ES2361749T3 - Reguladores transcripcionales de plantas. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para producir una planta transgénica que tiene mayor tolerancia a la falta de agua que una planta de control, comprendiendo el procedimiento las etapas de: (a) producir un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12; en el que el polipéptido tiene una propiedad de la SEQ ID NO: 12 de aumentar la tolerancia a la falta de agua en una planta con respecto a la planta de control; y (b) introducir el vector de expresión en una planta objetivo para producir una planta transgénica; en el que el polipéptido es expresado en exceso en la planta transgénica y dicho exceso de expresión da como resultado que la planta transgénica tiene una mayor tolerancia a la falta de agua que la planta de control.

Description

Campo de la invención

[0001] La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para modificar el fenotipo de una planta, para proporcionar una mayor tolerancia a la sequía.

Antecedentes de la invención

[0002] Control de procesos celulares por factores de transcripción. Los estudios de una diversidad de organismos procariotas y eucariotas sugieren una evolución gradual de los mecanismos bioquímicos y fisiológicos y de las rutas metabólicas. A pesar de diferentes presiones evolutivas, las proteínas que regulan el ciclo celular en levaduras, plantas, nematodos, moscas, ratas y el hombre, tienen características químicas o estructurales comunes y modulan la misma actividad celular general. Una comparación de secuencias de genes con estructura y/o función conocidas de una especie de planta, por ejemplo, Arabidopsis thaliana, con las de otras plantas, permite a los investigadores desarrollar modelos para manipular los rasgos de una planta y desarrollar variedades con propiedades valiosas.

[0003] Los rasgos de una planta se pueden controlar mediante una serie de procesos celulares. Una forma importante de manipular este control es mediante factores de transcripción, proteínas que influyen en la expresión de un gen o conjunto de genes particulares. Debido a que los factores de transcripción son elementos de control clave de las rutas biológicas, la alteración de los niveles de expresión de uno o más factores de transcripción puede cambiar las rutas biológicas enteras en un organismo. Las estrategias para manipular las características bioquímicas, de desarrollo o fenotípicas de una planta alterando la expresión de un factor de transcripción puede producir plantas y cultivos con propiedades nuevas y/o mejoradas comercialmente valiosas, incluyendo rasgos que mejoran el rendimiento o la supervivencia y el rendimiento durante periodos de estrés abiótico, mejoran la tolerancia a la sombra, o alteran la detección de la planta de su equilibrio de carbono/nitrógeno.

[0004] Problemas asociados con la falta de agua. En el entorno natural, las plantas a menudo crecen en condiciones que no son favorables, tales como sequía (poca disponibilidad de agua), alta salinidad, frío, heladas, o alta temperatura. Cualquiera de estos estreses abióticos puede retrasar el crecimiento y el desarrollo, reducir la productividad y en casos extremos, producir la muerte de la planta. De estos estreses, la poca disponibilidad de agua, que en una forma drástica se denomina una sequía, es un factor principal en la reducción del rendimiento de los cultivos en el mundo. Los problemas para las plantas producidos por la baja disponibilidad de agua incluyen estreses mecánicos causados por la extracción de agua celular. La sequía también provoca que las plantas se vuelvan más susceptibles a diferentes enfermedades (Simpson, ed. (1981) "The Value of Physiological Knowledge of Water Stress in Plants", en Water Stress on Plants, Praeger, NY, pág. 235-265).

[0005] Además de las muchas regiones en el mundo que son demasiado áridas para la mayoría si no para todas las plantas de cultivo, el uso excesivo del agua disponible está produciendo una mayor pérdida del suelo que se puede usar en agricultura, un proceso que, en el extremo, da como resultado la desertificación. El problema se combina además con la acumulación creciente de sal en los suelos, lo cual se añade a la pérdida de agua disponible en los suelos.

[0006] La falta de agua es un componente común de los estreses de muchas plantas. La falta de agua se produce en las células de las plantas cuando la velocidad de transpiración de la planta entera supera la absorción de agua. Además de la sequía, otros estreses tales como la salinidad y la baja temperatura, producen la deshidratación celular (McCue y Hanson (1990) Trends Biotechnol. 8: 358-362).

[0007] La transducción de señales del estrés salino y por sequía incluye las rutas de señalización de la homeostasis iónica y osmótica. El aspecto iónico del estrés salino es señalizado por la ruta de SOS en la que un complejo de proteína quinasas SOS3-SOS2 sensible a calcio controla la expresión y la actividad de los transportadores de iones tales como SOS1. La ruta que regula la homeostasis iónica en respuesta al estrés salino se ha descrito recientemente por Xiong y Zhu (2002) Plant Cell Environ. 25: 131-139 y Ohta y col. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11771-11776.

[0008] El componente osmótico del estrés salino implica reacciones complejas de la planta que se solapan con respuestas al estrés por sequía y/o baja temperatura.

[0009] Recientemente se han revisado aspectos comunes de las respuestas al estrés por sequía, frío y salino por Xiong y Zhu (2002), véase antes. Estos incluyen

(a)

cambios transitorios en los niveles citoplasmáticos de calcio muy pronto en el suceso de señalización (Knight, (2000) Int. Rev. Cytol. 195: 269-324; Sanders y col. (1999) Plant. Cell 11: 691706);

(b)

transducción de señales a través de proteína quinasas (CDPKs; Xiong y Zhu (2002) véase antes) y proteína fosfatasas (Merlot y col. (2001) Plant J. 25: 295-303; Tahtiharju y Palva (2001) Plant J. 26: 461-470) activadas por mitógenos y/o dependientes de calcio;

(c)

aumento en los niveles de ácido abscísico (ABA) en respuesta al estrés desencadenando un subconjunto de respuestas (Xiong y Zhu (2002); véase antes, y referencias citadas en el mismo);

(d)

fosfatos de inositol como moléculas señal (al menos para un subconjunto de cambios transcripcionales de respuesta al estrés (Xiong y col. (2001) Genes Dev. 15: 1971-1984);

(e)

activación de fosfolipasas que a su vez genera un conjunto diverso de moléculas de segundo mensajero, algunas de las cuales pueden regular la actividad de las quinasas sensibles al estrés (la fosfolipasa D funciona en una ruta independiente del ABA Frank y col. (2000) Plant Cell 12:111-124);

(f)

inducción de genes de tipo de embriogénesis tardía abundantes (LEA) incluyendo genes COR/RD sensibles a CRT/DRE (Xiong y Zhu (2002) véase antes);

(g)

mayores niveles de antioxidantes y osmolitos compatibles tales como prolina y azúcares solubles (Hasegawa y col. (2000) Annu. Rev Plant Mol. Plant Physiol. 51: 463-499); y

(h)

acumulación de especies de oxígeno reactivas tales como superóxido, peróxido de hidrógeno y radicales hidróxido (Hasegawa y col. (2000) véase antes).

[0010] La biosíntesis del ácido abscísico se regula mediante el estrés osmótico en múltiples puntos. La señalización del estrés osmótico tanto dependiente como independiente de ABA modifica primero los factores de transcripción expresados de forma constitutiva, conduciendo a la expresión de activadores transcripcionales de respuesta temprana, que después activan activadores transcripcionales en dirección 3’ y genes efectores de la tolerancia al estrés.

[0011] Basándose en la concordancia de muchos aspectos de las respuestas al estrés por temperatura baja, sequía y salino, se puede concluir que los genes que aumentan la tolerancia al estrés por temperatura baja o salinidad también pueden mejorar la protección frente al estrés por sequía. De hecho, esto ya se ha demostrado para factores de transcripción, como es el caso de AtCBF/DREB 1, y para otros genes tales como OsCDPK7 (Saijo y col. (2000) Plant J. 23: 319-327) o AVP1 (una bomba vacuolar de pirofosfatasa-protones, Gaxiola y col. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11444-11449).

Resumen de la invención

[0012] El presente procedimiento se dirige a polinucleótidos recombinantes que confieren tolerancia al estrés abiótico en plantas cuando se altera la expresión de cualquiera de estos polinucleótidos recombinantes (p. ej., por exceso de expresión). Las secuencias relacionadas que se describen en el presente documento incluyen secuencias de nucleótidos que hibridan con el complemento de las secuencias de la invención en condiciones restrictivas. Un ejemplo de condiciones rigurosas que definen la invención incluye un procedimiento de hibridación que incorpora dos etapas de lavado de 6x SSC y 65ºC, siendo cada etapa de 10-30 minutos de duración. Por ejemplo, G2133 (polinucleótido de la SEQ ID NO: 11 y polipéptido de la SEQ ID NO: 12) confiere tolerancia a la sequía, cuando éste polipéptido es expresado en exceso en plantas. Por lo tanto, la invención incluye el uso del polinucleótido y polipéptido G2133, así como de las secuencias de nucleótidos que son estructuralmente similares en cuanto que estas o su complemento hibridan con la SEQ ID NO: 11 en condiciones de hibridación restrictivas

[0013] En particular, la invención proporciona un procedimiento para producir una planta transgénica que tiene una mayor tolerancia a la falta de agua que una planta de control, comprendiendo el procedimiento las etapas de (a) producir un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12; en el que el polipéptido tiene la propiedad de la SEQ ID NO: 12 de aumentar la tolerancia a la falta de agua en una planta con respecto a la planta de control; y (b) introducir el vector de expresión en una planta objetivo para producir una planta transgénica; en el que el polipéptido es expresado en exceso en la planta transgénica y dicho exceso de expresión da como resultado que la planta transgénica tiene una mayor tolerancia a la falta de agua que la planta de control.

[0014] La invención proporciona además una semilla transgénica que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de los aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12 producido por una planta transgénica producida por cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una planta descendiente que ha crecido a partir de la semilla transgénica tiene una tolerancia mayor a la sequía con respecto a una planta de control; y en el que dicha secuencia está operativamente unida a un promotor que es inducible en respuesta al estrés por calor, sequía u osmótico, así como una semilla, fruta, hoja, raíz o descendiente de una planta que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12; en el que el polipéptido tiene la propiedad de la SEQ ID NO:12 de aumentar la tolerancia a la falta de agua en una planta con respecto a la planta de control, que se puede obtener por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha planta, semilla, fruta, hoja, raíz, célula vegetal o descendiente tiene una mayor tolerancia a la falta de agua que la planta de control, y en el que dicha secuencia está operativamente unida a un promotor que es inducible en respuesta al estrés por calor o sequía.

[0015] La invención proporciona además, el uso de un vector de expresión para producir una planta transgénica que tiene una mayor tolerancia a la falta de agua con respecto a una planta de control, en el que el vector de expresión codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12.

[0016] La invención también se refiere a un procedimiento para producir una planta transgénica que tiene una mayor tolerancia a la sequía. Las etapas de este procedimiento incluyen primero proporcionar un vector de expresión que contiene una secuencia de nucleótidos que hibrida con el complemento de un polinucleótido de la invención en condiciones de hibridación restrictivas. El vector de expresión después se introduce en una célula de planta, la célula de planta se cultiva y a partir de esta se genera una planta. Debido a la presencia del vector de expresión en la planta, el polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos es expresado en exceso. Este polipéptido tiene la propiedad de regular la sequía en una planta, comparado con una planta de control que no expresa en exceso el polipéptido. Después de producir la planta transgénica tolerante a la sequía, se puede identificar comparándola con una o más plantas no transformadas que no expresan en exceso el polipéptido. Estas etapas del procedimiento pueden incluir además la autofecundación o cruce de la planta tolerante al estrés abiótico consigo misma o con otra planta, respectivamente, para producir la semilla. La "autofecundación" se refiere a la autopolinización, o el uso de polen de una planta para fertilizar la misma planta u otra planta en la misma línea, mientras que " cruzamiento" en general se refiere a la polinización cruzada con una planta de una línea diferente, tal como una planta silvestre o no transformada, u otra planta transformada de una línea transgénica de plantas diferentes. El cruzamiento proporciona la ventaja de poder producir nuevas variedades. La semilla resultante después se puede usar para cultivar una planta descendiente que es transgénica y tiene una mayor tolerancia al estrés abiótico.

[0017] Por lo tanto, en el presente documento se describe un procedimiento para aumentar la tolerancia de una planta a la sequía. Este procedimiento incluye proporcionar primero un vector que comprende (i) elementos reguladores eficaces en el control de la expresión de una secuencia de polinucleótido en una planta diana, en el que los elementos reguladores flanquean la secuencia de polinucleótido; y (ii) las propias secuencias de polinucleótidos que codifican un polipéptido que tiene la capacidad de regular la tolerancia a la sequía en una planta, cuando se compara con una planta de control de la misma especie que no expresa en exceso el polipéptido. La planta se transforma con el vector con el fin de generar una planta transformada con una mayor tolerancia a la sequía.

Breve descripción de la lista de secuencias y las figuras

[0018] La lista de secuencias proporciona secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de ejemplo de la invención. Las características asociadas con el uso de las secuencias están incluidas en los ejemplos.

[0019] CD-ROM1 y CD-ROM2 son discos compactos de memoria de solo lectura legibles en el ordenador. El contenido de cada CD es idéntico, y cada uno contiene una copia de la Lista de Secuencias en formato de texto ASCII. La lista de secuencias se denomina "MBI0058PCT.ST25.txt" y tiene un tamaño de 2004 kilobytes. Las copias de la Lista de Secuencias en los discos de CD-ROM se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

La figura 1 muestra una evaluación conservativa de relaciones filogenéticas entre las órdenes de plantas con flores (modificado de Angiosperm Phylogeny Group (1998) Ann. Missouri Bot. Gard. 84: 1-49). Las plantas con un solo cotiledón (monocotiledóneas) son un clado monofilético anidado dentro de al menos dos linajes principales de dicotiledóneas; las eudicotiledóneas se dividen además en rósidas y astérides. Arabidopsis es una eucotiledónea rósida dentro del orden de las brasicáceas; el arroz es un miembro de las monocotiledóneas del orden poales. La figura 1 se ha adaptado de Daly y col. (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333.

La figura 2 muestra un dendograma filogenético que representa las relaciones de la taxonomía de las plantas superiores, incluyendo clados que contienen el tomate y Arabidopsis, adaptado de Ku y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 9121-9126; y Chase y col. (1993) Ann. Missouri Bot. Gard. 80: 528-580.

La figura 3 es un alineamiento múltiple de secuencias de aminoácidos dentro del dominio AP2 de G47, G2133 y sus ortólogos. Los ortólogos y parálogos del clado se indican mediante la barra negra en el lado izquierdo de la figura. De las secuencias examinadas hasta la fecha, se encontró que había dos restos de valina presentes en los miembros del clado G47 pero no fuera del clado (flechas). Los restos que se pueden usar para identificar un miembro del clado G47 se indican mediante los restos mostrados en las cajas en la figura 3.

La figura 4 ilustra la relación de G47 y secuencias relacionadas en este árbol filogenético del clado G47 y secuencias similares. El procedimiento de construcción del árbol usado fue la “Unión de vecinos” con “muerte rápida sistemática” y Boodtstrapping con 1000 réplicas (no corregido (“p”), con huecos distribuidos de forma proporcional). Se usaron polipéptidos de longitud entera para construir la filogenia como se define en la figura 4. Se predice que los miembros del clado mostrados dentro de la caja contienen homólogos funcionales de G47. Abreviaturas: At Arabidopsis thaliana; Os Oryza sativa; Zm Zea mays; Gm Glycine max; Mt Medicago trincatula; Br Brassica rapa; Bo Brassica oleracea; Ze; Zinnia elegans.

