia de polipéptido que está sustancialmente conservada entre los factores de transcripción polipeptídicos listados en la Lista de Secuencias.

[0039] “Alineamiento” se refiere a una serie de secuencias de ADN o aminoácidos alineadas para la comparación longitudinalmente de modo que los componentes comunes (es decir bases de nucleótidos o residuos de aminoácidos) se pueden identificar de forma visual y fácil. El número de componentes en común está relacionada con la homología o identidad entre las secuencias. Los alineamientos se pueden usar para identificar dominios conservados y relacionados dentro de estos dominios. Un alineamiento se puede determinar de forma adecuada mediante programas de ordenador conocidos en la técnica, tales como MacVector (1999) (Accelrys, Inc., San Diego, CA).

[0040] Un “dominio conservado” o “región conservada” como se usa en el presente documento, se refiere a una región en secuencias de polinucleótidos o polipéptidos heterólogas en la que hay un grado de identidad de secuencia relativamente alto entre las distintas secuencias.

[0041] Con respecto a los polinucleótidos que codifican los presentes factores de transcripción descritos, una región conservada preferiblemente tiene por lo menos 10 pares de bases (pb) de longitud.

[0042] Un “dominio conservado”, con respecto a los presentes polipéptidos descritos se refiere a un dominio dentro de un familia de los factores de transcripción que presenta un grado de homología de secuencia superior, tal como por lo menos 80% de similitud de secuencia, e incluso más preferiblemente por lo menos 85% o por lo menos aproximadamente 86%, o por lo menos aproximadamente 87%, o por lo menos aproximadamente 88%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de los residuos de aminoácidos de un polipéptido de residuos de aminoácidos consecutivos. Un fragmento o dominio puede denominarse fuera de un dominio conservado, fuera de una secuencia consenso o fuera de un sitio de unión al ADN consenso, cuando se sabe que existen o que existe para una clase, familia o su familia de factores de transcripción particulares. En este caso, el fragmento o dominio no incluirá los aminoácidos exactos de una secuencia consenso o sitio de unión al ADN consenso de una clase, familia o subfamilia de factores de transcripción, o los aminoácidos exactos de una secuencia consenso o sitio de unión al ADN consenso de factor de transcripción particular. Además, un fragmento, región o dominio particular de un polipéptido, o un polinucleótido que codifica un polipéptido, puede estar “fuera de un dominio conservado” si todos los aminoácidos del fragmento, región o dominio están fuera de un dominio o dominios conservados definidos para un polipéptido o proteína. Las secuencias que tienen un grado de identidad menor pero actividad biológica comparable se considera que son equivalentes.

[0043] Tal como un experto en la materia reoconoce, se pueden identificar dominios conservados como regiones o dominios de identidad a una secuencia consenso específica (véase, por ejemplo, Riechmann et al. (2000) supra). De este modo, utilizando procesos de alineación conocidos en la técnica, se pueden determinar los dominios conservados de los factores de transcripción de plantas para cada uno de los siguientes: la familia del factor de transcripción del dominio AP2 (APETALA2) (Riechmann y Meyerowitz (1998) supra); la familia del factor de transcripción MYB (ENBib; Martin y Paz-Ares (1997) supra); la familia del factor de transcripción del dominio MADS (Riechmann y Meyerowitz (1997) supra; Immink et al. (2003) supra); la familia de la proteína WRKY (Ishiguro y Nakamura (1994) supra); la familia de proteína de repetición ankyrin (Zhang et al. (1992) supra); la familia de proteínas de dedos de zinc (Z) (Klug y Schwabe (1995) supra; Takatsuji (1998) supra); la familia de proteínas homeobox (HB) (Buerglin (1994) supra); las proteínas de unión a elemento CAAT (Forsburg y Guarente (1989) supra); proteínas de unión a promotor escuamosa (SPB) (Klein et al. (1996) supra); la familia de proteínas NAM (Souer et al. (1996) supra); las proteínas IAA/AUX (Abel et al. (1995) supra); la familia de proteínas HLH/MYC (Littlewood et al. (1994) supra); la familia de proteínas de unión a ADN (DBP) (Tucker et al. (1994) supra); la familia de factores de transcripción bZIP (Foster et al. (1994) supra); la familia de proteínas de unión a Box P (la BPF-1) (da Costa e Silva et al. (1993) supra); la familia del grupo de movilidad elevada (HMG) (Bustin y Reeves (1996) supra); la familia “espantapájaros” (SCR) (Di Laurenzio et al. (1996) supra); la familia GF14 (Wu et al. (1997) supra); la familia polycomb (PCOMB) (Goodrich et al. (1997) supra); la familia ramificada teosinte (TEO) (Luo et al. (1996) supra); la familia ABI3 (Giraudat et al. (1992) supra); la familia de la triple hélice (TH) (Dehesh et al. (1990) supra); la familia EIL (Chao et al. (1997) supra); la familia AT-HOOK (Reeves y Nissen (1990) supra); la familia S1FA (Zhou et al. (1995) supra); la familia bZIPT2 (Lu y Ferl (1995) supra); la familia YABBY (Bowman et al. (1999) supra); la familia PAZ (Bohmert et al. (1998) supra); una familia de factores de transcripción diversos (MISC), incluyendo la familia DPBF (Kim et al. (1997) supra) y la familia SPF1 (Ishiguro y Nakamura (1994) supra); la familia GARP (Hall et al. (1998) supra), la familia TUBBY (Boggin et al (1999) supra), la familia de choque térmico (Wu (1995) supra), la familia ENBP (Christiansen et al. (1996) supra), la familia de ANILLO-zinc (Jensen et al. (1998) supra), la familia PDBP (Janik et al. (1989) supra), la familia PCF (Cubas et al. Plant J. (1999) supra), la familia SRS (relacionada con SHI) (Fridborg et al. (1999) supra), la familia CPP (similar a polycomb rica en cisteína) (Cvitanich et al. (2000) supra), la familia ARF (factor de respuesta a auxina) (Ulmasov et al. (1999) supra), la familia SWI/SNF (Collingwood et al. (1999) supra), la familia ACBF (Seguin et al. (1997) supra), la familia PCGL (similar a CG-1) (da Costa e Silva et al. (1994) supra) la familia ARID (Vazquez et al. (1999) supra), la familia Jumonji (Balciunas et al. (2000), supra), la familia bZIPNIN (Schauser et al. (1999) supra), la familia E2F (Kaelin et al. (1992) supra) y la familia similar a GRF (Knaap et al. (2000) supra).

[0044] Los dominios conservados de SEQ ID NO: 328 se indican en la Tabla 5.

[0045] “Complementaria” se refiere a los enlaces de hidrógeno naturales de emparejamiento de bases entre purinas y pirimidinas. Por ejemplo, la secuencia A-C-G-T (5’'3') forma enlaces de hidrogeno con sus complementarias A-C-G-T (5’ ' 3') o A -C-G-U (5’'3'). Dos moleculas de monocatenarias se pueden considerar parcialmente complementarias si forman enlace sólo algunos de los nucleótidos, o “completamente complementarias” si forman enlace todos los nucleótidos. El grado de complementariedad entre cadenas de ácido nucleico afecta a la eficacia y fuerza de las reacciones de hibridación y amplificación. “Totalmente complementarias” se refiere al caso en el que la formación de enlaces se produce entre cada uno de los pares de bases y sus complementarios en una pareja de secuencias, y las dos secuencias tienen el mismo número de nucleótidos.

[0046] Las expresiones “muy riguroso” o “condiciones muy rigurosas” se refiere a condiciones que permiten la hibridación de cadenas de ADN cuyas secuencias son muy complementarias, en las que las mismas condiciones excluyen la hibridación de ADN con emparejamientos erróneos significativos. Las secuencias de polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con los polinucleótidos la presente invención pueden ser, por ejemplo, variantes de las secuencias de polinucleótidos descritas, incluyendo variantes alélicas o de corte y empalme, o secuencias que codifican ortólogos o parálogos de los presentes polipéptidos descritos. Los procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos se describen en detalle en Kashima y col. (1985) Nature 313:402-404, Sambrook y col. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

N.Y. ("Sambrook"), y en Hames y Higgins, "Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach", IRL Press, Washington, D.C. (1985), cuyas referencias se incorporan en el presente documento por referencia.

[0047] En general, las condiciones rigurosas se determinan por la temperatura, fuerza iónica y concentración de los agentes desnaturalizantes (por ejemplo, formamida) usados en una hibridación y el procedimiento de lavado (para una descripción más detallada para establecer y determinar las condiciones rigurosas, véase a continuación). El grado con que hibridan dos ácidos nucleicos en diferentes condiciones rigurosas esta correlacionado con la extensión de su similitud. Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos similares de una variedad de fuentes, tal como en el genoma de una planta (como es el caso de parálogos) o de otra planta (como es el caso de ortólogos) que pueden realizar funciones similares, se pueden aislar basándose en su capacidad de hibridar con secuencias de factores de transcripción conocidas. Son posibles numerosas variaciones en las condiciones y medios con los que se puede realizar la hibridación de ácidos nucleicos para aislar secuencias de factores de transcripción que tienen similitud con las secuencias de factores de transcripción conocidas en la técnica, y no están limitados a los que se describen explícitamente en el presente documento. Dicho procedimiento se puede usar para aislar secuencias de polinucleótidos que tienen diferentes grados de similitud con las secuencias de factores de transcripción descritos, tal como por ejemplo factores de transcripción que tienen 60% de identidad, o más preferiblemente más de aproximadamente 70% de identidad, lo más preferiblemente 72% de identidad o identidad mayor con los factores de transcripción descritos.

[0048]El término "equivalogo” describe miembros de un conjunto de proteínas homólogas que son conservadas con respecto a su función desde su último ancestro común. Las proteínas relacionadas se agrupan en familias de equivalogos, y por otra parte en familias de proteínas con otros tipos de homología jerárquicamente definidas. Esta definición se proporciona en el sitio web (www) del Institute for Genomic Research (TIGR), "tigr.org" bajo el título "Terms associated with TIGRFAMs". Institute for Genomic Research (TIGR) página web (www), "tigr.org" bajo el título "Terms associated with TIGRFAMs".

[0049] El término “variante”, como se usa en el presente documento, se puede referir a polinucleótidos o polipéptidos que difieren entre sí en la secuencia de los polinucleótidos o polipéptidos descritos en el presente documento, respectivamente, y se exponen más adelante.

[0050] Con respecto a las variantes de polinucleótidos, las diferencias entre los polinucleótidos descritos en el presente documento y las variantes de polinucleótidos están limitadas de modo que las secuencias de nucleótidos de los primeros y de estos últimos son en general muy similares y, en muchas regiones, idénticos. Debido a la degeneración del código genético, la diferencia entre las primeras y estas últimas secuencias de nucleótidos puede ser silenciosa (es decir, los aminoácidos codificados por el polinucleótido son los mismos, y la secuencia de polinucleótidos variante codifica la misma secuencia de aminoácidos que el presente polinucleótido descrito. Las secuencias de nucleótidos variantes pueden codificar secuencias de aminoácidos diferentes, en cuyo caso dichas diferencias de nucleótidos darán como resultado sustituciones, adiciones, eliminaciones, inserciones, truncados o fusiones de aminoácidos, con respecto a las secuencias de polinucleótidos descritas. Estas variaciones pueden dar como resultado variantes de polinucleótido que codifica polipéptidos que comparten por lo menos una característica funcional. La degeneración del código genético también dicta que muchos polinucleótidos variantes diferentes pueden codificar polipéptidos idénticos y/o sustancialmente similares además de las secuencias ilustradas en la Lista de Secuencias.

[0051] También se describe en este documento una variante de un ácido nucleico de factor de transcripción listado en la Lista de Secuencias, es decir, uno que tiene una secuencia que difiere de una de las secuencias de polinucleótidos de la Lista de Secuencias, o una secuencia complementaria, que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente (es decir, un polipéptido que tiene algún grado de actividad biológica equivalente o similar) pero difiere en la secuencia respecto a la secuencia en la Lista de Secuencias, debido a la degeneración en el código genético. Están incluidos en esta definición los polimorfismos que se pueden detectar fácilmente o no usando una sonda de oligonucleótido particular del polinucleótido que codifica el polipéptido, y la hibridación inadecuada o inesperada con variantes alélicas, con un locus distinto del locus cromosómico normal para la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido.

[0052] “Variante alélica” o “variante alélica de polinucleótido” se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural por mutación, y puede dar como resultado el polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser “silenciosas” o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. “Variante alélica” y “variante alélica de polipéptido” también se pueden usar con respecto a los polipéptidos, y en este caso la expresión se refiere a un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0053] “Variante de corte y empalme” o “variante de corte y empalme de polinucleótido”, como se usa en el presente documento, se refiere a formas alternativas de ARN transcrito a partir de un gen. La variación por corte y empalme se produce de forma natural como resultado de sitios alternativos que son cortados y empalmados dentro de una sola molécula de ARN transcrita o entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado diferentes formas de ARNm transcritas del mismo gen. Por lo tanto, las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos que pueden tener o no funciones similares en el organismo. La “variante de corte y empalme” o “variante de corte y empalme de polipéptido” también se puede referir a un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de un ARNm transcrito.

[0054] También como se usa en el presente documento, las “variantes de polinucleótido” también se pueden referir a secuencias de polinucleótidos que codifican parálogos y ortólogos de las presentes secuencias de polipéptidos descritas. Las “variantes de polipéptido” también se pueden referir a secuencias de polipéptidos que son parálogas y ortólogas de las presentes secuencias de polipéptidos descritas.

[0055] Las diferencias entre los polipéptidos descritos aquí y variantes de polipéptidos son limitadas, de manera que las secuencias de los primeros y los últimos son en general muy similares y, en muchas regiones, idénticas. Las secuencias de polipéptidos descritos aquí y variantes de polipéptidos similares pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos, que pueden estar presentes en cualquier combinación. Estas diferencias pueden producir cambios silenciosos y dar lugar a un factor de transcripción funcionalmente equivalente. De este modo, se entenderá fácilmente por los expertos en la materia, que cualquier variedad de secuencias de polinucleótidos es capaz de codificar los factores de transcripción y polipéptidos homólogos de factores de transcripción. Una variante de secuencia de polipéptido puede tener cambios “conservativos”, en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares. De este modo, se pueden realizar sustituciones deliberadas de aminoácidos en base a la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos, siempre que se mantenga la actividad funcional o biológica del factor de transcripción. Por ejemplo, aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico, aminoácidos cargados positivamente pueden incluir lisina y arginina, y aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilicidad similares pueden incluir leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; serina y treonina; y fenilalanina y tirosina (para más detalles sobre sustituciones conservativas, véase la tabla 2). Más raramente, una variante puede tener cambios “no conservativos”, por ejemplo, la sustitución de una glicina por un triptófano. Las variaciones menores similares pueden incluir también deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Los polipéptidos relacionados pueden comprender, por ejemplo, adiciones y/o deleciones de uno o más sitios de glicosilación de unión a N u O, o una adición y/o una deleción de uno o más residuos de cisteína. Una guía sobre la determinación de qué y cómo muchos residuos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o eliminar sin abolir la actividad funcional o biológica se puede hallar utilizando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, software DNASTAR (véase USPN 5,840,544).

[0056] “Ligando” se refiere a cualquier molécula, agente o compuesto que se unirá específicamente a un sitio complementario en una molécula de ácido nucleico o proteína. Dichos ligandos estabilizan o modulan la actividad de las moléculas de ácido nucleico o proteínas de la invención y pueden estar compuestas por por lo menos uno de los siguientes: sustancias inorgánicas y orgánicas incluyendo ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono, grasas y lípidos.

[0057] “Modula” se refiere a un cambio en actividad (biológica, química o inmunológica) o vida útil que resulta de la unión específica entre una molécula y una molécula de ácido nucleico o una proteína.

[0058] El término “planta” incluye las plantas enteras, órganos/estructuras vegetativas que brotan (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endospermo y recubrimiento de semilla) y fruto (el ovario maduro), tejido de la planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido del suelo y similares) y células (por ejemplo, células guarda, células huevo y similares), y descendientes de los mismos. La clase de plantas que se puede usar en el procedimiento de la invención en general es tan amplio como la clase de plantas superiores e inferiores susceptibles de técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas); gimnospermas, helechos, belchos, psilofitos, licofitos, briofitos y algas multicelulares (véase, por ejemplo, en la figura 1, adaptada de Daly y col. (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333, Figura 2, adaptada de Ku y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 9121-9126; y véase también en Tudge (2000) en “The Variety of Life”, Oxford University Press, Nueva York, NY, pág. 547-606).

[0059] Una “planta transgénica” se refiere a una planta que contiene material genético que no se encuentra en una planta tipo salvaje de la misma especie, variedad o variedad cultivada. El material genético puede incluir un transgén, un suceso de mutagénesis por inserción (tal como mutagénesis por inserción de transposón o ADN-T), una secuencia marcadora de activación, una secuencia mutada, un suceso de recombinación homóloga o una secuencia modificada por quimeroplastia. Típicamente, el material genético extraño se ha introducido en la planta mediante manipulación humana, pero se puede usar cualquier procedimiento como reconocerá el experto en la materia.

[0060]Una planta transgénica puede contener un vector o casete de expresión. El casete de expresión típicamente comprende una secuencia que codifica un polipéptido operativamente unida (es decir, bajo el control regulador de) a secuencias reguladoras inducibles o constitutivas adecuadas que permiten la expresión del polipéptido. El casete de expresión se puede introducir en una planta mediante transformación o mediante cultivo después de transformación de una planta parental. Una planta se refiere a una planta entera así como a una parte de la planta, tal como la semilla, fruto, hoja o raíz, tejido de la planta, células de la planta o cualquier otro material de la planta, por ejemplo, un explante de planta, así como descendientes de la misma, y a sistemas in vitro que imitan los componentes o procedimientos bioquímicos o celulares en una célula.

[0061] "Planta de control" se refiere a una planta que sirve como estándar de comparación para analizar los resultados de un tratamiento o alteración genética, o el grado de expresión alterada de un gen o producto génico. Ejemplos de plantas de control incluyen plantas que no han sido tratadas o genéticamente inalteradas (es decir, de tipo salvaje).

[0062] “Tipo salvaje”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula, semilla, tejido o planta que no se ha modificado genéticamente para inactivar o sobreexpresar uno o más de los factores de transcripción descritos en la presente invención. Las células, tejidos, o plantas de tipo salvaje se pueden usar como controles para comparar los niveles de expresión y la extensión y naturaleza de la modificación del rasgo con células, tejidos o plantas en las que se ha alterado la expresión de un factor de transcripción o se ha expresado ectópicamente, por ejemplo, se ha inactivado o sobreexpresado.

[0063] “Fragmento”, con respecto a un polinucleótido, se refiere a un clon o cualquier parte de una molécula de polinucleótido que retiene una característica funcional usable. Los fragmentos útiles incluyen oligonucleótidos y polinucleótidos que se pueden usar en las tecnologías de hibridación o amplificación o en la regulación de la replicación, transcripción o traducción. Un “fragmento de polinucleótido” se refiere a cualquier subsecuencia de un polinucleótido, típicamente, de por lo menos aproximadamente 9 nucleótidos consecutivos, preferiblemente por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 50 nucleótidos, de cualquiera de las secuencias proporcionadas en el presente documento. Los fragmentos de polinucleótido de ejemplo son los primeros 60 nucleótidos consecutivos de los polinucleótidos de los factores de transcripción listados en la Lista de Secuencias. Los fragmentos de ejemplo incluyen fragmentos que comprenden una región que codifica un dominio conservado de un factor de transcripción.

[0064] Los fragmentos también pueden incluir subsecuencias de polipéptidos y moléculas de proteínas, o una subsecuencia de un polipéptido. Los fragmentos pueden tener uso en cuanto que pueden tener potencial antigénico. En algunos casos, el fragmento o dominio es una subsecuencia del polipéptido que realiza por lo menos una función biológica del polipéptido intacto sustancialmente de la misma manera, o en una extensión similar, a la que lo hace en el polipéptido intacto. Por ejemplo, un fragmento de polipéptido puede comprender un patrón estructural reconocible

o dominio funcional tal como un sitio de unión al ADN o dominio que se une a una región promotora de ADN, un dominio de activación o un dominio para interacciones proteína–proteína, y puede iniciar la transcripción. Los fragmentos pueden variar de tamaño desde tan pocos como 3 residuos de aminoácidos hasta la longitud entera del polipéptido intacto, pero preferiblemente tienen por lo menos aproximadamente 30 residuos de aminoácidos de longitud y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 60 residuos de aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptidos de ejemplo son los primeros 20 aminoácidos consecutivos de una proteína de mamífero codificada por los primeros veinte aminoácidos consecutivos de los polipéptidos de los factores de transcripción listados en la Lista de Secuencias. Los fragmentos de ejemplo también incluyen fragmentos que comprenden un dominio conservado de un factor de transcripción.

[0066] “Derivado” se refiere a la modificación química de una molécula de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos. Las modificaciones químicas pueden incluir la sustitución de hidrógeno o un grupo alquilo, acilo o amino o la glicosilación, pegilación, o cualquier procedimiento similar que retenga o potencie la actividad biológica o la vida útil de la molécula o secuencia.

[0067] Un “rasgo” se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o un material o célula de planta particular. En algunos casos, esta característica es visible a simple vista, tal como el tamaño de la semilla o planta, o se puede medir por técnicas bioquímicas, tales como detectando el contenido de proteína, almidón o aceite de semillas u hojas, o por observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, midiendo la captación del dióxido de carbono o por la observación del nivel de expresión de un gen o genes, por ejemplo usando análisis Northern, RT-PCR, ensayos de expresión de genes de micromatrices, o sistemas de expresión de genes indicadores, o por observaciones agrícolas tales como la tolerancia al estrés, la producción o la tolerancia a patógenos. Sin embargo, se puede usar cualquier técnica para medir la cantidad, el nivel comparativo o la diferencia en cualquier compuesto o macromolécula química seleccionada en las plantas transgénicas.

[0068] " La “modificación de rasgo” se refiere a una diferencia detectable en una característica en una planta que expresa ectópicamente un polinucleótido o polipéptido de la presente invención con respecto a una planta que no lo hace, tal como una planta de tipo salvaje. En algunos casos, la modificación del rasgo se puede evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, la modificación del rasgo puede conllevar un aumento o disminución de por lo menos aproximadamente 2% en un rasgo (diferencia) observado, por lo menos un 5% de diferencia, por lo menos aproximadamente un 10% de diferencia, por lo menos aproximadamente un 20% de diferencia, por lo menos aproximadamente un 30% de diferencia, por lo menos aproximadamente un 50% de diferencia, por lo menos aproximadamente un 70% de diferencia, o por lo menos aproximadamente un 100% de diferencia, o una diferencia incluso mayor, comparado con una planta de tipo salvaje. Se sabe que puede haber una variación natural en el rasgo modificado. Por lo tanto, la modificación del rasgo observado conlleva un cambio de la distribución y magnitud normales del rasgo de las plantas comparado con la distribución y magnitud observadas en las plantas de tipo salvaje.

[0069] La expresión “perfil del transcritos” se refiere a los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula en un estado particular, en particular por comparación con los niveles de expresión del mismo conjunto de genes en una célula del mismo tipo en un estado de referencia. Por ejemplo, el perfil de transcritos de un factor de transcripción particular en una célula en suspensión son los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula que que sobreexpresa este factor de transcripción comparado con los niveles de expresión del mismo conjunto de genes en una célula en suspensión que tiene los niveles normales de este factor de transcripción. El perfil de transcritos se puede presentar como una lista de aquellos genes cuyo nivel de expresión es significativamente diferente entre los dos tratamientos, y las proporciones de la diferencia. Las diferencias y similitudes entre los niveles de expresión también se pueden evaluar y calcular usando procedimientos estadísticos y de agrupamiento.

[0070] La “expresión ectópica o expresión alterada” en referencia a un polinucleótido indica que el patrón de expresión, por ejemplo, en una planta transgénica o tejido de planta, es diferente del patrón de expresión en una planta tipo salvaje o una planta de referencia de la misma especie. El patrón de expresión también se puede comparar con un patrón de expresión de referencia en una planta tipo salvaje de la misma especie. Por ejemplo, el polinucleótido o polipéptido se expresa en una célula o tipo de tejido distintos de una célula o tipo de tejido en el que la secuencia se expresa en la planta tipo salvaje, o por la expresión en un momento distinto al momento en el que la secuencia se expresa en la planta tipo salvaje, o por una respuesta a diferentes agentes inducibles, tales como hormonas o señales del entorno, o con niveles de expresión diferentes (sean mayores o menores) comparados con los encontrados en una planta tipo salvaje. El término también se refiere a patrones de expresión alterados que se producen disminuyendo los niveles de expresión por debajo del nivel de detección o por eliminación completa de la expresión. El patrón de expresión resultante puede ser transitorio o estable, constitutivo o inducible. Con referencia a un polipéptido, la expresión “expresión ectópica o expresión alterada” se puede referir además a los niveles de actividad alterados que resultan de las interacciones de los polipéptidos con moduladores exógenos o endógenos o de interacciones con factores o como resultado de la modificación química de los polipéptidos.

[0071] La expresión “sobreexpresión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un nivel de expresión mayor de un gen en una planta, célula de planta o tejido de planta, comparado con la expresión en una planta, célula

o tejido tipo salvaje, en cualquier fase de desarrollo o temporal para el gen. La sobreexpresión se produce cuando, por ejemplo, los genes que codifican uno o más factores de transcripción están bajo el control de una señal de expresión fuerte, tal como uno de los promotores descritos en el presente documento (por ejemplo, la región de inicio de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor). La sobreexpresión se puede producir en toda la planta o en tejidos específicos de la planta, dependiendo del promotor usado, como se describe más adelante.

[0072] La sobreexpresión puede tener lugar en células de plantas que normalmente carecen de la expresión de polipéptidos opcionalmente equivalentes o idénticos a los presentes factores de transcripción. La sobreexpresión también se puede producir en células de plantas en las que normalmente se produce la expresión endógena de los presentes factores de transcripción o moléculas funcionalmente equivalentes, pero dicha expresión normal es en un nivel inferior. Por lo tanto, la sobreexpresión da como resultado una producción mayor que la normal o “exceso de producción” del factor de transcripción en la planta, célula o tejido.

[0073] El término “cambio de fase” se refiere a la progression de una planta desde un embrión a adulto y, en algunas definiciones, la transición en la que las plantas florales ganan competencia reproductiva. Se cree que el cambio de fases tiene lugar después de un cierto número de divisiones celulares en la parte terminal de un brote de una planta en desarrollo, o cuando la parte terminal del brote alcanza una distancia concreta desde las raíces. De este modo, alterando el ritmo de los cambios de fases se puede influir en el tamaño de la planta que, a su vez, puede afectar a la producción y la biomasa.

[0074] La "tolerancia" resulta de las características específicas heredables de una planta huésped que permiten que un patógeno se desarrolle y se multiplique en el huésped, mientras el huésped, ya sea por la carencia de sitios receptores o por la inactivación o compensación de las secreciones irritantes del patógeno, aún consigue crecer o, en el caso de plantas de cultivos, producir un buena cultivo. Las plantas tolerantes son susceptibles al patógeno, pero no son eliminadas por el mismo, y generalmente muestran poco daño por el patógeno (Agrios (1988) Plant Pathology, 3rd ed. Academic Press, N.Y., p. 129).

[0075] "Resistencia", también referida como “resistencia verdadera”, resulta cuando una planta contiene uno o más genes que hacen que la plata y un patógeno potencial más o menos incompatibles entre sí, ya sea debido a la falta de reconocimiento químico entre el huésped y el patógeno, o porque la planta huésped puede defenderse por sí sola contra el patógeno mediante mecanismos de defensa ya presentes o activados en respuesta a la infección (Agrios (1988)) Plant Pathology, 3rd ed. Academic Press, N.Y., p. 125).

[0076] Una “muestra” con respecto a un material que contiene moléculas de ácido nucleico, puede comprender un fluido corporal; un extracto de una célula, cromosoma, orgánulo o membrana aislados de una célula; ADN, ARN o ADNc genómicos en disolución o unidos a un sustrato; una célula; un tejido; una huella tisular; una muestra forense; y similares. En este contexto “sustrato” se refiere a cualquier soporte rígido o semirígido al que se unen moléculas de ácido nucleico o proteínas, que incluyen membranas, filtros, chips, portaobjetos, obleas, fibras, perlas magnéticas

o nanomagnéticas, geles, capilares u otros tubos, placas, polímeros y micropartículas, con una variedad de formas de la superficie incluyendo pocillos, zanjas, agujas, canales y poros. Un sustrato también se puede referir a un reaccionante en una reacción química o biológica, o una sustancia que actúa sobre ella (por ejemplo, una enzima).

[0077] "Sustancialmente purificado" se refiere a moléculas de ácido nucleico o proteínas que se extraen de su medio natural y se aíslan o separan, y están por lo menos aproximadamente un 60% libres, preferiblemente aproximadamente un 75% libres, y lo más preferible aproximadamente un 90% libres, de otros componentes con los que pueden estar asociados de forma natural.