Las figuras 5A y 5B comparan la recuperación de un tratamiento de sequía de controles silvestres y dos líneas de plantas Arabidopsis que expresan en exceso G2133, un parálogo de G47. Las figuras 5A y 5B muestran dos líneas de plantas 35S::G2133 (una línea en cada figura) en la maceta a la izquierda de cada figura y plantas de control a la derecha en cada figura. Cada maceta contenía varias plantas cultivadas con 24 h de luz. Se privó a todas de agua durante 8 días, y se muestran después de volver a regarlas. Todas las plantas de las líneas que expresaban en exceso G2133 se recuperaron, y todas las plantas de control murieron o estaban adversa y gravemente afectadas por el tratamiento de la sequía.

Descripción detallada de las realizaciones específicas

[0020] Los datos presentados en el presente documento representan los resultados de un cribado de una colección de factores de transcripción para identificar genes que se pueden aplicar para reducir las pérdidas de rendimiento que se producen por respuestas a la falta de nutrientes, estrés relacionado con la sequía y/o evitación de sombra.

[0021] Los autores de la invención han identificado numerosos genes de factores de transcripción que confieren una mayor tolerancia a la sequía con respecto a las plantas silvestres cuando se altera su expresión, tal como por un exceso de expresión o inactivación del gen en plantas transgénicas. Por lo tanto, la presente invención se dirige en parte a polinucleótidos recombinantes que confieren tolerancia al estrés relacionado con la sequía, a las plantas cuando se altera la expresión de los polinucleótidos recombinantes de la invención (p. ej., por exceso de expresión). En los presentes estudios, se llevaron a cabo ensayos basados en el suelo en los que primero se priva de agua a las plantas transgénicas, se evalúan por comparación con plantas de control, se vuelven a regar, y se evalúa también su recuperación en comparación con las plantas de control tratadas de forma similar.

[0022] Se llevó a cabo un segundo cribado en el que 2 o 3 líneas individuales de expresión en exceso (o un lote de semillas homocigotas diferentes, en el caso de líneas con genes inactivados) se volvieron a probar en el ensayo. A las líneas transgénicas individuales que mostraron fenotipos destacados en este segundo ciclo de ensayos se les dio una clasificación prioritaria “A”. El conjunto de secuencias a las que se asignó una clasificación de prioridad “B” en la tabla de resultados debían confirmarse todavía en un segundo ensayo o no tenían un fenotipo destacado.

[0023] La presente invención se refiere en parte a polinucleótidos y polipéptidos, por ejemplo, para modificar fenotipos de plantas, en particular los asociados con la mejora del estrés por sequía. A lo largo de toda esta descripción, se hace referencia a diferentes fuentes de información. Las fuentes de información incluyen artículos de revistas científicas, documentos de patentes, libros de texto, y direcciones de páginas inactivas del explorador de la Red. La referencia a estas fuentes de información indican claramente que las puede usar el experto en la materia. Se puede contar con y usar los contenidos y las enseñanzas de todas y cada una de las fuentes de información para hacer y usar las realizaciones de la invención.

[0024] Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen las referencias plurales salvo que se indique de otra forma claramente en el contexto. Por lo tanto, por ejemplo, una referencia a “una planta” incluye una pluralidad de dichas plantas, y una referencia a “un estrés” es una referencia a uno o más estreses y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la materia, etc.

Definiciones

[0025] “Molécula de ácido nucleico” se refiere a un oligonucleótido, polinucleótido o cualquier fragmento de los mismos. Puede ser ADN o ARN de origen genómico o sintético, de doble cadena o una cadena, y combinado con hidratos de carbono, lípidos, proteínas u otros materiales para llevar a cabo una actividad particular tal como transformación o formación de una composición útil tal como un ácido nucleico peptídico (PNA).

[0026] “Polinucleótido” es una molécula de ácido nucleico que comprende una pluralidad de nucleótidos polimerizados, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 o más nucleótidos polimerizados consecutivos. Un polinucleótido puede ser un ácido nucleico, oligonucleótido, nucleótido o cualquier fragmento de los mismos. En muchos casos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (o proteína) o un dominio o fragmento del mismo. Además, el polinucleótido puede comprender un promotor, un intrón, una región potenciadora, un sitio de poliadenilación, un sitio de inicio de la traducción, regiones 5’ o 3’ no traducidas, un gen indicador, un marcador seleccionable, o similares. El polinucleótido puede ser ADN o ARN de una cadena o de doble cadena. El polinucleótido comprende opcionalmente bases modificadas o una cadena principal modificada. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN o ARN genómico, un transcrito (tal como un ARNm), un ADNc, un producto de la PCR, un ADN clonado, un ADN o ARN sintético, o similares. El polinucleótido puede estar combinado con hidratos de carbono, lípidos, proteínas u otros materiales para realizar una actividad particular tal como una transformación o formar una composición útil tal como un ácido nucleico-peptídico (PNA). El polinucleótido puede comprender una secuencia en orientación de sentido directo o sentido contrario. “Oligonucleótido” es sustancialmente equivalente a los términos amplímero, cebador, oligómero, elemento, diana y sonda y es preferiblemente monocatenario.

[0027] “Gen” o “secuencia génica” se refiere a la secuencia codificante parcial o completa de un gen, su complemento y sus regiones 5’ o 3’ no traducidas. Un gen también es una unidad funcional de herencia, y en términos físicos es un segmento o secuencia particular de nucleótidos a lo largo de una molécula de ADN (o ARN, en el caso de virus de ARN) implicada en la producción de una cadena de polipéptido. Esta última se puede someter a un procesamiento posterior tal como modificación química, corte y empalme, y plegado para obtener una proteína

o polipéptido funcional. Un gen se puede aislar parcialmente o puede encontrarse con un genoma del organismo. A modo de ejemplo, un gen de un factor de transcripción codifica un polipéptido de factor de transcripción, que puede ser funcional o requiere procesamiento para funcionar como un iniciador de la transcripción.

[0028] Desde un punto de vista operativo, los genes se pueden definir por el ensayo cis-trans, un ensayo genético que determina si hay dos mutaciones en el mismo gen y esto se puede usar para determinar los límites de la unidad genéticamente activa (Rieger y col. (1976) “Glossary of Genetics and Cytogenetics: Classical and Molecular”, 4ª ed., Springer Verlag. Berlín). Un gen en general incluye regiones que preceden (“líderes”; en la dirección 5’) y que siguen (“remolques”; dirección 3’) a la región codificante. Un gen puede incluir también secuencias no codificantes, intercaladas, denominadas “intrones” localizadas entre segmentos codificantes individuales denominados “exones”. La mayoría de los genes tienen una región promotora asociada, una secuencia 5’ reguladora del codón de inicio de la transcripción (hay algunos genes que no tienen un promotor identificable). La función de un gen también puede ser regulada por potenciadores, operadores y otros elementos reguladores.

[0029] “Un polinucleótido recombinante” es un polinucleótido que no está en su estado natural, por ejemplo, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que no se encuentra en la naturaleza, o el polinucleótido está en un contexto distinto del que se encuentra de forma natural, por ejemplo, separado de secuencias de nucleótidos de las que normalmente está próximo en la naturaleza, o secuencias de nucleótidos adyacentes (o contiguas) con las que normalmente no está próximo. Por ejemplo, la secuencia en cuestión se puede clonar en un vector, o recombinar de otra forma con uno o más ácidos nucleicos adicionales.

[0030] Un “polinucleótido aislado” es un polinucleótido, sea natural o recombinante, que está presente fuera de la célula en la que normalmente se encuentra en la naturaleza, sea purificado o no. Opcionalmente, un polinucleótido aislado se somete a uno o más procedimientos de enriquecimiento o purificación, por ejemplo, lisis celular, extracción, centrifugación, precipitación, o similares.

[0031] Un “polipéptido” es una secuencia de aminoácidos que comprende una pluralidad de restos de aminoácidos polimerizados consecutivos, por ejemplo, al menos aproximadamente 15 restos de aminoácidos polimerizados consecutivos. En muchos casos, un polipéptido comprende una secuencia de restos de aminoácidos polimerizados que es un factor de transcripción o un dominio o parte o un fragmento del mismo. Además, el polipéptido puede comprender: (i) un dominio de localización; (ii) un dominio de activación; (iii) un dominio de represión; (iv) un dominio de oligomerización; o (v) un dominio de unión a ADN, o similares. El polipéptido comprende opcionalmente restos de aminoácidos modificados, restos de aminoácidos naturales que no codifican un codón, o restos de aminoácidos no naturales.

[0032] “Proteína” se refiere a una secuencia de aminoácidos, oligopéptido, péptido, polipéptido o partes de los mismos sean naturales o sintéticos.

[0033] “Parte”, como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier parte de una proteína usada para cualquier propósito, pero en especial para el cribado de una biblioteca de moléculas que se unen específicamente a esa parte o para la producción de anticuerpos.

[0034] Un “polipéptido recombinante” es un polipéptido producido por la traducción de un polinucleótido recombinante. Un “polipéptido sintético” es un polipéptido creado por polimerización consecutiva de restos de aminoácidos aislados usando procedimientos conocidos en la técnica. Un “polipéptido aislado”, sea un polipéptido natural o recombinante, está más enriquecido en (o fuera de) una célula que el polipéptido en su estado natural en una célula salvaje, por ejemplo enriquecido en más de aproximadamente 5%, o al menos 105% con respecto al tipo salvaje normalizado a 100%. Dicho enriquecimiento no es el resultado de una respuesta natural de una planta silvestre. Alternativa o adicionalmente, el polipéptido aislado se separa de otros componentes celulares con los que está normalmente asociado, por ejemplo, por cualquiera de los diferentes procedimientos de purificación de proteínas del presente documento.

[0035] “Homología” se refiere a la similitud de secuencia entre una secuencia de referencia y al menos un fragmento de un inserto de clon secuenciado nuevo o su secuencia de aminoácidos codificada. Además, las expresiones “homología” y “secuencia(s) homóloga(s)” se pueden referir a una o más secuencias de polipéptidos que se modifican por medios químicos o enzimáticos. La secuencia homóloga puede ser una secuencia modificada por lípidos, azúcares, péptidos, compuestos orgánicos o inorgánicos, usando aminoácidos modificados o similares. Las técnicas de modificación de proteínas se ilustran en Ausubel y col. (eds) “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons (1998).

[0036] “Identidad” o “similitud” se refieren a la similitud de secuencias entre dos secuencias de polinucleótidos

o entre dos secuencias de polipéptidos, siendo la identidad la comparación más rigurosa. Las frases “porcentaje de identidad” y “% de identidad” se refieren al porcentaje de similitud de secuencia encontrado en una comparación de dos o más secuencias de polinucleótidos o dos o más secuencias de polipéptidos. “Similitud de secuencia” se refiere al porcentaje de similitud en la secuencia de pares de bases (determinado por cualquier método adecuado) entre dos o más secuencias de polinucleótidos. Dos o más secuencias pueden tener una similitud en cualquier punto de 0100%, o cualquier valor entero entre estos. La identidad o similitud se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se pueden alinear para los propósitos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base de nucleótido o aminoácido, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El grado de similitud o identidad entre secuencias de polinucleótidos es una función del número de emparejamientos idénticos de nucleótidos correspondientes en posiciones compartidas por las secuencias de polinucleótidos. El grado de identidad de una secuencia de polipéptido es una función del número de aminoácidos idénticos en las posiciones correspondientes compartidas por las secuencias de polipéptidos. El grado de homología

o similitud de secuencias de polipéptidos es una función del número de aminoácidos en las posiciones correspondientes compartidas por las secuencias de polipéptidos.

[0037] Con respecto a los polipéptidos, las expresiones “identidad sustancial” o “sustancialmente idénticos” puede referirse a secuencias de suficiente similitud y estructura con los factores de transcripción de la Lista de Secuencias para producir una función similar cuando son expresadas o expresadas en exceso en una planta; en la presente invención esta función es la detección del C/N alterado o una mayor tolerancia a la sequía o la sombra. Las secuencias que son al menos aproximadamente 50% idénticas, y preferiblemente al menos 82% idénticas con las presentes secuencias de polipéptidos se considera que tienen una “identidad sustancial” con estas últimas. Las secuencias que tienen grados de identidad menores pero actividad biológica comparable se considera que son equivalentes. La estructura necesaria para mantener la funcionalidad adecuada está relacionada con la estructura terciaria del polipéptido. Hay dominios y patrones discretos dentro de un factor de transcripción que deben estar presentes en el polipéptido para conferir la función y especificidad. Estas estructuras específicas son necesarias de modo que las secuencias interactivas se orientarán de forma adecuada para retener la actividad deseada. Por lo tanto, la “identidad sustancial” también se puede usar con respecto a subsecuencias, por ejemplo, patrones, que tienen una estructura y similitud suficientes, que son al menos aproximadamente 50% idénticas, y preferiblemente al menos 82% idénticas, con patrones similares en otras secuencias relacionadas, de modo que cada una confiere o es necesaria para la detección del C/N alterado o la mayor tolerancia a la sequía o la sombra.

[0038] La expresión “patrón consenso de aminoácidos” se refiere a la parte o a la subsecuencia de una secuencia de polipéptido que está sustancialmente conservada entre los factores de transcripción polipeptídicos listados en la Lista de Secuencias.

[0039] “Alineamiento” se refiere a una serie de secuencias de nucleótidos o restos de aminoácidos alineadas para la comparación longitudinalmente de modo que los componentes comunes (es decir bases de nucleótidos o restos de aminoácidos) se pueden identificar de forma visual y fácil. La fracción o porcentaje de componentes en común está relacionada con la homología o identidad entre las secuencias. Los alineamientos como los encontrados en las figuras se pueden usar para identificar dominios conservados y relacionados dentro de estos dominios. Un alineamiento se puede determinar de forma adecuada mediante programas de ordenador conocidos en la técnica, tales como MacVector (1999) (Accelrys, Inc., San Diego, CA).

[0040] Un “dominio conservado” o “región conservada” como se usa en el presente documento, se refiere a una región en secuencias de polinucleótidos o polipéptidos heterólogas en la que hay un grado de identidad de secuencia relativamente alto entre las distintas secuencias. Los dominios AP2 son ejemplos de dominios conservados.

[0041] Con respecto a los polinucleótidos que codifican los presentes factores de transcripción descritos, un dominio conservado preferiblemente tiene al menos 10 pares de bases (pb) de longitud.

[0042] Un “dominio conservado”, con respecto a los presentes polipéptidos descritos se refiere a un dominio dentro de un familia de los factores de transcripción que presenta un grado de homología de secuencia superior, tal como al menos 70% de similitud de secuencia, incluyendo sustituciones conservativas, y más preferiblemente al menos 79% de identidad de secuencia, e incluso más preferiblemente al menos 81%, o al menos aproximadamente 86%, o al menos aproximadamente 89%, o al menos aproximadamente 91%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de los restos de aminoácidos respecto al dominio conservado. La invención también abarca las secuencias que tienen o codifican dominios conservados que están de forma reconocible dentro de un clado dado de polipéptidos de factores de transcripción y que tienen una actividad biológica comparable con las secuencias de esta invención. Un fragmento o dominio puede denominarse fuera de un dominio conservado, fuera de una secuencia consenso o fuera de un sitio de unión al ADN consenso, cuando se sabe que existen o que existe para una clase, familia o su familia de factores de transcripción particulares. En este caso, el fragmento o dominio no incluirá los aminoácidos exactos de una secuencia consenso o sitio de unión al ADN consenso de una clase, familia o subfamilia de factores de transcripción, o los aminoácidos exactos de una secuencia consenso o sitio de unión al ADN consenso de factor de transcripción particular. Además, un fragmento, región o dominio particular de un polipéptido, o un polinucleótido que codifica un polipéptido, puede estar “fuera de un dominio conservado” si todos los aminoácidos del fragmento, región o dominio están fuera de un dominio o dominios conservados definidos para un polipéptido o proteína. Las secuencias que tienen un grado de identidad menor pero actividad biológica comparable se considera que son equivalentes.

[0043] Como reconoce un experto en la materia, los dominios conservados se pueden identificar como regiones o dominios de identidad respecto a una secuencia consenso específica (por ejemplo, Riechmann y col. (2000) véase antes). Por lo tanto, usando los procedimientos de alineamiento conocidos en la técnica, se pueden determinar los dominios conservados de los factores de transcripción de plantas AP2.

[0044] Los dominios conservados para una serie de las secuencias que confieren tolerancia a la sequía y detección del C/N alterado, se encuentran en las tablas 1 y 3, respectivamente. Una comparación de las regiones de los polipéptidos en las tablas 1 o 3 permite al experto en la materia identificar dominios conservados para cualquiera de los polipéptidos listados o a los que se hace referencia en esta descripción.

[0045] “Complementaria” se refiere a los enlaces de hidrógeno naturales de emparejamiento de bases entre purinas y pirimidinas. Por ejemplo, la secuencia A-C-G-T (5’→3’) forma enlaces de hidrógeno con sus complementarias A-C-G-T (5’ → 3’) o A-C-G-U (5’→3’). Dos moléculas de monocatenarias se pueden considerar parcialmente complementarias si forman enlace sólo algunos de los nucleótidos, o “completamente complementarias” si forman enlace todos los nucleótidos. El grado de complementariedad entre cadenas de ácido nucleico afecta a la eficacia y fuerza de las reacciones de hibridación y amplificación. “Totalmente complementarias” se refiere al caso en el que la formación de enlaces se produce entre cada uno de los pares de bases y sus complementarios en una pareja de secuencias, y las dos secuencias tienen el mismo número de nucleótidos.

[0046] Las expresiones “muy riguroso” o “condiciones muy rigurosas” se refiere a condiciones que permiten la hibridación de cadenas de ADN cuyas secuencias son muy complementarias, en las que las mismas condiciones excluyen la hibridación de ADN con emparejamientos erróneos significativos. Las secuencias de polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones rigurosas con los polinucleótidos la presente invención pueden ser, por ejemplo, variantes de las secuencias de polinucleótidos descritas, incluyendo variantes alélicas o de corte y empalme, o secuencias que codifican ortólogos o parálogos de los presentes polipéptidos descritos. Los procedimientos de hibridación de ácidos nucleicos se describen en detalle en Kashima y col. (1985) Nature 313:402-404, Sambrook y col. (1989) “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”. 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

N.Y. ("Sambrook"), y en Hames y Higgins, "Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach", IRL Press, Washington, D.C. (1985), cuyas referencias se incorporan en el presente documento por referencia.

[0047] En general, las condiciones rigurosas se determinan por la temperatura, fuerza iónica y concentración de los agentes desnaturalizantes (por ejemplo, formamida) usados en una hibridación y el procedimiento de lavado (para una descripción más detallada para establecer y determinar las condiciones rigurosas, véase a continuación). El grado con que hibridan dos ácidos nucleicos en diferentes condiciones rigurosas esta correlacionado con la extensión de su similitud. Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos similares de una variedad de fuentes, tal como en el genoma de una planta (como es el caso de parálogos) o de otra planta (como es el caso de ortólogos) que pueden realizar funciones similares, se pueden aislar basándose en su capacidad de hibridar con secuencias de factores de transcripción conocidas. Son posibles numerosas variaciones en las condiciones y medios con los que se puede realizar la hibridación de ácidos nucleicos para aislar secuencias de factores de transcripción que tienen similitud con las secuencias de factores de transcripción conocidas en la técnica, y no están limitados a los que se describen explícitamente en el presente documento. Dicho procedimiento se puede usar para aislar secuencias de polinucleótidos que tienen diferentes grados de similitud con las secuencias de factores de transcripción descritos, tal como por ejemplo factores de transcripción que tienen 60% de identidad, o más preferiblemente más de aproximadamente 70% de identidad, lo más preferiblemente 72% de identidad o identidad mayor con los factores de transcripción descritos.

[0048] En relación con los términos “parálogo” y “ortólogo”, las secuencias de polinucleótidos homólogas y las secuencias de polipéptidos homólogas pueden ser parálogas u ortólogas de la secuencia de polipéptido o polinucleótido reivindicada. Los ortólogos y parálogos son genes evolutivamente relacionados que tienen secuencia similar y funciones similares. Los ortólogos son genes estructuralmente relacionados en especies diferentes que han derivado de un suceso de especiación. Los parálogos son genes estructuralmente relacionados dentro de una sola especie que han derivado de un suceso de duplicación. Los expertos en la materia apreciarán las secuencias que son suficientemente similares entre sí y pueden basarse en el porcentaje de identidad de las secuencias completas, porcentaje de identidad de un dominio o secuencia conservados dentro de una secuencia completa, porcentaje de similitud con la secuencia completa, porcentaje de similitud con un dominio o secuencia conservados dentro de la secuencia completa, y/o una disposición de nucleótidos contiguos o péptidos particulares respecto a un dominio conservado o secuencia completa. Las secuencias que son suficientemente similares entre sí también se unirán de una forma similar a los mismos sitios de unión al ADN de los elementos reguladores de la transcripción usando procedimientos conocidos por el experto en la materia.

[0049] El término "equivalogo” describe miembros de un conjunto de proteínas homólogas que son conservadas con respecto a su función desde su último ancestro común. Las proteínas relacionadas se agrupan en familias de equivalogos, y por otra parte en familias de proteínas con otros tipos de homología jerárquicamente definidas. Esta definición se proporciona en el sitio web (www) del Institute for Genomic Research (TIGR), "tigr.org" bajo el título "Terms associated with TIGRFAMs". Institute for Genomic Research (TIGR) página web (www), "tigr.org" bajo el título "Terms associated with TIGRFAMs".

[0050] El término “variante”, como se usa en el presente documento, se puede referir a polinucleótidos o polipéptidos que difieren entre sí en la secuencia de los polinucleótidos o polipéptidos descritos en el presente documento, respectivamente, y se exponen más adelante.

[0051] Con respecto a las variantes de polinucleótidos, las diferencias entre los polinucleótidos descritos en el presente documento y las variantes de polinucleótidos están limitadas de modo que las secuencias de nucleótidos de los primeros y de estos últimos son en general muy similares y, en muchas regiones, idénticos. Debido a la degeneración del código genético, la diferencia entre las primeras y estas últimas secuencias de nucleótidos puede ser silenciosa (es decir, los aminoácidos codificados por el polinucleótido son los mismos, y la secuencia de polinucleótidos variante codifica la misma secuencia de aminoácidos que el presente polinucleótido descrito. Las secuencias de nucleótidos variantes pueden codificar secuencias de aminoácidos diferentes, en cuyo caso dichas diferencias de nucleótidos darán como resultado sustituciones, adiciones, eliminaciones, inserciones, truncados o fusiones de aminoácidos, con respecto a las secuencias de polinucleótidos descritas. Estas variaciones pueden dar como resultado variantes de polinucleótido que codifica polipéptidos que comparten al menos una característica funcional. La degeneración del código genético también dicta que muchos polinucleótidos variantes diferentes pueden codificar polipéptidos idénticos y/o sustancialmente similares además de las secuencias ilustradas en la Lista de Secuencias.

[0052] Las secuencias de polipéptidos descritas en el presente documento y variantes de polipéptidos similares pueden diferir en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncados, que pueden estar presentes en cualquier combinación. Estas diferencias pueden producir cambios silenciosos y dar como resultado un factor de transcripción funcionalmente equivalente. Por lo tanto, el experto en la materia apreciará fácilmente que cualquiera de una variedad de secuencias de polinucleótidos es capaz de codificar factores de transcripción y polipéptidos homólogos de los factores de transcripción de la invención. Una variante de la secuencia de polipéptido puede tener cambios “conservativos”, en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas similares. Se pueden hacer sustituciones de aminoácidos deliberadas basándose en la similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia, y/o naturaleza anfipática de los restos, con la condición de que se retenga una cantidad sustancial de la actividad funcional o biológica del factor de transcripción. Por ejemplo, los aminoácidos con carga negativa pueden incluir ácido aspártico y ácido glutámico, los aminoácidos con carga positiva pueden incluir lisina y arginina, y los aminoácidos con grupos de cabeza polares no cargados que tienen valores de hidrofilia similares pueden incluir leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina, serina y treonina; y fenilalanina y tirosina (para más detalles de las sustituciones conservativas, véase la tabla 6). De forma más rara, una variante puede tener cambios “no conservativos”, por ejemplo, sustitución de una glicina por un triptófano. Las variaciones minoritarias similares también pueden incluir eliminaciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Los polipéptidos relacionados pueden comprender, por ejemplo, adiciones y/o eliminaciones de uno o más sitios de glicosilación unidos a N o unidos a O, o una adición y/o eliminación de uno o más restos de cisteína. Se puede encontrar orientación para determinar cuáles y cómo muchos restos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o eliminar sin abolir la actividad funcional o biológica, usando programas de ordenador conocidos por el experto en la materia, por ejemplo, el software DNASTAR (USPN 5.840.544).

[0053] También está dentro del alcance de la invención una variante de un ácido nucleico de factor de transcripción listado en la Lista de Secuencias, es decir, uno que tiene una secuencia que difiere de una de las secuencias de polinucleótidos de la Lista de Secuencias, o una secuencia complementaria, que codifica un polipéptido funcionalmente equivalente (es decir, un polipéptido que tiene algún grado de actividad biológica equivalente o similar) pero difiere en la secuencia respecto a la secuencia en la Lista de Secuencias, debido a la degeneración en el código genético. Están incluidos en esta definición los polimorfismos que se pueden detectar fácilmente o no usando una sonda de oligonucleótido particular del polinucleótido que codifica el polipéptido, y la hibridación inadecuada o inesperada con variantes alélicas, con un locus distinto del locus cromosómico normal para la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido.

[0054] “Variante alélica” o “variante alélica de polinucleótido” se refiere a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de forma natural por mutación, y puede dar como resultado el polimorfismo fenotípico en las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser “silenciosas” o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. “Variante alélica” y “variante alélica de polipéptido” también se pueden usar con respecto a los polipéptidos, y en este caso la expresión se refiere a un polipéptido codificado por una variante alélica de un gen.

[0055] “Variante de corte y empalme” o “variante de corte y empalme de polinucleótido”, como se usa en el presente documento, se refiere a formas alternativas de ARN transcrito a partir de un gen. La variación por corte y empalme se produce de forma natural como resultado de sitios alternativos que son cortados y empalmados dentro de una sola molécula de ARN transcrita o entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede dar como resultado diferentes formas de ARNm transcritas del mismo gen. Por lo tanto, las variantes de corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen diferentes secuencias de aminoácidos que pueden tener o no funciones similares en el organismo. La “variante de corte y empalme” o “variante de corte y empalme de polipéptido” también se puede referir a un polipéptido codificado por una variante de corte y empalme de un ARNm transcrito.

[0056] También como se usa en el presente documento, las “variantes de polinucleótido” también se pueden referir a secuencias de polinucleótidos que codifican parálogos y ortólogos de las presentes secuencias de polipéptidos descritas. Las “variantes de polipéptido” también se pueden referir a secuencias de polipéptidos que son parálogas y ortólogas de las presentes secuencias de polipéptidos descritas.

[0057] “Ligando” se refiere a cualquier molécula, agente o compuesto que se unirá específicamente a un sitio complementario en una molécula de ácido nucleico o proteína. Dichos ligandos estabilizan o modulan la actividad de las moléculas de ácido nucleico o proteínas de la invención y pueden estar compuestas por al menos uno de los siguientes: sustancias inorgánicas y orgánicas incluyendo ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono, grasas y lípidos.

[0058] “Modula” se refiere a un cambio en actividad (biológica, química o inmunológica) o vida útil que resulta de la unión específica entre una molécula y una molécula de ácido nucleico o una proteína.

[0059] El término “planta” incluye las plantas enteras, órganos/estructuras vegetativas que brotan (por ejemplo, hojas, tallos y tubérculos), raíces, flores y órganos/estructuras florales (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (incluyendo embriones, endospermo y recubrimiento de semilla) y fruto (el ovario maduro), tejido de la planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido del suelo y similares) y células (por ejemplo, células guarda, células huevo y similares), y descendientes de los mismos. La clase de plantas que se puede usar en el procedimiento de la invención en general es tan amplio como la clase de plantas superiores e inferiores susceptibles de técnicas de transformación, incluyendo angiospermas (plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas); gimnospermas, helechos, belchos, psilofitos, licofitos, briofitos y algas multicelulares (como se muestra, por ejemplo, en la figura 1, adaptada de Daly y col. (2001) Plant Physiol. 127: 1328-1333, y en la Figura 2, adaptada de Ku y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 9121-9126; y en Tudge (2000) en “The Variety of Life”, Oxford University Press, Nueva York, NY, pág. 547-606).

[0060] Una “planta transgénica” se refiere a una planta que contiene material genético que no se encuentra en una planta silvestre de la misma especie, variedad o variedad cultivada. El material genético puede incluir un transgén, un suceso de mutagénesis por inserción (tal como mutagénesis por inserción de transposón o ADN-T), una secuencia marcadora de activación, una secuencia mutada, un suceso de recombinación homóloga o una secuencia modificada por quimeroplastia. Típicamente, el material genético extraño se ha introducido en la planta mediante manipulación humana, pero se puede usar cualquier procedimiento como reconocerá el experto en la materia.

[0061] Una planta transgénica puede contener un vector o casete de expresión. El casete de expresión típicamente comprende una secuencia que codifica un polipéptido operativamente unida (es decir, bajo el control regulador de) a secuencias reguladoras inducibles o constitutivas adecuadas que permiten la expresión del polipéptido. El casete de expresión se puede introducir en una planta mediante transformación o mediante cultivo después de transformación de una planta parental. Una planta se refiere a una planta entera así como a una parte de la planta, tal como la semilla, fruto, hoja o raíz, tejido de la planta, células de la planta o cualquier otro material de la planta, por ejemplo, un explante de planta, así como descendientes de la misma, y a sistemas in vitro que imitan los componentes o procedimientos bioquímicos o celulares en una célula.

[0062] “Silvestre”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una célula de planta, semilla, componente de planta, tejido de planta, órgano de planta o la planta entera que no se ha modificado genéticamente ni se ha tratado en un sentido experimental. Las células, semillas, componentes, tejidos, órganos o plantas enteras silvestres se pueden usar como controles para comparar los niveles de expresión y la extensión y naturaleza de la modificación del rasgo con células, tejidos o plantas de la misma especie en las que se ha alterado la expresión de un factor de transcripción, por ejemplo, se ha inactivado, expresado en exceso, o expresado ectópicamente.