Rasgos que se pueden modificar en plantas sobreexpresantes o knock-out

[0078] Entre las modificaciones de los rasgos de interés particular se incluyen aquellas en semilla (tales como embriones o endoesperma), fruto, raíz, flor, hoja, tallo, brote, semillero o similar, incluyendo: mayor tolerancia a las condiciones medioambientales, incluyendo helada, frío, calor, sequía, saturación de agua, radiación y ozono; mejor tolerancia a enfermedades microbianas, fúngicas o virales; mejor tolerancia a infestación de plagas, incluyendo insectos, nematodos, mollicutes, plantas superiores parasitarias o similares; menos sensibilidad a herbicida; mejor tolerancia de metales pesados o mayor capacidad de captación de metales pesados; mejor crecimiento bajo fotocondiciones pobres (por ejemplo, luz baja y/o longitud corta del día) o cambios en los niveles de expresión de genes de interés. Otro fenotipo que se puede modificar se refiere a la producción de metabolitos de la planta, tales como variaciones en la producción de taxol, tocoferol, tocotrienol, esteroles, fitoesteroles, vitaminas, monómeros cerosos, antioxidantes, aminoácidos, ligninas, celulosa, taninos, pernil lípidos (tales como clorofilas y carotenoides), glucosinolatos y terpenoides, producción de proteína o aceite aumentada o alterada en la composición (especialmente en semillas), o azúcar modificado (insoluble o soluble) y/o composición de almidón. Las características físicas de la planta que se pueden modificar incluyen, el desarrollo celular, tal como el número de tricomas), tamaño y número de frutos y semillas, producción de las partes de las plantas, tales como los tallos, hojas, inflorescencia y raíces, la estabilidad de las semillas durante el almacenamiento, las características de la vaina de las semillas (por ejemplo, susceptibilidad a quebrarse), longitud y cantidad del pelo radical, distancias internodales o la calidad del recubrimiento de la semilla. Las características del crecimiento de la planta que se pueden modificar incluyen la velocidad de crecimiento, la velocidad de germinación de las semillas, el vigor de las plantas y semilleros, senescencia de la hoja y la flor, esterilidad masculina, apomixis, tiempo de floración, grietas de las flores, velocidad de captación de nitrógeno, sensibilidad osmótica a concentraciones de azúcar soluble, características de biomasa o tanspiración, así como características de la arquitectura de la planta, tales como la dominancia apical, patrones de ramificación, número de órganos, identidad de órganos, forma o tamaño de órgano.

Los factores de transcripción modifican la expresión de genes endógenos

[0079] La expresión de genes que codifican factores de transcripción que modifican la expresión de genes, polinucleótidos y proteínas endógenos, es bien conocida en la materia. Además, las plantas transgénicas que comprenden polinucleótidos aislados que codifican factores de transcripción también pueden modificar la expresión de genes, polinucleótidos y proteínas endógenos. Los ejemplos incluyen Peng y col. (1997) Genes Development 11: 3194-3205, y Peng y col. (1999) Nature, 400: 256-261). Además, muchos otros han demostrado que un factor de transcripción de Arabidopsis expresado en una especie de planta exógena produce la misma respuesta fenotípica o muy similar. Véase, por ejemplo, en Fu y col. (2001) Plant Cell 13: 1791-1802; Nandi y col. (2000) Curr. Biol 10: 215218; Coupland (1995) Nature 377:482483; y Weigel y Nilsson (1995) Nature 377: 482-500).

[0080] En otro ejemplo, Mandel y col. (1992) Cell 71-133-143, y Suzuki y col. (2001) Plant J. 28: 409-418 enseñan que un factor de transcripción expresado en otra especie de planta produce la misma respuesta fenotípica o muy similar a la de la secuencia endógena, como se ha predicho con frecuencia en estudios previos de factores de transcripción de Arabidopsis, en Arabidopsis (véase Mandel y col. (1992) supra; y Suzuki y col. (2001) supra).

[0081] Otros ejemplos incluyen Muller y col. (2001) Plant J. 28: 169-179; Kim y col. (2001) Plant J. 25: 247-259; Kyozuka y Shimamoto (2002) Plant Cell Physiol. 43: 130-135; Boss y Thomas (2002) Nature, 416: 847-850; He y col. (2000) Transgenic Res. 9: 223-227; y Robson y col. (2001) Plant J. 28: 619-631.

[0082] En otro ejemplo más, Gilmour y col. (1998) Plant J. 16: 433-442, enseñan un factor de transcripción AP2 de Arabidopsis, CBF1, que cuando se expresa en exceso en plantas transgénicas aumenta la tolerancia a las heladas. Jaglo y col. (2001) Plant Physiol. 127: 910-917, identificaron además secuencias en Brassica napus que codifican genes de tipo CBF y que los transcritos para estos genes se acumulaban rápidamente en respuesta a la temperatura baja. También se encontró que los transcritos que codifican las proteínas CBF se acumulaban rápidamente en respuesta a la temperatura baja en el trigo, así como en el tomate. El alineamiento de las proteínas CBF de Arabidopsis, B. napus, trigo, centeno y tomate pusieron de manifiesto la presencia de residuos de aminoácidos consecutivos conservados, PKK/RPAGRxKFxETRHP y DSAWR, que encierran los dominios de unión al ADN AP2/EREBP de las proteínas y las distingue de otros miembros de la familia de proteínas AP2/EREBP (véase Jaglo y col. (2001) antes).

[0083] Los factores de transcripción median respuestas celulares y controlan los rasgos a través de la expresión alterada de genes que contienen secuencias de nucleótidos que actúan en cis, que son dianas del factor de transcripción introducido. Se apreciará en la técnica que el efecto de un factor de transcripción en las respuestas celulares o un rasgo celular está determinado por los genes particulares cuya expresión se altera de forma directa o indirecta (por ejemplo, por una cascada de sucesos de unión de factores de transcripción y cambios transcripcionales) por la unión del factor de transcripción. En un análisis global de la transcripción comparando un estado estándar con uno en el que se expresa en exceso un factor de transcripción, el perfil de transcritos resultante asociado con el exceso de expresión del factor de transcripción está relacionado con el rasgo o proceso celular controlado por ese factor de transcripción. Por ejemplo, se ha mostrado que el gen PAP2 (y otros genes en la familia MYB) controla la biosíntesis de la antocianina a través de la regulación de la expresión de genes que se sabe que están implicados en la ruta biosintética de la antocianina (Bruce y col. (2000) Plant Cell, 12: 65-79; Borevitz y col. (2000) Plant Cell 12: 2383-93). Además, los perfiles de transcritos globales se han usado con éxito como herramientas de diagnóstico para estados celulares específicos (por ejemplo, cancerosos frente a no cancerosos; Bhattacharjee y col. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98: 13790-13795; Xu y col. (2001) Proc. Natl Acad. Sci., USA, 98: 15089.15094). Por consiguiente, es evidente para el experto en la materia que la similitud del perfil de transcritos tras el exceso de expresión de diferentes factores de transcripción indicaría similitud de la función del factor de transcripción.

Polipéptidos y polinucleótidos

[0084] Se describen en el presente documento, entre otras cosas, factores de transcripción (TF), y polipéptidos homólogos de factores de transcripción, y polinucleótidos aislados o recombinantes que codifican los polipéptidos o nuevos polipéptidos variantes de secuencia o polinucleótidos que codifican nuevas variantes de factores de transcripción derivados de las secuencias específicas proporcionadas en el presente documento. Estos polipéptidos y polinucleótidos se pueden utilizar para modificar una característica de planta.

[0085] Se identificaron polinucleótidos de ejemplo que codifican los polipéptidos de la lista de secuencias en la base de datos de GenBank de Arabidopsis thaliana usando programas y parámetros de análisis de secuencias disponibles al público. Las secuencias identificadas inicialmente después se caracterizaron adicionalmente para identificar las secuencias que comprenden cadenas de secuencia específicas correspondientes a patrones de secuencia presentes en familias de factores de transcripción conocidos. Además, se identificaron otros polinucleótidos de ejemplo que codifican los polipéptidos en la base de datos de GenBank de plantas usando programas y parámetros de análisis de secuencias disponibles al público. Las secuencias identificadas inicialmente después se caracterizaron más para identificar las secuencias que comprenden cadenas de secuencia específicas correspondientes a patrones de secuencia presentes en familias de factores de transcripción conocidos. Las secuencias de polinucleótidos que cumplen dichos criterios se confirmaron como factores de transcripción.

[0086] Se identificaron polinucleótidos adicionales mediante el cribado de bibliotecas de ADNc de Arabidopsis thaliana y/u otras plantas con sondas correspondientes a factores de transcripción conocidos en condiciones de hibridación rigurosas bajas. Posteriormente se recuperaron secuencias adicionales, incluyendo secuencias codificantes de longitud entera, mediante el procedimiento de amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE), usando un kit disponible en el comercio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando era necesario, se llevaron a cabo varios ciclos de RACE para aislar los extremos 5’ y 3’. Después, se recuperó el ADNc de longitud entera mediante una reacción en cadena de la polimerasa de extremo a extremo rutinaria (PCR) usando celadores específicos para aislar los extremos 5’ y 3’. Se proporcionan secuencias de ejemplo en la Lista de Secuencias.

[0087] Los polinucleótidos se pueden expresar o fueron expresados ectópicamente en plantas sobreexpresantes o knockout y se pueden observar los cambios en la característica o características o rasgo o rasgos de las plantas. Por lo tanto, los polinucleótidos y polipéptidos se pueden utilizar para mejorar las características de las plantas.

[0088] Los polinucleótidos se pueden expresar o fueron expresados ectópicamente en células vegetales sobreexpresantes y se pueden observar los cambios en los niveles de expresión de un conjunto de genes, polinucleótidos y/o proteínas de las células vegetales. Por lo tanto, los polinucleótidos y polipéptidos se pueden utilizar para cambiar los niveles de expresión de un conjunto de genes, polinucleótidos y/o proteínas de las plantas.

Producción de polipéptidos

[0089] Los polinucleótidos incluyen secuencias que codifican factores de transcripción y polipéptidos homólogos de factores de transcripción y secuencias complementarias de los mismos, así como fragmentos únicos de secuencia codificante, o secuencia complementaria de la misma. Dichos polinucleótidos pueden ser, por ejemplo, ADN o ARN, por ejemplo ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADNc, ADN sintético, oligonucleótidos, etc. Los polinucleótidos son de doble cadena o de cadena sencilla, e incluyen tanto secuencias de sentido directo (es decir, codificantes) como secuencias de sentido contrario (es decir, no codificantes, complementarias). Los polinucleótidos incluyen la secuencia codificante de un factor de transcripción, o un polipéptido homólogo del factor de transcripción, aislado, en combinación con secuencias codificantes adicionales (por ejemplo, un marcador de purificación, una señal de localización, como una proteína de fusión, como una preproteína o similares), en combinación con secuencias no codificantes (por ejemplo, intrones o inteínas, elementos reguladores tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares), y/o un vector o entorno de un hospedador en el que el polinucleótido que codifica un factor de transcripción o polipéptido homólogo del factor de transcripción es un gen endógeno o exógeno.

[0090] Existe una variedad de procedimientos para producir los polinucleótidos aquí descritos. Los procedimientos para identificar y aislar clones de ADN son bien conocidos para el experto en la materia, y se describen, por ejemplo, en Berger y Kimmel, “Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology”, vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Sambrook y col. “Molecular Clonining - A Laboratory Manua”l (2ª ed.), Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 ("Sambrook") y “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel y col. eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2000) ("Ausubel").

[0091] Alternativamente, los polinucleótidos se pueden producir por una variedad de procedimientos de amplificación in vitro adaptados al presente documento mediante la selección adecuada de cebadores específicos o degenerados. Los ejemplos de protocolos suficiente para dirigir a los expertos en la materia a través de los procedimientos de amplificación in vitro, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por Q1-replicasa y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), por ejemplo, para la producción de ácidos nucleicos homólogos, se encuentran en Berger (supra), Sambrook (supra), y Ausubel (supra), así como en Mullis y col. (1987) “PCR Protocols A Guide to Methods and Applications” (Innis y col. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis). Se describen procedimientos mejorados para la clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro en Wallace y col. patente de EE.UU. nº 5.426.039. Se resumen procedimientos mejorados para la amplificación de ácidos nucleicos largos mediante PCR en Cheng y col. (1994) Nature 369: 684-685, y las referencias citadas en los mismos, en los que se generan amplicones por PCR de hasta 40 kb. Un experto en la materia apreciará que esencialmente se puede convertir cualquier ARN en un ADN de doble cadena adecuado para la digestión por restricción, expansión por PCR y secuenciación, usando transcriptasa inversa y una polimerasa. Véase, por ejemplo, Ausubel, Sambrook and Berger.

[0092] Alternativamente, los polinucleótidos y oligonucleótidos se pueden formar a partir de fragmentos producidos por procedimientos de síntesis en fase sólida. Típicamente, se sintetizan individualmente fragmentos de hasta aproximadamente 100 bases y después se ligan enzimática o químicamente para producir una secuencia deseada, por ejemplo, un polinucleótido que codifica todo o parte de un factor de transcripción. Por ejemplo, se describe la síntesis química usando el procedimiento de la fosforamidita, en Beaucage y col. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869; y Matthes y col. (1984) EMBO J. 3: 801-805. De acuerdo con dichos procedimientos, se sintetizan oligonucleótidos, se purifican, se reasocian con su cadena complementaria, se ligan y después opcionalmente se clonan en vectores adecuados. Y si se desea, los polinucleótidos y polipéptidos se pueden encargar a cualquiera de una serie de proveedores comerciales.

Secuencias homólogas

[0093] Las secuencias homólogas a SEQ ID NO: 328, es decir, las que tienen una identidad en la secuencia de aminoácidos de por lo menos el 95% sobre la longitud completa de SEQ ID NO: 328 derivada de Arabidopsis thaliana o de otras plantas elegidas, también se pueden utilizar en las plantas, procesos y usos de la invención.

[0094] Las secuencias homólogas se pueden obtener de cualquier planta incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas y en particular especies de plantas importantes en agricultura, incluyendo pero sin limitar, cultivos tales como soja, trigo, maíz, patata, algodón, arroz, colza, colza de semillas oleaginosas (incluida la canola), girasol, alfalfa, trébol, caña de azúcar, y césped, o frutas y verduras, como banano, mora, arándano, fresa, y frambuesa, melón, zanahoria, coliflor, café, pepino, berenjena, uva, melón, lechuga, mango, melón dulce, cebolla, papaya, guisantes, pimientos, piña, calabaza, espinaca, chayote, maíz dulce, tabaco, tomate, tomatillo, sandía, frutas rosáceas (tales como manzana, melocotón, pera, cereza y ciruela) y vegetales Brassica (tales como el brócoli, repollo, coliflor, coles de Bruselas y colirrábano). Otros cultivos, que incluyen frutas y verduras, cuyo fenotipo se puede cambiar y que comprenden secuencias homólogas incluyen la cebada; centeno; mijo; sorgo; grosella; aguacate; frutas cítricas tales como naranjas, limones, pomelos y mandarinas, alcachofas, cerezas; frutos secos, tales como la nuez y el cacahuete, endibia, puerro, raíces como de arruruz, remolacha, yuca, nabo, el rábano, batata, y boniato; y judías. Las secuencias homólogas también se pueden obtener de las especies leñosas, tales como el pino, álamo y eucalipto o menta u otras labiadas. Además, se pueden obtener secuencias homólogas de plantas que están evolutivamente relacionadas con las plantas de cultivo, pero que pueden no haberse usado todavía como plantas de cultivo. Los ejemplos incluyen belladona (Atropa belladona), relacionada con el tomate; estramonio (Datura strommium), relacionada con el peyote, y el teosinta (Zea), relacionado con el maíz.

Ortólogos y parálogos

[0095] Las secuencias homólogas como las descritas antes pueden comprender secuencias ortólogas y parálogas. Son conocidos varios procedimientos diferentes por los expertos en la materia para identificar y definir estas secuencias funcionalmente homólogas. Se han descrito 3 procedimientos generales para definir ortólogos y parálogos; un ortólogo, parálogo u homólogo se puede identificar por uno o más de los procedimientos descritos a continuación.

[0096] Los ortólogos y parálogos son genes relacionados evolucionalmente que tienen una secuencia similar y funciones similares. Los ortólogos son genes estructuralmente relacionados en especies diferentes que se derivan mediante un suceso de especiación. Los parálogos son genes estructuralmente relacionados en una única especie que se derivan mediante un suceso de duplicación.

[0097] Dentro de una sola especie de planta, la duplicación de genes pueden producir dos copias de un gen particular, dando lugar a dos o más genes con secuencia similar y a menudo función similar, conocidos como parálogos. Por lo tanto, un parálogo es un gen similar formado por duplicación dentro de la misma especie. Los parálogos típicamente se agrupan entre sí o en el mismo clado (un grupo de genes similares) cuando se analiza la filogenia de una familia de genes usando programas tales como CLUSTAL (Thompson y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680; Higgins y col. (1996) Methods Enzymol. 266: 383-402). Los grupos de genes similares también se pueden identificar con el análisis de BLAST por parejas (Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 25: 351-360). Por ejemplo, un clado de factores de transcripción con dominios MADS muy similares de Arabidopsis comparten todos una función común en el momento de la floración (Ratcliffe y col. (2001) Plant Physiol. 126: 122-132), y un grupo de factores de transcripción con dominios AP2 muy similares de Arabidopsis está implicado en la tolerancia de las plantas a la helada (Gilmour y col. (1998) Plant J. 16: 433-442). El análisis de grupos de genes similares con función similar que están dentro de un clado pueden dar subsecuencias que son particulares para el clado. Estas subsecuencias, conocidas como secuencias consenso, se pueden usar no sólo para definir las secuencias dentro de cada clado, sino para definir las funciones de esos genes; los genes dentro de un clado pueden contener secuencias parálogas o secuencias ortólogas que comparten la misma función (por ejemplo, en Mount (2001), en “Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, página 543).

[0098] La especiación, la producción de nuevas especies a partir de una especie parental, también puede dar lugar a dos o más genes con secuencia similar y función similar. Estos genes, denominados ortólogos, a menudo tienen una función idéntica en sus plantas hospedadoras y a menudo son intercambiables entre especies sin perder la función. Debido a que las plantas tienen ancestros comunes, muchos genes en cualquier especie de planta tendrán un gen ortólogo correspondiente en otra especie de planta. Una vez que se ha construido un árbol filogenético para una familia de genes de una especie usando un programa tal como CLUSTAL (Thompson y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 46734680; Higgins y col. (1996) supra), se pueden poner las potenciales secuencias ortólogas en el árbol filogenético y determinar su relación con los genes de las especies de interés. Las secuencias ortólogas también se pueden identificar por una estrategia de BLAST recíproca. Una vez que se ha identificado una secuencia ortóloga, la función del ortólogo se puede deducir de la función identificada de la secuencia de referencia.

[0099] Las secuencias de los genes de factores de transcripción están conservadas a través de diferentes líneas de especies eucariotas (Goodrich y col. (1993) Cell 75: 519-530; Lin y col. (1991) Nature 353: 569-571; Sadowski y col. (1988) Nature 335: 563-564). Las plantas no son una excepción a esta observación; diferentes especies de plantas tienen factores de transcripción que tienen secuencias y funciones similares.

[0100] Los genes ortólogos de organismos diferentes tienen funciones altamente conservadas, y muy a menudo funciones esencialmente idénticas (Lee y col. (2002) Genome Res. 12: 493-502; Remmy col. (2001) J. Mol. Biol.

314: 1041-1052). Los genes parálogos, que han divergido por la duplicación de genes, pueden retener funciones similares de las proteínas codificadas. En dichos casos, los parálogos se pueden usar de forma intercambiable con respecto a determinadas realizaciones de la presente invención (por ejemplo, expresión transgénica de una secuencia codificante). Un ejemplo de dichos parálogos muy relacionados es la familia CBF, con 3 miembros bien definidos en Arabidopsis y por lo menos un ortólogo en Brassica napus (SEQ ID No: 2238, 2240, 2242 y 2244, respectivamente), los cuales controlan todos las rutas implicadas en el estrés tanto por helada como por sequía (Gilmour y col. (1998) Plant J. 16: 433-442; Jaglo y col. (1998) Plant Physiol. 127: 910-917).

[0101] Las siguientes referencias representan una pequeña muestra de los muchos estudios que demuestran que los genes de factores de transcripción conservados de diferentes especies es probable que funcionen de forma similar (es decir, regulan secuencias diana similares y controlan los mismos rasgos), y que se pueden transformar los factores de transcripción en diversas especies para conferir o mejorar rasgos.

(1) El gen NPR1 de Arabidopsis regula la resistencia sistémica adquirida (SAR); la sobreexpresión de NPR1 conduce a una resistencia potenciada en Arabidopsis. Cuando NPR1 de Arabidopsis o el ortólogo de NPR1 del arroz se expresaban en exceso en el arroz (el cual, como una monocotiledónea, es diferente de Arabidopsis), las plantas transgénicas presentaban una resistencia potenciada a la estimulación con el patógeno bacteriano del añublo del arroz Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Chern y col. (2001) Plant J. 27: 101-113). NPR1 actúa a través de la activación de la expresión de los genes de factores de transcripción, tales como TGA2 (Fan y Dong (2002) Plant Cell

14: 1377-1389).

(2)

Los genes E2F están implicados en la transcripción de genes de plantas para el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA). Los E2F de plantas comparten un grado alto de similitud en la secuencia de aminoácidos entre monocotiledóneas y dicotiledóneas, y son incluso similares a los dominios conservados de los E2F de animales. Dicha conservación indica una similitud funcional entre EsF de plantas y animales. Los factores de transcripción E2F que regulan el desarrollo del meristemo actúan a través de elementos cis comunes, y regulan genes relacionados (PCNA) (Kosugi y Ohashi, (2002) Plant J. 29: 45-59).

(3)

El gen ABI5 (insensible a ABA 5) codifica un factor de la cremallera de leucina básico necesario para la respuesta de ABA en la semilla y los tejidos vegetativos. Los experimentos de transformación simultánea con construcciones de ADNc de ABI5 en protoplastos de arroz dieron como resultado la trasactivación específica de promotores del trigo, Arabidopsis¸ judía y cebada inducibles por ABA. Estos resultados demuestran que los factores de transcripción similares en secuencia a ABI5 son dianas clave de una ruta de señalización de ABA conservada en diversas plantas (Gampala y col. (2001) J. Biol. Chem. 277: 1689-1694).

(4)

Las secuencias de 3 genes de tipo GAMYB de Arabidopsis se obtuvieron basándose en la similitud de secuencia con los genes GAMYB de la cebada, arroz y L. temulentum. Se determinó que estos 3 genes de Arabidopsis codificaban factores de transcripción (AtMYB33, AtMYB65 y AtMYB101) y podían sustituir la expresión de GAMYB de la cebada y de la a-amilasa de control (Gocal y col. (2001) Plant Physiol. 127: 1682-1693).

(5)

El gen del control floral LEAFY de Arabidopsis puede acelerar espectacularmente la floración en numerosas plantas dicotiledóneas. La expresión constitutiva de LEAFY de Arabidopsis también producía la floración temprana en el arroz transgénico (una monocotiledóneas), con una fecha de espigamiento que era 26-34 días antes que la de las plantas tipo salvaje. Estas observaciones indican que los genes reguladores de la floración de Arabidopsis son herramientas útiles para mejorar la fecha de espigamiento en cultivos de cereales (He y col. (2000) Transgenic Res.

9: 223-227).

(6)

Las giberelinas (GA) bioactivas son reguladores endógenos esenciales del crecimiento de la planta. La señalización de GA tiende a ser conservada a través del reino vegetal. La señalización de GA es mediada por GAI, un miembro nuclear de la familia GRAS de factores de transcripción de plantas. Se ha mostrado que GAI de Arabidopsis funciona en el arroz para inhibir las rutas de respuestas a las giberelinas (Fu y col. (2001) Plant Cell 13: 1791-1802).

(7)

El gen SUPERMAN (SUP) de Arabidopsis codifica un factor de transcripción presunto que mantiene el límite entre los estambres y los carpelos. Mediante la sobreexpresión de SUP de Arabidopsis en el arroz, se mostró que el efecto de la presencia de los genes en los bordes de los verticilos era conservado. Esto demostraba que SUP es un regulador conservado de los bordes de los verticilos florales y afecta a la proliferación celular (Nandi y col. (2000) Curr. Biol. 10: 215-218).

(8)

Los factores de transcripción myb de maíz, petunia y Arabidopsis que regulan la biosíntesis de flavonoides son genéticamente similares y afectan al mismo rasgo en su especie nativa; por lo tanto, la secuencia y la función de estos factores de transcripción myb se correlacionan entre sí en diversas especies (Borevitz y col. (2000) Plant Cell

12: 2383-2394).

(9) Los genes de la altura reducida del trigo 1 (Rht-B1/Rht-D1) y maíz enano 8 (d8) son ortólogos del gen insensible a la giberelina (GAI) de Arabidopsis. Ambos genes se han usado para producir variedades de grano enano que tiene un mejor rendimiento de granos. Estos genes codifican proteínas que se parecen a los factores de transcripción nucleares y contienen un dominio de tipo SH-2, indicando que la fosfotirosina puede participar en la señalización de la giberelina. Las plantas de arroz transgénicoas que contienen un alelo de GAI mutante de Arabidopsis han mostrado producir menores respuestas a la giberelina y las hacen enanas, indicando que los ortólogos de GAI mutantes se podrían usar para aumentar el rendimiento en una amplia variedad especies de cultivo (Peng y col. (1999) Nature 400: 256-261).

[0102] A nivel de nucleótidos, las secuencias típicamente compartirán una identidad de secuencia de nucleótidos de por lo menos aproximadamente 40%, preferiblemente por lo menos aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% de identidad de secuencia y más preferiblemente aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 97% o mayor identidad de secuencia con una o más de las secuencias listadas, o con una secuencia listada pero excluyendo o fuera de una secuencia consenso conocida o sitio de unión al ADN consenso, o fuera de uno o todos los dominios conservados. La degeneración del código genético permite variaciones importantes de la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido mientras que se mantiene la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Los dominios conservados en una familia de factores de transcripción pueden presentar un grado mayor de homología de secuencia, tal como una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 80%, y más preferiblemente por lo menos 85%, o por lo menos aproximadamente 86%, o por lo menos aproximadamente 87%, o por lo menos aproximadamente 88%, o por lo menos aproximadamente 90%, o por lo menos aproximadamente 95%, o por lo menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia. Los factores de transcripción que son homólogos con las secuencias listadas deben compartir una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 95% sobre la longitud entera del polipéptido o el homólogo.

[0103] El porcentaje de identidad se puede determinar electrónicamente, por ejemplo usando el programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.). El programa MEGALIGN puede crear alineamientos entre dos o más secuencias de acuerdo con diferentes procedimientos, por ejemplo, el procedimiento clustal. (Véase, por ejemplo, en Higgins y Sharp (1988) Gene 73: 237-244). El algoritmo clustal agrupa secuencias en agrupaciones examinando las distancias entre todos los pares. Las agrupaciones se alinean en parejas y después en grupos. Se pueden usar otros programas o algoritmos de alineamiento, incluyendo FASTA, BLAST, o ENTREZ, FASTA y BLAST, y sepueden usar para calcular el porcentaje de similitud. Éstos están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con o sin los parámetros por defecto. ENTREZ está disponible en el National Center for Biotechnology Information. En una realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias se puede determinar mediante el programa GCG con un peso de hueco de 1, por ejemplo, cada hueco de aminoácido se pesa como si fuera un solo aminoácido o emparejamiento erróneo de nucleótido entre las dos secuencias (USPN 6.262.333).

[0104] Se describen otras técnicas de alineamiento en Enzymology, vol. 266, “Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis” (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., EE.UU. Preferiblemente, se usa un programa de alineamiento que permite huecos en la secuencia para alinear las secuencias. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite huecos en los alineamientos de secuencias (Shpaer (1997) Methods Mol. Biol. 70: 173-187). También se puede usar el programa GAP, usando el procedimiento de alineamiento de Needleman y Wunsch para alinear las secuencias. Una estrategia de búsqueda alternativa usa el software MPSRCH, el cual funciona en un ordenador MASPAR. MPSRCH usa un algoritmo de Smith-Waterman para puntuar las secuencias en un ordenador de procesamiento paralelo masivo. Este procedimiento implica la capacidad de coger emparejamientos relacionados a distancia, y es especialmente tolerante para huecos pequeños y errores de secuencias de nucleótidos. Las secuencias de aminoácidos codificadas por ácidos nucleicos se pueden usar para buscar en bases de datos tanto de proteínas como de ADN.

[0105] El porcentaje de similitud entre dos secuencias de polipéptido, por ejemplo la secuencia A y la secuencia B, se calcula dividiendo la longitud de la secuencia A, menos el número de huecos de residuos de la secuencia A, menos el número de residuos de huecos en la secuencia B, entre la suma de los emparejamientos de residuos entre la secuencia A y la secuencia B, por cien. Los huecos sin o con poca similitud entre las dos secuencias de aminoácidos no están incluidos en la determinación del porcentaje de similitud. El porcentaje de identidad entre secuencias de polinucleótidos también se puede contar o calcular por otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, el procedimiento de Jotun Hein. (Véase, por ejemplo, Hein (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645). La identidad entre secuencias también se puede determinar por otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, variando las condiciones de hibridación (solicitud de patente de EE.UU. Nº 20010010913).