[0063] Una “planta de control”, tal como se usa la presente invención, se refiere a una célula de planta, semilla, componente de planta, tejido de planta, órgano de planta o la planta entera usada para comparar frente a la planta transgénica o genéticamente modificada, con el propósito de identificar un fenotipo potenciado en la planta transgénica o modificada genéticamente. Una planta de control en algunos casos puede ser una línea de planta transgénica que comprende un vector vacío o un gen marcador, pero no contiene el polinucleótido recombinante de la presente invención que se expresa en la planta transgénica o genéticamente modificada que se está evaluando. En general, una planta de control es una planta de la misma línea o variedad que la planta transgénica o genéticamente modificada que se está ensayando. Una planta de control adecuada incluiría una planta no transgénica o no alterada genéticamente de la línea parental usada para generar una planta transgénica en el presente documento.

[0064] “Fragmento”, con respecto a un polinucleótido, se refiere a un clon o cualquier parte de una molécula de polinucleótido que retiene una característica funcional usable. Los fragmentos útiles incluyen oligonucleótidos y polinucleótidos que se pueden usar en las tecnologías de hibridación o amplificación o en la regulación de la replicación, transcripción o traducción. Un “fragmento de polinucleótido” se refiere a cualquier subsecuencia de un polinucleótido, típicamente, de al menos aproximadamente 9 nucleótidos consecutivos, preferiblemente al menos aproximadamente 30 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 50 nucleótidos, de cualquiera de las secuencias proporcionadas en el presente documento. Los fragmentos de polinucleótido de ejemplo son los primeros 60 nucleótidos consecutivos de los polinucleótidos de los factores de transcripción listados en la Lista de Secuencias. Los fragmentos de ejemplo incluyen fragmentos que comprenden una región que codifica un dominio conservado (por ejemplo, un dominio AP2) de un factor de transcripción.

[0065] Los fragmentos también pueden incluir subsecuencias de polipéptidos y moléculas de proteínas, o una subsecuencia de un polipéptido. Los fragmentos pueden tener uso en cuanto que pueden tener potencial antigénico. En algunos casos, el fragmento o dominio es una subsecuencia del polipéptido que realiza al menos una función biológica del polipéptido intacto sustancialmente de la misma manera, o en una extensión similar, a la que lo hace en el polipéptido intacto. Por ejemplo, un fragmento de polipéptido puede comprender un patrón estructural reconocible

o dominio funcional tal como un sitio de unión al ADN o dominio que se une a una región promotora de ADN, un dominio de activación o un dominio para interacciones proteína–proteína, y puede iniciar la transcripción. Los fragmentos pueden variar de tamaño desde tan pocos como 3 restos de aminoácidos hasta la longitud entera del polipéptido intacto, pero preferiblemente tienen al menos aproximadamente 30 restos de aminoácidos de longitud y más preferiblemente al menos aproximadamente 60 restos de aminoácidos de longitud. Los fragmentos de polipéptidos de ejemplo son los primeros 20 aminoácidos consecutivos de los polipéptidos de los factores de transcripción listados en la Lista de Secuencias. Los fragmentos de ejemplo también incluyen fragmentos que comprenden un dominio AP2 de un factor de transcripción, por ejemplo, los restos de aminoácidos 10-77 de G2133 (SEQ ID NO: 12), como se indica en la tabla 1.

[0066] La invención también abarca la producción de secuencias de ADN que codifican factores de transcripción y derivados de factores de transcripción, o fragmentos de los mismos, totalmente por química sintética. Después de la producción, la secuencia sintética se puede insertar en cualquiera de los muchos vectores de expresión y sistemas celulares disponibles usando reactivos conocidos en la técnica. Además, se puede usar la química sintética para introducir mutaciones en una secuencia que codifica factores de transcripción o cualquier fragmento de la misma.

[0067] “Derivado” se refiere a la modificación química de una molécula de ácido nucleico o secuencia de aminoácidos. Las modificaciones químicas pueden incluir la sustitución de hidrógeno o un grupo alquilo, acilo o amino o la glicosilación, pegilación, o cualquier procedimiento similar que retenga o potencie la actividad biológica o la vida útil de la molécula o secuencia.

[0068] Un “rasgo” se refiere a una característica fisiológica, morfológica, bioquímica o física de una planta o un material o célula de planta particular. En algunos casos, esta característica es visible a simple vista, tal como el tamaño de la semilla o planta, o se puede medir por técnicas bioquímicas, tales como detectando el contenido de proteína, almidón o aceite de semillas u hojas, o por observación de un proceso metabólico o fisiológico, por ejemplo, midiendo la tolerancia a la falta de agua o a concentraciones de sales o azúcar particulares, o por la observación del nivel de expresión de un gen o genes, por ejemplo usando análisis Northern, RT-PCR, ensayos de expresión de genes de micromatrices, o sistemas de expresión de genes indicadores, o por observaciones agrícolas tales como la tolerancia al estrés por sequía o el rendimiento. Sin embargo, se puede usar cualquier técnica para medir la cantidad, el nivel comparativo o la diferencia en cualquier compuesto o macromolécula química seleccionada en las plantas transgénicas.

[0069] La “modificación de rasgo” se refiere a una diferencia detectable en una característica en una planta que expresa ectópicamente un polinucleótido o polipéptido de la presente invención con respecto a una planta que no lo hace, tal como una planta silvestre. En algunos casos, la modificación del rasgo se puede evaluar de forma cuantitativa. Por ejemplo, la modificación del rasgo puede conllevar un aumento o disminución de al menos aproximadamente 2% en un rasgo observado, o una diferencia incluso mayor, comparado con una planta silvestre o de control. Se sabe que puede haber una variación natural en el rasgo modificado. Por lo tanto, la modificación del rasgo observado conlleva un cambio de la distribución y magnitud normales del rasgo de las plantas comparado con la distribución y magnitud observadas en las plantas silvestres.

[0070] La expresión “perfil del transcritos” se refiere a los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula en un estado particular, en particular por comparación con los niveles de expresión del mismo conjunto de genes en una célula del mismo tipo en un estado de referencia. Por ejemplo, el perfil de transcritos de un factor de transcripción particular en una célula en suspensión son los niveles de expresión de un conjunto de genes en una célula que reprimen o expresan en exceso este factor de transcripción comparado con los niveles de expresión del mismo conjunto de genes en una célula en suspensión que tiene los niveles normales de este factor de transcripción. El perfil de transcritos se puede presentar como una lista de aquellos genes cuyo nivel de expresión es significativamente diferente entre los dos tratamientos, y las proporciones de la diferencia. Las diferencias y similitudes entre los niveles de expresión también se pueden evaluar y calcular usando procedimientos estadísticos y de agrupamiento.

[0071] La “expresión ectópica o expresión alterada” en referencia a un polinucleótido indica que el patrón de expresión, por ejemplo, en una planta transgénica o tejido de planta, es diferente del patrón de expresión en una planta silvestre o una planta de referencia de la misma especie. El patrón de expresión también se puede comparar con un patrón de expresión de referencia en una planta silvestre de la misma especie. Por ejemplo, el polinucleótido

o polipéptido se expresa en una célula o tipo de tejido distintos de una célula o tipo de tejido en el que la secuencia se expresa en la planta silvestre, o por la expresión en un momento distinto al momento en el que la secuencia se expresa en la planta silvestre, o por una respuesta a diferentes agentes inducibles, tales como hormonas o señales del entorno, o con niveles de expresión diferentes (sean mayores o menores) comparados con los encontrados en una planta silvestre. El término también se refiere a patrones de expresión alterados que se producen disminuyendo los niveles de expresión por debajo del nivel de detección o por eliminación completa de la expresión. El patrón de expresión resultante puede ser transitorio o estable, constitutivo o inducible. Con referencia a un polipéptido, la expresión “expresión ectópica o expresión alterada” se puede referir además a los niveles de actividad alterados que resultan de las interacciones de los polipéptidos con moduladores exógenos o endógenos o de interacciones con factores o como resultado de la modificación química de los polipéptidos.

[0072] La expresión “exceso de expresión”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un nivel de expresión mayor de un gen en una planta, célula de planta o tejido de planta, comparado con la expresión en una planta, célula o tejido silvestre, en cualquier fase de desarrollo o temporal para el gen. El exceso de expresión se produce cuando, por ejemplo, los genes que codifican uno o más factores de transcripción están bajo el control de un promotor fuerte descrito en el presente documento (por ejemplo, la región de inicio de la transcripción 35S del virus del mosaico de la coliflor), o el exceso de expresión puede ser inducido cuando está presente una señal adecuada en el entorno. El exceso de expresión se puede producir en toda la planta o en tejidos específicos de la planta, dependiendo del promotor usado, como se describe más adelante.

[0073] El exceso de expresión puede tener lugar en células de plantas que normalmente carecen de la expresión de polipéptidos opcionalmente equivalentes o idénticos a los presentes factores de transcripción. El exceso de expresión también se puede producir en células de plantas en las que normalmente se produce la expresión endógena de los presentes factores de transcripción o moléculas funcionalmente equivalentes, pero dicha expresión normal es en un nivel inferior. Por lo tanto, el exceso de expresión da como resultado una producción mayor que la normal o “exceso de producción” del factor de transcripción en la planta, célula o tejido.

[0074] La expresión “región reguladora de la transcripción” se refiere a una secuencia reguladora de ADN que regula la expresión de uno o más genes en una planta cuando un factor de transcripción que tiene uno o más dominios de unión específicos se une a la secuencia reguladora de ADN. Los factores de transcripción de la presente invención pueden tener, por ejemplo, un dominio AP2, en cuyo caso el dominio AP2 del factor de transcripción se une a una región reguladora de la transcripción, tal como AtERF1, que se une al patrón AGCCGCC (la “caja GCC”) que está presente en promotores de genes tales como PDF1.2. Los factores de transcripción de la invención también comprenden una subsecuencia de aminoácidos que forma un dominio de activación de la transcripción que regula la expresión de uno o más genes de tolerancia al estrés abiótico en una planta cuando el factor de transcripción se une a la región reguladora.

[0075] Una “muestra” con respecto a un material que contiene moléculas de ácido nucleico, puede comprender un fluido corporal; un extracto de una célula, cromosoma, orgánulo o membrana aislados de una célula; ADN, ARN o ADNc genómicos en disolución o unidos a un sustrato; una célula; un tejido; una huella tisular; una muestra forense; y similares. En este contexto “sustrato” se refiere a cualquier soporte rígido o semirígido al que se unen moléculas de ácido nucleico o proteínas, que incluyen membranas, filtros, chips, portaobjetos, obleas, fibras, perlas magnéticas o nanomagnéticas, geles, capilares u otros tubos, placas, polímeros y micropartículas, con una variedad de formas de la superficie incluyendo pocillos, zanjas, agujas, canales y poros. Un sustrato también se puede referir a un reaccionante en una reacción química o biológica, o una sustancia que actúa sobre ella (por ejemplo, una enzima).

Los factores de transcripción modifican la expresión de genes endógenos

[0076] Un factor de transcripción puede incluir, pero sin limitar, cualquier polipéptido que pueda activar o reprimir la transcripción de un solo gen o de una serie de genes. Como reconoce el experto en la materia, los factores de transcripción se pueden identificar por la presencia de una región o dominio de similitud o identidad estructural con una secuencia consenso específica o la presencia de un sitio de unión al ADN consenso específico o patrón de sitio de unión al ADN (por ejemplo, en Riechmann y col. (2000) Science 290: 2105-2110).

[0077] En general, los factores de transcripción codificados por las presentes secuencias están implicados en la diferenciación y proliferación celular y la regulación del crecimiento. Por consiguiente, un experto en la materia reconocerá que mediante la expresión de las presentes secuencias en una planta, se puede cambiar la expresión de genes autólogos o inducir la expresión de genes introducidos. Afectando a la expresión de secuencias autólogas similares en una planta que tienen la actividad biológica de las presentes secuencias, o introduciendo las presentes secuencias en una planta, se puede alterar el fenotipo de una planta a uno con rasgos mejorados en relación con el estrés por sequía, la tolerancia a la sombra, o la detección del C/N. Las secuencias de la invención también se pueden usar para transformar una planta e introducir rasgos deseables que nos encuentran en la variedad cultivada

o cepa silvestre. Después, se pueden seleccionar aquellas plantas que producen el grado más deseado de exceso o defecto de expresión de los genes diana de interés y la mejora simultánea del rasgo.

[0078] Las secuencias de la presente invención pueden ser de cualquier especie, en particular especies de plantas, en forma natural o de cualquier fuente sea natural, sintética, semisintética o recombinante. Las secuencias de la invención también pueden incluir fragmentos de las presentes secuencias de aminoácidos. Cuando se cita la “secuencia de aminoácidos” para referirse a una secuencia de aminoácidos de una molécula de proteína natural, no se pretende que la “secuencia de aminoácidos” y expresiones similares limiten la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos nativa completa asociada con la molécula de proteína citada.

[0079] Además de los procedimientos para modificar el fenotipo de una planta usando uno o más polinucleótidos y polipéptidos de la invención descritos en el presente documento, los polinucleótidos y polipéptidos de la invención tienen una variedad de usos adicionales. Estos usos incluyen su uso en la producción recombinante (es decir, expresión) de proteínas; como reguladores de la expresión de genes de la planta, como sondas de diagnóstico para la presencia de ácidos nucleicos complementarios o parcialmente complementarios (incluyendo para la detección de ácidos nucleicos codificantes naturales); como sustratos para otras reacciones, por ejemplo, reacciones de mutación, reacciones de PCR, o similares; como sustratos para la clonación por ejemplo, incluyendo reacciones de digestión o ligado; y para la identificación de moduladores exógenos o endógenos de los factores de transcripción. En muchos casos, un polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido (o proteína) o un dominio o fragmento del mismo. Además, el polinucleótido puede comprender un promotor, un intrón, una región potenciadora, un sitio de poliadenilación, un sitio de inicio de la traducción, regiones 5’ o 3’ no traducidas, un gen indicador, un marcador seleccionable, o similares. El polinucleótido puede ser ADN o ARN de una cadena o dos cadenas. El polinucleótido comprende opcionalmente bases modificadas o una cadena principal modificada. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN o ARN genómicos, un transcrito (tal como un ARNm), un ADNc, un producto de la PCR, un ADN clonado, un ADN o ARN sintéticos, o similares. El polinucleótido puede comprender una secuencia en las orientaciones de sentido directo o sentido contrario.

[0080] La expresión de genes que codifican factores de transcripción que modifican la expresión de genes, polinucleótidos y proteínas endógenos, es bien conocida en la materia. Además, las plantas transgénicas que comprenden polinucleótidos aislados que codifican factores de transcripción también pueden modificar la expresión de genes, polinucleótidos y proteínas endógenos. Los ejemplos incluyen Peng y col. (1997) Genes Development 11: 3194-3205, y Peng y col. (1999) Nature, 400: 256-261). Además, muchos otros han demostrado que un factor de transcripción de Arabidopsis expresado en una especie de planta exógena produce la misma respuesta fenotípica o muy similar (por ejemplo, en Fu y col. (2001) Plant Cell 13: 1791-1802; Nandi y col. (2000) Curr. Biol 10: 215-218; Coupland (1995) Nature 377:482483; y Weigel y Nilsson (1995) Nature 377: 482-500).

[0081] En otro ejemplo, Mandel y col. (1992) Cell 71-133-143, y Suzuki y col. (2001) Plant J. 28: 409-418 enseñan que un factor de transcripción expresado en otra especie de planta produce la misma respuesta fenotípica

o muy similar a la de la secuencia endógena, como se ha predicho con frecuencia en estudios previos de factores de transcripción de Arabidopsis, en Arabidopsis (Mandel y col. (1992) véase antes; y Suzuki y col. (2001) véase antes). Otros ejemplos incluyen Muller y col. (2001) Plant J. 28: 169-179; Kim y col. (2001) Plant J. 25: 247-259; Kyozuka y Shimamoto (2002) Plant Cell Physiol. 43: 130-135; Boss y Thomas (2002) Nature, 416: 847-850; He y col. (2000) Transgenic Res. 9: 223-227; y Robson y col. (2001) Plant J. 28: 619-631.

[0082] En otro ejemplo más, Gilmour y col. (1998) Plant J. 16: 433-442, enseñan un factor de transcripción AP2 de Arabidopsis, CBF1, que cuando se expresa en exceso en plantas transgénicas aumenta la tolerancia a las heladas. Jaglo y col. (2001) Plant Physiol. 127: 910-917, identificaron además secuencias en Brassica napus que codifican genes de tipo CBF y que los transcritos para estos genes se acumulaban rápidamente en respuesta a la temperatura baja. También se encontró que los transcritos que codifican las proteínas CBF se acumulaban rápidamente en respuesta a la temperatura baja en el trigo, así como en el tomate. El alineamiento de las proteínas CBF de Arabidopsis, B. napus, trigo, centeno y tomate pusieron de manifiesto la presencia de restos de aminoácidos consecutivos conservados, PKK/RPAGRxKFxETRHP y DSAWR, que encierran los dominios de unión al ADN AP2/EREBP de las proteínas y las distingue de otros miembros de la familia de proteínas AP2/EREBP (Jaglo y col. (2001) véase antes).

[0083] Los factores de transcripción median respuestas celulares y controlan los rasgos a través de la expresión alterada de genes que contienen secuencias de nucleótidos que actúan en cis, que son dianas del factor de transcripción introducido. Se apreciará en la técnica que el efecto de un factor de transcripción en las respuestas celulares o un rasgo celular está determinado por los genes particulares cuya expresión se altera de forma directa o indirecta (por ejemplo, por una cascada de sucesos de unión de factores de transcripción y cambios transcripcionales) por la unión del factor de transcripción. En un análisis global de la transcripción comparando un estado estándar con uno en el que se expresa en exceso un factor de transcripción, el perfil de transcritos resultante asociado con el exceso de expresión del factor de transcripción está relacionado con el rasgo o proceso celular controlado por ese factor de transcripción. Por ejemplo, se ha mostrado que el gen PAP2 (y otros genes en la familia MYB) controla la biosíntesis de la antocianina a través de la regulación de la expresión de genes que se sabe que están implicados en la ruta biosintética de la antocianina (Bruce y col. (2000) Plant Cell, 12: 65-79; Borevitz y col. (2000) Plant Cell 12: 2383-93). Además, los perfiles de transcritos globales se han usado con éxito como herramientas de diagnóstico para estados celulares específicos (por ejemplo, cancerosos frente a no cancerosos; Bhattacharjee y col. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 98: 13790-13795; Xu y col. (2001) Proc. Natl Acad. Sci., USA, 98: 15089.15094). Por consiguiente, es evidente para el experto en la materia que la similitud del perfil de transcritos tras el exceso de expresión de diferentes factores de transcripción indicaría similitud de la función del factor de transcripción.

Polipéptidos y polinucleótidos de la solicitud

[0084] La presente invención proporciona, entre otras cosas, factores de transcripción (TF), y polipéptidos homólogos de factores de transcripción, y polinucleótidos aislados o recombinantes que codifican los polipéptidos o nuevos polipéptidos variantes de secuencia o polinucleótidos que codifican nuevas variantes de factores de transcripción derivados de las secuencias específicas proporcionadas en el presente documento.

[0085] Los polinucleótidos de la invención pueden ser expresados ectópicamente en células de plantas que producen exceso de expresión y observarse los cambios en los niveles de expresión de una serie de genes, polinucleótidos y/o proteínas de las células de la planta. Por lo tanto, los polinucleótidos y polipéptidos se pueden usar para cambiar los niveles de expresión de genes, polinucleótidos y/o o proteínas de plantas o células de plantas. Estos polipéptidos y polinucleótidos se pueden usar para modificar las características de una planta, en particular la tolerancia a la sequía. Los polinucleótidos de la invención se pueden expresar ectópicamente en plantas que producen un exceso de expresión o se encuentran inactivadas, y observar los cambios en la o las características, o el o los rasgos de las plantas. Por lo tanto, los polinucleótidos y polipéptidos se pueden usar para mejorar las características de las plantas. Se ha mostrado que las secuencias de polipéptidos de la Lista de Secuencia confieren una mayor tolerancia a la sequía o a la sombra o la detección del C/N alterado, cuando estos polipéptidos son expresados en exceso en plantas de Arabidopsis. Se ha mostrado que estos polinucleótidos tienen una asociación fuerte con estos rasgos, en cuanto que las plantas que expresan en exceso estas secuencias son más tolerantes a la sequía, la sombra o tienen detección del C/N alterado, respectivamente. La invención también abarca un complemento de los polinucleótidos. Los polinucleótidos también son útiles para el cribado de bibliotecas de moléculas o compuestos para la unión específica y para crear plantas transgénicas que tienen rasgos mejorados. Se ha mostrado y se espera que la alteración de los niveles de expresión de los equivalogos de estas secuencias, incluyendo parálogos y ortólogos en la Lista de Secuencias, y otros ortólogos que son estructural y secuencialmente similares a los primeros ortólogos, confiera fenotipos similares, incluyendo la detección del C/N alterado, tolerancia a la sequía y/o a la sombra en las plantas.

[0086] En algunos casos, se identificaron polinucleótidos de ejemplo que codifican los polipéptidos de la lista de secuencias en la base de datos de GenBank de Arabidopsis thaliana usando programas y parámetros de análisis de secuencias disponibles al público. Las secuencias identificadas inicialmente después se caracterizaron adicionalmente para identificar las secuencias que comprenden cadenas de secuencia específicas correspondientes a patrones de secuencia presentes en familias de factores de transcripción conocidos. Además, se identifican otros polinucleótidos de ejemplo que codifican los polipéptidos de la invención en la base de datos de GenBank de plantas usando programas y parámetros de análisis de secuencias disponibles al público. Las secuencias identificadas inicialmente después se caracterizaron más para identificar las secuencias que comprenden cadenas de secuencia específicas correspondientes a patrones de secuencia presentes en familias de factores de transcripción conocidos. Las secuencias de polinucleótidos que cumplen dichos criterios se confirmaron como factores de transcripción.

[0087] Se identificaron polinucleótidos adicionales de la invención mediante el cribado de bibliotecas de ADNc de Arabidopsis thaliana y/u otras plantas con sondas correspondientes a factores de transcripción conocidos en condiciones de hibridación rigurosas bajas. Posteriormente se recuperaron secuencias adicionales, incluyendo secuencias codificantes de longitud entera, mediante el procedimiento de amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE), usando un kit disponible en el comercio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando era necesario, se llevaron a cabo varios ciclos de RACE para aislar los extremos 5’ y 3’. Después, se recuperó el ADNc de longitud entera mediante una reacción en cadena de la polimerasa de extremo a extremo rutinaria (PCR) usando celadores específicos para aislar los extremos 5’ y 3’. Se proporcionan secuencias de ejemplo en la Lista de Secuencias.

[0088] Los polinucleótidos son particularmente útiles cuando son elementos de la matriz que se pueden hibridar en una micromatriz. Dicha micromatriz se puede usar para el seguimiento de la expresión de genes que se expresan de forma diferente en respuesta a la luz limitada, sequía otros estreses osmóticos, o baja disponibilidad de nitrógeno. La micromatriz se puede usar en análisis de expresión de genes o genético a gran escala de un gran número de polinucleótidos; o en el diagnóstico de, por ejemplo, el estrés por sequía antes de que los síntomas fenotípicos sean evidentes. Además, se puede usar la micromatriz para investigar la respuestas celulares, tales como la proliferación celular, transformación y similares.

[0089] Cuando los polinucleótidos de la invención también se pueden usar como elementos de matriz que se pueden hibridar en una micromatriz, los elementos de la matriz se organizan de una forma ordenada de modo que cada elemento esté presente en una posición especificada en el sustrato. Debido a que los elementos de la matriz están en posiciones especificadas sobre el sustrato, los patrones y las intensidades de hibridación (que juntos crean un perfil de expresión único) se pueden interpretar en términos de niveles de expresión de genes particulares y se pueden correlacionar con un estrés, patología o tratamiento particular.

[0090] La invención también implica una composición agrónoma que comprende un polinucleótido de la invención junto con un vehículo adecuado, y un procedimiento para alterar una unidad de planta usando la composición.

[0091] A continuación se proporcionan ejemplos de polinucleótidos y polipéptidos específicos de la invención, y secuencias de equivalogos, junto con las descripciones de las familias de genes que comprenden estos polinucleótidos y polipéptidos.

[0092] A continuación se proporcionan ejemplos de polinucleótidos y polipéptidos específicos de la invención, y secuencias de equivalogos.

[0093] Se ha demostrado que las secuencias de polipéptidos de la lista de secuencias, incluyendo, por ejemplo, las secuencias de Arabidopsis G2133; G1274, G922, G2999, G3086, G354, G1792, G2053, G975, G1069, G916, G1820, G2701, G47, G2854, G2789, G634, G175, G2839, G1452, G3091, G489, G303, G2992, y G682 (SEQ ID NO: 12, 6, 4, 14, 16, 228, 8, 10, 238, 240, 236, 244, 246, 2, 252, 248, 232, 224, 250, 242, 254, 230, 226, 50 y 234, respectivamente) confieren una mayor tolerancia a la sequía cuando se altera la expresión de estos polipéptidos en plantas de Arabidopsis. Estos polinucleótidos han mostrado que tienen una asociación fuerte con la tolerancia al estrés por sequía, en cuanto que las plantas que expresan en exceso estas secuencias son más tolerantes a la sequía. Las secuencias de ejemplo de la invención incluyen la G2133.

[0094] La presente descripción también abarca los complementos de estos polinucleótidos. Los polinucleótidos también son útiles para cribar bibliotecas de moléculas o compuestos para la unión específica y para crear plantas transgénicas que tienen tolerancia a la sequía alterada. Se espera que los equivalogos de estas secuencias, incluyendo parálogos y ortólogos en la lista de secuencias, y otros ortólogos que son estructural y secuencialmente similares a los ortólogos anteriores, confieran tolerancia a la sequía cuando se altera su expresión.

[0095] La familia AP2 incluyendo los clados G47/G2133 y G1792. AP2 (APETALA2) y EREBP (proteínas de unión a elementos de respuesta a etileno) son los miembros prototípicos de una familia de factores de transcripción única de las plantas, cuya característica que los distingue es que contienen el dominio de unión al ADN llamado AP2 (Riechmann y Meyerowitz (1998) Biol. Chem. 379: 633-646). El dominio AP2 fue reconocido por primera vez como un patrón repetido en la proteína AP2 de Arabidopsis thaliana (Jofuku y col. (1994) Plant Cell 6: 1211-122). Poco después, se identificaron 4 proteínas de unión al ADN del tabaco, que interaccionan con una secuencia que es esencial para la respuesta de algunos promotores a la hormona etileno de la planta, y se designaron como proteínas de unión a elementos de respuesta al etileno (EREBPs; Ohme-Takagi y col. (1995) Plant Cell 7: 173-182). El dominio de unión al ADN de EREBP-2 se cartografió en una región que era común a las cuatro proteínas (Ohme-Takagi y col. (1995) véase antes), y que se encontró que estaba estrechamente relacionado con el dominio de AP2 (Weigel (1995) Plant Cell 7: 388-389) pero que no contenía similitud de secuencia con los patrones de unión al ADN previamente conocidos.

[0096] Los genes AP2/BREBP forman una gran familia, con muchos miembros conocidos en varias especies de plantas (Okamuro y col. (1997) Proc Natl. Acad. Sci. USA 94: 7076-7081; Riechmann y Meyerowitz (1998) véase antes). El número de genes AP2/EREBP en el genoma de Arabidopsis thaliana es aproximadamente 145 (Riechmann y col. (2000) Science 290: 2105-2110). La clase APETALA2 se caracteriza por la presencia de 2 dominios de unión al ADN AP2, y contiene 14 genes. La AP2/ERF es la superfamilia más grande, e incluye 125 genes que están implicados en las respuestas al estrés abiótico (subgrupo DREB) y biótico (subgrupo ERF) y el subgrupo RAV incluye 6 genes que tienen todos un dominio de unión al ADN B3 además del dominio de unión al ADN AP2 (Kagaya y col. (1999) Nucleic Acids Res. 27: 470-478).

[0097] AP2 de Arabidopsis está implicado en la especificación de la identidad de sépalos y pétalos a través de su actividad como un gen homeótico que forma parte del mecanismo genético combinatorio de la determinación de la identidad de los órganos florales y también es necesario para el desarrollo normal de óvulos y semillas (Bowman y col. (1991) Development 112: 1-20; Jofuku y col. (1994) véase antes). ANT de Arabidopsis es necesario para el desarrollo del óvulo y también tiene una función en el crecimiento de los órganos florales (Elliott y col. (1996) Plant Cell 8: 155-168; Klucher y col. (1996) Plant Cell 8: 137-153). Finalmente, Gll5 del maíz regula la identidad celular epidérmica de las hojas (Moose y col. (1996) Genes Dev. 10: 3018-3027).

[0098] El ataque de un patógeno a una planta puede inducir respuestas de defensa que conducen a la resistencia a la invasión, y estas respuestas están asociadas con la activación de la transcripción de genes relacionados con la defensa, entre ellos los que codifican las proteínas relacionadas con la patogénesis (PR). La implicación de los genes de tipo EREBP en el control de la respuesta de defensa de la planta se basa en la observación de que muchos promotores de genes de PR contiene un elemento de actuación en cis corto que media sus respuestas al etileno (parece que en etileno es una de varias moléculas señal que controlan la activación de las respuestas de defensa). Se ha mostrado que las proteínas EREBP-1, -2; -3, y -4 del tabaco, y las proteínas Pti4, Pti5 y Pti6 del tomate reconocen dichos elementos de actuación en cis (Ohme-Takagi (1995) véase antes; Zhou y col. (1997) EMBO J. 16: 3207-3218). Además, se ha mostrado que las proteínas Pti4, Pti5, y Pti6 interaccionan directamente con Pto, una proteína quinasa que confiere resistencia frente a Pseudomonas syringae en el tomate (Zhou y col. (1997) véase antes). Las plantas también son estimuladas por diferentes condiciones ambientales adversas como el frío o la sequía, y parece que las proteínas de tipo EREBP también están implicadas en las respuestas a estos estrés abióticos. La expresión del gen de COR (regulado por el frío) es inducida durante la aclimatación al frío, procedimiento por el cual las plantas aumentan su resistencia a la helada en respuesta a temperaturas bajas descongelantes. El gen CBF1 de tipo EREBP de Arabidopsis (Stockinger y col. (1997) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 94: 1035-1040) es un regulador de la respuesta de aclimatación al frío, debido a que la expresión ectópica de CBF1 en plantas transgénicas de Arabidopsis inducía la expresión del gen COR en ausencia del estímulo del frío, y aumentaba la tolerancia de la planta a la helada (Jaglo-Ottosen y col. (1998) Science 280: 104106). Finalmente, otro gen de tipo EREBP de Arabidopsis, ABI4, está implicado en la transducción de la señal de

5 ABA, porque los mutantes abi4 son insensibles al ABA (ABA es una hormona de planta que regula muchos aspectos importantes desde el punto de vista agronómico del desarrollo de la planta; Finkelstein y col. (1998) Plant Cell 10: 1043-1054).