[0106] El porcentaje de identidad entre dos dominios conservados de una secuencia de polipéptido consenso del dominio de unión a ADN del factor de transcripción puede ser como mínimo un 16%, ejemplificado en el caso de la familia GATA1 de factores de transcripción de dedos de zinc del tipo Cys2/Cys2 eucariotas. La secuencia del polipéptido consenso del dominio de unión a ADN de la familia GATA1 es CX2CX17CX2C, donde X es cualquier residuo de aminoácido. (Véase, por ejemplo, Takatsuji, supra.) Otros ejemplos de dichas secuencias de polipéptido consenso conservadas con un porcentaje de identidad de secuencia globalmente bajo son bien conocidos por los expertos en la materia.

[0107] Por lo tanto, se describen aquí procedimientos para identificar una secuencia similar o paráloga u ortóloga u homóloga de uno o más polinucleótidos como se indica en el presente documento, o uno o más polipéptidos diana codificados por los polinucleótidos, o lo que se indique de otra manera en el presente documento, y puede incluir la conexión o asociación del fenotipo de una planta dada o función génica con una secuencia. En los procedimientos, se proporciona una base de datos de secuencias (local o a través de internet o intranet) y se plantea una cuestión frente a la base de datos de secuencias usando las secuencias relevantes del presente documento y los fenotipos de plantas o funciones de genes asociados.

[0108] Además, se pueden usar una o más secuencias de polinucleótidos o uno o más polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos para buscar frente a BLOCKS (Bairoch y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 217221), PFAM, y otras bases de datos que contienen patrones, secuencias y funciones de genes previamente identificados y anotados. Se pueden usar los procedimientos que buscan patrones de secuencia primaria con penalizaciones por huecos en la estructura secundaria (Smith y col. (1992) Protein Engineering 5: 35-51) así como algoritmos tales como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul y col. (1990) ver antes), BLOCKS (Henikoff y Henikoff (1991) Nucleic Acids Res. 19: 6565-6572), Hidden Markov Models (HMM; Eddy (1996) Curr. Opin. Str. Biol. 6: 361-365; Sonnhammer y col. (1997) Proteins 28: 405-420), y similares, para manipular y analizar secuencias de polinucleótidos y polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Estas bases de datos, algoritmos y otros procedimientos son bien conocidos en la técnica y se describen en Ausubel y col. (1997) “Short Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, unit 7.7) y en Meyers (1995) “Molecular Biology and Biotechnology”, Wiley VCH, Nueva York, NY, p 856-853).

[0109] Un procedimiento adicional para identificar o confirmar que las secuencias homólogas específicas controlan la misma función es por comparación del o de los perfiles de los transcritos obtenidos tras la expresión en exceso o inactivación de dos o más factores de transcripción relacionados. Puesto que los perfiles de transcritos son diagnóstico para estados celulares específicos, un experto la materia apreciará que los genes que tienen un perfil de transcritos muy similar (por ejemplo, con más de 50% de los transcritos regulados en común, más preferiblemente con más de 70% de los transcritos regulados en común, lo más preferiblemente con más de 90% de los transcritos regulados en común) tendrán funciones muy similares. Fowler y col. (2002) Plant Cell 14: 1675-1679) han mostrado que 3 genes parálogos de la familia AP2 (CBF1, CBF2 y CBF3), cada uno de los cuales es inducido tras tratamiento con frío, y cada uno de los cuales pueden condicionar una mejor tolerancia a la helada, tienen perfiles de transcritos muy similares. Una vez que se ha mostrado que un factor de transcripción proporciona una función específica, su perfil de transcritos se convierte en una herramienta de diagnóstico para determinar si parálogos u ortólogos presuntos tienen la misma función.

[0110] Además, se pueden usar procedimientos que usan el alineamiento manual de secuencias similares u homólogas con una o más secuencias de polinucleótidos o uno o más polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos, para identificar regiones de similitud y dominios de unión de AP2. Dichos procedimientos manuales son bien conocidos para el experto en la materia y pueden incluir, por ejemplo, comparaciones de la estructura terciaria entre una secuencia de polipéptido codificada por un polinucleótido que comprende una función conocida con una secuencia de polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótido que tiene una función todavía no determinada. Dichos ejemplos de estructura terciaria pueden comprender hélices a, láminas 1, hélices anfipáticas, patrones de cremallera de leucina, patrones de dedos de cinc, regiones ricas en prolina, patrones de repetición de cisteína, y similares.

[0111] Los ortólogos y parálogos de los presentes factores de transcripción descritos, se pueden clonar usando composiciones proporcionadas por el presente documento de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Los ADNc se pueden clonar usando ARNm de una célula o tejido de planta que expresa uno de los presentes factores de transcripción. Las fuentes de ARNm adecuadas se pueden identificar examinando transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de secuencias de los presentes factores de transcripción, después de lo cual se prepara una biblioteca a partir del ARNm obtenido de una célula o tejido positivo. Después, el ADNc que codifica el factor de transcripción se aísla usando, por ejemplo, la PCR, usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de genes del presente factor de transcripción descrito, o mediante hibridación con un ADNc parcial o completa o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. La biblioteca de ADNc se puede usar para transformar células de plantas. La expresión de los ADNc de interés se detecta usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento tales como micromatrices, transferencias Northern, PCR cuantitativa, o cualquier otra técnica para el seguimiento de los cambios en la expresión. Los clones genómicos se pueden aislar usando técnicas similares a estas.

Identificación de polinucleótidos o ácidos nucleicos por hibridación

[0112] Los polinucleótidos homólogos a las secuencias ilustradas en la Lista de Secuencias y en las tablas, se pueden identificar, por ejemplo, por hibridación entre sí en condiciones rigurosas o muy rigurosas. Los polinucleótidos monocatenarios hibridan cuando se asocian basándose en una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizada, tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. La restricción de una hibridación refleja el grado de identidad de secuencia de los ácidos nucleicos implicados, de modo que cuanto más altas son las condiciones rigurosas, más similares son las dos cadenas de polinucleótido. En las condiciones rigurosas influyen una variedad de factores, incluyendo la temperatura, concentración de sales y composición, aditivos orgánicos y no orgánicos, disolventes, etc. presentes tanto en las disoluciones de hibridación como en las de lavado, e incubaciones (y número de las mismas), como se describe con más detalle en las referencias citadas antes.

[0113] La presente descripción comprende secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias de polinucleótidos reivindicadas, incluyendo cualquiera de los polinucleótidos de factores de transcripción en el Listado de Secuencias y fragmentos de los mismos bajo condiciones de rigurosidad (véase, por ejemplo, Wahl y Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407; y Kimmel (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Además de las secuencias de nucleótidos indicadas en las Tablas 4-9, se pueden identificar y aislar ADNc de longitud completa, ortólogos y parálogos de las presentes secuencias de nucleótidos utilizando procesos bien conocidos. Las bibliotecas de ADNc, ortólogos y parálogos de las presentes secuencias de nucleótidos se pueden cribar utilizando procesos de hibridación para determinar su utilidad como diana de hibridación o sondas de amplificación.

[0114] Con respecto a la hibridación, condiciones que son altamente rigurosas, y medios para conseguirlas, son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. (1989) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory); Berger y Kimmel, eds., (1987) "Guide to Molecular Cloning Techniques", en Methods in Enzymology: 152: 467-469; y Anderson and Young (1985) "Quantitative Filter Hybridisation." en: Hames and Higgins, ed., Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach. Oxford, IRL Press, 73-111.

[0115] A la estabilidad de los dúplex de ADN le afecta factores tales como la composición de bases, longitud y grado de emparejamiento erróneo de los pares de bases. Las condiciones de hibridación se pueden ajustar para permitir que los ADN de diferentes secuencias relevantes hibriden. La temperatura de fusión (Tf (Tm en inglés)) se define como la temperatura cuando 50% de las moléculas de dúplex se han disociado en sus constituyentes de cadenas sencillas. Las temperaturas de fusión de una cadena doble perfectamente emparejado, en el que el tampón de hibridación contiene formamida como agente desnaturalizante, se puede calcular por las siguientes ecuaciones:

(I)

ADN-ADN:

(II)

ADN-ARN:

(III) ARN-ARN:

en las que L es la longitud del dúplex formado, [Na+] es la concentración molar del ion sodio en la disolución de hibridación o de lavado, y % de G+C es el porcentaje de las bases (guanina + citosina) en el híbrido. Para híbridos emparejados de forma imperfecta, es necesario aproximadamente 1ºC para reducir la temperatura de fusión para cada 1% de emparejamientos erróneos.

[0116] Los experimentos de hibridación en general se llevan a cabo en un tampón con pH entre 6,8 y 7,4, aunque la velocidad de hibridación es casi independiente del pH a las fuerzas iónicas que es probable que se usen en el tampón de hibridación (Anderson y col. (1985) ver antes). Además, se puede usar uno o más de los siguientes para reducir la hibridación no específica: ADN de esperma de salmón tratado con ultrasonidos u otro ADN no complementario, albúmina de suero bovino, pirofosfato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), polivinilpirrolidona, Ficoll y disolución de Denhardt. El sulfato de dextrano y el polietilenglicol 6000 actúan para excluir el ADN de la disolución, aumentando así la concentración de ADN sonda eficaz y la señal de hibridación en una unidad de tiempo dada. En algunos casos, pueden ser deseables o necesarias condiciones incluso más rigurosas para reducir la hibridación de fondo y/o no específica. Estas condiciones se pueden crear con el uso de temperatura mayor, fuerza iónica menor y mayor concentración de un agente desnaturalizante tal como la formamida.

[0117] Las condiciones rigurosas se pueden ajustar para cribar fragmentos moderadamente similares tales como secuencias homólogas de organismos relacionados de forma distante, o fragmentos muy similares tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos relacionados de cerca. Las condiciones rigurosas se pueden ajustar durante la etapa de hibridación, o en los lavados posteriores a la hibridación. La concentración de sal, concentración de formamida, temperatura de hibridación y longitud de la sonda, son variables que se pueden usar para alterar las condiciones rigurosas (como se describe mediante la fórmula anterior). Como norma general las condiciones muy rigurosas se llevan a cabo típicamente de Tf-5ºC a Tf-20ºC, condiciones rigurosas moderadas de Tf-20ºC a Tf-35ºC y condiciones poco rigurosas de Tf- 35ºC a Tf-50ºC, para dúplex de >150 pares de bases. La hibridación se puede llevar a cabo en condiciones de poco rigurosas a moderadas (25-50ºC por debajo de la Tf), seguido de lavados posteriores a la hibridación con condiciones rigurosas crecientes. Las velocidades de hibridación máximas en disolución se determina empíricamente que se producen a Tf-25ºC para dúplex de ADN-ADN y Tf-15ºC para dúplex de ARN-ADN. Opcionalmente, el grado de disociación se puede evaluar después de cada etapa de lavado para determinar la necesidad de posteriores etapas de lavado, de condiciones más rigurosas.

[0118] Las condiciones rigurosas altas se pueden usar para seleccionar secuencias de ácidos nucleicos con grados altos de identidad con las secuencias descritas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas obtenidas en un procedimiento basado en filtro, tal como una transferencia Southern o Northern para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 residuos complementarios, es aproximadamente de 5ºC a 20ºC inferior que el punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones usadas para la hibridación pueden incluir cloruro de sodio de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M, caseína de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, SDS aproximadamente al 0,02% o N-laurilsarcosina aproximadamente al 0,1%, citrato de sodio de aproximadamente 0,001 M a aproximadamente 0,03 M, a temperaturas de hibridación entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 70ºC. Más preferiblemente, las condiciones muy rigurosas son cloruro de sodio aproximadamente 0,02 M, caseína aproximadamente al 0,5%, SDS aproximadamente al 0,02%, citrato de sodio aproximadamente 0,001 M, a una temperatura de aproximadamente 50ºC. Las moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas típicamente hibridarán con una sonda basada en la molécula de ADN entera o partes seleccionadas, por ejemplo, con una subsecuencia única del ADN.

[0119] La concentración de sal rigurosa normalmente será menor de aproximadamente NaCl 750 mM y citrato trisódico 75 mM. Se pueden obtener condiciones rigurosas crecientes con menos de aproximadamente NaCl 500 mM y citrato trisódico 50 mM, hasta condiciones incluso más rigurosas con menos de aproximadamente NaCl 250 mM y citrato trisódico 25 mM. La hibridación en condiciones poco rigurosas se puede obtener en ausencia de disolvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que la hibridación en condiciones muy rigurosas se puede obtener en presencia de formamida por lo menos aproximadamente al 35% y más preferiblemente formamida por lo menos aproximadamente al 50%. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas de por lo menos aproximadamente 30ºC, más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 37ºC y lo más preferiblemente de por lo menos aproximadamente 42ºC, con formamida presente. Los diversos parámetros adicionales, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergentes, por ejemplo, de dodecilsulfato de sodio (SDS) y la fuerza iónica, son bien conocidas por el experto en la materia. Los diferentes niveles de condiciones rigurosas se logran combinando estas diferentes condiciones según sea necesario.

[0120] Las etapas de lavado que siguen a la hibridación también pueden tener distintas condiciones rigurosas; las etapas de lavado posteriores a la hibridación determinan principalmente la especificidad de la hibridación, siendo los factores más críticos la temperatura y la fuerza iónica de la disolución de lavado final. Las condiciones de lavado rigurosas se pueden aumentar disminuyendo la concentración de sales o aumentando la temperatura. Las condiciones rigurosas de la concentración de sales para las etapas de lavado serán preferiblemente menores de aproximadamente NaCl 3 mM y citrato sódico 3 mM, y lo más preferiblemente menores de aproximadamente NaCl 1,5 mM y citrato sódico 1,5 mM.

[0121] Por lo tanto, las condiciones de hibridación y de lavado que se pueden usar para unir y eliminar polinucleótidos con homología menor de la deseada con las secuencias de ácidos nucleicos o sus complementarias que codifican los factores de transcripción presentes incluyen, por ejemplo:

6X SSC a 65ºC; formamida al 50%, 4X SSC a 42ºC; o 0,5X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC; con, por ejemplo, 2 etapas de lavado de 10-30 minutos cada una. Las variaciones útiles de estas condiciones serán fácilmente evidentes para el experto en la materia.

[0122] Un experto en la materia no esperará una variación sustancial entre las especies de polinucleótidos abarcadas en el alcance de la presente invención, porque las condiciones muy rigurosas expuestas en las fórmulas anteriores dan polinucleótidos estructuralmente similares.

[0123] Si se desea, se pueden usar etapas de lavado incluso más rigurosas, incluyendo aproximadamente 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC y lavado dos veces, siendo cada etapa de lavado de aproximadamente 30 min, o aproximadamente 0,1 X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC y lavado dos veces durante 30 min. La temperatura de las disoluciones de lavado normalmente será por lo menos aproximadamente 25ºC, y para condiciones más rigurosas por lo menos aproximadamente 42ºC. Las condiciones rigurosas de la hibridación se pueden aumentar incluso más usando las mismas condiciones que en las etapas de hibridación, aumentando la temperatura de lavado de aproximadamente 3ºC a aproximadamente 5ºC, y las condiciones rigurosas se pueden aumentar incluso más usando las mismas condiciones excepto que la temperatura de lavado se aumenta de aproximadamente 6ºC a aproximadamente 9ºC. Para la identificación de homólogos menos relacionados, las etapas de lavado se pueden llevar a cabo a una temperatura inferior, por ejemplo, 50ºC.

[0124] Un ejemplo de una etapa de lavado de condiciones rigurosas bajas usa una disolución y condiciones de por lo menos 25ºC en NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM y SDS al 0,1% durante 30 min. Se pueden obtener condiciones más rigurosas a 42ºC en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1% durante 30 min. Se obtienen condiciones incluso más rigurosas a 65-68ºC en una disolución de NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1%. Los procedimientos de lavado usarán en general por lo menos 2 etapas finales de lavado. Las variaciones adicionales de estas condiciones serán fácilmente evidentes para el experto en la materia (véase, por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. Nº 20010010913).

[0125] Las condiciones rigurosas se pueden seleccionar de modo que un oligonucleótido que sea perfectamente complementario con el oligonucleótido codificante hibride con el oligonucleótido codificante con una relación de señal a ruido de por lo menos aproximadamente 5-10x mayor que la relación para la hibridación del oligonucleótido perfectamente complementario con un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción conocido en la fecha de presentación de la solicitud. Puede ser deseable seleccionar condiciones para un ensayo particular de modo que se obtenga una relación de señal a ruido mayor, es decir, aproximadamente 15x o más. Por consiguiente, un ácido nucleico objeto hibridará con un oligonucleótido codificante único con una relación de señal a ruido de por lo menos 2x o mayor, comparado con la hibridación del oligonucleótido codificante con un ácido nucleico que codifica un polipéptido conocido. La señal particular dependerá del marcador usado en el ensayo pertinente, por ejemplo, un marcador fluorescente, un marcador colorimétrico, un marcador radiactivo, o similares. La hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias de polinucleótidos relacionadas se pueden producir por oligomarcaje, traslado de mellas, marcaje del extremo o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado.

[0126] El presente documento abarca secuencias de polinucleótidos que codifican polipéptidos capaces de regular la transcripción, siendo dichas secuencias de polinucleótidos capaces de hibridar con las secuencias de polinucleótidos reivindicadas, incluyendo aquellas listadas en la Lista de Secuencias, o polinucleótidos que codifican los polipéptidos listados en la Lista de Secuencias y específicamente SEQ ID Nos: 1-2237, y fragmentos de los mismo bajo diversas condiciones de rigurosidad. (Véase, por ejemplo, Wahl y Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, y Kimmel (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Las valoraciones de homología se proporcionan por hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN en condiciones rigurosas como entienden bien los expertos en la materia (Hames y Higgins, Eds. (1985) “Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach”, IRL Press, Oxford, Reino Unido). Las condiciones rigurosas se pueden ajustar para cribar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas de organismos relacionados lejanamente, hasta fragmentos muy similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones rigurosas.

Identificación de polinucleótidos o ácidos nucleicos con bibliotecas de expresión

[0127] Además de los procedimientos de hibridación, se pueden obtener polipéptidos homólogos de factores de transcripción mediante el cribado de una biblioteca de expresión usando anticuerpos específicos para uno o más factores de transcripción. Proporcionando en el presente documento el factor de transcripción descrito y secuencias de ácidos nucleicos homólogas de los factores de transcripción, el o los polipéptidos codificados se pueden expresar y purificar en un sistema de expresión heterólogo (por ejemplo, E. coli) y usar para producir anticuerpos (monoclonales o policlonales) específicos para el o los polipéptidos en cuestión. También se pueden producir anticuerpos contra péptidos sintéticos derivados de secuencias de aminoácidos de un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción. Los procedimientos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica y se describen en Harlow y Lane (1988), “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York. Dichos anticuerpos se pueden usar después para cribar una biblioteca de expresión producida a partir de la planta de la cual se desean clonar homólogos de factores de transcripción adicionales, usando los procedimientos descritos antes. Los ADNc seleccionados se pueden confirmar mediante secuenciación y actividad enzimática.

Variaciones de secuencia

[0128] Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que cualquiera de una variedad de secuencias de polinucleótidos son capaces de codificar los factores de transcripción y polipéptidos homólogos de factores de transcripción aquí descritos. Debido a la degeneración del código genético, muchos polinucleótidos diferentes pueden codificar polipéptidos idénticos y/o sustancialmente similares además de las secuencias ilustradas en la Lista de Secuencias. También están contemplados ácidos nucleicos que tienen una secuencia que difiere de las secuencias mostradas en la Lista de Secuencias, o secuencias complementarias, que codifican péptidos funcionalmente equivalentes (es decir, péptidos que tienen el mismo grado de actividad biológica equivalente o similar) pero difieren en la secuencia respecto a la secuencia mostrada en la Lista de Secuencias debido a la degeneración del código genético.

[0129] Las secuencias de polinucleótidos alteradas que codifican polipéptidos incluyen las secuencias con eliminaciones, inserciones o sustituciones de diferentes nucleótidos, que dan como resultado un polinucleótido que codifica un polipéptido con por lo menos una característica funcional de los presentes polipéptidos. Están incluidos en esta definición los polimorfismos que pueden ser o no fácilmente detectables usando una sonda de oligonucleótido particular del polinucleótido que codifica los presentes polipéptidos, y la hibridación inadecuada o inesperada con variantes alélicas, con un locus distinto del locus cromosómico normal para la secuencia de polinucleótido que codifica los presentes polipéptidos.

[0130] Las variantes alélicas se refieren a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente por mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (es decir no hay cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante alélica también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. La variante por corte y empalme se refiere a formas alternativas de ARN transcritas a partir de un gen. La variación por corte y empalme surge de forma natural por el uso de sitios de corte y empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o de forma menos común entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede producir varios ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes por corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante por corte y empalme también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante por corte y empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.

[0131] Los ADNc generados a partir de ARNm de corte y empalme alternativo, que retienen las propiedades del factor de transcripción están incluidos dentro del alcance del presente documento, como lo están los polipéptidos codificados por dichos ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y variantes por corte y empalme de estas secuencias se pueden clonar por hibridación de bibliotecas de ADNc o genómicas de diferentes organismos o tejidos individuales de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica (documento USPN 6.388.064).

[0132] Las moléculas de ácido nucleico relacionadas también incluyen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una sustitución, modificación, adición y/o eliminación de uno o más residuos de aminoácidos comparado con las secuencias de polipéptidos de la Lista de Secuencias. Dichos polipéptidos relacionados pueden comprender, por ejemplo, adiciones y/o eliminaciones de uno o más sitios de glicosilación unidos a N o unidos a O, o una adición y/o una eliminación de uno o más residuos de cisteína.

[0133] Por ejemplo, la tabla 1 ilustra, por ejemplo, que los codones AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, y TCT codifican todos el mismo aminoácido: la serina. Por consiguiente, en cada posición en la secuencia en la que hay un codón que codifica una serina, se puede usar cualquiera de las secuencias trinucleótidas anteriores sin alterar el polipéptido codificado.

Tabla 1

[0134] Las alteraciones de secuencia que no cambien la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido se denominan variaciones “silenciosas”. Con la excepción de los codones ATG y TGG, que codifican la metionina y el triptófano, respectivamente, cualquiera de los posibles codones para el mismo aminoácido se puede sustituir por una variedad de técnicas, por ejemplo, mutagénesis dirigida, disponible en la técnica. Por consiguiente, todas y cualquiera de dichas variaciones de una secuencia seleccionada de la tabla anterior son una característica de la invención.

[0135] Además de las variaciones silenciosas, se pueden hacer otras variaciones conservativas que alteran uno o algunos residuos de aminoácidos en el polipéptido codificado, sin alterar la función del polipéptido, y estas variantes conservativas son también una característica del documento.

[0136] Por ejemplo, también se prevén sustituciones, eliminaciones e inserciones introducidas en las secuencias proporcionadas en la Lista de Secuencias. Dichas modificaciones de secuencia se pueden diseñar en una secuencia mediante mutagénesis dirigida (Wu (ed.) Methods Enzymol. (1993) vol. 217, Academic Press) o por otros procedimientos indicados más adelante. Las sustituciones de aminoácidos normalmente son de residuos individuales; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente de 1 a 10 residuos de aminoácidos; y las eliminaciones estarán en el intervalo de aproximadamente 1 a 30 restos. En realizaciones preferidas, las eliminaciones o inserciones se hacen en pares adyacentes, por ejemplo, una eliminación de dos residuos o inserción de dos restos. Se pueden combinar sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinación de los mismos para llegar a una secuencia. Las mutaciones que se hacen en el polinucleótido que codifica el factor de transcripción no deben poner a la secuencia fuera del marco de lectura y no deben crear regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Preferiblemente, el polipéptido codificado por el ADN realiza la función deseada.

[0137] Las sustituciones conservativas son aquellas en las que se ha eliminado por lo menos un residuo en la secuencia de aminoácidos y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Dichas sustituciones en general se hacen de acuerdo con la tabla 2 cuando se desea mantener la actividad de la proteína. La tabla 2 muestra los aminoácidos que se pueden sustituir por un aminoácido en una proteína y que se considera normalmente como sustituciones conservativas.

Tabla 2

[0138] Sustituciones similares son aquellas en las que por lo menos un residuo de la secuencia de aminoácidos se ha eliminado y se ha insertado en su lugar un residuo diferente. Dichas sustituciones en general se hacen de acuerdo con la tabla 3 cuando se desea mantener la actividad de la proteína. La tabla 3 muestra los aminoácidos que se pueden sustituir por un aminoácido en una proteína y que se consideran normalmente como sustituciones estructurales y funcionales. Por ejemplo, un residuo en la columna 1 de la tabla 3 se puede sustituir por un residuo en la columna 2; además, un residuo en la columna 2 de la tabla 3 se puede sustituir por el residuo de la columna 1.

Tabla 3

[0139] Se pueden seleccionar sustituciones que son menos conservativas que las de la tabla 2 escogiendo residuos que difieren de forma más significativa en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o de hélice, (b) la carga

o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera que en general produzcan cambios más grandes en las propiedades de la proteína serán aquellas en las que

(a)

un residuo hidrofílico, por ejemplo, serilo o treonilo es sustituido por un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo; (b) una cisteína o prolina es sustituida por cualquier otro resto; (c) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo es sustituido por un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo; o (d) un residuo que tiene cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye por uno que no tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, glicina.

Modificación adicional de las secuencias - mutación/evolución forzada

[0140] Además de generar sustituciones silenciosas o conservativas como se ha indicado antes, la presente invención incluye opcionalmente procedimientos para modificar las secuencias de la lista de secuencias. En los procedimientos, se usan procedimientos de modificación de ácidos nucleicos o proteínas para alterar las secuencias dadas para producir más secuencias y/o para modificar química o enzimáticamente secuencias dadas para cambiar las propiedades de los ácidos nucleicos o proteínas.

[0141] Por lo tanto, en una realización, las secuencias de ácidos nucleicos dadas se modifican, por ejemplo, de acuerdo con la mutagénesis estándar o procedimientos de evolución artificial para producir secuencias modificadas. Las secuencias modificadas se pueden crear usando polinucleótidos naturales purificados aislados de cualquier organismo o se pueden sintetizar a partir de composiciones y productos químicos purificados usando medios químicos bien conocidos para el experto en la materia. Por ejemplo, Ausubel, supra, proporciona detalles adicionales de los procedimientos de mutagénesis. Los procedimientos de evolución forzada artificial se describen, por ejemplo, en Stemmer (1994) Nature 370: 389-391, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 10747-10751, y patentes de EE.UU. 5.811.238, 5.837.500, y 6.242.568. Se describen procedimientos para diseñar factores de transcripción sintéticos y otros polipéptidos, por ejemplo, en Zhang y col. (2000) J. Biol. Chem. 275: 33850-33860, Liu y col. (2001) J. Biol. Chem. 276: 11323-11334, e Isalan y col. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660. También están disponibles muchos otros procedimientos de mutación y de evolución y se basará en el criterio del experto.

[0142] Igualmente, se puede llevar a cabo la alteración química o enzimática de ácidos nucleicos expresados y polipéptidos mediante procedimientos estándar. Por ejemplo, una secuencia se puede modificar por adición de lípidos, azúcares, péptidos, compuestos orgánicos o inorgánicos, por la inclusión de nucleótidos o aminoácidos modificados, o similares. Por ejemplo, se ilustran técnicas de modificación de proteínas en Ausubel, supra. En el presente documento se pueden encontrar más detalles sobre las modificaciones químicas y enzimáticas. Estos procedimientos de modificación se pueden usar para modificar cualquier secuencia dada, o para modificar cualquier secuencia producida por los diferentes procedimientos de modificación por mutación y evolución artificial indicados en el presente documento.

[0143] Por consiguiente, el presente documento proporciona la modificación de cualquier ácido nucleico dado por mutación, evolución, modificación química o enzimática, u otros procedimientos disponibles, así como los productos producidos por la práctica de dichos procedimientos, por ejemplo, usando las secuencias del presente documento como un sustrato de partida para los diferentes procedimientos de modificación.

[0144] Por ejemplo, se puede usar una secuencia codificante optimizada que contiene codones preferidos por un hospedador procariota o eucariota particular, por ejemplo, para aumentar la velocidad de traducción o para producir transcritos de ARN recombinante que tienen las propiedades deseadas, tales como una semivida más prolongada, comparado con los transcritos producidos usando una secuencia no optimizada. Los codones de parada de la traducción también se pueden modificar para reflejar la preferencia del hospedador. Por ejemplo, los codones de parada preferidos para Saccharomyces cerevisiae y mamíferos son TAA y TGA, respectivamente. El codón de parada preferido para las plantas monocotiledóneas es TGA, mientras que los insectos y E. coli prefieren usar TAA como codón de parada.

[0145] Las secuencias de polinucleótidos también se pueden diseñar con el fin de alterar una secuencia codificante por una variedad de razones, incluyendo, pero sin limitar, alteraciones que modifican la secuencia para facilitar la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. Por ejemplo, se introducen opcionalmente alteraciones usando técnicas que son conocidas en la materia, por ejemplo mutagénesis dirigida, para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar patrones de glicosilación, para cambiar preferencias de codones, para introducir sitios de corte y empalme, etc.