[0099] De las secuencias examinadas hasta la fecha, se encontraron dos restos de valina que están 10 presentes en miembros del clado G47 pero no fuera del clado (indicado mediante flechas en la figura 3). Todos los miembros del clado examinado hasta ahora tienen la subsecuencia:

V-(X)17-A-A-V-A-H-D-X-A, en la que X es un aminoácido y los restos identificados se indican mediante los restos mostrados en las cajas en la figura 3.

15 [0100] La tabla 1 muestra secuencias de la memoria descriptiva que, en muchos casos, confieren tolerancia a la sequía cuando se expresan en exceso. Los polipéptidos se identifican por la SEQ ID NO del polipéptido e identificador (por ejemplo, ID de gen (GID) Nº, número de acceso u otro nombre), se presentan en orden de similitud con la primera secuencia de Arabidopsis listada para cada grupo, e incluye los dominios conservados del polipéptido

20 en coordenadas de aminoácidos, las respectivas secuencias de los dominios, y la extensión de la identidad en términos de porcentaje respecto a la primera secuencia de Arabidopsis listada para cada grupo.

Tabla 1. Familia de genes y dominios de unión para secuencias de ejemplo que confieren tolerancia a la sequía,

incluyendo parálogos y ortólogos

imagen1

imagen1

[0101] La tabla 2 muestra en la primera columna la SEQ ID NO del polipéptido; en la segunda columna el identificador (por ejemplo, ID de gen (GID) Nº); en la tercera columna la familia del factor de transcripción a la que pertenece el polinucleótido; y en la cuarta columna las posiciones de los restos de aminoácidos del domino conservado en coordenadas de aminoácidos (AA):

Tabla 2. Familias de genes y dominios conservados

SEQ ID NO del polipéptido

identificador Familia Dominios conservados en coordenadas de aminoácidos

12

G2133 AP2 10-77

Producción de polipéptidos

[0102] Los polinucleótidos de la invención incluyen secuencias que codifican factores de transcripción y polipéptidos homólogos de factores de transcripción y secuencias complementarias de los mismos, así como fragmentos únicos de secuencia codificante, o secuencia complementaria de la misma. Dichos polinucleótidos pueden ser, por ejemplo, ADN o ARN, incluyendo el último ARNm, ARNc, ARN sintético, ADN genómico, ADNc, ADN sintético, oligonucleótidos, etc. Los polinucleótidos son de doble cadena o de cadena sencilla, e incluyen tanto secuencias de sentido directo (es decir, codificantes) como secuencias de sentido contrario (es decir, no codificantes, complementarias). Los polinucleótidos incluyen la secuencia codificante de un factor de transcripción, o un polipéptido homólogo del factor de transcripción, aislado, en combinación con secuencias codificantes adicionales (por ejemplo, un marcador de purificación, una señal de localización, como una proteína de fusión, como una preproteína o similares), en combinación con secuencias no codificantes (por ejemplo, intrones o inteínas, elementos reguladores tales como promotores, potenciadores, terminadores y similares), y/o un vector o entorno de un hospedador en el que el polinucleótido que codifica un factor de transcripción o polipéptido homólogo del factor de transcripción es un gen endógeno o exógeno.

[0103] Existe una variedad de procedimientos para producir los polinucleótidos de la invención. Los procedimientos para identificar y aislar clones de ADN son bien conocidos para el experto en la materia, y se describen, por ejemplo, en Berger y Kimmel, “Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology”, vol. 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA ("Berger"); Sambrook y col. “Molecular Clonining -A Laboratory Manua”l (2ª ed.), Vol 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989 ("Sambrook") y “Current Protocols in Molecular Biology”, Ausubel y col. eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 2000) ("Ausubel").

[0104] Alternativamente, los polinucleótidos de la invención se pueden producir por una variedad de procedimientos de amplificación in vitro adaptados a la presente invención mediante la selección adecuada de cebadores específicos o degenerados. Los ejemplos de protocolos suficiente para dirigir a los expertos en la materia a través de los procedimientos de amplificación in vitro, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por Qβ-replicasa y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa (por ejemplo, NASBA), por ejemplo, para la producción de ácidos nucleicos homólogos de la invención, se encuentran en Berger (véase antes), Sambrook (véase antes), y Ausubel (véase antes), así como en Mullis y col. (1987) “PCR Protocols A Guide to Methods and Applications” (Innis y col. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis). Se describen procedimientos mejorados para la clonación de ácidos nucleicos amplificados in vitro en Wallace y col. patente de EE.UU. nº 5.426.039. Se resumen procedimientos mejorados para la amplificación de ácidos nucleicos largos mediante PCR en Cheng y col. (1994) Nature 369: 684-685, y las referencias citadas en los mismos, en los que se generan amplicones por PCR de hasta 40 kb. Un experto en la materia apreciará que esencialmente se puede convertir cualquier ARN en un ADN de doble cadena adecuado para la digestión por restricción, expansión por PCR y secuenciación, usando transcriptasa inversa y una polimerasa (por ejemplo, en Ausubel, Sambrook and Berger, véanse todos antes).

[0105] Alternativamente, los polinucleótidos y oligonucleótidos de la invención se pueden formar a partir de fragmentos producidos por procedimientos de síntesis en fase sólida. Típicamente, se sintetizan individualmente fragmentos de hasta aproximadamente 100 bases y después se ligan enzimática o químicamente para producir una secuencia deseada, por ejemplo, un polinucleótido que codifica todo o parte de un factor de transcripción. Por ejemplo, se describe la síntesis química usando el procedimiento de la fosforamidita, en Beaucage y col. (1981) Tetrahedron Letters 22: 1859-1869; y Matthes y col. (1984) EMBO J. 3: 801-805. De acuerdo con dichos procedimientos, se sintetizan oligonucleótidos, se purifican, se reasocian con su cadena complementaria, se ligan y después opcionalmente se clonan en vectores adecuados. Y si se desea, los polinucleótidos y polipéptidos de la invención se pueden encargar a cualquiera de una serie de proveedores comerciales.

Secuencias homólogas

[0106] Las secuencias homólogas, es decir, las que comparten una identidad o similitud de secuencia significativa con las proporcionadas en la Lista de Secuencias, derivadas de Arabidopsis thaliana o de otras plantas elegidas, también son un aspecto de la invención. Las secuencias homólogas se pueden obtener de cualquier planta incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas y en particular especies de plantas importantes en agricultura, incluyendo pero sin limitar, cultivos tales como soja, trigo, maíz, patata, algodón, arroz, colza, colza de semillas oleaginosas (incluida la canola), girasol, alfalfa, trébol, caña de azúcar, y césped, o frutas y verduras, como banano, mora, arándano, fresa, y frambuesa, melón, zanahoria, coliflor, café, pepino, berenjena, uva, melón, lechuga, mango, melón dulce, cebolla, papaya, guisantes, pimientos, piña, calabaza, espinaca, chayote, maíz dulce, tabaco, tomate, tomatillo, sandía, frutas rosáceas (tales como manzana, melocotón, pera, cereza y ciruela) y vegetales Brassica (tales como el brócoli, repollo, coliflor, coles de Bruselas y colirrábano). Otros cultivos, que incluyen frutas y verduras, cuyo fenotipo se puede cambiar y que comprenden secuencias homólogas incluyen la cebada; centeno; mijo; sorgo; grosella; aguacate; frutas cítricas tales como naranjas, limones, pomelos y mandarinas, alcachofas, cerezas; frutos secos, tales como la nuez y el cacahuete, endibia, puerro, raíces como de arruruz, remolacha, yuca, nabo, el rábano, batata, y boniato; y judías. Las secuencias homólogas también se pueden obtener de las especies leñosas, tales como el pino, álamo y eucalipto o menta u otras labiadas. Además, se pueden obtener secuencias homólogas de plantas que están evolutivamente relacionadas con las plantas de cultivo, pero que pueden no haberse usado todavía como plantas de cultivo. Los ejemplos incluyen belladona (Atropa belladona), relacionada con el tomate; estramonio (Datura strommium), relacionada con el peyote, y el teosinta (Zea), relacionado con el maíz.

Ortólogos y parálogos

[0107] Las secuencias homólogas como las descritas antes pueden comprender secuencias ortólogas y parálogas. Son conocidos varios procedimientos diferentes por los expertos en la materia para identificar y definir estas secuencias funcionalmente homólogas. Se han descrito 3 procedimientos generales para definir ortólogos y parálogos; un ortólogo, parálogo u homólogo se puede identificar por uno o más de los procedimientos descritos a continuación.

[0108] Dentro de una sola especie de planta, la duplicación de genes pueden producir dos copias de un gen particular, dando lugar a dos o más genes con secuencia similar y a menudo función similar, conocidos como parálogos. Por lo tanto, un parálogo es un gen similar formado por duplicación dentro de la misma especie. Los parálogos típicamente se agrupan entre sí o en el mismo clado (un grupo de genes similares) cuando se analiza la filogenia de una familia de genes usando programas tales como CLUSTAL (Thompson y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680; Higgins y col. (1996) Methods Enzymol. 266: 383-402). Los grupos de genes similares también se pueden identificar con el análisis de BLAST por parejas (Feng y Doolittle (1987) J. Mol. Evol. 25: 351-360). Por ejemplo, un clado de factores de transcripción con dominios MADS muy similares de Arabidopsis comparten todos una función común en el momento de la floración (Ratcliffe y col. (2001) Plant Physiol. 126: 122-132), y un grupo de factores de transcripción con dominios AP2 muy similares de Arabidopsis está implicado en la tolerancia de las plantas a la helada (Gilmour y col. (1998) Plant J. 16: 433-442). El análisis de grupos de genes similares con función similar que están dentro de un clado pueden dar subsecuencias que son particulares para el clado. Estas subsecuencias, conocidas como secuencias consenso, se pueden usar no sólo para definir las secuencias dentro de cada clado, sino para definir las funciones de esos genes; los genes dentro de un clado pueden contener secuencias parálogas o secuencias ortólogas que comparten la misma función (por ejemplo, en Mount (2001), en “Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis” Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, página 543).

[0109] La especiación, la producción de nuevas especies a partir de una especie parental, también puede dar lugar a dos o más genes con secuencia similar y función similar. Estos genes, denominados ortólogos, a menudo tienen una función idéntica en sus plantas hospedadoras y a menudo son intercambiables entre especies sin perder la función. Debido a que las plantas tienen ancestros comunes, muchos genes en cualquier especie de planta tendrán un gen ortólogo correspondiente en otra especie de planta. Una vez que se ha construido un árbol filogenético para una familia de genes de una especie usando un programa tal como CLUSTAL (Thompson y col. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 46734680; Higgins y col. (1996) véase antes), se pueden poner las potenciales secuencias ortólogas en el árbol filogenético y determinar su relación con los genes de las especies de interés. Las secuencias ortólogas también se pueden identificar por una estrategia de BLAST recíproca. Una vez que se ha identificado una secuencia ortóloga, la función del ortólogo se puede deducir de la función identificada de la secuencia de referencia.

[0110] Las secuencias de los genes de factores de transcripción están conservadas a través de diferentes líneas de especies eucariotas (Goodrich y col. (1993) Cell 75: 519-530; Lin y col. (1991) Nature 353: 569-571; Sadowski y col. (1988) Nature 335: 563-564). Las plantas no son una excepción a esta observación; diferentes especies de plantas tienen factores de transcripción que tienen secuencias y funciones similares.

[0111] Los genes ortólogos de organismos diferentes tienen funciones altamente conservadas, y muy a menudo funciones esencialmente idénticas (Lee y col. (2002) Genome Res. 12: 493-502; Remmy col. (2001) J. Mol. Biol. 314: 1041-1052). Los genes parálogos, que han divergido por la duplicación de genes, pueden retener funciones similares de las proteínas codificadas. En dichos casos, los parálogos se pueden usar de forma intercambiable con respecto a determinadas realizaciones de la presente invención (por ejemplo, expresión transgénica de una secuencia codificante). Un ejemplo de dichos parálogos muy relacionados es la familia CBF, con 4 miembros bien definidos en Arabidopsis (CBF 1, GBF2, CBF3 y CBF4) y al menos un ortólogo en Brassica napus, los cuales controlan todos las rutas implicadas en el estrés tanto por helada como por sequía (Gilmour y col. (1998) Plant J. 16: 433-442; Jaglo y col. (1998) Plant Physiol. 127: 910-917).

[0112] Las siguientes referencias representan una pequeña muestra de los muchos estudios que demuestran que los genes de factores de transcripción conservados de diferentes especies es probable que funcionen de forma similar (es decir, regulan secuencias diana similares y controlan los mismos rasgos), y que se pueden transformar los factores de transcripción en diversas especies para conferir o mejorar rasgos.

(1)

Diferentes factores de transcripción de Arabidopsis, incluyendo G28 (patente de EE.UU. 6.664.446), G432 (solicitud de patente de EE.UU. 20040045049; SEQ ID NO: 290 en la presente Lista de Secuencias), G867 (solicitud de patente de EE.UU. 20040098764; SEQ ID NO: 630 en la presente Lista de Secuencias), y G1073 (solicitud de patente de EE.UU. 20040128712; SEQ ID NO: 300 en la presente Lista de Secuencias), han mostrado que confieren tolerancia al estrés abiótico cuando las secuencias se expresan en exceso. Las secuencias de polipéptidos pertenecen a distintos clados de polipéptidos de factores de transcripción que incluyen miembros de diferentes especies. En cada caso, se ha mostrado que un número significativo de secuencias derivadas tanto de dicotiledóneas como de monocotiledóneas confieren tolerancia a diferentes estreses abióticos cuando las secuencias se expresan en exceso.

(2)

El gen NPR1 de Arabidopsis regula la resistencia sistémica adquirida (SAR) (Cao y col. (1997) Cell 88: 57-63); la expresión en exceso de NPR1 conduce a una resistencia potenciada en Arabidopsis. Cuando NPR1 de Arabidopsis

o el ortólogo de NPR1 del arroz se expresaban en exceso en el arroz (el cual, como una monocotiledónea, es diferente de Arabidopsis), las plantas transgénicas presentaban una resistencia potenciada a la estimulación con el patógeno bacteriano del añublo del arroz Xanthomonas oryzae pv. Oryzae (Chern y col. (2001) Plant J. 27: 101113). NPR1 actúa a través de la activación de la expresión de los genes de factores de transcripción, tales como TGA2 (Fan y Dong (2002) Plant Cell 14: 1377-1389).

(3)

Los genes E2F están implicados en la transcripción de genes de plantas para el antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA). Los E2F de plantas comparten un grado alto de similitud en la secuencia de aminoácidos entre monocotiledóneas y dicotiledóneas, y son incluso similares a los dominios conservados de los E2F de animales. Dicha conservación indica una similitud funcional entre EsF de plantas y animales. Los factores de transcripción E2F que regulan el desarrollo del meristemo actúan a través de elementos cis comunes, y regulan genes relacionados (PCNA) (Kosugi y Ohashi, (2002) Plant J. 29: 45-59).