[0146] Además, un fragmento o dominio derivado de cualquiera de los polipéptidos se puede combinar con dominios derivados de otros factores de transcripción o dominios sintéticos para modificar la actividad biológica de un factor de transcripción. Por ejemplo, un dominio de unión al ADN derivado de un factor de transcripción se puede combinar con el dominio de activación de otro factor de transcripción o con un dominio de activación sintético. Un dominio de activación de la transcripción ayuda en el inicio de la transcripción a partir de un sitio de unión al ADN. Los ejemplos incluyen la región de activación de la transcripción de VP16 o GAL4 (Moore y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 376-381; Aoyama y col. (1995) Plant Cell 7: 1773-1785), péptidos derivados de secuencias bacterianas (Ma y Ptashne (1987) Cell 51: 113-119) y péptido sintéticos (Giniger y Ptashne (1987) Nature 330: 670-672).

Expresión y modificación de polipéptidos

[0147] Típicamente, las secuencias de polinucleótidos se incorporan en moléculas de ADN (o ARN) recombinantes que dirigen la expresión de polipéptidos en células hospedadoras adecuadas, plantas transgénicas, sistemas de traducción in vitro, o similares. Debido a la degeneración inherente del código genético, cualquier secuencia listada se puede sustituir por secuencias de ácidos nucleicos que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente, para proporcionar la clonación y expresión del homólogo pertinente.

[0148] Las plantas transgénicas de la presente invención que comprenden secuencias de polinucleótidos recombinantes en general derivan de plantas parentales, que pueden ser ellas mismas plantas no transformadas (o no transgénicas). La sobreexpresión de plantas “progenie” transgénicas, presentarán mayores niveles de ARNm, en las que el ARNm codifica un factor de transcripción, es decir, una proteína de unión al ADN que es capaz de unirse a una secuencia reguladora de ADN y que incluye la transcripción, y preferiblemente, la expresión de un gen del rasgo de la planta. Preferiblemente, el nivel de expresión del ARNm será por lo menos 3 veces mayor que el de la planta parental, o más preferiblemente por lo menos 10 veces mayor que los niveles de ARNm comparados con dicha planta parental, y lo más preferiblemente por lo menos 50 veces mayor comparado con dicha planta parental.

Vectores, promotores y sistemas de expresión

[0149] El presente documento incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más secuencias de ácidos nucleicos del presente documento. Las construcciones típicamente comprenden un vector, tal como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus (por ejemplo un virus de planta), un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o similares, en el que se habrá insertado una secuencia de ácido nucleico, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor operativamente unido a la secuencia. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y están disponibles en el comercio.

[0150] Los textos generales que describen técnicas de biología molecular útiles en el presente documento, incluyendo el uso y la producción de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes, incluyen Berger, Sambrook, supra y Ausubel, supra. Cualquiera de las secuencias identificadas se puede incorporar en un casete o vector, por ejemplo, para la expresión en plantas. Se ha descrito una serie de vectores de expresión adecuados para la transformación estable de células de plantas o para el establecimiento de plantas transgénicas, incluyendo los descritos en Weissbach y Weissbach (1989) “Methods for Plant Molecular Biology” Academic Press, y Gelvin y col. (1990) “Plant Molecular Biology Manual”, Kluwer Academic Publishers. Los ejemplos específicos incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como los descritos en Herrera- Estrella y col. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technology 3: 637-642, para plantas dicotiledóneas.

[0151] Alternativamente, se pueden usar vectores no-Ti para transferir el ADN a plantas monocotiledóneas y células usando técnicas de suministro de ADN libre. Dichos procedimientos pueden implicar, por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación, bombardeo de microproyectiles, filamentos de carburo de silicio y virus. Usando estos procedimientos se pueden producir plantas transgénicas tales como trigo, arroz (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618). Un embrión inmaduro también puede ser un buen tejido diana para monocotiledóneas para las técnicas de suministro directo de ADN usando la pistola de partículas (Weeks y col. (1993) Plant Physiol. 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technology 10: 667-674; Wan y Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48, y para la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium (Ishida y col. (1996) Nature Biotechnol. 14: 745-750).

[0152] Típicamente, los vectores de transformación de plantas incluyen una o más secuencias codificantes clonadas de la planta (genómicas o ADNc) bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5’ y 3’ y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de transformación de plantas típicamente contienen también un promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o el desarrollo, específica de célula o tejido), un sitio de inicio de la transcripción, una señal de procesamiento del ARN (tal como sitios de corte y empalme, intrones), un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

[0153] Una utilidad potencial de los polinucleótidos de los factores de transcripción descritos en el presente documento es el aislamiento de elementos promotores de estos genes, que se pueden usar para programar la expresión en plantas de cualesquiera genes. Cada gen de factor de transcripción descrito en el presente documento se expresa de una forma única, determinada por los elementos promotores localizados en la dirección 5’ del inicio de la traducción, y además dentro de un intrón del gen del factor de transcripción o en la dirección 3’ del codón determinación del gen. Como se sabe en la técnica, para una parte significativa de los genes, las secuencias promotoras están situadas totalmente en la región directamente en la dirección 5’ del inicio de la traducción. En dichos casos, típicamente las secuencias promotoras están situadas dentro de 2,0 kb del inicio de la traducción, o dentro de 1,5 kb del inicio de la traducción, con frecuencia dentro de 1,0 kb del inicio de la traducción, y a veces dentro de 0,5 kb del inicio de la traducción.

[0154] Las secuencias promotoras se pueden aislar de acuerdo con procedimientos conocidos para el experto en la materia.

[0155] Los ejemplos de promotores de plantas constitutivos que pueden ser útiles para expresar la secuencia de TF incluyen: el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que confiere expresión de alto nivel constitutiva en la mayoría de los tejidos de plantas (véase, por ejemplo, Odell y col. (1985) Nature 313: 810-812); el promotor de la nopalina sintasa (An y col. (1988) Plant Physiol. 88: 547-552); y el promotor de la octopina sintasa (Fromm y col. (1989) Plant Cell 1: 977-984).

[0156] Se puede usar una variedad de promotores de genes de plantas que regulan la expresión de genes en respuesta a señales medioambientales, hormonales, químicas, de desarrollo, y de una forma activada por tejido, para la expresión de una secuencia de TF en plantas. La elección de un promotor se basa en gran medida en el fenotipo de interés y se determina por factores tales como el tejido (por ejemplo, semilla, fruta, raíz, polen, tejido vascular, flor, carpelo, etc.), capacidad de inducción (por ejemplo, en respuesta a heridas, calor, frío, sequía, luz, patógenos, etc.), el tiempo, la etapa de desarrollo, y similares. Se han caracterizado numerosos promotores conocidos y se pueden usar favorablemente para promover la expresión de un polinucleótido en una planta o célula transgénica de interés. Por ejemplo, los promotores específicos de tejido incluyen: promotores específicos de semilla (tal como el promotor de napina, faseolina o DC3 descritos en la patente de EE.UU. nº 5.773.697), promotores específicos de fruto que son activos durante la maduración del fruto (tal como el promotor dru 1 (patente de EE.UU. nº 5.783.393), o el promotor 2A11 (patente de EE.UU. nº 4.943.674) y el promotor de la poligalacturonasa del tomate (Bird y col. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 651-662), promotores específicos de raíz, tales como los descritos en las patentes de EE.UU. Nº 5.618.988, 5.837.848 y 5.905.186, promotores activos en el polen tales como PTA29, PTA26 y PTA13 (patente de EE.UU. nº 5.792.929), promotores activos en el tejido vascular (Ringli y Keller (1998) Plant Mol. Biol. 37: 977-988), específicos de flores (Kaiser y col. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 231-243), polen (Baerson y col. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1947-1959), carpelos (Ohl y col. (1990) Plant Cell 2: 837-848), polen y óvulos (Baerson y col. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 255-267), promotores inducibles por auxina (tales como los descritos en van der Kop y col. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 979-990 o Baumann y col., (1999) Plant Cell 11: 323-334), promotor inducible por citoquinas (Guevara-Garcia (1998) Plant Mol. Biol. 38: 743-753), promotores que responden a la giberelina (Shi y col. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1053-1060, Willmott y col. (1998) Plant Molec. Biol. 38: 817-825) y similares. Son promotores adicionales los que producen expresión en respuesta al calor (Ainley y col. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 1323), la luz (por ejemplo el promotor del guisante rbcS-3A, Kuhlemeier y col. (1989) Plant Cell 1: 471-478), y el promotor del maíz rbcS, Schaffner y Sheen (1991) Plant Cell 3: 997-1012); heridas (por ejemplo, wunI, Siebertz y col. (1989) Plant Cell 1: 961-968); patógenos (tales como el promotor PR-1 descrito en Buchel y col. (1999) Plant Mol. Biol. 40: 387-396, y el promotor PDFI.2 descrito en Manners y col. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1071-1080), y productos químicos tales como el jasmonato de metilo o ácido salicílico (Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Además, el momento de la expresión se puede controlar usando promotores tales como los que actúan en la senescencia (Gan y Amasino (1995) Science 270: 1986-1988); o tarde en el desarrollo de la semilla (Odell y col. (1994) Plant Physiol. 106: 447-458).

[0157] Los vectores de expresión de plantas también pueden incluir señales de procesamiento del ARN que pueden estar situadas dentro, en dirección 5’ o en dirección 3’ de la secuencia codificante. Además, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras adicionales a partir de la región 3’ no traducida de genes de plantas, por ejemplo, una región 3’ terminadora para aumentar la estabilidad del ARNm, tal como la región terminadora PI-II de la patata o las regiones 3’ terminadoras de la octopino o nopalina sintasa.

Elementos de expresión adicionales

[0158] Las señales de inicio específicas pueden ayudar a la traducción eficaz de las secuencias codificantes. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Pueden no ser necesarias señales de control de la traducción adicionales cuando se insertan una secuencia codificante, su codón de inicio y secuencias en la dirección 5’ en el vector de expresión adecuado. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta la secuencia codificante (por ejemplo, una secuencia codificante de proteína madura) o una parte de ella, se pueden proporcionar por separado señales de control de la transcripción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. El codón de inicio se proporciona en el marco de lectura correcto para facilitar la transcripción. Los elementos transcripcionales y codones de inicio exógenos pueden ser de diferentes orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión se puede potenciar por la inclusión de potenciadores adecuados para el sistema celular que se usa.

Hospedadores de expresión

[0159] La presente invención también se refiere a células hospedadoras que se transducen con vectores de la invención, y a la producción de polipéptidos (incluyendo fragmentos de los mismos) por técnicas recombinantes. Las células hospedadoras se transforman por ingeniería genética (es decir, se introducen ácidos nucleicos, por ejemplo, se transducen, transforman o transfectan), con los vectores de este documento, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión que comprenden los ácidos nucleicos relevantes del presente documento. El vector es opcionalmente un plásmido, una partícula vírica, un fago, un ácido nucleico desnudo, etc. Las células hospedadoras transformadas por ingeniería genética se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para la activación de promotores, selección de transformantes o amplificación el gen relevante. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia y se encuentran en la referencias citadas en el presente documento, incluyendo, Sambrook, supra, y Ausubel, supra.

[0160] La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, tal como una célula de levadura o una célula de planta, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. Los protoplastos de planta también son adecuados para algunas aplicaciones. Por ejemplo, se introducen fragmentos de ADN en tejidos de planta, células de plantas cultivadas o protoplastos de planta por procedimientos estándar, que incluyen la electroporación (Fromm y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824-5828), infección por vectores víricos tales como el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Hohn y col., (1982) “Molecular Biology of Plant Tumors” Academic Press, Nueva York, NY, pág. 549-560; documento US 4.407.956), penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico dentro de la matriz de perlas o partículas pequeñas o en la superficie (Klein y col. (1987) Nature 327: 70-73), uso de polen como vector (documento WO 85/01856), o uso de Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes que lleva un plásmido de ADN-T en el que se clona fragmentos de ADN. El plásmido ADN-T se transmite a las células de la planta por infección mediante Agrobacterium tumefaciens, y una parte se integra establemente en el genoma de la planta (Horsch y col. (1984) Science 233: 496-498; Fraley y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803-4807).

[0161] La célula puede incluir un ácido nucleico que codifica un polipéptido, en el que la célula expresa un polipéptido. La célula también puede incluir secuencias de vectores, o similares. Además, las células y plantas transgénicas que incluyen cualquier polipéptido o ácido nucleico anterior o a lo largo de esta memoria descriptiva, por ejemplo, producidos por transducción de un vector del presente documento, son una característica adicional.

[0162] Para la producción de alto rendimiento y a largo plazo de proteínas recombinantes, se puede usar la expresión estable. Las células hospedadoras transformadas con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido se cultivan opcionalmente en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. La proteína o fragmento de la misma producida por una célula recombinante puede ser secretada, estar unida a membrana, o contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. Como entenderá el experto en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican proteínas maduras, se pueden diseñar con secuencias señal que dirigen la secreción de los polipéptidos maduros a través de la membrana celular procariota o eucariota.

Residuos de aminoácidos modificados

[0163] Los polipéptidos pueden contener uno o más residuos de aminoácidos modificados. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa, por ejemplo, para aumentar la semivida del polipéptido, reducir la antigenicidad o toxicidad del polipéptido, aumentar la estabilidad en el almacenamiento del polipéptido, o similares. El o los residuos de aminoácidos se modifican, por ejemplo, simultáneamente con la traducción o después de la traducción durante la producción recombinante o se modifican por medios sintéticos o químicos.

[0164] Los ejemplos no limitantes de un residuo de aminoácido modificado incluyen la incorporación u otro uso de aminoácidos acetilados, aminoácidos glicosilados, aminoácidos sulfatados, aminoácidos prenilados (por ejemplo, farnesilados, geranilgeranilados), aminoácidos modificados con PEG (por ejemplo, “PEGilados”), aminoácidos biotinilados, aminoácidos carboxilados, aminoácidos fosforilados, etc. La bibliografía está llena de referencias adecuadas para guiar al experto en la modificación de los residuos de aminoácidos.

[0165] Los residuos de aminoácidos modificados pueden prevenir o aumentar la afinidad del polipéptido por otra molécula, incluyendo, pero sin limitar, polinucleótido, proteínas, hidratos de carbono, lípidos y derivados de lípidos, y otros compuestos orgánicos o sintéticos.

Identificación de factores adicionales

[0166] Un factor de transcripción proporcionado por el presente documento también se puede usar para identificar moléculas endógenas o exógenas adicionales que pueden afectar al fenotipo o a un rasgo de interés. Por un lado, dichas moléculas incluyen compuestos orgánicos (moléculas pequeñas o grandes) y/o inorgánicos que afectan a la expresión de (es decir, regulan) un factor de transcripción particular. Alternativamente, dichas moléculas incluyen moléculas endógenas que actúan a un nivel transcripcional mediante un factor de transcripción para modificar un fenotipo como se desea. Por ejemplo, los factores de transcripción se pueden usar para identificar uno o más genes en la dirección 3’ que se someten a un efecto regulador del factor de transcripción. En un procedimiento, un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción se expresa en una célula hospedadora, por ejemplo, una célula de planta transgénica, tejido o explante, y se hace el seguimiento de los productos de expresión, ARN o proteína, de dianas probables o aleatorias, por ejemplo, por hibridación con una micromatriz de sondas de ácidos nucleicos correspondientes a los genes expresados en un tejido o tipo de célula de interés, mediante electroforesis en gel bidimensional de los productos proteínicos, o por cualquier otro procedimiento conocido en la técnica para evaluar la expresión de productos génicos a nivel del ARN o proteína. Alternativamente, se puede usar un factor de transcripción para identificar secuencias promotoras (tales como sitios de unión en secuencias de ADN) implicadas en la regulación de una diana en la dirección 3’. Después de identificar una secuencia promotora, se pueden modificar las interacciones entre el factor de transcripción y la secuencia promotora mediante cambios en nucleótidos específicos en la secuencia promotora o aminoácidos específicos en el factor de transcripción que interacciona con la secuencia promotora, para alterar un rasgo de la planta. Típicamente, los sitios de unión al ADN de factores de transcripción se identifican mediante ensayos de desplazamiento en gel. Después de identificar las regiones promotoras, las secuencias de la región promotora se pueden usar en matrices de ADN de doble cadena para identificar moléculas que afectan a las interacciones de los factores de transcripción con sus promotores (Bulyk y col. (1999) Nature Biotechnol. 17: 573-577).

[0167] Los factores de transcripción identificados también son útiles para identificar proteínas que modifican la actividad del factor de transcripción. Dicha modificación se puede producir por modificación covalente, tal como por fosforilación o por interacciones de proteína-proteína (homo o heteropolímero). Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para detectar interacciones de proteína–proteína. Entre los procedimientos que se pueden usar están la inmunoprecipitación simultánea, entrecruzamiento y purificación simultánea a través de gradientes o columnas cromatográficas, y el sistema de doble híbrido en levaduras.

[0168] El sistema de doble híbrido detecta interacciones de proteínas in vivo y se describen en Chien y col. ((1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 9578-9582) y está disponible en el comercio en Clontech (Palo Alto, Calif.). En dicho sistema, se construyen plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: una consiste en el dominio de unión al ADN de una proteína activadora de la transcripción fusionada con el polipéptido del TF y la otra consiste en el dominio de activación de la proteína activadora de la transcripción fusionado con una proteína desconocida que es codificada por un ADNc que se ha recombinado en el plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión del dominio de unión al ADN y la biblioteca de ADNc se transforman en una cepa de levaduras de Saccharomyces cerevisiae que contiene una gen indicador (por ejemplo, lacZ) cuya región reguladora contiene el sitio de unión al activador de la transcripción. Cualquiera de las proteínas híbridas sola no puede activar la transcripción del gen indicador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional y da como resultado de expresión del gen indicador, que se detecta mediante un ensayo para el producto del gen indicador. Después, los plásmidos de la biblioteca responsables de la expresión del gen indicador se aíslan y se secuencian para identificar las proteínas codificadas por los plásmidos de la biblioteca. Después de identificar las proteínas que interaccionan con los factores de transcripción, se pueden llevar a cabo ensayos para los compuestos que interfieren con las interacciones de proteína–proteína del TF.

Identificación de moduladores

[0169] Además de las moléculas intracelulares descritas anteriormente, pueden identificarse moléculas extracelulares que alteran la actividad o la expresión de un factor de transcripción, ya sea directa o indirectamente. Por ejemplo, los procedimientos pueden implicar primero la puesta en contacto de una molécula candidata con una planta o una célula vegetal. Puede introducirse la molécula mediante administración tópica, como por pulverización o empapando la planta, o incubando una planta en una solución que contiene la molécula, y a continuación se monitoriza el efecto de la molécula en la expresión o la actividad del polipéptido de TF o la expresión del polinucleótido. Pueden monitorizarse los cambios en la expresión del polipéptido de TF mediante el uso de anticuerpos policlonales o monoclonales, electroforesis en gel o similares. Pueden detectarse cambios en la expresión de la secuencia de polinucleótidos correspondiente mediante el uso de microarrays, Northern, PCR cuantitativo, o cualquier otra técnica para monitorizar cambios en la expresión de ARNm. Se ejemplifican estas técnicas en Ausubel et al. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998, y suplementos a lo largo de 2001). Pueden monitorizarse cambios en la actividad del factor de transcripción, directa o indirectamente, mediante el ensayo de la función del factor de transcripción, por ejemplo, mediante la medición de la expresión de promotores conocidos por estar controlados por el factor de transcripción (utilizando construcciones promotorinformador), la medición de los niveles de transcritos utilizando microarrays, transferencias Northern, PCR cuantitativa, etc. Pueden correlacionarse dichos cambios en los niveles de expresión con rasgos de plantas modificadas y de este modo las moléculas identificadas pueden ser útiles para empaparse o pulverizarse sobre el fruto, cultivos hortícolas y de grano para modificar los rasgos en las plantas.

[0170] Esencialmente puede analizarse cualquier composición disponible por la actividad moduladora de expresión

o la actividad de cualquier ácido nucleico o polipéptido del presente documento. De este modo, pueden analizarse por la actividad moduladora las bibliotecas disponibles de compuestos, tales como compuestos químicos, polipéptidos, ácidos nucleicos y similares. Frecuentemente, pueden disolverse potenciales compuestos moduladores en soluciones acuosas u orgánicas (por ejemplo, de base DMSO) para liberar fácilmente en la célula o la planta de interés en el que se va a analizar la actividad del modulador. De modo opcional, se diseñan ensayos para cribar bibliotecas grandes de composiciones de moduladores mediante la automatización de las etapas del ensayo y la disposición en los ensayos de compuestos de cualquier origen conveniente, que típicamente se procesan en paralelo (por ejemplo, en formatos de microtitulación en placas de micrómetro en ensayos robóticos).

[0171] En una realización, los procesos de cribado de alto rendimiento implican proporcionar una biblioteca combinatoria que contiene un gran número de compuestos potenciales (compuestos moduladores potenciales). A continuación, se criban dichas “bibliotecas químicas combinatorias” en uno o más ensayos, tal y como se describe en la presente invención, para identificar aquellos miembros de la biblioteca (especie química concreta o subclases) que muestran una actividad característica deseada. Los compuestos identificados de este modo pueden servir como compuestos diana.

[0172] Una biblioteca química combinatoria puede ser, por ejemplo, una colección de diversos compuestos químicos generados mediante síntesis química o síntesis biológica. Por ejemplo, se forma una biblioteca química combinatoria, tal como por ejemplo una biblioteca de polipéptidos, mediante la combinación de un conjunto de bloques de construcción química (por ejemplo, en un ejemplo, aminoácidos) de cada manera posible para una longitud de compuesto determinada (es decir, el número de aminoácidos en un compuesto polipéptido de una longitud). Bibliotecas de ejemplo incluyen bibliotecas de péptidos, bibliotecas de ácidos nucleicos, bibliotecas de anticuerpos (ver, por ejemplo, Vaughn et al. (1996) Nature Biotechnol. 14: 309-314 y PCT/US96/10287), bibliotecas de carbohidratos (ver, por ejemplo, Liang et al. Science (1996) 274: 1520-1522 y Patente de Estados Unidos 5.593.853), bibliotecas de ácidos nucleicos de péptidos (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5.539.083), y bibliotecas de moléculas orgánicas pequeñas (ver, por ejemplo, benzodiacepinas, en Baum Chem. & Engineering News Jan 18, 1993, página 33; isoprenoides, Patente de Estados Unidos 5.569.588; tiazolidinonas y metatiazanonas, Patente de Estados Unidos 5.549.974; pirrolidinas, Patentes de Estados Unidos 5.525.735 y 5.519.134; compuestos de morfolino, Patente de Estados Unidos 5.506.337) y similares.

[0173] La preparación y el cribado de bibliotecas combinatorias u otras bibliotecas son bien conocidas por los expertos en la materia. Dichas bibliotecas químicas combinatorias incluyen, pero sin limitación, bibliotecas de péptido (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos 5.010.175; Furka, (1991) Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493; y Houghton et al. (1991) Nature 354: 84-88). También pueden utilizarse otras químicas para generar bibliotecas de diversidad química.

[0174] Además, tal y como se indica, el equipo de cribado de compuestos para un cribado de alto rendimiento está generalmente disponible, por ejemplo, utilizando cualquiera de un conjunto de sistemas robóticos bien conocidos que también se han desarrollado para químicas de fase en solución útiles en sistemas de ensayo. Estos sistemas incluyen estaciones de trabajo automatizadas que incluyen un aparato de síntesis automatizado y sistema robóticos que utilizan brazos robóticos. Cualquiera de los dispositivos anteriores es adecuado para utilizar con este aspecto de la memoria, por ejemplo, para el cribado de alto rendimiento de potenciales moduladores. La naturaleza y la implementación de las modificaciones a estos dispositivos (si las hubiera) de manera que pudieran operar tal y como se describe en la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia pertinente.

[0175] De hecho, están disponibles comercialmente sistemas completos de cribado alto rendimiento. Estos sistemas automatizan típicamente procedimientos completos que incluyen todo el pipeteo de muestra y reactivo, la dispensación de líquido, las incubaciones con el tiempo, y las lecturas finales de la microplaca en el detector o detectores apropiados para el ensayo. Estos sistemas configurables proporcionan un alto rendimiento y un inicio rápido además de un alto grado de flexibilidad y personalización. De modo similar, también están disponibles comercialmente las implementaciones microfluídicas de cribado.

[0176] Los fabricantes de dichos sistemas proporcionan protocolos detallados de los diversos sistemas de cribado de alto rendimiento. De este modo, por ejemplo, Zymark Corp. proporciona boletines técnicos que describen los sistemas de cribado para detectar la modulación de la transcripción génica, la unión a ligando, y similares. Los sistemas integrados en la presente invención, además de proporcionar una alineación de secuencias y, opcionalmente, la síntesis de ácidos nucleicos relevantes, pueden incluir dicho aparato de cribado para identificar moduladores que tienen un efecto sobre uno o más polinucleótidos o polipéptidos descritos aquí.

[0177] En algunos ensayos es deseable tener controles positivos para asegurar que los componentes de los ensayos estén trabajando correctamente. Son apropiados por lo menos dos tipos de controles positivos. Es decir, pueden incubarse activadores o inhibidores transcripcionales conocidos con células o plantas, por ejemplo, en una muestra del ensayo, y puede detectarse el aumento/disminución resultante en la transcripción mediante la medición del incremento resultante en niveles de ARN y/o la expresión de proteína, por ejemplo, según los procedimientos del presente documento. Se entenderá que los moduladores también pueden combinarse con activadores o inhibidores transcripcionales para descubrir moduladores que inhiban la activación transcripcional o la represión transcripcional. Pueden monitorizarse la expresión de los ácidos nucleicos y las proteínas del presente documento o cualquier ácido nucleico o proteína adicional activado por los ácidos nucleicos o proteínas del presente documento, o ambos.

[0178] En una realización, la presente memoria establece un procedimiento para identificar composiciones que modulan la actividad o la expresión de un polinucleótido o polipéptido de la memoria. Por ejemplo, se pone en contacto un compuesto de análisis, ya sea una molécula pequeña o grande, con una célula, planta (o tejido vegetal o explante), o una composición que comprende el polinucleótido o el polipéptido de interés y se evalúa el efecto resultante sobre la célula, planta, (o tejido o explante) o composición mediante la monitorización, ya sea directamente o indirectamente, de uno o más de: nivel de expresión del polinucleótido o polipéptido, actividad (o modulación de la actividad) del polinucleótido o polipéptido. En algunos casos, puede detectarse una alteración en un fenotipo de la planta después del contacto de una planta (o célula vegetal, o tejido o explante) con el posible modulador, por ejemplo, mediante la modulación de la expresión o la actividad de un polinucleótido o un polipéptido. La modulación de la expresión o la actividad de un polinucleótido o un polipéptido también puede estar causada por elementos moleculares en una ruta de transducción de señal con segundo mensajero y dicha modulación puede afectar a elementos similares en la misma u otra ruta de de transducción de señal con segundo mensajero.

Subsecuencias

[0179] También se describen en este documento usos de los polinucleótidos, denominados también en el presente documento como oligonucleótidos, que típicamente tienen por lo menos 12, preferiblmente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 20, 30 ó 50 bases, que hibridan bajo condiciones por lo menos altamente rigurosas (o condiciones rigurosas ultraelevadas o ultraultraelevadas) con una secuencia de polinucleótido descrita antes. Los polinucleótidos se pueden usar como sondas, cebadores, agentes de sentido directo y sentido contrario, y similares, de acuerdo con los procedimientos indicados antes.

[0180] Las subecuencias de los polinucleótidos, incluyendo fragmentos de polinucleótido y oligonucleótidos, son útiles como sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un oligonucleótido adecuado para usar como sonda o cebador tiene por lo menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, más a menudo por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, a menudo por lo menos aproximadamente 21 nucleótidos, con frecuencia por lo menos aproximadamente 30 nucleótidos, o aproximadamente 40 nucleótidos, o más de longitud. Una sonda de ácido nucleico es útil en protocolos de hibridación, por ejemplo, para identificar homólogos de polipéptidos adicionales, incluyendo protocolos para experimentos de micromatrices. Los cebadores se pueden volver a asociar con una cadena de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, y después extender a lo largo de la cadena de ADN diana mediante una enzima ADN polimerasa. Se pueden usar parejas de cebadores para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos. Véase Sambrook, supra y Ausubel, supra.

[0181] Además, se describe en este documento un polipéptido aislado o recombinante que incluye una subsecuencia de por lo menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos codificados por los polinucleótidos recombinantes o aislados. Por ejemplo, dichos polipéptidos, o dominios o fragmentos de los mismos, se pueden usar como inmunógenos, por ejemplo, para producir anticuerpos específicos para la secuencia de polipéptido, o como sondas para detectar una secuencia de interés. El tamaño de una subsecuencia puede estar en el intervalo de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud hasta e incluyendo la longitud completa del polipéptido.

[0182] Un polipéptido expresado que comprende dicha subsecuencia de polipéptido realiza por lo menos una función biológica del polipéptido intacto sustancialmente de la misma forma, o en una extensión similar, a como lo hace el polipéptido intacto. Por ejemplo, un fragmento de polipéptido puede comprender un patrón estructural reconocible o dominio funcional tal como un dominio de unión al ADN que activa la transcripción, por ejemplo, mediante unión a una región promotora de ADN específica de un dominio de activación, o un dominio para interacciones de proteína–proteína.

Producción de plantas transgénicas

Modificación de rasgos

[0183] Los polinucleótidos de la memoria se usan de forma favorable para producir plantas transgénicas con diferentes rasgos o características que se han modificado de una forma conveniente, por ejemplo, para mejorar las características de las semillas de una planta. Por ejemplo, la alteración de los niveles o patrones de expresión (por ejemplo, patrones de expresión espacial o temporal) de uno o más de los factores de transcripción (u homólogos de factores de transcripción), comparado con los niveles de la misma proteína encontrados en una planta tipo salvaje, se puede usar para modificar rasgos de una planta. Un ejemplo ilustrativo de la modificación de rasgos, características mejoradas, mediante la alteración de los niveles de expresión de un factor de transcripción particular se describe a continuación en los ejemplos y la lista de secuencias.

Arabidopsis como un sistema modelo

[0184] Arabidopsis thaliana es objeto de una atención que crece rápidamente como un modelo para la genética y el metabolismo en plantas. Arabidopsis tiene un genoma pequeño y están disponibles estudios bien documentados. Es fácil cultivarla en grandes cantidades y están disponibles mutantes que definen mecanismos genéticamente controlados importantes, o se pueden obtener fácilmente. Están disponibles diferentes procedimientos para introducir y expresar genes homólogos aislados (véase Koncz y col., eds., ”Methods in Arabidopsis Research” (1992) World Scientific, Nueva Jersey, NJ, en “Prólogo”). Debido a su pequeño tamaño, ciclo de vida corto, autogamia obligada y alta fertilidad, Arabidopsis también es un organismo de elección para el aislamiento de mutantes y estudios en rutas morfogenéticas y de desarrollo, y el control de estas rutas por factores de transcripción (Koncz (1992), supra, pág. 72). Una serie de estudios que introducen factores de transcripción en A. thaliana han demostrado la utilidad de esta planta para la comprensión de los mecanismos de regulación de genes y alteración de rasgos en plantas. (Véase, por ejemplo, en Koncz (1992) supra, y en la patente de EE.UU. nº 6.417.428).

Genes homólogos introducidos en plantas transgénicas

[0185] Se pueden introducir en plantas genes homólogos que se pueden obtener de cualquier planta, o de cualquier fuente sea natural, sintética o semisintética o recombinante, y que comparte una identidad o similitud de secuencia significativa con las proporcionadas aquí, por ejemplo, en plantas cultivadas, para conferir los rasgos mejorados o deseados. Por consiguiente, se pueden producir plantas transgénicas que comprenden un vector o casete de expresión recombinante con un promotor operativamente unido a una o más secuencias homólogas con las presentes secuencias descritas. El promotor puede ser, por ejemplo, un promotor de planta o vírico.

[0186] La invención proporciona, por lo tanto, procedimientos para preparar plantas transgénicas y para modificar rasgos de las plantas tal como se define en las reivindicaciones. Estos procedimientos incluyen introducir en una planta un vector o casete de expresión recombinante que comprende un promotor funcional operativamente unido a una o más secuencias homólogas con las presentes secuencias descritas. Las plantas y los kits para producir estas plantas que resultan de la aplicación de estos procedimientos también están incluidos en la presente invención.

Factores de transcripción de interés para la modificación de rasgos de plantas

5 [0187] Actualmente, la existencia de una serie de grupos de maduración para diferentes latitudes representa una barrera importante para la producción de nuevos rasgos valiosos. Cualquier rasgo (por ejemplo, resistencia a una enfermedad) debe cultivarse en cada uno de los diferentes grupos de maduración por separado, un ejercicio laborioso y costoso. Por lo tanto, la disponibilidad de una sola cepa, que podría cultivarse a cualquier latitud,

10 aumentaría mucho el potencial para introducir nuevos rasgos en especies de cultivo tales como la soja y el algodón.

[0188] Para muchos de los efectos, rasgos y utilidades específicos indicados en la tabla 4 y la tabla 6 que pueden ser conferidos a las plantas, se puede usar uno o más de los genes de los factores de transcripción, para aumentar

o disminuir, avanzar o retrasar, o mejorar o perjudicar para un rasgo determinado. Se puede introducir más de un 15 gen de factor de transcripción en una planta, transformando la planta con uno o más vectores que comprenden dos

o más factores de transcripción, o mediante cultivo selectivo de plantas para dar cruces de híbridos que comprenden más de un factor de transcripción introducido.

[0189] En la Tabla 4 se proporciona una lista de efectos específicos y utilidades que los genes de factores de

20 transcripción descritos en la presente invención tienen sobre las plantas, tal y como se determinan mediante la observación directa y el análisis de ensayo. La Tabla 4 muestra los polinucleótidos identificados mediante SEQ ID Nº; Nº ID Gen (GID); y si se analizó el polinucleótido en un ensayo transgénico. La primera columna muestra la SEQ ID Nº del polinucleótido; la segunda columna muestra el GID; la tercera columna muestra si el gen se sobreexpresó (OE) o inactivó (knocked out) (KO) en los estudios de plantas; la cuarta columna muestra la categoría de rasgo

25 modificado resultante del knock out o la sobreexpresión del polinucleótido en la planta transgénica; y la quinta columna (“Observaciones experimentales”), incluye observaciones específicas hechas con respecto al polinucleótido de la primera columna respectiva.

Tabla 4. Rasgos, categorías de rasgos, y efectos y utilidades que tienen los genes de factores de transcripción sobre 30 las plantas.

SEQ ID Nº:

GID OE/K O Categoría Observaciones experimentales

327

G198 8 OE Nutriente; Tolerancia a N bajo Nutriente; tolerancia a PO4 bajo Tiempo de floración Respuesta a luz; pecíolo largo; hipocótilo largo Mejor crecimiento en N bajo más glutamina, mejor crecimiento en fosfato bajo; hipocótilo largo, pecíolo largo, floración temprana

[0190] La tabla 5 muestra los polipéptidos identificados por SEQ ID Nº; Nº de ID de Gen (GID); la familia de factores de transcripción a la que pertenece el polipéptido, y dominios conservados del polipéptido. La primera columna

35 muestra la SEQ ID Nº del polipéptido; la tercera columna muestra la familia de factores de transcripción a la que pertenece el polipéptido; y la cuarta columna muestra las posiciones de residuos de aminoácidos del dominio conservado en coordenadas de aminoácidos (AA).

Tabla 5. Familias génicas y dominios conservados 40

Polipéptido SEQ ID Nº:

GID Nº Familia Dominios conservados en coordenadas de aminoácidos

328

G188 5-50 Tipo Z-CO

[0191] En la Tabla 6 se listan ejemplos de algunas de las utilidades que pueden ser deseables en plantas, y que pueden proporcionarse mediante la transformación de las plantas con las secuencias aquí descritas. Muchos de los factores de la transcripción listados en la Tabla 6 pueden unirse operativamente con un promotor específico que

45 provoca que se exprese el factor de transcripción en respuesta a señales medioambientales, específicas de tejido o temporales. Para ejemplos de otros promotores específicos de tejido, específicos temporales o inducibles, ver la discusión anterior bajo el título “Vectores, promotores, y sistemas de expresión”.

Tabla 6. Genes, rasgos y utilidades que afectan a las características de la planta 50

Categoría de rasgo

Alteración o alteraciones fenotípicas Genes de factores de transcripción que afectan en los rasgos Utilidad

Estrés abiótico

Estrés de nitrógeno Menos sensible a G1988 Producción y tolerancia a estrés de nutriente

limitación de N

aumentados, utilización de fertilizante disminuida

Estrés de fosfato Menos sensible a limitación de PO4

G1988 Producción y tolerancia a estrés de nutriente aumentados, utilización de fertilizante disminuida

Regulador de crecimiento

Sensibilidad a C/N alterada G1988 Alteración o control de división asimilada

Tiempo de floración

Floración temprana G1988 Tiempo de generación más rápido; sincronía de floración; cosechas adicionales dentro de una estación de crecimiento, acortamiento de programas de reproducción

Desarrollo y morfología

Forma, color y desarrollo de hipocótilo alterados G1988 Aplicaciones ornamentales; respuesta a luz alterada (ver “Respuesta a luz” más adelante)

Respuesta a luz/ evitar sombra

Hipocótilo alterado Pecíolo alterado G1988 G1988 Densidades de plantación incrementadas y aumento de la producción

Abreviaturas: N=nitrógeno, P=fosfato ABA=ácido abscísico C/N=equilibrio carbono/nitrógeno

Descripción detallada de genes, rasgos y utilidades que afectan a las características de la planta

[0192] Las siguientes descripciones de rasgos y utilidades asociadas con los presentes factores de transcripción 5 ofrecen una descripción más exhaustiva que la proporcionada en la Tabla 6.

Estrés abiótico, consideraciones generales

[0193] Los factores de transcripción de la planta puede modular la expresión de genes, y a su vez, ser modulados

10 por la experiencia medioambiental de la planta. Las alteraciones significativas del entorno de una planta producen de forma invariable un cambio en el patrón de expresión de los genes de los factores de transcripción de la planta. Los patrones de expresión de los factores de transcripción alterados en general dan como resultado cambios fenotípicos en la planta. El o los productos génicos de factores de transcripción en las plantas transgénicas difieren entonces en las cantidades o proporciones de las encontradas en las plantas tipo salvaje o no transformadas, y es probable que

15 estos factores de transcripción representen polipéptidos que son usados para alterar la respuesta al cambio medioambiental. A modo de ejemplo, está aceptado en la técnica que los procedimientos analíticos basados en patrones de expresión alterados se pueden usar para cribar cambios fenotípicos en una planta de forma mucho más eficaz que la lograda usando procedimientos tradicionales.

20 [0194] Captación y utilización de nutrientes: nitrógeno y fósforo: Los genes de factores de transcripción aquí descritos introducidos en plantas proporcionan un medio para mejorar la captación de nutrientes esenciales, incluyendo compuestos de nitrógeno, fosfatos, potasio y minerales en traza. El mejor rendimiento de, por ejemplo, G1988, y otras líneas sobreexpresantes bajo condiciones de nitrógeno bajo o G1988, bajo condiciones de fósforo bajo, indican que estos genes y sus homólogos se podrían utilizar para diseñar cultivos que podrían crecer bajo

25 condiciones de disponibilidad reducida de nutrientes. El fósforo, en particular, tiende a ser un nutriente limitante en tierras y en general se añade como componente en fertilizantes. Las plantas jóvenes presentan una rápida captación de fosfato y un fosfato suficiente es importante para la producción de cultivos de raíces, tales como zanahoría, patata y chirivía.

30 [0195] El efecto de estas modificaciones es incrementar la germinación del semillero y la gama de plantas ornamentales y cultivos. Las utilidades de genes de factores de transcripción descritos aquí que confieren tolerancia a las condiciones de nutrientes bajos también incluyen una reducción de costes para el cultivador mediante la reducción de fertilizante necesario, ventajas medioambientales de fertilizante reducido añadido en la cuenca; y producción y tolerancia al estrés mejoradas. Además, al proporcionar una mejor capacidad de captación de nitrógeno, estos genes se pueden utilizar para alterar las cantidades de proteínas y/o la composición de la semilla, de manera que podría afectar en la producción, así como el valor nutricional y producción de varios productos alimenticios.

[0196] Regulador del crecimiento: equilibrio de carbono y nitrógeno. Se puede utilizar un conjunto de las líneas que sobreexpresan factores de transcripción, incluyendo G1988, para producir plantas con una sensibilidad C/N alterada. Estas plantas pueden por ejemplo, fabricar menos antocianina en sacarosa elevada más glutamina, indicando que estos genes se pueden utilizar para modificar el estado del carbono y el nitrógeno, y, de este modo, asimilar la separación (asimilar la separación se refiere a la manera en que un elemento esencial, tal como nitrógeno, se distribuye enter los diferentes grupos en una planta, en general en una forma reducida, para el objetivo de transportarse a varios tejidos).

[0197] Tiempo de floración: floración temprana y tardía. Los genes de factores de transcripción aquí descritos que aceleran la floración, podrían tener aplicaciones valosas en dichos programas, ya que permiten tiempos de generación mucho más rápidos. En un conjunto de especies, por ejemplo, brócoli, coliflor, donde las partes reproductoras de las plantas constituyen el cultivo y se descartan los tejidos vegetativos, sería ventajoso acelerar el tiempo hasta la floración. La aceleración de la floración podría acortar los programas de desarrollo de cultivo y árboles. Adicionalmente, en algunos casos, un tiempo de generación más rápido permitiría cosechas adicionales de un cultivo a realizar en una temporada de crecimiento determinada. Un conjunto de genes de Arabidopsis ya han mostrado que acceleran la floración cuando se expresan de forma constitutiva. Estos incluyen LEAFY, APETALA1 y CONSTANS (Mandel et al. (1995) Nature 377: 522-524; Weigel and Nilsson (1995) Nature 377: 495-500; Simon et al. (1996) Nature 384: 59-62).

[0198] Mediante la regulación de la expresión de la potencial floración utilizando promotores inducibles, la floración se podría desencadenar mediante la aplicación de un producto químico inductor. Esto permitiría que la floración se sincronizara a lo largo del cultivo y facilitara una cosecha más eficaz. Actualmente, están disponibles especies, tales como soja y algodón, como una serie de grupos de madurez que son adecuados para diferentes latitudes en base a su tiempo de floración (que está governado por la longitud del día). Un sistema en que la floración podría controlarse químicamente permitiría que un grupo de madurez del norte con alta producción creciera en cualquier latitud. En regiones del sur, dichas plantas podrían crecer durante periodos más largos antes de inducir la floración, incrementando así las producciones. En áreas más norteñas, la inducción se utilizaría para asegurar que el cultivo florece antes de las primeras heladas de invierno.

[0199] Los factores de transcripción descritos aquí que alargan el tiempo de floración son útiles en el diseño de plantas con flores más dueraderas para la industria hortícola y para alargar el tiempo en que la planta es fértil.

[0200] Desarrollo y morfología: cotiledón, hipocótilo. Los fenotipos morfológicos mostrados por plantas que sobreexpresan varios de los genes de factores de transcripción de la tabla 6 indican que estos genes, incluyendo aquellos que producen hipocótilos alterados (G1988), se pueden utilizar para manipular respuestas a la luz, tales como evitando la sombra. Dado que estos genes también alteran la arquitectura de la platan, pueden ser útiles en la industrial de horticultura ornamental.

[0201] Respuesta a la luz/evitar sombras: cotiledón alterado, hipocótilo, desarrollo del peciolo, orientación de la hoja alterada, fotomorfogénesis constitutiva, fotomorfogénesis en luz baja. Los genes de factores de transcripción aquí descritos, incluyendo G1988, y sus equiválogos que pueden modificar la respuesta de una planta a la luz pueden ser útiles para modificar el crecimiento o desarrollo de la planta, por ejemplo, fotomorfogénesis en luz escasa, o aceleración del tiempo de floración en respuesta a varias intensidades de luz, calidad o duración a la que una planta no transformada no respondería de forma similar. Ejemplos de dichas respuestas que se han demostrado incluyen el número y la disposición de las hojas, y aparición temprana de capullos de flor. La eliminación de las respuestas a la sombra puede conducir a una mayor densidad de plantación con el consecuente aumento de la producción. Dado que estos genes pueden alterar también la arquitectura de la planta, pueden ser útiles en la industria de la horticultura ornamental.

Sentido contrario y supresión simultánea

[0202] Además de la expresión de los ácidos nucleicos de la invención como sustitución de genes o ácidos nucleicos modificadores del fenotipo de la planta, los ácidos nucleicos también son útiles para la supresión de la expresión en sentido directo y sentido contrario, por ejemplo, para reducir la expresión de un ácido nucleico de la memoria, por ejemplo, como un mecanismo adicional para modular el fenotipo de la planta. Es decir, los ácidos nucleicos de la invención, o subsecuencias o secuencias de sentido contrario de las mismas, se pueden usar para bloquear la expresión de ácidos nucleicos homólogos naturales. Se conocen en la técnica una variedad de tecnologías de sentido directo o sentido contrario, por ejemplo, como se expone en Lichtenstein y Nellen (1997) “Antisense Technology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Reino Unido. La regulación de sentido contrario también se describe en Crowley y col. (1985) Cell 43: 633-641; Rosenberg y col. (1985) Nature 313: 703-706; Preiss y col. (1985) Nature 313: 27-32; Melton (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:144-148; Izant y Weintraub (1985) Science 229: 345-352; y Kim y Wold (1985) Cell 42:129-138. Se conocen procedimientos adicionales de regulación de sentido contrario en la técnica. La regulación de sentido contrario se ha usado para reducir o inhibir la expresión de genes de plantas, por ejemplo, en la publicación de patente europea nº 271988. El ARN de sentido contrario se puede usar para reducir la expresión de genes para producir un cambio fenotípico visible o bioquímico en la planta (Smith y col. (1988) Nature, 334: 724-726; Smith y col. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 369-379). En general, las secuencias de sentido directo o sentido contrario se introducen en la célula donde son opcionalmente amplificadas, por ejemplo, por transcripción. Dichas secuencias incluyen tanto secuencias de oligonucleótidos sencillas como secuencias catalíticas tales como ribozimas.

[0203] Por ejemplo, una reducción o eliminación de la expresión (es decir, una “inactivación”) de un factor de transcripción o polipéptido homólogo del factor de transcripción en una planta transgénica, por ejemplo, para modificar un rasgo de la planta, se puede obtener introduciendo una construcción de sentido contrario correspondiente al polipéptidos de interés como un ADNc. Para la supresión de sentido contrario, el ADNc del factor de transcripción u homólogo se dispone en orientación contraria (con respecto a la secuencia codificante) con respecto a la secuencia del promotor en el vector de expresión. No es necesario que la secuencia introducida sea el ADNc o gen de longitud completa, y no es necesario que sea idéntica al ADNc o gen que se encuentra en el tipo de planta que se va a transformar. Típicamente, solo es necesario que la secuencia de sentido contrario sea capaz de hibridar con el gen o ARN diana de interés. Por lo tanto, cuando la secuencia introducida es de menor longitud, será necesario un mayor grado de homología con la secuencia del factor de transcripción endógeno para la supresión de sentido contrario eficaz. Aunque se pueden usar secuencias de sentido contrario de diferentes longitudes, preferiblemente, la secuencia de sentido contrario introducida en el vector será de por lo menos 30 nucleótidos de longitud, y típicamente se observará una mejor supresión de sentido contrario al aumentar la longitud de la secuencia de sentido contrario. Preferiblemente, la longitud de la secuencia de sentido contrario en el vector tendrá más de 100 nucleótidos. La transcripción de una construcción de sentido contrario como se describe, da como resultado la producción de moléculas de ARN que son el complemento inverso de las moléculas de ARNm transcritas a partir del gen del factor de transcripción endógeno en la célula de la planta.

[0204] La supresión de la expresión del gen del factor de transcripción endógeno también se puede lograr usando la interferencia de ARN, o ARNi. La ARNi es una técnica de silenciamiento de genes dirigida, postranscripcional, que usa ARN bicatenario (ARNdc) para incitar la degradación del ARN mensajero (ARNm) que contiene la misma secuencia que el ARNdc (Constans, (2002) The Scientist 16:36). Los ARN interferentes pequeños, o ARNip, se producen en por lo menos 2 etapas: una ribonucleasa endógena escinde el ARNdc más largo en ARN más cortos de 21-23 nucleótidos de longitud. Los segmentos de ARNip median entonces la degradación del ARNm diana (Zamore, (2001) Nature Struct. Biol., 8:746-50). La ARNi se ha usado para la determinación de la función de genes de una forma similar a los oligonucleótideos de sentido contrario (Constans, (2002) The Scientist 16:36). Los vectores de expresión que expresan continuamente ARNip en células transfectadas transitoria y establemente se han diseñado para expresar ARN en horquilla pequeños (ARNhp), que son procesados in vivo en moléculas de tipo ARNip capaces de llevar a cabo el silenciamiento específico de genes (Brummelkamp y col., (2002) Science 296:550-553, y Paddison, y col. (2002) Genes & Dev. 16:948-958). El silenciamiento de genes postranscripcionales por el ARN bicatenario se discute con más detalle en Hammond y col. (2001) Nature Rev Gen 2: 110-119, Fire et, al. (1998) Nature 391: 806-811 y Timmons y Fire (1998) Nature 395: 854. Los vectores en las que el ARN codificado por un ADNc de factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción es expresado en exceso, también se pueden usar para obtener la supresión simultánea de un gen endógeno correspondiente, por ejemplo de la forma descrita en la patente de EE.UU. nº 5.231.020 de Jorgensen. Dicha supresión simultánea (denominada también supresión de sentido contrario), no requiere que se introduzca el ADNc del factor de transcripción entero en las células de la planta, ni requiere que la secuencia introducida sea exactamente igual al gen del factor de transcripción endógeno de interés. Sin embargo, como con la supresión de sentido contrario, la eficacia de la supresión aumentará al aumentar la especificidad de la hibridación, por ejemplo, cuando la secuencia introducida se alarga y/o se aumenta la similitud de secuencia entre la secuencia introducida y el gen del factor de transcripción endógeno.

[0205] Los vectores que expresan una forma no traducible del ARNm del factor de transcripción (por ejemplo, secuencias que comprenden uno o más codones de parada o mutaciones sin sentido) también se pueden usar para suprimir la expresión de un factor de transcripción endógeno, reduciendo o eliminando así su actividad y modificando uno o más rasgos. Se describen procedimientos para producir dichas construcciones en la patente de EE.UU. nº

5.583.021. Preferiblemente, dichas construcciones se hacen introduciendo un codón de parada prematuro en el gen del factor de transcripción. Alternativamente, se puede modificar un rasgo de la planta mediante el silenciamiento de genes usando ARN de doble cadena (Sharp (1999) Genes and Development 13: 139-141). Otro procedimiento para abolir la expresión de un gen es mediante inserción de mutagénesis usando el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens. Después de generar los mutantes de inserción, los mutantes se pueden cribar para identificar aquellos que contienen la inserción en un gen del factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción. Las plantas que contienen un solo suceso de inserción de transgén en el gen deseado se pueden cruzar para generar plantas homocigotas para la mutación. Dichos procedimientos son bien conocidos para el experto en la materia (por ejemplo, en Koncz y col. (1992) “Methods in Arabidopsis Research”. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., River Edge, NJ).

[0206] Alternativamente, el fenotipo de una planta se puede alterar eliminando una gen endógeno, tal como un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción, por ejemplo, mediante recombinación homóloga (Kempin y col. (1997) Nature 389: 802-803).

[0207] Un rasgo de una planta también se puede modificar usando el sistema Cre-lox (por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.658.772). Se puede modificar el genoma de una planta para incluir un primer y un segundo sitio lox que después se ponen en contacto con una Cre recombinasa. Si los sitios lox están en la misma orientación, entonces la secuencia de ADN intermedia entre los dos sitios se escinde. Si los sitios lox están en orientación opuesta, la secuencia intermedia se invierte.

[0208] Los polinucleótidos y polipéptidos de esta memoria también se pueden expresar en una planta en ausencia de un casete de expresión, manipulando la actividad o nivel de expresión del gen endógeno por otros medios, tales como por ejemplo, mediante la expresión ectópica de un gen mediante marcaje de activación de ADN-T (Ichikawa y col. (1997) Nature 390 698-701; Kakimoto y col. (1996) Science 274: 982-985). Este procedimiento conlleva transformar una planta con un marcador de gen que contiene múltiples potenciadores transcripcionales y una vez que se ha insertado el marcador en el genoma, queda desregulada la expresión de un gen flanqueador que codifica la secuencia. En otro ejemplo, la maquinaria transcripcional de una planta se puede modificar para que aumente los niveles de transcripción de un polinucleótido de la invención. (Véase, por ejemplo, las publicaciones PCT WO 96/06166 y WO98/53057, que describen la modificación de la especificidad de unión al ADN de proteínas de dedos de cinc cambiando aminoácidos particulares en el patrón de unión al ADN).

[0209] La planta transgénica también puede incluir la maquinaria necesaria para expresar o alterar la actividad de un polipéptido codificado por un gen endógeno, por ejemplo, alterando el estado de fosforilación del polipéptido para mantenerlo en un estado activado.

[0210] Las plantas transgénicas (o células de plantas o explantes de plantas o tejidos de plantas) que incorporan los polinucleótidos de la memoria y/o expresan los polipéptidos de la memoria se pueden producir por una variedad de técnicas bien establecidas como se ha descrito antes. Después de la construcción de un vector, lo más típico un casete de expresión, que incluye un polinucleótido que codifica, por ejemplo, un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción, se pueden usar técnicas estándar para introducir el polinucleótido en una planta, una célula de planta, un explante de planta o un tejido de planta de interés. Opcionalmente, la célula, explante o tejido de planta se pueden regenerar para producir una planta transgénica.

[0211] La planta puede ser cualquier planta superior, incluyendo plantas gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Están disponibles protocolos adecuados para Leguminosae (alfalfa, soja, trébol, etc.), Umbeliferae (zanahoria, apio, chirivía), Cruciferae (col, rábano, colza, brócoli, etc.), Cucurbitaceae (melón y pepino), Gramineae (trigo, maíz, arroz, cebada, mijo, etc.), Solaneceae (patata, tomate, tabaco, pimientos, etc.), y otros cultivos diferentes. Véanse los protocolos descritos en Ammirato y col., eds., (1984) “Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species”, Macmillan Publ. Co., Nueva York, NY; Shimamoto y col. (1989) Nature 338: 274-276; Fromm y col. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; y Vasil y col. (1990) Bio/Technol. 8: 429-434.

[0212] La transformación y regeneración de células de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas ahora es rutinario, y la selección de la técnica de transformación más adecuada la determinará el experto. La elección del procedimiento variará con el tipo de planta que se va a transformar; los expertos en la materia reconocerán la idoneidad de procedimientos particulares para tipos de plantas dados. Los procedimientos adecuados pueden incluir, pero sin limitar: electroporación de protoplastos de plantas; transformación mediada por liposomas; transformación mediada por polietilenglicol (PEG); transformación usando virus; microinyección de células de plantas; bombardeo con microproyectiles de células de plantas; infiltración al vacío; y transformaciones mediada por Agrobacterium tumefaciens. La transformación significa introducir una secuencia de nucleótidos en una planta de una forma para producir la expresión estable o transitoria de la secuencia.

[0213] Los ejemplos satisfactorios de modificación de características de las plantas mediante transformación con secuencias clonadas que sirven para ilustrar el conocimiento actual en este campo de tecnología, y que se incorporan en el presente documento por referencia, incluyen: patente de EE.UU. nº 5.571.706; 5.677.175; 5.510.471; 5.750.386; 5.597.945; 5.589.615; 5.750.871; 5.268.526; 5.780.708; 5.538.880; 5.773.269; 5.736.369 y

5.610.042.

[0214] Después de la transformación, las plantas se seleccionan preferiblemente usando un marcador seleccionable dominante incorporado en el vector de transformación. Típicamente, dicho marcador conferirá resistencia a un antibiótico o herbicida a las plantas transformadoras, y la selección de los transformantes se puede llevar a cabo exponiendo las plantas a concentraciones adecuadas del antibiótico o herbicida.

[0215] Después de seleccionar las plantas transformadas y cultivarlas hasta la madurez, se identifican aquellas plantas que presentan un rasgo modificado. El raso modificado puede ser cualquiera de los rasgos descritos antes. Además, para confirmar que el rasgo modificado se debe a los cambios en los niveles de expresión o actividad del polipéptido o polinucleótido, se puede determinar analizando la expresión del ARNm usando transferencias Northern, RT-PCR o micromatrices, o la expresión de proteínas usando inmunotransferencias o transferencias Western o ensayos de desplazamiento en gel.

Sistemas integrados - identidad de secuencias

[0216] Además, se describe aquí un sistema integrado, ordenador o medio de lectura por ordenador que comprende un conjunto de instrucciones para determinar la identidad de una o más secuencias en una base de datos. Además, el conjunto de instrucciones se puede usar para generar o identificar secuencias que cumplen cualquiera de los criterios especificados. Además, el conjunto de instrucciones se puede usar para asociar o conectar determinados beneficios opcionales, tales como características mejoradas, con una o más secuencias identificadas.

[0217] Por ejemplo, el conjunto de instrucciones puede incluir, por ejemplo, una comparación de secuencias u otro programa de alineamiento, por ejemplo, un programa disponible tal como, por ejemplo, Wisconsin Package Versión 10.0, tales como BLAST, FASTA, PILEUP, FINDPATTERNS o similares (GCG, Madison, WI). Se pueden buscar bases de datos de secuencias públicas tales como GenBank, EMBL, Swiss-Prot y PIR o bases de datos de secuencias privadas tales como la base de datos de secuencias PHYTOSEQ (Incyte Genomics, Palo Alto, CA).

[0218] El alineamiento de secuencias para la comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. AppL Math. 2: 482-489, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, mediante la búsqueda por el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos. Después del alineamiento, típicamente se llevan a cabo las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos comparando las secuencias de las dos secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. La ventana de comparación puede ser un segmento de por lo menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 posiciones contiguas. Se proporciona una descripción del procedimiento en Ausubel y col., supra.

[0219] Se puede usar una variedad de procedimientos para determinar las relaciones de las secuencias, incluyendo el alineamiento manual y el alineamiento y análisis de secuencias asistido por ordenador. Esta última estrategia es una estrategia preferida debido al mayor rendimiento que se logra mediante los procedimientos asistidos por ordenador. Como se ha indicado antes, están disponibles una variedad de programas de ordenador para llevar a cabo el alineamiento de secuencias, o los puede producir el experto.