(4)

El gen ABI5 (insensible a ABA 5) codifica un factor de la cremallera de leucina básico necesario para la respuesta de ABA en la semilla y los tejidos vegetativos. Los experimentos de transformación simultánea con construcciones de ADNc de ABI5 en protoplastos de arroz dieron como resultado la trasactivación específica de promotores del trigo, Arabidopsis¸ judía y cebada inducibles por ABA. Estos resultados demuestran que los factores de transcripción similares en secuencia a ABI5 son dianas clave de una ruta de señalización de ABA conservada en diversas plantas (Gampala y col. (2001) J. Biol. Chem. 277: 1689-1694).

(5)

Las secuencias de 3 genes de tipo GAMYB de Arabidopsis se obtuvieron basándose en la similitud de secuencia con los genes GAMYB de la cebada, arroz y L. temulentum. Se determinó que estos 3 genes de Arabidopsis codificaban factores de transcripción (AtMYB33, AtMYB65 y AtMYB101) y podían sustituir la expresión de GAMYB de la cebada y de la α-amilasa de control (Gocal y col. (2001) Plant Physiol. 127: 1682-1693).

(6)

El gen del control floral LEAFY de Arabidopsis puede acelerar espectacularmente la floración en numerosas plantas dicotiledóneas. La expresión constitutiva de LEAFY de Arabidopsis también producía la floración temprana en el arroz transgénico (una monocotiledóneas), con una fecha de espigamiento que era 26-34 días antes que la de las plantas silvestres. Estas observaciones indican que los genes reguladores de la floración de Arabidopsis son herramientas útiles para mejorar la fecha de espigamiento en cultivos de cereales (He y col. (2000) Transgenic Res.

9: 223-227).

(7)

Las giberelinas (GA) bioactivas son reguladores endógenos esenciales del crecimiento de la planta. La señalización de GA tiende a ser conservada a través del reino vegetal. La señalización de GA es mediada por GAI, un miembro nuclear de la familia GRAS de factores de transcripción de plantas. Se ha mostrado que GAI de Arabidopsis funciona en el arroz para inhibir las rutas de respuestas a las giberelinas (Fu y col. (2001) Plant Cell 13: 1791-1802).

(8)

El gen SUPERMAN (SUP) de Arabidopsis codifica un factor de transcripción presunto que mantiene el límite entre los estambres y los carpelos. Mediante la expresión en exceso de SUP de Arabidopsis en el arroz, se mostró que el efecto de la presencia de los genes en los bordes de los verticilos era conservado. Esto demostraba que SUP es un regulador conservado de los bordes de los verticilos florales y afecta a la proliferación celular (Nandi y col. (2000) Curr. Biol. 10: 215-218).

(9)

Los factores de transcripción myb de maíz, petunia y Arabidopsis que regulan la biosíntesis de flavonoides son genéticamente similares y afectan al mismo rasgo en su especie nativa; por lo tanto, la secuencia y la función de estos factores de transcripción myb se correlacionan entre sí en diversas especies (Borevitz y col. (2000) Plant Cell

12: 2383-2394).

(10) Los genes de la altura reducida del trigo 1 (Rht-B1/Rht-D1) y maíz enano 8 (d8) son ortólogos del gen insensible a la giberelina (GAI) de Arabidopsis. Ambos genes se han usado para producir variedades de grano enano que tiene un mejor rendimiento de granos. Estos genes codifican proteínas que se parecen a los factores de transcripción nucleares y contienen un dominio de tipo SH-2, indicando que la fosfotirosina puede participar en la señalización de la giberelina. Las plantas de arroz transgénicoas que contienen un alelo de GAI mutante de Arabidopsis han mostrado producir menores respuestas a la giberelina y las hacen enanas, indicando que los ortólogos de GAI mutantes se podrían usar para aumentar el rendimiento en una amplia variedad especies de cultivo (Peng y col. (1999) Nature 400: 256-261).

[0113] Los factores de transcripción que son homólogos a las secuencias listadas típicamente compartirán al menos aproximadamente una identidad de secuencia de aminoácidos de 70% en su dominio conservado. Los factores de transcripción más estrechamente relacionados pueden compartir al menos aproximadamente 79% o aproximadamente 90% o aproximadamente 95% o aproximadamente 98% o mayor identidad de secuencia con las secuencias listadas, o con las secuencias listadas pero excluyendo o fuera de una secuencia consenso conocida o sitio de unión al ADN consenso, o con las secuencias listadas excluyendo uno o todos los dominios conservados. Los factores que están más estrechamente relacionados con las secuencias listadas comparten, por ejemplo, al menos aproximadamente 85%, aproximadamente 90% o aproximadamente 95% o mayor % de identidad de secuencia con las secuencias listadas, o con las secuencias listadas pero excluyendo o fuera de una secuencia consenso conocida o sitio de unión al ADN consenso, o fuera de uno o todos los dominios conservados. A nivel de nucleótidos, las secuencias típicamente compartirán una identidad de secuencia de nucleótidos de al menos aproximadamente 40%, preferiblemente al menos aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70% o aproximadamente 80% de identidad de secuencia y más preferiblemente aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95% o aproximadamente 97% o mayor identidad de secuencia con una o más de las secuencias listadas, o con una secuencia listada pero excluyendo o fuera de una secuencia consenso conocida o sitio de unión al ADN consenso, o fuera de uno o todos los dominios conservados. La degeneración del código genético permite variaciones importantes de la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido mientras que se mantiene la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada. Los dominios AP2 dentro de la familia de factores de transcripción AP2 puede presentar un grado mayor de homología de secuencia, tal como una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% incluyendo sustituciones conservativas, y preferiblemente una identidad de secuencia de al menos 80%, y más preferiblemente al menos 85%, o al menos aproximadamente 86%, o al menos aproximadamente 87%, o al menos aproximadamente 88%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia. Los factores de transcripción que son homólogos con las secuencias listadas deben compartir una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 30%, o al menos aproximadamente 60%, o al menos aproximadamente 75%, o al menos aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95% a lo largo de la longitud entera del polipéptido o el homólogo.

[0114] El porcentaje de identidad se puede determinar electrónicamente, por ejemplo usando el programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc. Madison, Wis.). El programa MEGALIGN puede crear alineamientos entre dos o más secuencias de acuerdo con diferentes procedimientos, por ejemplo, el procedimiento clustal (por ejemplo, en Higgins y Sharp (1988) Gene 73: 237-244). El algoritmo clustal agrupa secuencias en agrupaciones examinando las distancias entre todos los pares. Las agrupaciones se alinean en parejas y después en grupos. Se pueden usar otros programas o algoritmos de alineamiento, incluyendo FASTA, BLAST, o ENTREZ, FASTA y BLAST, y sepueden usar para calcular el porcentaje de similitud. Éstos están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con o sin los parámetros por defecto. ENTREZ está disponible en el National Center for Biotechnology Information. En una realización, el porcentaje de identidad de dos secuencias se puede determinar mediante el programa GCG con un peso de hueco de 1, por ejemplo, cada hueco de aminoácido se pesa como si fuera un solo aminoácido o emparejamiento erróneo de nucleótido entre las dos secuencias (USPN 6.262.333).

[0115] Se describen otras técnicas de alineamiento en Enzymology, vol. 266, “Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis” (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., San Diego, Calif., EE.UU. Preferiblemente, se usa un programa de alineamiento que permite huecos en la secuencia para alinear las secuencias. El Smith-Waterman es un tipo de algoritmo que permite huecos en los alineamientos de secuencias (Shpaer (1997) Methods Mol. Biol. 70: 173-187). También se puede usar el programa GAP, usando el procedimiento de alineamiento de Needleman y Wunsch para alinear las secuencias. Una estrategia de búsqueda alternativa usa el software MPSRCH, el cual funciona en un ordenador MASPAR. MPSRCH usa un algoritmo de Smith-Waterman para puntuar las secuencias en un ordenador de procesamiento paralelo masivo. Este procedimiento implica la capacidad de coger emparejamientos relacionados a distancia, y es especialmente tolerante para huecos pequeños y errores de secuencias de nucleótidos. Las secuencias de aminoácidos codificadas por ácidos nucleicos se pueden usar para buscar en bases de datos tanto de proteínas como de ADN.

[0116] El porcentaje de similitud entre dos secuencias de polipéptido, por ejemplo la secuencia A y la secuencia B, se calcula dividiendo la longitud de la secuencia A, menos el número de huecos de restos de la secuencia A, menos el número de restos de huecos en la secuencia B, entre la suma de los emparejamientos de restos entre la secuencia A y la secuencia B, por cien. Los huecos sin o con poca similitud entre las dos secuencias de aminoácidos no están incluidos en la determinación del porcentaje de similitud. El porcentaje de identidad entre secuencias de polinucleótidos también se puede contar o calcular por otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, el procedimiento de Jotun Hein (por ejemplo, en Hein (1990) Methods Enzymol. 183: 626-645). La identidad entre secuencias también se puede determinar por otros procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, variando las condiciones de hibridación (solicitud de patente de EE.UU. Nº 20010010913).

[0117] Por lo tanto, la invención proporciona procedimientos para identificar una secuencia similar o paráloga u ortóloga u homóloga de uno o más polinucleótidos como se indica en el presente documento, o uno o más polipéptidos diana codificados por los polinucleótidos, o lo que se indique de otra manera en el presente documento, y puede incluir la conexión o asociación del fenotipo de una planta dada o función génica con una secuencia. En los procedimientos, se proporciona una base de datos de secuencias (local o a través de internet o intranet) y se plantea una cuestión frente a la base de datos de secuencias usando las secuencias relevantes del presente documento y los fenotipos de plantas o funciones de genes asociados.

[0118] Además, se pueden usar una o más secuencias de polinucleótidos o uno o más polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos para buscar frente a BLOCKS (Bairoch y col. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 217-221), PFAM, y otras bases de datos que contienen patrones, secuencias y funciones de genes previamente identificados y anotados. Se pueden usar los procedimientos que buscan patrones de secuencia primaria con penalizaciones por huecos en la estructura secundaria (Smith y col. (1992) Protein Engineering 5: 3551) así como algoritmos tales como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul (1993) J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410), BLOCKS (Henikoff y Henikoff (1991) Nucleic Acids Res.

19: 6565-6572), Hidden Markov Models (HMM; Eddy (1996) Curr. Opin. Str. Biol. 6: 361-365; Sonnhammer y col. (1997) Proteins 28: 405-420), y similares, para manipular y analizar secuencias de polinucleótidos y polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Estas bases de datos, algoritmos y otros procedimientos son bien conocidos en la técnica y se describen en Ausubel y col. (1997) “Short Protocols in Molecular Biology”, John Wiley & Sons, Nueva York, NY, unit 7.7) y en Meyers (1995) “Molecular Biology and Biotechnology”, Wiley VCH, Nueva York, NY, p 856853).

[0119] Un procedimiento adicional para identificar o confirmar que las secuencias homólogas específicas controlan la misma función es por comparación del o de los perfiles de los transcritos obtenidos tras la expresión en exceso o inactivación de dos o más factores de transcripción relacionados. Puesto que los perfiles de transcritos son diagnóstico para estados celulares específicos, un experto la materia apreciará que los genes que tienen un perfil de transcritos muy similar (por ejemplo, con más de 50% de los transcritos regulados en común, más preferiblemente con más de 70% de los transcritos regulados en común, lo más preferiblemente con más de 90% de los transcritos regulados en común) tendrán funciones muy similares. Fowler y col. (2002) Plant Cell 14: 1675-1679) han mostrado que 3 genes parálogos de la familia AP2 (CBF1, CBF2 y CBF3), cada uno de los cuales es inducido tras tratamiento con frío, y cada uno de los cuales pueden condicionar una mejor tolerancia a la helada, tienen perfiles de transcritos muy similares. Una vez que se ha mostrado que un factor de transcripción proporciona una función específica, su perfil de transcritos se convierte en una herramienta de diagnóstico para determinar si parálogos u ortólogos presuntos tienen la misma función.

[0120] Además, se pueden usar procedimientos que usan el alineamiento manual de secuencias similares u homólogas con una o más secuencias de polinucleótidos o uno o más polipéptidos codificados por las secuencias de polinucleótidos, para identificar regiones de similitud y dominios de unión de AP2. Dichos procedimientos manuales son bien conocidos para el experto en la materia y pueden incluir, por ejemplo, comparaciones de la estructura terciaria entre una secuencia de polipéptido codificada por un polinucleótido que comprende una función conocida con una secuencia de polipéptido codificado por una secuencia de polinucleótido que tiene una función todavía no determinada. Dichos ejemplos de estructura terciaria pueden comprender hélices α, láminas β, hélices anfipáticas, patrones de cremallera de leucina, patrones de dedos de cinc, regiones ricas en prolina, patrones de repetición de cisteína, y similares.

[0121] Los ortólogos y parálogos de los presentes factores de transcripción descritos, se pueden clonar usando composiciones proporcionadas por la presente invención de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Los ADNc se pueden clonar usando ARNm de una célula o tejido de planta que expresa uno de los presentes factores de transcripción. Las fuentes de ARNm adecuadas se pueden identificar examinando transferencias Northern con sondas diseñadas a partir de secuencias de los presentes factores de transcripción, después de lo cual se prepara una biblioteca a partir del ARNm obtenido de una célula o tejido positivo. Después, el ADNc que codifica el factor de transcripción se aísla usando, por ejemplo, la PCR, usando cebadores diseñados a partir de la secuencia de genes del presente factor de transcripción descrito, o mediante hibridación con un ADNc parcial o completa o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas basadas en las secuencias descritas. La biblioteca de ADNc se puede usar para transformar células de plantas. La expresión de los ADNc de interés se detecta usando, por ejemplo, los procedimientos descritos en el presente documento tales como micromatrices, transferencias Northern, PCR cuantitativa, o cualquier otra técnica para el seguimiento de los cambios en la expresión. Los clones genómicos se pueden aislar usando técnicas similares a estas.

Identificación de polinucleótidos o ácidos nucleicos por hibridación

[0122] Los polinucleótidos homólogos a las secuencias ilustradas en la Lista de Secuencias y en las tablas, se pueden identificar, por ejemplo, por hibridación entre sí en condiciones rigurosas o muy rigurosas. Los polinucleótidos monocatenarios hibridan cuando se asocian basándose en una variedad de fuerzas fisicoquímicas bien caracterizada, tales como enlaces de hidrógeno, exclusión de disolvente, apilamiento de bases y similares. La restricción de una hibridación refleja el grado de identidad de secuencia de los ácidos nucleicos implicados, de modo que cuanto más altas son las condiciones rigurosas, más similares son las dos cadenas de polinucleótido. En las condiciones rigurosas influyen una variedad de factores, incluyendo la temperatura, concentración de sales y composición, aditivos orgánicos y no orgánicos, disolventes, etc. presentes tanto en las disoluciones de hibridación como en las de lavado, e incubaciones (y número de las mismas), como se describe con más detalle en las referencias citadas antes.

[0123] A la estabilidad de los dúplex de ADN le afecta factores tales como la composición de bases, longitud y grado de emparejamiento erróneo de los pares de bases. Las condiciones de hibridación se pueden ajustar para permitir que los ADN de diferentes secuencias relevantes hibriden. La temperatura de fusión (Tf) se define como la temperatura cuando 50% de las moléculas de dúplex se han disociado en sus constituyentes de cadenas sencillas. Las temperaturas de fusión de un dúplex perfectamente emparejado, en el que el tampón de hibridación contiene formamida como agente desnaturalizante, se puede calcular por las siguientes ecuaciones:

(I)

ADN-ADN:

(II)

ADN-ARN:

imagen1

imagen1

(III) ARN-ARN:

imagen1

en las que L es la longitud del dúplex formado, [Na+] es la concentración molar del ion sodio en la disolución de hibridación o de lavado, y % de G+C es el porcentaje de las bases (guanina + citosina) en el híbrido. Para híbridos emparejados de forma imperfecta, es necesario aproximadamente 1ºC para reducir la temperatura de fusión para cada 1% de emparejamientos erróneos.