[0220] Un algoritmo de ejemplo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. El software para llevar a cabo los análisis con BLAST está disponible al público, por ejemplo, a través del National Library of Medicine’s National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih; página web (www) del National Institutes of Health US government (gov)). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias con una puntuación alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que se corresponden

o satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul y col., supra). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largas que los contienen: los aciertos de palabras se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta tan lejos como se pueda aumentar la puntuación acumulativa de alineamiento. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de residuos de emparejamiento; siempre >0) y N (puntuación de penalización para los residuos de emparejamiento erróneo; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulativa del alineamiento disminuye en la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de residuos de puntuación negativa; o se llega al extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un punto de corte de 100, M=S, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 10915-10919). Salvo que se indique lo contrario, la “identidad de secuencia” en el presente documento se refiere al % de identidad de secuencia generado a partir de tblasx usando la versión de NCBI del algoritmo con los parámetros por defecto usando alineamientos incompletos con el filtro apagado (por ejemplo, en la página web de NIH NLM NCBI ncbi.nlm.nih, supra).

[0221] Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (por ejemplo, en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que ocurriría por azar un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia (y, por lo tanto, en este contexto, homóloga) si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo respecto al ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, o menor de aproximadamente 0,01, o incluso menor de aproximadamente 0,001. Un ejemplo adicional de un algoritmo de alineamiento de secuencias útiles PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares, progresivos. El programa puede lineal, por ejemplo, hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5.000 letras.

[0222] El sistema integrado, u ordenador, típicamente incluye un interfaz de entrada de usuario que permite al usuario ver selectivamente uno o más registros de secuencias correspondientes a una o más cadenas de caracteres, así como un conjunto de instrucciones que alinea la una o más cadenas de caracteres entre sí o con una cadena de caracteres adicional para identificar una o más regiones de similitud de secuencia. El sistema puede incluir una conexión de una o más cadenas de caracteres con un fenotipo particular o función génica. Típicamente, el sistema incluye un elemento de salida de lectura por el usuario que presenta un alineamiento producido por el conjunto de instrucciones de alineamiento.

[0223] Los procedimientos anteriores se pueden implementar en un entorno de computación localizado o distribuido. En un entorno distribuido, los procedimientos se pueden implementar en un solo ordenador que comprende múltiples procesadores o en una multiplicidad de ordenadores. Los ordenadores pueden estar conectados, por ejemplo, a través de un bus común, más preferiblemente el o los ordenadores son nodos en una red. La red ha de ser una red generalizada o local y dedicada o de área amplia, y en determinadas realizaciones preferidas, los ordenadores pueden ser componentes de una intranet o un internet.

[0224] Por lo tanto, la memoria proporciona procedimientos para identificar una secuencia similar u homóloga a uno

o más polinucleótidos como se indica en el presente documento, o uno o más polipéptidos diana codificados por los polinucleótidos, o indicados de otra forma en el presente documento, y pueden incluir la conexión o asociación de un fenotipo o función génica de una planta dada con una secuencia. En los procedimientos, se proporciona una base de datos de secuencias (localmente o a través de una intranet o internet) y se hace una consulta a la base de datos de secuencias usando las secuencias relevantes del presente documento y fenotipos o funciones génicas asociados de la planta.

[0225] Se puede introducir cualquier secuencia del presente documento en la base de datos, antes o después de la consulta en la base de datos. Esto proporciona tanto la expansión de la base de datos como, si se hace antes de la etapa de consulta, la inserción de secuencias de control en la base de datos. Las secuencias de control se pueden detectar mediante la consulta para asegurar la integridad general tanto de la base de datos como de la consulta. Como se ha indicado, la consulta se puede llevar a cabo usando un interfaz basado en un navegador de internet. Por ejemplo, la base de datos puede ser una base de datos pública centralizada tal como las indicadas en el presente documento, y la consulta se puede hacer desde un terminal u ordenador remotos a través de internet o intranet.

[0226] Cualquier secuencia del presente documento se puede usar para identificar una secuencia similar, homóloga, paráloga u ortóloga en otra planta. Esto proporciona medios para identificar secuencias endógenas en otras plantas que pueden ser útiles para alterar un rasgo de las plantas descendientes, que resulta del cruce de dos plantas de cepas diferentes. Por ejemplo, se pueden identificar secuencias que codifican un ortólogo de cualquiera de las secuencias del presente documento que están de forma natural en una planta con un rasgo deseado, usando las secuencias descritas en el presente documento. Después, la planta se cruza con una segunda planta de la misma especie pero que no tiene el rasgo deseado, para producir descendencia que después se puede usar en experimentos de cruce posteriores para producir el rasgo deseado en la segunda planta. Por lo tanto, la planta descendiente resultante no contiene transgenes; la expresión de la secuencia endógena también se puede regular por el tratamiento con un producto químico particular u otros medios, tales como EMR. Algunos ejemplos de dichos compuestos bien conocidos en la técnica incluyen: etileno; citoquinas; compuestos fenólicos; los cuales estimulan la transcripción de los genes necesarios para la infección; monosacáridos específicos y entornos ácidos que potencian la inducción de genes; polisacáridos ácidos que inducen uno o más genes cromosómicos; y opines; otros mecanismos incluyen tratamiento de luz u oscuridad (para una revisión de ejemplos de dichos tratamientos, véase Winans (1992) Microbiol. Rev. 56: 12-31; Eyal y col. (1992) Plant. Mol. Biol. 19: 589-599; Chrispeels y col. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 279-290; Piazza y col. (2002) Plant Physiol. 128:1077-1086).

[0227] La tabla 7 indica secuencias descubiertas por ser ortólogas a un conjunto de factores de transcripción representativos de la presente memoria. Los encabezados de columna incluyen los factores de transcripción indicados por (a) la SEQ ID NO: de la secuencia de Arabidopsis que se utilizó para descubrir la secuencia ortóloga no de Arabidopsis; (b) el identificador de secuencia GID de la secuencia de Arabidopsis; (c) el identificador de Secuencia o Número de Acceso de GenBank de la secuencia ortóloga;(d) la especie de la que deriva la secuencia ortóloga; (e) la SEQ ID NO: de la secuencia ortóloga no de Arabidopsis y (e) la comparación por parejas de la probabilidad de suma más pequeña de cada secuencia ortóloga con la secuencia similar de Arabidopsis determinada por análisis BLAST.

Tabla 7. Ortólogos de genes de factores de transcripción de Arabidopsis

SEQ ID No: de la secuencia de Arabidopsis utilizada para descubrir la ortóloga

GID No. Especie de la que deriva la ortóloga Identificador de secuencia o número de acceso SEQ ID NO: de la secuencia ortóloga Probabilidad de suma más pequeña al ortólogo, cuando se conoce

327

G1988 Glycine max GLYMA-28NOV01-CLUSTER75453_1 1098

327

G1988 Glycine max GLYMA-28NOV01-CLUSTER75453 2 1099

327

G1988 Oryza sativa ORYSA-22JAN02-CLUSTER153439 2 1100

327

G1988 Zea mays ZEAMA-08NOV01-CLUSTER10890_1 1101

327

G1988 Zea mays ZEAMA-08NOV01-CLUSTER10890_3 1102

327

G1988 Zea mays ZEAMA-08NOV01-CLUSTER201962_1 1103

327

G1988 Zea mays ZEAMA-08NOV01-CLUSTER3040 3 1104

327

G1988 Oryza sativa Os_S91481 1601

327

G1988 Lycopersicon esculentum SGN-UNIGENE SINGLET-5090 2045

328

G1988 Brassica oleracea BH478747 5,00E-23

328

G1988 Populus balsamifera subsp. trichocarpa BU873581 7,00E-22

328

G1988 Citrus unshiu C95300 2,00E-18

328

G1988 Lycopersicon esculentum AW034552 2,00E-18

328

G1988 Oryza sativa (grupo de cultivo indica) AAAA01000340 1,00E-17

328

G1988 Beta vulgaris BQ594583 1,00E-16

328

G1988 Zea mays CC655765 2,00E-15

328

G1988 Glycine max BI469275 8,00E-15

328

G1988 Prunus persica BU046688 7,00E-14

328

G1988 Vitis vinifera CD719941 2,00E-13

328

G1988 Malus x domestica gi4091806 2,60E-07

328

G1988 Brassica napus gi30984027 1,10E-06

328

G1988 Brassica nigra gi22854920 1,10E-06

328

G1988 Raphanus sativus gi3341723 2,70E-06

328

G1988 Oryza sativa (grupo de cultivo japónica) gi32488104 4,80E-06

328

G1988 Ipomoea nil gi10946337 5,10E-06

328

G1988 Oryza sativa gi11094211 2,20E-05

328

G1988 Hordeum vulgare gi21667475 4,50E-05

328

G1988 Hordeum vulgare subsp. vulgare gi21655168 0,00018

328

G1988 Pinus radiata Gi4557093 0,0016

[0228] La tabla 9 enumera el número de identificación de genes (GID) y relaciones para secuencias homólogas (halladas utilizando el análisis según el Ejemplo IX) y secuencias variantes para las secuencias del Listado de secuencias.

Tabla 9. Relaciones de similitud halladas en el listado de secuencias

SEQ ID No.

GID ADN o Proteína (PRT) Especie de la que deriva la secuencia Relación

1098

ADN Glycine max Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

1099

ADN Glycine max Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

1100

ADN Oryza sativa Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

1101

ADN Zea mays Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

1102

ADN Zea mays Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

1103

ADN Zea mays Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

1104

ADN Zea mays Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

1601

ADN Oryza sativa Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

2045

ADN Lycopersicon esculentum Secuencia de polipéptido prevista es ortóloga a G1988

EJEMPLOS

10 [0229] La invención, descrita ahora de forma general, se entenderá mejor por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con el propósito de ilustrar determinados aspectos y realizaciones de la presente invención y no se pretende que limiten la invención. El experto en la materia reconocerá que un factor de transcripción que está asociado con un primer rasgo particular también puede estar asociado con por lo menos otro segundo rasgo no relacionado e inherente que no se había predicho por el primer rasgo.

15 [0230] Las descripciones completas de los rasgos asociados con cada polinucleótido de la invención se describen con detalle en la tabla 4 y la tabla 6. La descripción completa de la familia de genes de factores de transcripción y dominios conservados identificados de los polipéptidos codificados por el polinucleótido se describe en detalle en la tabla 5.

Ejemplo I: Identificación y clonación de genes de longitud completa

[0231] Se identificaron secuencias de factores de transcripción presuntos (genómicas o EST) relacionadas con factores de transcripción conocidos en la base de datos de GenBank de Arabidopsis thaliana usando el programa de

25 análisis de secuencias tblastn usando los parámetros por defecto y un umbral del valor de punto de corte P de -4 o -5 o inferior, dependiendo de la longitud de la secuencia de consulta. Después se cribaron los aciertos de la secuencia del factor de transcripción presunto para identificar aquellos que contienen cadenas de secuencia particulares. Si los aciertos de secuencia contenían dichas cadenas de secuencias, las secuencias se confirmaban como factores de transcripción.

30 [0232] Alternativamente, se cribaron bibliotecas de ADNc de Arabidopsis thaliana obtenidas de diferentes tejidos o tratamientos, o bibliotecas genómicas, para identificar nuevos miembros de una familia de transcripción usando un procedimiento de hibridación en condiciones rigurosas bajas. Se sintetizaron sondas usando cebadores específicos de genes en una reacción de PCR estándar (temperatura de reasociación 60ºC) y se marcaron con 32P dCTP

35 usando el kit de marcaje High Prime DNA Labeling (Boehringer Mannheim Corp. (ahora Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN)). Las sondas radiomarcadas purificadas se añadieron a filtros sumergidos en medio de hibridación Church (NaPO4 0,5 M pH 7,0, SDS al 7%, albúmina de suero bovino al 1% en p/v) y se hibridaron durante la noche a 60ºC con agitación. Los filtros se lavaron dos veces durante 45 a 60 minutos con 1 x SCC, SDS al 1% a 60ºC.

[0233] Para identificar secuencias adicionales 5’ o 3’ de una secuencia de ADNc parcial en una biblioteca de ADNc, se llevó a cabo la amplificación rápida 5’ y 3’ de los extremos del ADNc (RACE) usando el kit de amplificación de ADNc MARATHON (Clontech, Palo Alto, CA). En general, el procedimiento implica aislar primero el poli(A)-ARNm, llevando a cabo la síntesis de la primera y segunda cadena de ADNc para generar ADNc de doble cadena, hacer los extremos romos del ADNc, seguido de la unión del adaptador MARATHON al ADNc para formar una biblioteca de ADNc de doble cadena ligado al adaptador.

[0234] Se diseñaron cebadores específicos de gen para usar junto con cebadores específicos del adaptador para la reacciones RACE tanto 5’ como 3’. Se usaron cebadores anidados en lugar de cebadores sencillos, para aumentar la especificidad de la PCR. Usando las reacciones RACE de 5’ y 3’, se obtuvieron fragmentos de RACE 5’ y 3’, se secuenciaron y se clonaron. El procedimiento se puede repetir hasta identificar los extremos 5’ y 3’ del gen de longitud completa. Después se generó el ADNc de longitud completa por PCR usando cebadores específicos para los extremos 5’ y 3’ del gen mediante PCR de extremo a extremo.

Ejemplo II: Construcción de vectores de expresión

[0235] La secuencia se amplificó a partir de una biblioteca genómica o de ADNc usando cebadores específicos para las secuencias en dirección 5’ y dirección 3’ de la región codificante. El vector de expresión era pMEN20 o pMEN65, que derivan ambos de pMON316 (Sanders y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:1543-1558) y contienen el promotor 35S de CaMV. Para clonar la secuencia en el vector, se digirieron tanto pMEN20 como el fragmento de ADN amplificado por separado con las enzimas de restricción SalI y NotI a 37ºC durante 2 horas. Los productos de digestión se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN que contenían la secuencia y el plásmido linealizado se escindieron y se purificaron usando un kit de extracción en gel de QIAQUICK (Qiagen, Valencia CA). Los fragmentos de interés se ligaron en una relación de 3:1 (vector a inserto). Las reacciones de ligación usando la ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Beverly MA) se llevaron a cabo a 16ºC durante 16 h. Los ADN ligados se transformaron en células competentes de la cepa de E. coli DH5a usando el procedimiento de choque térmico. Las transformaciones se cultivaron en placas LB que contenían kanamicina 50 mg/l (Sigma Chemical Co. St. Louis MO). Las colonias individuales se cultivaron durante la noche en 5 ml de caldo LB que contenía kanamicina 50 mg/l a 37ºC. El ADN plasmídico se purificó usando los kits Qiaquick Mini Prep kits (Qiagen).

Ejemplo III: Transformación de Agrobacterium con el vector de expresión

[0236] Después de construir el vector plasmídico que contenía el gen, el vector se usó para transformar células de Agrobacterium tumefaciens que expresaban los productos génicos. La cepa de células de Agrobacterium tumefaciens para la transformación se hizo como describen Nagel y col. (1990) FEMS Microbiol Letts. 67: 325-328. Se cultivó la cepa ABI de Agrobacterium en 250 ml de medio LB (Sigma) durante la noche a 28ºC con agitación hasta que se alcanzó una absorbancia a lo largo de 1 cm a 600 nm (A600) de 0,5 -1,0. Las células se recogieron por centrifugación a 4.000 x g durante 15 min a 4ºC. Después las células se volvieron a suspender en 250 ml de tampón enfriado (HEPES 1 mM, pH ajustado a 7,0 con KOH). Las células se centrifugaron otra vez como se ha descrito antes y se volvieron a suspender en 125 !l de tampón enfriado. Después, las células se centrifugación y se volvieron a suspender dos veces más en el mismo tampón HEPES como se ha descrito antes con un volumen de 100 !l y 750 !l, respectivamente. Después, las células resuspendidas se distribuyeron en partes alícuotas de 40 !l, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC.

[0237] Las células de Agrobacterium se transformaron con plásmidos preparados como se ha descrito antes siguiendo el protocolo descrito por Nagel y col., supra. Para cada construcción de ADN que se iba a transformar, se mezclaron 50-100 ng de ADN (en general resuspendido en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) con 40 !l de células de Agrobacterium. La mezcla de ADN/células después se transfirió a una cubeta enfriada con un hueco de electrodo de 2 mm y se sometió a una carga de 2,5 kV disipada a 25 !F y 200 !F usando un aparato Gene Pulser II (Bio-Rad, Hercules, CA). Después de electroporación, las células se volvieron a suspender inmediatamente en 1,0 ml de LB y se dejaron recuperar sin selección con antibiótico durante 2-4 h a 28ºC en un incubador con agitación. Después de recuperación, las células se cultivaron en medio de caldo LB que contenía estreptomicina 100 !g/ml (Sigma) y se incubaron durante 24-48 horas a 28ºC. Después se recogieron colonias individuales y se inocularon en medio reciente. La presencia de la construcción del plásmido se verificó por amplificación por PCR y análisis de secuencia.

Ejemplo IV: Transformación de plantas de Arabidopsis con Agrobacterium tumefaciens con vector de expresión

[0238] Después de la transformación de Agrobacterium tumefaciens con vectores plasmídicos que contenían el gen, se identificaron colonias individuales de Agrobacterium, se propagaron y se usaron para transformar plantas de Arabidopsis. Brevemente, se inocularon cultivos de 500 ml de medio LB que contenía kanamicina 50 mg/ml con las colonias y se cultivaron a 28ºC con agitación durante 2 días hasta alcanzar una absorbancia óptica a 600 nm de longitud de onda a lo largo de 1 cm (A600) de >2,0. Después, se recogieron las células por centrifugación a 4.000 x g durante 10 min y se volvieron a suspender en medio de infiltración (1/2 X sales de Murashige y Skoog (Sigma), 1 X vitaminas B-5 de Gamborg (Sigma), sacarosa al 5,0% (p/v) (Sigma), bencilamino-purina 0,044 !M (Sigma), Silwet L77 200 !l/l (Lehle Seeds)) hasta alcanzar una A600 de 0,8.

[0239] Antes de la transformación, las semillas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) se sembraron con una densidad de �10 plantas por maceta de 5 cm en medio de siembra en maceta Pro-Mix BX (Hummert International) cubiertas con malla de fibra de vidrio (18 mm X 16 mm). Las plantas se cultivaron con iluminación continua (50-75 !E/m2/s) a 22-23ºC con una humedad relativa de 65-70%. Después de aproximadamente 4 semanas, se cortan los tallos de inflorescencias primarias (espigas) para potenciar el crecimiento de múltiples espigas secundarias. Después de florecer las espigas secundarias maduras, las plantas se prepararon para la transformación retirando todas las silicuas y flores abiertas.

[0240] Después, las macetas se sumergieron boca abajo en la mezcla de medio de infiltración de Agrobacterium como se ha descrito antes durante 30 s, y se pusieron de lado para permitir el drenaje en una superficie plana de 2,54 x 5 cm cubiertas con una envoltura plástica. Después de 24 h, se retiró la envoltura plástica y las macetas se pusieron derechas. El procedimiento de inmersión se repitió una semana después, durante un total de 2 inmersiones por maceta. Después se recogieron las semillas de cada maceta de transformación y se analizaron siguiente el siguiente protocolo descrito.

Ejemplo V: Identificación de transformantes primarios de Arabidopsis

[0241] Las semillas recogidas de las macetas de transformación se esterilizaron esencialmente como sigue. Las semillas se dispersaron en una disolución que contenía Triton X-100 (Sigma) al 0,1% (v/v) y agua estéril y se lavaron agitando la suspensión durante 20 min. La disolución de lavado después se drenó y se sustituyó por una disolución de lavado reciente para lavar las semillas durante 20 min con agitación. Después de eliminar la disolución de etanol/detergente, se añadió a las semillas una suspensión que contenía Triton X-100 al 0,1 % (v/v) y lejía al 30% (v/v) (CLOROX; Clorox Corp. Oakland CA), y la suspensión se agitó durante 10 min. Después de separar la disolución de lejía/detergente, las semillas se lavaron 5 veces en agua destilada estéril. Las semillas se almacenaron en el último agua de lavado a 4ºC durante 2 días en la oscuridad antes de cultivarlas en placa en medio de selección con antibiótico (1 X sales de Murashige y Skoog (pH ajustado a 5,7 con KOH 1 M), 1 X vitaminas B-5 de Gamborg, Phytagar al 0,9% (Life Technologies) y kanamicina 50 mg/l). Las semillas se germinaron con iluminación continua (50-75 !E/m2/s) a 22-23ºC. Después de 7-10 días de crecimiento en estas condiciones, se obtuvieron los transformantes primarios resistentes a la kanamicina (generación T1) que eran visibles. Estas plántulas se transfirieron primero a placas de selección recientes, en las que las plántulas continuaron creciendo durante 3-5 días más, y después al suelo (medio de siembra en macetas Pro-Mix BX).

[0242] Los transformantes primarios se cruzaron con semillas de la descendencia (T2) recogidas; se seleccionaron las plántulas resistentes a la kanamicina y se analizaron. Los niveles de expresión de los polinucleótidos recombinantes en los transformantes varía de aproximadamente un aumento del nivel de expresión de 5% hasta por lo menos un aumento del nivel de expresión de 100%. Se hicieron observaciones similares con respecto al nivel de expresión del polipéptido.

Ejemplo VI: Identificación de plantas de Arabidopsis con inactivaciones (knockouts) de genes de factores de transcripción

[0243] El cribado de las colecciones de Arabidopsis mutegenizadas por inserción para mutantes nulos en un gen diana conocido, se hizo esencialmente como describen Krysan y col. (1999) Plant Cell 11: 2283-2290. Brevemente, se diseñaron cebadores específicos de gen, anidados por 5-250 pares de bases entre sí, a partir de las regiones 5’ y 3’ de un gen diana conocido. Igualmente, también se crearon grupos de cebadores anidados específicos para cada uno de los ADN-T o extremos de transposones (los bordes “derecho” e “izquierdo”). Se usaron todas las posibles combinaciones de cebadores específicos de gen y ADN-T/transposón para detectar por PCR un suceso de inserción dentro o cerca del gen diana. Después, los fragmentos de ADN amplificados se secuenciaron, lo que permite la determinación precisa del punto de inserción del ADN-T/transposón con respecto al gen diana. Los sucesos de inserción dentro de la secuencia codificante o intermedia de los genes se desconvolucionaron de un grupo que comprendía una pluralidad de sucesos de inserción en una sola planta mutante única para la caracterización funcional. El procedimiento se describe con más detalle en Yu y Adam, solicitud de EE.UU. nº de serie 09/177.733 presentada el 23 de octubre, 1998.

Ejemplo VII: Identificación de fenotipos modificados en plantas con sobreexpresión o knockout de genes.

[0244] Los experimentos se realizaron para identificar aquellos transformantes o knockouts que mostraron características bioquímicas modificadas. Entre las sustancias bioquímicas que se analizaron estaban los azúcares insolubles, tales como arabinosa, fucosa, galactosa, manosa, ramnosa o xilosa o similares; prenil lípidos, tales como luteína, beta-caroteno, xantofilo-1, xantofilo-2, clorofilas A o B, o alfa-, delta- o gamma-tocoferol o similares; ácidos grasos, tales como 16:0 (ácido palmítico), 16:1 (ácido palmitoleico), 18:0 (ácido esteárico), 18:1 (ácido oleico), 18:2 (ácido linoleico), 20:0 , 18:3 (ácido linolénico), 20:1 (ácido eicosenoico), 20:2, 22:1 (ácido erúcico) o similar; ceras, tales como mediante la alteración de los niveles de alcanos C29, C31, o C33; esteroles, tales como brassicasterol, campesterol, estigmasterol, sitosterol o estigmastanol o similares, niveles de glucosinolatos, proteína o aceite.

[0245] Los ácidos grasos se midieron utilizando dos procesos dependiendo de si el tejido era de hojas o semillas. Para las hojas, se extrajeron lípidos y se esterificaron con H2SO4 metanólico y se separó en hexano de salmuera metanólica. Para ácidos grasos de semillas, se pulverizaron las semillas y se extrajeron en metanol:heptano:tolueno:2,2-dimetoxipropano:H2SO4 (39:34:20:5:2) durante 90 minutos a 80°C. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, la fase superior, que contenia los ésteres de ácido grasos de la semilla, se sometió a análisis GC. Los ésteres de ácido grasos se los tejidos de semilla y hoja se analizaron con una columna SUPELCO SP-2330 (Supelco, Bellefonte, PA).

[0246] Los glucosinolatos se purificaron de las semillas o las hojas mediante el calentamiento el primer lugar del tejido a 95°C durante 10 minutos. Se añade etanol:agua (50:50) precalentado y después del calentamiento a 95°C durante 10 minutos adicionales, se aplica el disolvente de extracción a una columna SEPHADEX DEAE (Pharmacia) que se había equilibrado previamente con acetato de piridina 0,5 M. Se eluyeron los desulfoglucosinolatos con 300 ul de agua y se analizaron mediante HPLC de fase inversa con seguimiento a 226 nm.

[0247] Para alcanos de ceras, se extrajeron muestras utilizando un proceso idéntico al de los ácidos grasos y se analizaron los extractos en un GC HP 5890 acoplado con un MSD 5973. Las muestras se aislaron cromatográficamente en un espectrómetro de masas J&W DB35 (J&W Scientific Agilent Technologies, Folsom, CA).

[0248] Para medir los niveles de prenil lípidos,se pulverizaron las semillas o las hojas con pirogalol al 1 a 2% como antioxidante. Para las semillas, se filtraron las muestras extraídas y se extrajo una porción para el análisis de tocoferol y carotenoide/clorofila mediante HPLC. El material restante se saponificó para la determinación de esterol. Para las hojas, se extrajo una alícuota y se diluyó con metanol y clorofila A, clorofila B y se midió el total de carotenoides mediante espectrofotometría mediante la determinación de la absorbancia óptica a 665,2 nm, 652,5 nm y 470 nm. Se extrajo una alícuota para la composición de tocoferol y carotenoide/clorofila mediante HPLC utilizando una columna Waters PBondapak C18 (4,6 mm x 150 mm). La solución metanólica restante se saponificó con KOH al 10% a 80°C durante una hora. Las muestras se enfriaron y se diluyeron con una mezcla de metanol y agua. Se le mezcló una solución de cloruro de metileno al 2% en hexano y se centrifugaron las mezclas. La fase acuosa de metabol se reextrajo de nuevo con cloruro de metileno al 2% en hexanbo y, después de la centrifugación, se combinaron las dos fases superiores y se evaporaron. Se añadió cloruro de metileno al 2% en hexano a los tubos y las muestras se extrajeron a continuación con un ml de agua. Se extrajo la fase superior, se secó y se resuspendió en 400 !l de cloruro de metileno al 2% en hexano y se analizó mediante cromatografía de gases utilizando una DB5ms de 50 m (0,25 mm DI, 0,25 um fase, J&W Scientific).

[0249] Los niveles de azúcares insolubles se midieron mediante el proceso descrito esencialmente por Reiter et al. (1999), Plant J. 12: 335-345. Este proceso analiza la composición de azúcares neutros de los polímeros de la pared celular hallados en las hojas de Arabidopsis. Los azúcares solubles se separaron de los polímeros de azúcares mediante la extracción de las hojas con etanola caliente al 70%. El residuo restante que contenía los polisacáridos insolubles se hidrolizaron a continuación con ácido con alosa añadida como patrón interno. Los monómeros de ázucares generados mediante la hidrólisis se redujeron a continuación hasta los correspondientes alditioles mediante el tratamiento con NaBH4, a continuación se acetilaron para generar acetatos de alditiol volátiles que se analizaron a continuación mediante GC-FID. La identidad de los picos se determinó mediante la comparación de los tiempos de retención de azúcares conocidos convertidos en los correspondientes acetatos de alditiol con los tiempos de retención de picos de los extractos de plantas de tipo salvaje. Los acetato de alditiol se analizaron en una columna capilar Supelco SP-2330 (30 m x 250 !m x 0,2 !m) utilizando un programa de temperaturas que empieza a 180°C durante 2 minutos seguido de un incremento hasta 220°C en 4 minutos. Después de mantenerse a 220°C durante 10 minutos, la temperatura del horno se incrementa hasta 240°C en 2 minutos y se mantuvo a esta temperatura durante 10 minutos y se llevó a temperatura ambiente.

[0250] Para identificar las plantas con alteraciones en el contenido total de aceite o proteína en las semillas, se sometieron 150 mg de plantas de progenie T2 a un análisis de Espectroscopía de Reflectancia del Infrarrojo Cercano (NIRS) utilizando Foss NirSystems Modelo 6500 con un sistema de transporte de copa giratoria. La NIRS es un proceso analítico no destructivo utilizado para determinar la composición de aceite y proteína en la semilla. El infrarrojo es la región del espectro electromagnético situado después de la región visible en la dirección de las longitudes de onda más largas. “Infrarrojo cercano” debe su nombre por estar la región infrarroja cercana a la región visible del espectro electromagnético. Por razones prácticas, el infrarrojo cercano comprende longitudes de onda entre 800 y 2500 nm. La NIRS se aplica a compuestos orgánicos ricos en enlaces O-H (tales como humedad, carbohidratos, y grasas), enlaces C-H (tales como compuestos orgánicos y derivados del petróleo), y enlaces N-H (tales como proteínas y aminoácidos). Los instrumentos analíticos de NIRS operan mediante señales de NIRS que se correlacionan estadísticamente a varias longitudes de onda con la característica o propiedad pretendida para medir. Todas las sustancias biológicas contienen miles de enlaces C-H, O-H, y N-H. Por lo tanto, la exposición a la radiación del infrarrojo cercano de una muestra biológica, tal como una semilla, da lugar a un espectro complejo que contiene información cualitativa y cuantitativa sobre la composición física y química de esa muestra.

[0251] El valor numérico de un analito específico en la muestra, tal como el contenido de proteína o el contenido de aceite, está mediado por una estrategia de calibración conocida como quimiometría. La quimiometría aplica procesos estadísticos, tales como la regresión lineal múltiple (MLR), análisis de mínimos cuadrados parciales (PLS) y el análisis del componente principal (PCA), a los datos espectrales y se correlacionan con una propiedad física u otro factor, los cuales se determinan directamente en lugar de que la propia concentración de analito. El proceso proporciona primero datos de “química húmeda” de las muestras requeridas para el desarrollo de la calibración.

[0252] La calibración de la respuesta de NIRS se realizó utilizando datos obtenidos mediante un análisis químico húmedo de una población de ecotipos de Arabidopsis que se esperaba que representaran la diversidad de niveles de aceite y proteína.

[0253] La composición exacta de aceite de cada ecotipo utilizado en el experimento de calibración se realizó utilizando un análisis gravimétrico de aceites extraídos de muestras de semillas (0,5 g ó 1,0 g) mediante el proceso de extracción acelerada con disolvente (ASE; Dionex Corp, Sunnyvale, CA). El proceso de extracción se validó frente a muestras de canola certificadas (Community Bureau of Reference, Bélgica). Las muestras de semillas de cada ecotipo (0,5 g ó 1g) se sometieron a una extracción acelerada con disolvente y los pesos resultantes del aceite extraido en comparación con el peso de aceite recuperado de la semilla de cánola que se ha certificado por el contenido de aceite (Community Bureau of Reference). La ecuación de calibración del aceite se basó en 57 muestras con un intervalo de contenido de aceite del 27,0% al 50,8%. Para comprobar la validez de la curva de calibración, se extrajo un grupo adicional de muestras mediante ASE y se predijo utilizando la ecuación de calibración del aceite. Este grupo de validación presentaba 46 muestras, que variaban desde 27,9% a 47,5% de aceite, y tenían un error de acción estándar previsto de 0,63%. El proceso químico húmedo para la proteína fue un análisis elemental (%N X 6,0) utilizando el promedio de 3 muestras representativas de 5 mg cada una validadas frente a maíz molido certificado (NIST). La instrumentación fue un analizador elemental Elementar Vario-EL III operado en modo operativo CNS (Elementar Analysensysteme GmbH, Hanau, Alemania).

[0254] La ecuación de calibración de proteínas se basó en una biblioteca de 63 muestras con un intervalo del contenido de proteína de 17,4% a 31,2%. Se analizó un grupo adicional de muestras por las proteínas mediante análisis elemental (n = 57) y se rastreó mediante NIRS a efectos de validar la ecuación de predicción de proteína. El intervalo de proteína del grupo de validación fue de 16,8% a 31,2% y el error de predicción estándar fue de 0,468%.

[0255] El análisis NIRS de las semillas de Arabidopsis se llevó a cabo en muestras experimentales de 40-300 mg. El contenido de aceite y proteína se predijo utilizando las respectivas ecuaciones de calibración.

[0256] Los datos obtenidos del análisis de NIRS se analizó estadísticamente utilizando un análisis del “vecino más próximo” (N-N). El análisis NN permite la eliminación de la variabilidad espacial en un bloque de una manera bastante flexible, lo cual no requiere un conocimiento previo del patrón de variabilidad en la cámara. Idealmente, todos los híbridos se desarrollan bajo condiciones experimentales idénticas en un bloque (rep). En realidad, incluso en muchos diseños en bloque, existe una variabilidad significativa en el bloque. Los procedimientos del vecino más próximo se basan en la presunción de que el efecto medioambiental de un terreno está relacionado estrechamente con la de sus vecinos. Los procesos del vecino más próximo utilizan información de terrenos adyacentes para ajustar la heterogeneidad en un bloque y así proporcionar estimaciones más precisas de medios de tratamiento y diferencias. Si existe heterogeneidad en un bloque a una escala espacial que es mayor que un único terreno y es más pequeña que el bloque completo, entonces los rendimientos de los terrenos adyacentes se correlacionarán positivamente. La información de los terrenos vecinos se puede utilizar para reducir o eliminar el efecto no deseado de la heterogeneidad espacial y, por tanto, mejorar la estimación del efecto del tratamiento. Los datos de terrenos vecinos también se pueden utilizar para reducir la influencia de la competición entre terrenos adyacentes. El análisis N-N de Papadakis se puede utilizar con diseños para eliminar la variabilidad en un bloque que no se eliminaría con el análisis del terreno separado estándar ((Papadakis (1973) Inst. d’Amelior. Plantes Thessaloniki (Greece) Bull. Scientif. No. 23; Papadakis (1984) Proc. Acad. Athens 59: 326-342).

[0257] Los experimentos se realizaron para identificar aquellos transformantes o knockouts que mostraron una sensibilidad a azúcares modificada. Para dichos estudios, se germinaron semillas de transformantes en medios que contenían glucosa al 5% o sacarosa al 9,4% que normalmente parcialmente limitaban el alargamiento de hipocótilo. Las plantas con una sensibilidad alterada a azúcares pueden tener hipocótilos más largos o más cortos que plantas normales cuando se desarrollan en este medio. Adicionalmente, se pueden variar otros rasgos de las plantas, tales como la masa de raíz.

[0258] Los experimentos se pueden realizar para identificar aquellos transformantes o knockouts que mostraban una tolerancia mejorada a patógenos. Para dichos estudios, los transformantes se exponen a patógenos fúngicos biotrópicos, tales como Erysiphe orontii, y patógenos fúngicos nnecrotrópicos, tales como Fusarium oxysporum. Los aislados de Fusarium oxysporum causan la marchitez vascular y la humectación de varios plantas de huerta, plantas perennes y algas anuales (Mauch-Mani y Slusarenko (1994) Molec Plant-Microbe Interact. 7: 378-383). Para los experimentos con Fusarium oxysporum, se desarrollan plantas en placas de Petri y se pulverizan con una suspensión recién preparada de esporas de F. oxysporum. La suspensión de esporas se prepara de la siguiente manera: se coloca un tapón de hifas fúngicas de un cultivo en placas sobre una placa nueva de agar dextrosa de patata y se deja que se extienda durante una semana. A continuación, se añaden cinco ml de agua estéril a la placa, se centrifugan y se pipetean en 50 ml de medio Armstrong Fusarium. Las esporas se desarrollan durante la noche en medio Fusarium y a continuación se pulverizan sobre las plantas utilizando un pulverizador de pintura Preval. El tejido vegetal se recoge y se congela en nitrógeno líquido 48 horas después de la infección.

[0259] Erysiphe orontii es un agente causante del oídio. Para los experimentos con Erysiphe orontii, las plantas se desarrollan aproximadamente 4 semanas en un invernadero bajo 12 horas de luz (20°C, ~30% de humedad relativa (rh)). Hojas individuales se infectan con esporas de E. orontii de plantas infectadas utilizando un cepillo de pelo de camello y las plantas se transfieren a una cámara de crecimiento de Percival (20°C, 80% rh.). El tejido vegetal se recoge y se congela en nitrógeno líquido 7 días después de la infección.

[0260] Botrytis cinerea es un patógeno necrotrófico. Se desarrolla Botrytis cinerea en agar dextrosa de patata bajo 12 horas de luz (20°C, ~30% de humedad relativa (rh)). Se realiza un cultivo de esporas mediante la extensión de 10 ml de agua estéril en la placa de hongos, centrifugación y transferencia de esporas a 10 ml de agua estéril. A continuación, se utiliza el inóculo de esporas (aproximadamente 105 esporas/ml) para pulverizar semilleros de 10 días de vida desarrollados bajo condiciones estériles en medio MS (menos sacarosa). Los síntomas se evalúan cada día hasta aproximadamente 1 semana.

[0261] Se desarrollan cultivos de hifas de Sclerotinia sclerotiorum en caldo de dextrosa de patata. Se muele un gramo de hifa, se filtra, se centrífuga y se resuspende en agua estéril. Se utiliza una dilución 1:10 para pulverizar semilleros de 10 días de vida desarrolladas de forma aséptica bajo un régimen de 12 horas de luz/oscuridad en medio MS (menos sacarosa). Los síntomas se evalúan cada día hasta aproximadamente 1 semana.

[0262] Se inocularon a mano en dos dosis la cepa 4326 de Pseudomonas syringae pv maculicola (Psm) y la cepa de pv maculicola. Dos dosis de inoculación permiten la diferenciación entre plantas con una mayor susceptibilidad y plantas con una mayor resistencia con el patógeno. Las plantas se desarrollan durante 3 semanas en el invernadero, a continuación se transfieren a la cámara de crecimiento para el residuo del crecimiento. Psm ES4326 se puede inocular a mano con una jeringa de 1 ml en 3 hojas totalmente expandidas por planta (4 semanas y media) utilizando por lo menos 9 plantas por línea sobreexpresante en dos dosis de inoculación, DO=0,005 y DO=0,0005. La evaluación de la enfermedad se realiza en el día 3 después de la inoculación con las fotografías de las plantas y las hojas tomadas en paralelo.

[0263] En algunos casos, los patrones de expresión de los genes inducidos por patógenos (tales como genes de defensa) se pueden seguir por experimentos de micromatrices (microarray). En estos experimentos, los ADNc se generan por la PCR y se vuelven a suspender a una concentración final de 100 ng/!l en 3x SSC o fosfato-Na 150 mM (Eisen y Brown (1999) Methods Enzymol. 303: 179-205). Los ADNc se aplican como manchas puntuales sobre portaobjetos de vidrio de microscopio recubiertos con polilisina. Los ADNc preparados se dividen en partes alícuotas en placas de 384 pocillos y se aplican como manchas puntuales sobre los portaobjetos usando, por ejemplo, una estructura de soporte x-y-z (OmniGrid) que se puede adquirir en (Menlo Park, CA) equipado con clavijas de tipo vaina que se pueden adquirir en Telechem International (Sunnyvale, CA). Después de la aplicación en manchas puntuales, las matrices se curan durante un mínimo de una semana a temperatura ambiente y, se rehidratan y se bloquean siguiendo el protocolo recomendado por Eisen y Brown (1999) supra.

[0264] Las muestras de ARN total (10 !g) se marcan usando colorantes de Cy3 y Cy5 fluorescentes. Las muestras marcadas se vuelven a suspender en 4X SSC/SDS al 0,03%/4 !g de ADN de esperma de salmón/2 !g de ARNt/pirofosfato de sodio 50 mM, se calientan a 95ºC durante 2,5 min, se centrifugan y se ponen sobre la matriz. Después la matriz se cubre con un cubreobjetos de vidrio y se pone en una cámara herméticamente cerrada. Después la cámara se mantiene en un baño de agua a 62ºC durante una noche. Las matrices se lavan como describen Eisen y Brown (1999), supra, y se escanean en un escáner láser General Scanning 3000. Los archivos resultantes posteriormente se cuantifican usando el software IMAGENE, (BioDiscovery, Los Angeles CA).

[0265] Se pueden llevar a cabo experimentos de RT-PCR para identificar aquellos genes inducidos después de exposición a patógenos fúngicos biotrópicos, tales como Erysiphe orontii, patógenos fúngicos necrotrópicos, tales como Fusarium oxysporum, bacterias, virus y ácido salicílico, el último implicado en una respuesta de resistencia no específica en Arabidopsis thaliana. En general, se examinan los patrones de expresión de genes de tejidos foliares de plantas de suelo.

[0266] Se llevó a cabo la PCR con transcriptasa inversa usando cebadores específicos de gen con la región codificante de cada secuencia identificada. Los cebadores se diseñaron cerca de la región 3’ de cada secuencia de unión al ADN identificada inicialmente.

[0267] Los ARN totales de estos tejidos foliares del suelo se aislaron usando los protocolos de extracción de CTAB. Una vez extraído, el ARN total se normalizó en concentración con todos los tipos de tejidos para asegurar que la reacción de la PCR para cada tejido recibía la misma cantidad de molde de ADNc usando la banda 28S como referencia. Se purificó el poli(A+) ARN usando un protocolo modificado del protocolo del lote del kit de purificación Qiagen OLIGOTEX. El ADNc se sintetizó usando protocolos estándar. Después de la síntesis de la primera cadena de ADNc, se usaron cebadores para actina 2 para normalizar la concentración de ADNc en todos los tipos de tejidos. Se encontró que la actina 2 es expresada de forma constitutiva en niveles bastante iguales en todos los tipos de tejidos que se investigan.

[0268] Para la RT-PCR, los moldes de ADNc se mezclaron con los cebadores correspondientes y la ADN polimerasa Taq. Cada reacción consistía en 0,2 !l de molde de ADNc, 2 !l de 10X tampón de Tricina, 2 !l de 10X tampón de Tricina y 16,8 !l de agua, 0,05 !l de cebador 1, 0,05 !l, de cebador 2, 0,3 !l de ADN polimerasa Taq y 8,6 !l de agua.

[0269] La placa de 96 pocillos se cubre con micropelícula y se pone en el termociclador para iniciar el ciclo de reacción. A modo de ilustración, el ciclo de reacción puede comprender las siguientes etapas:

ETAPA 1: 93ºC durante 3 minutos; ETAPA 2: 93ºC durante 30 segundos; ETAPA 3: 65ºC durante 1 minuto; ETAPA 4: 72ºC durante 2 minutos; Las ETAPAS 2, 3 y 4 se repiten durante 28 ciclos; ETAPA 5: 72ºC durante 5 minutos; y ETAPA 6: 4ºC.

[0270] Para amplificar más productos, por ejemplo, para identificar genes que tienen expresión muy baja, se pueden llevar a cabo etapas adicionales: el siguiente procedimiento ilustra un procedimiento que se puede usar en relación con esto; la placa de PCR se vuelve a poner en el termociclador durante 8 ciclos más de etapas 2-4.

ETAPA 2: 93ºC durante 30 segundos; ETAPA 3: 65ºC durante 1 minuto; ETAPA 4: 72ºC durante 2 minutos, repetida 8 ciclos; y ETAPA 5: 4ºC.

[0271] Se cargan 8 !l de producto de la PCR y 1,5 !l de colorante de carga en un gel de agarosa al 1,2% para el análisis después de 28 ciclos y 36 ciclos. Los niveles de expresión de transcritos específicos se consideran bajos si son detectables sólo después de 36 ciclos de PCR. Los niveles de expresión se consideran medios o altos dependiendo de los niveles de transcritos comparados con los niveles de transcritos observados para un control interno tal como la actina 2. Los niveles de transcritos se determinan en experimentos repetidos y se comparan con los niveles de transcritos en plantas de control (p. ej., no transformadas).

[0272] Los experimentos se realizaron para identificar aquellos transformantes o knockouts que mostraron una tolerancia mejorada la estrés medioambiental. Para dichos estudios, los transformantes se expusieron a un conjunto de situaciones estresantes medioambientales. Las plantas se expusieron a estrés por frío (6 horas de exposición a 4-8°C), estrés por calor (6 horas de exposición a 32-37°C), estrés pos concentración elevada de sal (6 horas de exposición a NaCl 200 mM), estrés por sequía (168 horas después de eliminar el agua de los accesos), estrés osmótico (6 horas de exposición a manitol 3 M) o limitación de nutrientes (nitrógeno, fosfato y potasio) (nitrógeno: todos los componentes del medio MS permanecieron constantes a excepción del N que se redujo hasta 20 mg/l de NH4NO3; fosfato: todos los componentes del medio MS a excepción de KH2PO4, que se sustituyó por K2SO4; potasio: todos los componentes del medio MS a excepción de la eliminación de KNO3 y KH2PO4, que se sustituyeron por NaH4PO4).

[0273] Los experimentos se realizaron para identificar aquellos transformantes o knockouts que mostraron una estructura modificada y características de desarrollo. Para dichos estudios, se observaron los transformantes a simple vista para identificar características nuevas estructurales o desarrollo asociadas con la expresión ectópica de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención.

[0274] El tiempo de floración se midió mediante el número de hojas de escarapela presentes cuando se observa una inflorescencia visible de aproximadamente 3 cm. El número hojas de escarapela y el total en el tallo de la progenie están estrechamente correlacionados con el ritmo de floración (Koornneef et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229: 5766). También se midió la respuesta de vernaliación. Para los tratamientos de vernalización, se sembraron las semillas en placas agar MS, se sellaron con cinta de microporos y se colocaron en una habitación fría a 4°C con niveles bajos de luz durante 6-8 semanas. A continuación, las placas se transfirieron a las habitaciones de crecimiento al lado de placas que contenían controles no vernalizados recién sembrados. Se contaron las hojas de escarapela cuando se observó una inflorescencia visible de aproximadamente 3 cm.

[0275] Los fenotipos modificados observados para plantas sobreexpresantes particulares o knockout se proporcionan en la tabal 4. Para una sobreexpresante particular que muestra una característica menos beneficiosa, puede ser más útil seleccionar una planta con una expresión disminuida del factor de transcripción particular. Para un knockout particular que muestra una caratcterística menos beneficiosa, puede ser más útil seleccionar una planta con una expresión incrementada del factor de transcripción particular.

[0276] Las secuencias del listado de secuencias o aquellas de las tablas Tables 4 - 9, o aquesllas descritas aquí, se pueden utilizar para preparar plantas trnasgénicas y plantas con rasgos alterados. Las plantas transgénicas específicas indicadas a continuación se producen a partir de secuencias del listado de secuencias tal como se indica. Las tablas 4 y 6 proporcionan secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de ejemplo de la invención.

Ejemplo VIII: Ejemplo de genes que confieren mejoras significativas a las plantas

[0277] Ejemplos de genes u homólogos que confieren mejoras significativas a plantas knockout o sobreexpresantes se indican a continuación. También se presentan las observaciones experimentales realizadas por nosotros con respecto a genes específicos cuya expresión se ha modificado en plantas sobreexpresantes o knockout y las potenciales aplicaciones en base a estas observaciones.

[0278] Este ejemplo proporciona evidencia experimental para el incremento de la biomasa y tolerancia al estrés abiótico controlados por los polipéptidos del factor de transcripción y los polipéptidos de la invención.

[0279] Los ensayos de estrés salino pretenden encontrar genes que confirieran mejores germinación, vigor de las plántulas o crecimiento en concentración salina alta. La evaporación desde la superficie del suelo produce el movimiento del agua hacia arriba y la acumulación de sal en la capa superior del suelo donde se ponen las semillas. Por lo tanto, normalmente la germinación se produce con una concentración salina mucho más alta que la concentración salina media del perfil de todo el suelo. Las plantas difieren en su tolerancia al NaCl dependiendo de la etapa de desarrollo, por lo tanto se evalúan las respuestas en la germinación de la semilla, vigor de la plántula, y crecimiento de la planta.

[0280] Los ensayos de estrés osmótico (incluyendo ensayos de NaCl y manitol) pretenden determinar si un fenotipo de estrés osmótico es específico de NaCl o es un fenotipo de estrés osmótico general. Las plantas tolerantes al estrés osmótico podrían haber tenido también mayor tolerancia a la sequía y/o helada.

[0281] Los ensayos de sequía pretenden encontrar genes que medien en la mejor supervivencia de las plantas después de la privación sevara de agua a corto plazo. Se medirá, si es necesario, la pérdida de iones. La tolerancia al estrés osmótico también apoyaría un fenotipo tolerante a la sequía.

[0282] Los ensayos de estrés por temperatura pretenden descubrir genes que conferían una mejor germinación, vigor a las plántulas o crecimiento de las plantas en condiciones de estrés por temperatura (frío, helada y calor).

[0283] Los ensayos de sensibilidad a los azúcares pretenden encontrar genes implicados en la sensibilización a azúcares mediante la germinación de semillas en concentraciones elevadas de sacarosa y glucosa y la búsqueda de grados de alargamiento de hipocótilo. El ensayo de germinación en controles de manitol para respuestas relacionadas con el estrés osmótico. Los azúcares son moléculas reguladoras claves que afectan a diversos procesos en plantas superiores, incluyendo la germinación, crecimiento, floración, senescencia, metabolismo de los azúcares y fotosíntesis. La sacarosa es la forma de transporte principal de fotosintato y su flujo a través de las células se ha observado que afecta a la expresión génica y altera la acumulación de compuestos de almacenamiento en las semillas (relaciones fuente-sumidero). También se ha descrito la sensibilización a hexosa específica de glucosa en plantas y está implicada en la división celular y la represión de genes “hambrunos” (ciclos fotosintéticos o de glioxilato).

[0284] Los ensayos de germinación siguieron las modificaciones del mismo protocolo básico. Se sembraron semillas estériles en los medios condicionados listados a continuación. Las placas se incubaron a 22ºC con 24 h de luz (120130 !Ein/m2/s) en una cámara de crecimiento. La evaluación de la germinación y el vigor de las plántulas se llevó a cabo de 3 a 15 días después de plantarlas. El medio basal era medio Murashige-Skoog al 80% (MS) + vitaminas.

[0285] Para los experimentos de germinación para el estrés salino y osmótico, el medio se complementó con NaCl 150 mM o manitol 300 mM. Se llevaron a cabo ensayos de sensibilidad de reguladores del crecimiento en medio MS, vitaminas y, o bien ABA 0,3 !M, sacarosa al 9,4%, o bien glucosa al 5%.

[0286] Los experimentos de germinación en frío para el estrés por temperatura se llevaron a cabo a 8ºC. Los experimentos de germinación para el estrés por calor se llevaron a cabo de 32ºC a 37ºC durante 6 h de exposición.

[0287] Para los experimentos de estrés llevados a cabo con plantas más maduras, las semillas se germinaron y cultivaron durante varios días en MS + vitaminas + sacarosa al 1% a 22ºC y después se transfirieron a condiciones de estrés por frío y calor. Las plantas se expusieron o bien a estrés por frío (exposición de 6 h a 4-8ºC) o a estrés por calor (se aplicaron 32ºC durante 5 días), después de lo cual las plantas se volvieron a transferir a 22ºC para la recuperación y se evaluaron 5 días después con respecto a los controles que no se habían expuesto a temperatura reducida o elevada.

Información publicada

[0288] G1988 (At3g21150) está en el clon P1 MSA6 (número de acceso de GenBank AP000604) y se identificó en base a su similitud de secuencia en el dominio conservado con otras proteínas relacionadas similares a CONSTANS en Arabidopsis. No existe información publicada o pública sobre la función de G1988.

Observaciones experimentales.

[0289] La función de G1988 se estudió utilizando plantas trnasgénicas en las que el gen se expresó bajo el control del promotor 35S. La evidencia de los ensayos fisiológicos y morfológicos indican que G1988 puede jugar un papel en los priocesos de desarrollo regulados por la luz; los semilleros de 35S::G1988 mostraron hipocótilos más largos, peciolos alargados, y un conjunto de líneas florecidas de forma temprana.

[0290] Cuando se desarrollaron en fosfato limitado, todas las líneas aparecieron más grtnades y presentaban un mayor crecimiento de las raíces que los controles. Los semilleros germinados en placas que contenían nitrógeno limitado (suplementado con glutamina) aparecieron menos estresados que los controles.

Utilidades

[0291] En base a los resultados de los ensayos fisiológicos, G1988 podría utilizarse para diseñar plantas que muestran un crecimiento mejorado y una supervivencia en medios bajos en nutrientes.

[0292] G1988 también podría tener un papel en la modulación de procesos del desarrollo regulados por la luz, tales como evitar la sombra. La eliminación de las respuestas a la sombra podría conducir a densidades de plantación incrementadas con el consecuente aumento de la producción. El gen también podría ser útil en la manipulación del tiempo de floración.

Ejemplo IX: Identificación de secuencias homólogas

[0293] Este ejemplo describe la identificación de genes que son ortólogos a los factores de transcripción de Arabidopsis thaliana a partir de una búsqueda de homología por ordenador.

[0294] Las secuencias homólogas, incluyendo las de parálogos y ortólogos de Arabidopsis y otras especies de plantas, se identificaron usando herramientas de búsqueda de secuencias en bases de datos, tales como la herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul y col. (1990) supra; y Altschul y col. (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402). Los programas de análisis de secuencias tblastx se usaron con la matriz de puntuación BLOSUM-62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc Natl. Acad Sci. 89: 10915-10919). Se filtró la base de datos de NCBI GenBank entera para buscar secuencias de todas las plantas excepto de Arabidopsis thaliana seleccionando todas las entradas en la base de datos NCBI GenBank asociadas con el ID taxonómico de NCBI 33090 (Viridiplantae; todas las plantas) y excluyendo las entradas asociadas con el ID taxonómico 3701 (Arabidopsis thaliana).

[0295] Estas secuencias se comparan con secuencias que representan genes de la lista de secuencias, usando el algoritmo TBLASTX de la Universidad de Washington (versión 2.0a19MP) con los parámetros por defecto usando los alineamientos incompletos con el filtro “apagado”. Para cada una de estas secuencias de genes, se ordenaron comparaciones individuales por puntuaciones de probabilidad (valor P), donde las puntuaciones reflejan la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular al azar. Por ejemplo, una puntuación de 3,6E-40 es 3,6 x 10-40. Además de los valores P, también se puntuaron las comparaciones por el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad refleja el grado con el que dos segmentos de ADN o proteínas son idénticos a lo largo de una longitud particular. Los ejemplos de secuencias identificadas de esta forma se presentan en las tablas 7 y 9. Las secuencias parálogas u ortólogas se identificaron fácilmente a partir de bases de datos privadas y de GenBank. El porcentaje de identidad de secuencias entre estas secuencias puede ser tan bajo como 47%, o incluso una identidad de secuencia menor.

[0296] Las secuencias parálogas candidatas se identificaron entre factores de transcripción de Arabidopsis por el alineamiento, identidad y relaciones filogénicas. Se identificaron secuencias ortólogas candidatas del conjunto de la base de datos de Unigene de marca registrada de secuencias de genes de plantas en Zea mays, Glycine max y Oryza sativa, basándose en la homología significativa con los factores de transcripción de Arabidopsis. Estos candidatos se compararon recíprocamente con el conjunto de factores de transcripción de Arabidopsis. Si el candidato mostraba una similitud máxima en el dominio de proteína con el factor de transcripción que se provocaba

o con un parálogo del factor de transcripción que se provocaba, entonces se consideraba que era un ortólogo. Las secuencias que no eran de Arabidopsis que se mostró de esta forma que eran ortólogas a las secuencias de Arabidopsis se proporcionan en la tabla 6.

Ejemplo X. Cribado de biblioteca de ADNc de planta para la secuencia que codifica el dominio de unión al ADN del factor de transcripción que se une a un elemento promotor de unión al factor de transcripción y demostración de la actividad reguladora de transcripción de la proteína

[0297] Se usa la estrategia de “un híbrido” (Li y Herskowitz (1993) Science 262:1870-1874) para cribar clones de ADNc de planta que codifican un polipéptido que comprende un dominio de unión al ADN del factor de transcripción, un dominio conservado. Brevemente, se construyen cepas de levadura que contienen un gen indicador lacZ con las secuencias del elemento promotor de unión del factor de transcripción tipo salvaje o mutante en lugar de la UAS normal (secuencia activadora en dirección 5’) del promotor GALA. Se construyen cepas indicadoras de levadura que llevan las secuencias del elemento promotor de unión del factor de transcripción como elementos UAS que están operativamente unidos en dirección 5’ de un gen indicador lacZ con un promotor GAL4 mínimo. Las cepas se transforman con una biblioteca de expresión de planta que contiene insertos de ADNc aleatorios fusionados con el dominio de activación de GALA (GAL4-ACT) y se criban las formaciones de colonias azules en filtros tratados con Xgal (X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-1-D-galactosida; Invitrogen Corporation. Carlsbad CA). Alternativamente, las cepas se transformaron con un polinucleótido de ADNc que codifica una secuencia de polipéptido de dominio de unión al ADN de factor de transcripción conocida.

[0298] Las cepas de levadura que llevan estas construcciones indicadoras producen niveles bajos de 1galactosidasa y forman colonias blancas en los filtros que contienen X-gaL. Las cepas indicadoras que llevan las secuencias del elemento promotor de unión del factor de transcripción tipo salvaje se transforman con un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio de unión al ADN de factores de transcripción de planta operativamente unidos a un dominio activador ácido del factor de transcripción GAL4 de levadura, “GAL4-ACT”. Los clones que contienen un polinucleótido que codifica un dominio de unión al ADN de factor de transcripción operativamente unido a GLA4-ACT pueden unirse en dirección 5’ de los genes indicadores lacZ que llevan la secuencia del elemento promotor de unión del factor de transcripción tipo salvaje, activar la transcripción del gen lacZ y dar como resultado levaduras que forman colonias azules en los filtros tratados con X-gal.

[0299] Tras el cribado de aproximadamente 2 x 106 transformantes de levadura, se aíslan clones de ADNc positivos; es decir, clones que hacen que cepas de levaduras que llevan los indicadores lacZ operativamente unidos a elementos promotores de unión de factores de transcripción tipo salvaje formen colonas azules en filtros tratados con X-gal. Los clones de ADNc no hacen que una cepa de levaduras que lleva elementos promotores de unión de factor de transcripción de tipo mutante fusionados con LacZ se vuelva azul. Por lo tanto, se muestra que un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ADN de factor de transcripción, un dominio conservado, activa la transcripción de un gen.

Ejemplo XI: Ensayos de desplazamiento en gel.

[0300] La presencia de un factor de transcripción que comprende un dominio de unión al ADN que se une a un elemento de unión al ADN del factor de transcripción se evalúa usando el siguiente ensayo de desplazamiento en gel. El factor de transcripción se expresa de forma recombinante y se aísla de E. coli o se aísla de un material de planta. La proteína soluble total, que incluye el factor de transcripción, (40 ng) se incuba a temperatura ambiente en 10 !l de 1x tampón de unión (HEPES 15 mM (pH 7,9), EDTA 1 mM, KCl 30 mM, glicerol al 5%, albúmina de suero bovino al 5%, DTT 1 mM) más 50 ng poli(dl-dC):poli(dl-dC) (Pharmacia, Piscataway NJ) con o sin 100 ng de ADN competidor. Después de 10 minutos de incubación, se añade un ADN sonda que comprende un elemento de unión al ADN del factor de transcripción (1 ng) que se ha marcado con 32P mediante carga en el extremo (Sambrook y col. supra) y la mezcla se incuba durante 10 minutos adicionales. Las muestras se cargan en geles de poliacrilamida (al 4% en p/v) y se fraccionan por electroforesis a 150 V durante 2 h (Sambrook y col. supra). El grado de unión del factor de transcripción-ADN sonda se visualiza mediante autorradiografía. Las sondas y ADN competidores se preparan a partir de insertos oligonucleótidos ligados en un sitio BamHI de pUC118 (Vieira y col. (1987) Methods Enzymol. 153: 3-11). La orientación y el número de concatenaciones de insertos se determinan mediante análisis de secuencia de ADN por el procedimiento didesoxi (Sambrook y col. supra). Los insertos se recuperan después de digestión con enzimas de restricción con EcoRI y HindIII y se fraccionan en geles de poliacrilamida (al 12% en p/v) (Sambrook y col. supra).

Ejemplo XII. Introducción de polinucleótidos en plantas dicotiledóneas

[0301] Cualquiera de las secuencias de factores de transcripción listadas en la Lista de Secuencias y secuencias parálogas y ortólogas, se puede recombinar en vectores de expresión pMEN20 o pMEN65 y a continuación transformar en una planta con el propósito de modificar rasgos de la planta. El vector de clonación se puede introducir en una variedad de plantas de cereales mediante medios bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, la transferencia de ADN directa o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Ahora es rutinario producir plantas transgénicas usando la mayoría de las plantas dicotiledóneas (véase Weissbach y Weissbach, (1989) supra; Gelvin y col. (1990) supra; Herrera-Estrella y col. (1983) supra; Bevan (1984) supra; y Klee (1985) supra). Los procedimientos de análisis de rasgos son rutinarios en la técnica y se han descritos ejemplos antes.

Ejemplo XIII: Transformación de plantas de cereals con un vector de expresión

[0302] Las plantas de cereales tales como, pero sin limitar, maíz, trigo, arroz, sorgo o cebada, se pueden también transformar con las presentes secuencias de polinucleótidos en los vectores de expresión pMEN20 o pMEN65 con el propósito de modificar rasgos de la planta. Por ejemplo, pMEN020 se puede modificar para sustituir la región codificante NptII con el gen BAR de Streptomyces hygroscopicus que confiere resistencia a la fosfinotricina. Los sitios KpnI y BglII del gen Bar se eliminan mediante mutagénesis dirigida con cambios de codones silenciosos.

[0303] El vector de clonación se puede introducir en una variedad de plantas de cereales por medios bien conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, la transferencia directa de ADN o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Actualmente es habitual producir plantas transgénicas de la mayoría de cultivos de cereales (Vasil (1994) Plant Mol. Biol. 25: 925-937) tales como maíz, trigo, arroz, sorgo (Cassas y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216, y cebada (Wan y Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104:37-48). Los procedimientos de transferencia de ADN tales como el procedimiento de microproyectiles se pueden usar para el maíz (Fromm y col. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839); Gordon-Kamm y col. (1990) Plant Cell 2: 603-618; Ishida (1990) Nature Biotechnol. 14:745-750), trigo (Vasil y col. (1992) Bio/Technol. 10:667-674; Vasil y col. (1993). Bio/Technol. 11:1553-1558; Weeks y col. (1993) Plant Physlol. 102:1077-1084), arroz (Christou (1991) Bio/Technol. 9:957-962; Hiei y col. (1994) Plant J. 6:271-282; Aldemita y Hodges (1996) Planta 199:612-617; y Hiei y col. (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218). Para la mayoría de las plantas de cereales, las células embrionarias derivadas de los tejidos escutelares inmaduros son las dianas celulares preferidas para la transformación (Hiei y col. (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218; Vasil (1994) Plant Mol. Biol. 25: 925-937).

[0304] Los vectores según la presente invención se pueden transformar en células embrionarias de maíz derivadas de tejido escutelar inmaduro mediante la utilización del bombardeo de microproyectiles, cono el genotipo A188XB73 como genotipo preferido (Fromm et al. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603618). Después del bombardeo de microproyectiles, los tejidos se seleccionan en fosfinotricina para identificar las células embrionarias transgénicas (Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618). Las plantas transgénicas se regeneran mediante técnicas de regeneración de maíz estándar (Fromm et al. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2: 603-618).

[0305] Los plásmidos preparados tal como se ha descrito anteriormente también se pueden utilizar para producir plantas transgénicas de trigo y arroz (Christou (1991) Bio/Technol. 9:957-962; Hiei et al. (1994) Plant J. 6:271-282; Aldemita y Hodges (1996) Planta 199: 612-617; y Hiei et al. (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218) que expresan coordinadamente genes de interés mediante los siguientes protocolos de transformación estándar conocidos por los expertos en la materia para el arroz y el trigo (Vasil et al. (1992) Bio/Technol. 10:667-674; Vasil et al. (1993) Bio/Technol. 11:1553-1558; and Weeks et al. (1993) Plant Physiol. 102:1077-1084), donde el gen bar se utiliza como marcador seleccionable.

Ejemplo de referencia XIV: Identificación de secuencias ortólogas y parálogas

[0306] Los ortólogos de genes de Arabidopsis se pueden identificar por varios procedimientos, incluyendo la amplificación por hibridación o por procedimientos bioinformáticos. Este ejemplo describe cómo se pueden identificar homólogos del factor de transcripción CBF1 (polinucleótido SEQ ID No. 2238, polipéptido codificado: SEQ ID No: 2239) de la familia AP2 de Arabidopsis, que confieren tolerancia a estreses abióticos (Thomashow y col. (2002) patente de EE.UU. nº 6.417.428), y un ejemplo para confirmar la función de secuencias homólogas. En este ejemplo se encontraron ortólogos de CBF1 en la canola (Brassica napus) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

[0307] Se designaron cebadores degenerados para las regiones del dominio de unión AP2 y fuera del AP2 (dominio carboxi terminal patente de EE.UU. nº 6.417.428):

Mol 368 (inverso) 5’- CAY CCN ATH TAY MGN GGN GT -3’ (SEQ ID No: 2246)

Mol 378 (directo) 5’- GGN ARN ARC ATN CCY TCN GCC -3’ (SEQ ID No: 2247)

(Y: C/T, N: A/C/G/T, H: A/C/T, M: A/C, R: A/G)

[0308] El cebador Mol 368 está en el dominio de unión AP2 de CBF1 (secuencia de aminoácidos: His-Pro-Ile-Tyr-Arg-Gly-Val) mientras que el cebador Mol 378 está fuera del domino AP2. (dominio carboxilo terminal) (secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Glu-Gly- Met-Leu-Leu-Pro).

[0309] El ADN genómico aislado de B. napus se amplificó usando estos cebadores siguiendo estas condiciones: una etapa de desnaturalización de 2 min a 93ºC; 35 ciclos de 93ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, y 72ºC durante 1 min; y una incubación final de 7 min a 72ºC al final de los ciclos.

5 [0310] Los productos de la PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% y se transfirieron a membranas de nailon y se hibridaron con la sonda AT CBF1 preparada a partir de ADN genómico de Arabidopsis por amplificación por la PCR. Los productos hibridados se visualizaron mediante un sistema de detección colorimétrico (Boehringer Mannheim) y las correspondientes bandas de un gel de agarosa similar se aislaron usando el kit de extracción de Qiagen (Qiagen). Los fragmentos de ADN se ligaron en el vector clon TA del kit de clonación

10 TOPO TA (Invitrogen) y se transformaron en la cepa de E. coli TOP10 (Invitrogen).

[0311] Se recogieron 7 colonias y los insertos se secuenciaron en un aparato ABI 377 a partir de ambas cadenas de sentido directo y sentido contrario después de aislar los plásmidos de ADN. La secuencia de ADN se editó mediante el secuenciador y se alineó con AtCBF1 con el software GCG y la búsqueda con Blast de NCBI.

15 [0312] La secuencia de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de un ortólogo de canola encontrado de esta forma (bnCBF1; polinucleótido SEQ ID No. 2244 y polipéptido SEQ ID No: 2245) identificado por este procedimiento, se muestra en la Lista de Secuencias.

20 [0313] Las secuencias de aminoácidos alineadas muestran que el gen bnCBF1 tiene una identidad de 88% con la secuencia de Arabidopsis en la región del dominio AP2 y una identidad de 85% con la secuencia de Arabidopsis fuera del dominio AP2 cuando se alinean para dos secuencias de inserción que están fuera del dominio AP2.

[0314] De forma similar, también se pueden identificar las secuencias parálogas de los genes de Arabidopsis, tales 25 como CBF1.

[0315] Se han clonado dos parálogos de CBF1 de Arabidopsis thaliana: CBF2 y CBF3. CBF2 y CBF3 se han clonado y secuenciado como se describe a continuación. Las secuencias de ADN SEQ ID No. 2240 y 2242 y las proteínas codificadas: SEQ ID No: 2241 y 2243 se establecen en el Listado de Secuencias.

30 [0316] Se cribaron en una biblioteca de ADNc lambda preparada a partir de ARN aislado de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Lin y Thomashow (1992) Plant Physiol. 99: 519-525) los clones recombinantes que llevaban insertos relacionados con el gen CBF1 (Stockinger y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 1035-1040). CBF1 se radiomarcó con 32P por cebado aleatorio (Sambrook y col. supra) y se usó para cribar una biblioteca mediante la

35 técnica de placa elevada usando condiciones de hibridación y lavado rigurosas (Hajela y col. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252; Sambrook y col. supra, 6 X tampón SSPE, 60ºC para la hibridación y 0,1 X tampón SSPE y 60ºC para los lavados). Se obtuvieron 12 clones de hibridación positivos y se determinaron las secuencias de ADN de los insertos de ADNc. Los resultados indican que los clones entran en 3 clases. Una clase lleva insertos que corresponden a CBF1. Las otras dos clases llevan secuencias que corresponden a dos homólogos diferentes de

40 CBF1, denominados CBF2 y CBF3. Las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias que codifican la proteína predicha para CBF1, CBF2, CBF3 de Arabidopsis se indican en el Listado de Secuencias (SEQ ID No: 2238, 2240, 2242 y SEQ ID No: 2239, 2241 y 2243, respectivamente). Las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias que codifican la proteína predicha para CBF ortólogo de Brassica napus se lista en el Listado de Secuencias (SEQ ID No: 2244 y 2245, respectivamente).

45 [0317] Una comparación de las secuencias de ácidos nucleicos de CBF1, CBF2 y CBF3 de Arabidopsis indica que son de 83 a 85% idénticas como se muestran en la tabla 11.

TABLA 11 50

Porcentaje de identidada

ADNb

Polipéptido

cbf1/cbf2

85 86

cbf1/cbf2

83 84

cbf2/cbf3

84 85

aEl porcentaje de identidad se determinó usando el algoritmo Clustal del programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc.). bSe muestran las comparaciones de las secuencias de ácidos nucleicos de los marcos de lectura abiertos

[0318] De forma similar, las secuencias de aminoácidos de los 3 polipéptidos CBP están en el intervalo de identidad de 84 a 86%. Un alineamiento de las 3 secuencias de aminoácidos pone de manifiesto que la mayoría de las diferencias en la secuencia de aminoácidos se producen en la mitad C-terminal ácida del polipéptido. Esta región de

55 CBF1 sirve como dominio de activación tanto en levaduras como en Arabidopsis (no se muestra).

[0319] Los residuos 47 a 106 de CBF1 corresponden al dominio AP2 de la proteína, un patrón de unión al ADN que, hasta la fecha, sólo se había encontrado en proteínas de plantas. Una comparación de los dominios AP2 de CBF1, CBF2 y CBF3 indica que hay algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos. Estas diferencias en la secuencia de aminoácidos pueden tener un efecto en la especificidad de unión al ADN.

Ejemplo de referencia XV: Transformación de canola con un plásmido que contiene CBF1, CBF2 o CBF3

[0320] Después de identificar los genes homólogos de CHF1, la canola se transformó con un plásmido que contenía los genes CBF1, CBF2 o CBF3 de Arabidopsis clonados en el vector pGA643 (An (1987) Methods Enzymol. 253: 292). En estas construcciones, los genes CBF se expresaban de forma constitutiva bajo el promotor 35S de CaMV, además, el gen CBF1 se clonó bajo los controles del promotor COR15 de Arabidopsis en el mismo vector pGA643. Cada construcción se transformó en la cepa de Agrobacterium GV3101. Las agrobacterias transformadas se cultivaron durante 2 días en medio AB mínimo que contenía los antibióticos adecuados.

[0321] La canola de primavera (B. napus variedad cultivada Westar) se transformó usando el protocolo de Moloney y col. ((1989) Plant Cell Reports 8: 238) con algunas modificaciones como se describe. Brevemente, las semillas se esterilizaron y se cultivaron en placa en medio MS de media concentración, que contenía sacarosa al 1%. Las placas se cultivaron a 24ºC con luz de 60-80 !E/m2/s usando un periodo de iluminación de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Los cotiledones de las plántulas de 4-5 días de edad se recogieron, se cortaron los peciolos y se sumergieron en disolución de Agrobacterium. Los cotiledones sumergidos se pusieron en medio de cultivo simultáneo con una densidad de 20 cotiledones/placa y se incubaron como se ha descrito antes durante 3 días. Los explantes se transfirieron al mismo medio, pero que contenía 300 mg/l de timentina (SmithKline Beecham, PA) y se redujeron a 10 cotiledones/placa. Después de 7 días, los explantes se transfirieron a medio de selección/regeneración. Las transferencias se continuaron cada 2-3 semanas (2 o 3 veces) hasta que se desarrollaron los brotes. Los brotes se transfirieron a medio de brote-alargamiento cada 2-3 semanas. Los lotes que tenían un aspecto sano se transfirieron a medio de enraizamiento. Una vez que se desarrollaron raíces buenas, las plantas se plantaron en suelo para macetas húmedo.

[0322] Después se analizó en las plantas transformadas la presencia del gen NPTII/resistencia a la kanamicina mediante ELISA, usando el kit de ELISA NPTII de 5Prime-3Prime Inc. (Boulder, CO). Aproximadamente 70% de las plantas cribadas eran positivas para NPTII. Solamente estas plantas se siguieron analizando.

[0323] Los análisis de transferencia Northern de las plantas que se transformaron con las construcciones de expresión constitutiva mostraron expresión de los genes CBF y todos los genes CBF fueron capaces de inducir el gen BN115 regulado por el frío de Brassica napus (homólogo del gen COR15 de Arabidopsis). La mayor parte de las plantas transgénicas presentaron un fenotipo de crecimiento normal. Como se esperaba, las plantas transgénicas son más tolerantes a la helada que las plantas tipo salvaje. Usando el ensayo de pérdida de electrolitos de las hojas, el control mostró una pérdida de 50% de -2 a -3ºC. La canola de primavera transformada como CBF1 o CBF2 mostró una pérdida de 30% de -6 a -7ºC. La canola de primavera transformadas con CBF3 mostró una pérdida de 50% de aproximadamente -10 a -15ºC. La canola de invierno transformada con CBF3 puede presentar una pérdida de 50% de aproximadamente -16ºC a -20ºC. Además, si la canola de primavera o invierno se aclimatan al frío, las plantas transformadas pueden presentar una mayor aumento de la tolerancia a la helada de por lo menos -2ºC.

[0324] Para ensayar la tolerancia a la salinidad de las plantas transformadas, las plantas se regaron con NaCl 150 mM. Las plantas que expresaban en exceso CBF1, CBF2 o CBF3 crecieron mejor comparadas con las plantas que no se habían transformado con CBF1, CBF2 o CBF3.

[0325] Estos resultados demuestran que los homólogos de factores de transcripción de Arabidopsis se pueden identificar y se muestra que confieren funciones similares en especies de plantas que no son Arabidopsis.

Ejemplo de referencia XVI: Clonación de promotores de factores de transcripción

[0326] Los promotores se aislaron de genes de factores de transcripción que tienen patrones de expresión de genes útiles para una serie de aplicaciones, determinadas por los procedimientos bien conocidos en la técnica (incluyendo el análisis del perfil de transcritos con micromatrices de ADNc u oligonucleótidos, análisis de transferencia Northern, RT-PCR semicuantitativa o cuantitativa). Se ponen de manifiesto perfiles de expresión de genes interesantes determinando la abundancia de transcritos para un gen de factor de transcripción seleccionado, después de la exposición de las plantas a una serie de condiciones experimentales diferentes, y en una serie de tejidos o tipos de órganos diferentes, o etapas del desarrollo. Las condiciones experimentales a las que se exponen las plantas para este propósito incluyen frío, calor, sequía, estimulación osmótica, concentraciones de hormonas diferentes (ABA, GA, auxina, citoquinina, ácido salicílico, brasinoesteroide), estimulación con patógenos y plagas. Los tipos de tejidos y que etapas del desarrollo incluyen tallo, raíz, flor, hojas en roseta, hojas caulinares, silicuas, semillas en germinación y meristema. El conjunto de niveles de expresión proporciona un patrón que se determina mediante el elemento regulador del promotor génico.

[0327] Los promotores de factores de transcripción para los genes descritos en el presente documento se obtienen mediante clonación de 1,5 kb a 2,0 kb de secuencia genómica inmediatamente en la dirección 5’ del codón de inicio de la traducción para la secuencia codificante de la proteína del factor de transcripción codificado. Esta región incluye la 5’-UTR del gen del factor de transcripción, que puede comprender elementos reguladores. La región de 1,5 kb a 2,0 kb se clona por procedimientos de PCR, usando cebadores que incluyen uno en la dirección 3’ situado en el codón de inicio de la traducción (incluyendo una secuencia adaptadora adecuada), y otro en la dirección 5’ situado a partir de 1,5 kb a 2,0 kb en la dirección 5’ del condón de inicio de la traducción (incluyendo una secuencia adaptadora adecuada). Los fragmentos deseados se amplificaron por la PCR a partir del ADN genómico de Arabidopsis Col-0 usando ADN polimerasa Taq de alta fidelidad para minimizar la incorporación de mutación o mutaciones puntuales. Los cebadores de clonación incorporan dos sitios de restricción raros, tales como NotI y Sfi1, encontrados con frecuencia baja en el genoma de Arabidopsis. Se usan sitios de restricción adicionales en los casos en los que está presente un sitio de restricción NotI o Sfi1 dentro del promotor.

[0328] El fragmento de 1,5-2,0 kb en la dirección 5’ desde el codón de inicio de la traducción, incluyendo la región 5’ no traducida del factor de transcripción, se clona en un vector de transformación binario inmediatamente en la dirección 5’ de un gen indicador adecuado, o un gen transactivador que es capaz de programar la expresión de un gen indicador en una segunda construcción génica. Los genes indicadores usados incluyen la proteína fluorescente verde (y variantes de color de la proteína fluorescente verde), 1-glucuronidasa y luciferasa. Los genes transactivadores adecuados incluyen LexA-GAL4, junto con un indicador transactivable en un segundo plásmido binario (como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. 09/958.131, incorporada en el presente documento por referencia). El o los plásmidos binarios se transfieren a Agrobacterium y la estructura del plásmido se confirma por PCR. Estas cepas se introducen en plantas de Arabidopsis como se describe en otros ejemplos, y los patrones de expresión de genes se determinan de acuerdo con procedimientos estándar conocidos para el experto en la materia, para el seguimiento de la fluorescencia de la GFP, actividad de 1-glucuronidasa, o luminiscencia.

[0329] La región promotora para G1753 se obtiene del clon F1011 (AC006919) del cromosoma 2 de Arabidopsis, gen At2g36450, desde la posición 43906-45410 del clon genómico. El complemento de esta secuencia es el promotor orientado en la dirección 5’-3’, con el codón de inicio de la traducción para G1753 el complemento de las posiciones 43903-43905.

[0330] La presente invención no está limitada por las realizaciones específicas descritas en el presente documento.

LISTADO DE SECUENCIAS

[0331]

<110> Mendel Biotechnology, Inc.

<120> Poinucleótidos y polipéptidos en plantas

<130> AHB/FP6293542

<140> EP 10178358.7

<141> 2003-09-18

<150> EP 03779082.1

<151> 2003-09-18

<150> PCT/US2003/030292

<151> 2003-09-18

<150> US 60/411,837

<151> 2002-09-18

<150> US 60/434,166

<151> 2002-12-17

<150> US 60/465,809

<151> 2003-04-24

<160> 2247

<170> PatentIn version 3.2

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<213> Zea mays

<400> 2198 000

<210> 2199

<211> 0

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2199 000

<210> 2200

<211> 0

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 2200 000

<210> 2201

<211> 0

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2201 000

<210> 2202

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2202 000

<210> 2203

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2203 000

<210> 2204

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2204 000

<210> 2205

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2205 000

<210> 2206

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2206 000

<210> 2207

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2207 000

<210> 2208

<211> 0

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 2208 000

<210> 2209

<211> 0

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2209 000

<210> 2210

<211> 0

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 2210 000

<210> 2211

<211> 0

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2211 000

<210> 2212

<211> 0

<212> ADN

<213> Zea mays

<400> 2212 000

<210> 2213

<211> 0

<212> PRT

<213> Zea mays

<400> 2213 000

<210> 2214

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2214 000

<210> 2215

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2215 000

<210> 2216

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2216 000

<210> 2217

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2217 000

<210> 2218

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2218 000

<210> 2219

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2219 000

<210> 2220

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2220 000

<210> 2221

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2221 000

<210> 2222

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2222 000

<210> 2223

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2223 000

<210> 2224

<211> 0

<212> ADN

<213> Glycine max

<400> 2224 000

<210> 2225

<211> 0

<212> PRT

<213> Glycine max

<400> 2225 000

<210> 2226

<211> 0

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 2226 000

<210> 2227

<211> 0

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2227 000

<210> 2228

<211> 0

<212> ADN

<213> Brassica rapa

<400> 2228 000

<210> 2229

<211> 0

<212> PRT

<213> Brassica rapa

<400> 2229 000

<210> 2230

<211> 0

<212> ADN

<213> Brassica oleracea

<400> 2230 000

<210> 2231

<211> 0

<212> PRT

<213> Brassica oleracea

<400> 2231 000

<210> 2232

<211> 0

<212> ADN

<213> zinnia elegans

<400> 2232 000

<210> 2233

<211> 0

<212> PRT

<213> zinnia elegans

<400> 2233 000

<210> 2234

<211> 0

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 2234 000

<210> 2235

<211> 0

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2235 000

<210> 2236

<211> 0

<212> ADN

<213> Oryza sativa

<400> 2236 000

<210> 2237

<211> 0

<212> PRT

<213> Oryza sativa

<400> 2237 000

<210> 2238

<211> 929

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2238

<210> 2239

<211> 213

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2239 <210> 2240

<211> 803

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2240 <210> 2241

<211> 207

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400> 2241 <210> 2242

<211> 908

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<221> misc_feature

<222> (851)..(851)

<223> n es a, c, g, o t

<400> 2242 <210> 2243

<211> 216

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<400>

2243

<400>

2244

<210> 2245

<211> 208

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 2245

<210> 2246

<211> 20

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(18)

<223> y = c o t; n = a, c g o t; h = a, c o t; m = a o c

<400> 2246 cayccnatht aymgnggngt 20

<210> 2247

<211> 21

<212> ADN

<213> secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia artificial

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(18)

<223> y = c o t; n = a, c g o t; h = a, c o t; m = a o c; r = a o g

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(18)

<223> y = c o t; n = a, c g o t; h = a, c o t; m = a o c; r = a o g

<400> 2247 ggnarnarca tnccytcngc c 21

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Planta transgénica que sobreexpresa un polinucleótido recombinante, en la que dicha planta transgénica tiene una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o planta de tipo salvaje, en la que el polinucleótido codifica recombinante codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de SEQ ID No: 328, proporcionando dicho polipéptido una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido.

2. 2.

   Planta transgénica según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende un dominio conservado que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el dominio conservado de residuos 5-50 del polipéptido de SEQ ID NO:328.

3. 3.

   Planta transgénica según la reivindicación 1, en la que dicho polipéptido comprende SEQ ID NO:328.

4. 4.

   Planta transgénica según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que el polinucleótido recombinante comprende un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido unido operativamente a dicha secuencia de polinucleótido.

5. 5.

   Célula vegetal huésped cultivada que comprende un cassette de expresión que sobreexpresa un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido, en la que dicho polipéptido es tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

6. 6.

   Planta transgénica según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha planta comprende hipocótilos más largos y peciolos alargados en comparación con una planta no transgénica o una planta de tipo salvaje.

7. 7.

   Planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la planta transgénica se selecciona del grupo que consiste en: soja, patata, algodón, colza oleaginosa, canola, girasol, alfalfa, trébol, plátano, mora, arándano, fresa, frambuesa, cantalupo, zanahoria, coliflor, café, pepino, berenjena, uvas, melón dulce, lechuga, mango, melón, cebolla, papaya, guisantes, pimientos, piña, calabaza, espinaca, calabacín, tabaco, tomate, tomatillo, sandía, frutas rosáceas, árboles frutales, crucíferas, cebada; trigo, maíz, máiz dulce, arroz, centeno; caña de azúcar, césped; mijo; sorgo; grosella; aguacate; cítricos, naranjas, limones, pomelo, mandarinas, alcachofa, cerezas; nuez, cacahuete; endibia; puerro; arrurruz, remolacha, mandioca, nabo, rábano, batata, boniato; judías, pino, álamo, eucalipto y menta.

8. 8.

   Parte de planta de la planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 7, que comprende un cassette de expresión que comprende el polinucleótido recombinante, en la que la parte de planta se selecciona entre fruto, hoja, raíz, tejido vegetal incluyendo tejido vascular o fundamental, o células vegetales.

9. 9.

   Semilla de la planta transgénica según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 7, en la que dicha semilla comprende un cassette de expresión que comprende el polinucleótido recombinante.

10. 10.

    Proceso para producir una planta transgénica según las reivindicaciones anteriores, comprendiendo el proceso las etapas de:

    (a)

    producir un cassette de expresión que comprende un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de la SEQ ID NO:328;

    (b)

    introducir el cassette de expresión en la planta; y

    (c)

    identificar y seleccionar una planta con producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o una planta de tipo salvaje.

11. 11. Proceso para producir una planta transgénica que tiene el rasgo alterado de la producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o una planta de tipo salvaje, comprendiendo el proceso las etapas de:

    (a)

    proporcionar un vector de expresión que comprende:

    (i)

    un polinucleótido recombinante que el polinucleótido recombinante codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de SEQ ID NO:328; y

    (ii)

    por lo menos un elemento regulador que flanquea la secuencia de polinucleótido, siendo dicho por lo menos un elemento regulador efectivo en el control de la expresión de dicho polinucleótido recombinante en una planta diana;

    (b)

    introducir el vector de expresión en una célula vegetal, produciendo así una célula vegetal transgénica;

    (c)

    crecer la célula vegetal transgénica en una planta transgénica y permitir que la planta transgénica sobreexprese un polipéptido codificado por el polinucleótido recombinante, teniendo dicho polipéptido la propiedad de producción mejorada en una planta en comparación con una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido; y

    (d)

    identificar por lo menos una planta transgénica con dicha producción mejorada mediante la comparación de dicha planta transgénica con por lo menos una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido.

12. 12.

    Proceso según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho polipéptido comprende un dominio conservado que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el dominio conservado de residuos 5-50 del polipéptido de SEQ ID NO:328.

13. 13.

    Proceso según la reivindicación 10 u 11, en el que dicho polipéptido comprende SEQ ID NO:328.

14. 14.

    Utilización de un polinucleótido recombinante que el polinucleótido recombinante codifica un polipéptido que tiene por lo menos un 95% de identidad en la secuencia de aminoácidos sobre la longitud completa de SEQ ID NO:328, para producir una planta transgénica que tiene una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica o una planta de tipo salvaje, proporcionando dicho polipéptido una producción mejorada en comparación con una planta no transgénica que no sobreexpresa el polipéptido.

15. 15.

    Utilización según la reivindicación 14, en la que dicho polipéptido comprende un dominio conservado que tiene por lo menos un 80% de identidad en la secuencia con el dominio conservado de residuos 5-50 del polipéptido de SEQ ID NO:328.

16. 16.

    Utilización según la reivindicación 15, en la que dicho polipéptido comprende SEQ ID NO:328.

17. 17.

    Utilización según la reivindicación 14 or 15, en la que el polinucleótido comprende un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido unido operativamente a dicha secuencia de polinucleótido.