[0124] Los experimentos de hibridación en general se llevan a cabo en un tampón con pH entre 6,8 y 7,4, aunque la velocidad de hibridación es casi independiente del pH a las fuerzas iónicas que es probable que se usen en el tampón de hibridación (Anderson y Young (1985) "Quantitative Filter Hybridisation." En: Hames y Higgins, ed., Nucleic Acid Hybridisation, A Practical Approach. Oxford, IRL Press, 73-111). Además, se puede usar uno o más de los siguientes para reducir la hibridación no específica: ADN de esperma de salmón tratado con ultrasonidos u otro ADN no complementario, albúmina de suero bovino, pirofosfato de sodio, dodecilsulfato de sodio (SDS), polivinilpirrolidona, Ficoll y disolución de Denhardt. El sulfato de dextrano y el polietilenglicol 6000 actúan para excluir el ADN de la disolución, aumentando así la concentración de ADN sonda eficaz y la señal de hibridación en una unidad de tiempo dada. En algunos casos, pueden ser deseables o necesarias condiciones incluso más rigurosas para reducir la hibridación de fondo y/o no específica. Estas condiciones se pueden crear con el uso de temperatura mayor, fuerza iónica menor y mayor concentración de un agente desnaturalizante tal como la formamida.

[0125] Las condiciones rigurosas se pueden ajustar para cribar fragmentos moderadamente similares tales como secuencias homólogas de organismos relacionados de forma distante, o fragmentos muy similares tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos relacionados de cerca. Las condiciones rigurosas se pueden ajustar durante la etapa de hibridación, o en los lavados posteriores a la hibridación. La concentración de sal, concentración de formamida, temperatura de hibridación y longitud de la sonda, son variables que se pueden usar para alterar las condiciones rigurosas (como se describe mediante la fórmula anterior). Como norma general las condiciones muy rigurosas se llevan a cabo típicamente de Tf-5ºC a Tf-20ºC, condiciones rigurosas moderadas de Tf-20ºC a Tf-35ºC y condiciones poco rigurosas de Tf-35ºC a Tf-50ºC, para dúplex de >150 pares de bases. La hibridación se puede llevar a cabo en condiciones de poco rigurosas a moderadas (25-50ºC por debajo de la Tf), seguido de lavados posteriores a la hibridación con condiciones rigurosas crecientes. Las velocidades de hibridación máximas en disolución se determina empíricamente que se producen a Tf-25ºC para dúplex de ADN-ADN y Tf-15ºC para dúplex de ARN-ADN. Opcionalmente, el grado de disociación se puede evaluar después de cada etapa de lavado para determinar la necesidad de posteriores etapas de lavado, de condiciones más rigurosas.

[0126] Las condiciones rigurosas altas se pueden usar para seleccionar secuencias de ácidos nucleicos con grados altos de identidad con las secuencias descritas. Un ejemplo de condiciones de hibridación rigurosas obtenidas en un procedimiento basado en filtro, tal como una transferencia Southern o Northern para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios que tienen más de 100 restos complementarios, es aproximadamente de 5ºC a 20ºC inferior que el punto de fusión térmico (Tf) para la secuencia específica con una fuerza iónica y pH definidos. Las condiciones usadas para la hibridación pueden incluir cloruro de sodio de aproximadamente 0,02 M a aproximadamente 0,15 M, caseína de aproximadamente 0,5% a aproximadamente 5%, SDS aproximadamente al 0,02% o N-laurilsarcosina aproximadamente al 0,1%, citrato de sodio de aproximadamente 0,001 M a aproximadamente 0,03 M, a temperaturas de hibridación entre aproximadamente 50ºC y aproximadamente 70ºC. Más preferiblemente, las condiciones muy rigurosas son cloruro de sodio aproximadamente 0,02 M, caseína aproximadamente al 0,5%, SDS aproximadamente al 0,02%, citrato de sodio aproximadamente 0,001 M, a una temperatura de aproximadamente 50ºC. Las moléculas de ácido nucleico que hibridan en condiciones rigurosas típicamente hibridarán con una sonda basada en la molécula de ADN entera o partes seleccionadas, por ejemplo, con una subsecuencia única del ADN.

[0127] La concentración de sal rigurosa normalmente será menor de aproximadamente NaCl 750 mM y citrato trisódico 75 mM. Se pueden obtener condiciones rigurosas crecientes con menos de aproximadamente NaCl 500 mM y citrato trisódico 50 mM, hasta condiciones incluso más rigurosas con menos de aproximadamente NaCl 250 mM y citrato trisódico 25 mM. La hibridación en condiciones poco rigurosas se puede obtener en ausencia de disolvente orgánico, por ejemplo, formamida, mientras que la hibridación en condiciones muy rigurosas se puede obtener en presencia de formamida al menos aproximadamente al 35% y más preferiblemente formamida al menos aproximadamente al 50%. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30ºC, más preferiblemente de al menos aproximadamente 37ºC y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 42ºC, con formamida presente. Los diversos parámetros adicionales, tales como el tiempo de hibridación, la concentración de detergentes, por ejemplo, de dodecilsulfato de sodio (SDS) y la fuerza iónica, son bien conocidas por el experto en la materia. Los diferentes niveles de condiciones rigurosas se logran combinando estas diferentes condiciones según sea necesario.

[0128] Las etapas de lavado que siguen a la hibridación también pueden tener distintas condiciones rigurosas; las etapas de lavado posteriores a la hibridación determinan principalmente la especificidad de la hibridación, siendo los factores más críticos la temperatura y la fuerza iónica de la disolución de lavado final. Las condiciones de lavado rigurosas se pueden aumentar disminuyendo la concentración de sales o aumentando la temperatura. Las condiciones rigurosas de la concentración de sales para las etapas de lavado serán preferiblemente menores de aproximadamente NaCl 3 mM y citrato sódico 3 mM, y lo más preferiblemente menores de aproximadamente NaCl 1,5 mM y citrato sódico 1,5 mM.

[0129] Por lo tanto, las condiciones de hibridación y de lavado que se pueden usar para unir y eliminar polinucleótidos con homología menor de la deseada con las secuencias de ácidos nucleicos o sus complementarias que codifican los factores de transcripción presentes incluyen, por ejemplo:

6X SSC a 65ºC; formamida al 50%, 4X SSC a 42ºC; o 0,5X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC; con, por ejemplo, 2 etapas de lavado de 10-30 minutos cada una. Las variaciones útiles de estas condiciones serán fácilmente evidentes para el experto en la materia.

[0130] Un experto en la materia no esperará una variación sustancial entre las especies de polinucleótidos abarcadas en el alcance de la presente invención, porque las condiciones muy rigurosas expuestas en las fórmulas anteriores dan polinucleótidos estructuralmente similares.

[0131] Si se desea, se pueden usar etapas de lavado incluso más rigurosas, incluyendo aproximadamente 0,2X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC y lavado dos veces, siendo cada etapa de lavado de aproximadamente 30 min, o aproximadamente 0,1 X SSC, SDS al 0,1% a 65ºC y lavado dos veces durante 30 min. La temperatura de las disoluciones de lavado normalmente será al menos aproximadamente 25ºC, y para condiciones más rigurosas al menos aproximadamente 42ºC. Las condiciones rigurosas de la hibridación se pueden aumentar incluso más usando las mismas condiciones que en las etapas de hibridación, aumentando la temperatura de lavado de aproximadamente 3ºC a aproximadamente 5ºC, y las condiciones rigurosas se pueden aumentar incluso más usando las mismas condiciones excepto que la temperatura de lavado se aumenta de aproximadamente 6ºC a aproximadamente 9ºC. Para la identificación de homólogos menos relacionados, las etapas de lavado se pueden llevar a cabo a una temperatura inferior, por ejemplo, 50ºC.

[0132] Un ejemplo de una etapa de lavado de condiciones rigurosas bajas usa una disolución y condiciones de al menos 25ºC en NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM y SDS al 0,1% durante 30 min. Se pueden obtener condiciones más rigurosas a 42ºC en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1% durante 30 min. Se obtienen condiciones incluso más rigurosas a 65-68ºC en una disolución de NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y SDS al 0,1%. Los procedimientos de lavado usarán en general al menos 2 etapas finales de lavado. Las variaciones adicionales de estas condiciones serán fácilmente evidentes para el experto en la materia (por ejemplo, en la solicitud de patente de EE.UU. Nº 20010010913).

[0133] Las condiciones rigurosas se pueden seleccionar de modo que un oligonucleótido que sea perfectamente complementario con el oligonucleótido codificante hibride con el oligonucleótido codificante con una relación de señal a ruido de al menos aproximadamente 5-10x mayor que la relación para la hibridación del oligonucleótido perfectamente complementario con un ácido nucleico que codifica un factor de transcripción conocido en la fecha de presentación de la solicitud. Puede ser deseable seleccionar condiciones para un ensayo particular de modo que se obtenga una relación de señal a ruido mayor, es decir, aproximadamente 15x o más. Por consiguiente, un ácido nucleico objeto hibridará con un oligonucleótido codificante único con una relación de señal a ruido de al menos 2x o mayor, comparado con la hibridación del oligonucleótido codificante con un ácido nucleico que codifica un polipéptido conocido. La señal particular dependerá del marcador usado en el ensayo pertinente, por ejemplo, un marcador fluorescente, un marcador colorimétrico, un marcador radiactivo, o similares. La hibridación marcada o sondas de PCR para detectar secuencias de polinucleótidos relacionadas se pueden producir por oligomarcaje, traslado de mellas, marcaje del extremo o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado.

[0134] La invención abarca todas las secuencias de polinucleótidos que son capaces de hibridar con las secuencias de polinucleótidos de la Lista de Secuencias, y fragmentos de las mismas en diferentes condiciones rigurosas (por ejemplo, en Wahl y Berger (1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, y Kimmel (1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). Las valoraciones de homología se proporcionan por hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN en condiciones rigurosas como entienden bien los expertos en la materia (Hames y Higgins, Eds. (1985) “Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach”, IRL Press, Oxford, Reino Unido). Las condiciones rigurosas se pueden ajustar para cribar fragmentos moderadamente similares, tales como secuencias homólogas de organismos relacionados lejanamente, hasta fragmentos muy similares, tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos estrechamente relacionados. Los lavados posteriores a la hibridación determinan las condiciones rigurosas.

Identificación de polinucleótidos o ácidos nucleicos con bibliotecas de expresión

[0135] Además de los procedimientos de hibridación, se pueden obtener polipéptidos homólogos de factores de transcripción mediante el cribado de una biblioteca de expresión usando anticuerpos específicos para uno o más factores de transcripción. Proporcionando en el presente documento el factor de transcripción descrito y secuencias de ácidos nucleicos homólogas de los factores de transcripción, el o los polipéptidos codificados se pueden expresar y purificar en un sistema de expresión heterólogo (por ejemplo, E. coli) y usar para producir anticuerpos (monoclonales o policlonales) específicos para el o los polipéptidos en cuestión. También se pueden producir anticuerpos contra péptidos sintéticos derivados de secuencias o subsecuencias de aminoácidos de un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción. Los procedimientos para producir anticuerpos son bien conocidos en la técnica y se describen en Harlow y Lane (1988), “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York. Dichos anticuerpos se pueden usar después para cribar una biblioteca de expresión producida a partir de la planta de la cual se desean clonar homólogos de factores de transcripción adicionales, usando los procedimientos descritos antes. Los ADNc seleccionados se pueden confirmar mediante secuenciación y actividad enzimática.

Variaciones de secuencia

[0136] Los expertos en la materia apreciarán fácilmente que cualquiera de una variedad de secuencias de polinucleótidos son capaces de codificar los factores de transcripción y polipéptidos homólogos de factores de transcripción de la invención. Debido a la degeneración del código genético, muchos polinucleótidos diferentes pueden codificar polipéptidos idénticos y/o sustancialmente similares además de las secuencias ilustradas en la Lista de Secuencias. Los ácidos nucleicos que tienen una secuencia que difiere de las secuencias mostradas en la Lista de Secuencias, o secuencias complementarias, que codifican péptidos funcionalmente equivalentes (es decir, péptidos que tienen el mismo grado de actividad biológica equivalente o similar) pero difieren en la secuencia respecto a la secuencia mostrada en la Lista de Secuencias debido a la degeneración del código genético, también están dentro del alcance de la invención.

[0137] Las secuencias de polinucleótidos alteradas que codifican polipéptidos incluyen las secuencias con eliminaciones, inserciones o sustituciones de diferentes nucleótidos, que dan como resultado un polinucleótido que codifica un polipéptido con al menos una característica funcional de los presentes polipéptidos. Están incluidos en esta definición los polimorfismos que pueden ser o no fácilmente detectables usando una sonda de oligonucleótido particular del polinucleótido que codifica los presentes polipéptidos, y la hibridación inadecuada o inesperada con variantes alélicas, con un locus distinto del locus cromosómico normal para la secuencia de polinucleótido que codifica los presentes polipéptidos.

[0138] Las variantes alélicas se refieren a cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupan el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente por mutación, y puede dar como resultado polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones de genes pueden ser silenciosas (es decir no hay cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante alélica también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. La variante por corte y empalme se refiere a formas alternativas de ARN transcritas a partir de un gen. La variación por corte y empalme surge de forma natural por el uso de sitios de corte y empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita, o de forma menos común entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede producir varios ARNm transcritos a partir del mismo gen. Las variantes por corte y empalme pueden codificar polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos alterada. La expresión variante por corte y empalme también se usa en el presente documento para indicar una proteína codificada por una variante por corte y empalme de un ARNm transcrito a partir de un gen.

[0139] Los expertos en la materia reconocerán que, por ejemplo, G2133, SEQ ID NO: 12, representa un solo factor de transcripción, y se puede esperar que se produzca variación alélica y corte y empalme alternativo. Las variantes alélicas de la SEQ ID NO: 11 se pueden clonar mediante hibridación de bibliotecas de ADNc o genómicas de diferentes organismos individuales de acuerdo con procedimientos estándar. Las variantes alélicas de la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 11, incluyendo las que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las que las mutaciones producen cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, como lo están las proteínas que son variantes alélicas de la SEQ ID NO: 12. Los ADNc generados a partir de ARNm de corte y empalme alternativo, que retienen las propiedades del factor de transcripción están incluidos dentro del alcance de la presente invención, como lo están los polipéptidos codificados por dichos ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y variantes por corte y empalme de estas secuencias se pueden clonar por hibridación de bibliotecas de ADNc o genómicas de diferentes organismos o tejidos individuales de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica (documento USPN 6.388.064).

[0140] Por lo tanto, además de las secuencias expuestas en la Lista de Secuencias, la invención también abarca moléculas de ácidos nucleicos relacionadas que incluyen variantes alélicas o por corte y empalme de las secuencias de la Lista de Secuencias, e incluyen secuencias que son complementarias de cualquiera de las secuencias de nucleótidos anteriores. Las moléculas de ácido nucleico relacionadas también incluyen secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido que comprende una sustitución, modificación, adición y/o eliminación de uno o más restos de aminoácidos comparado con las secuencias de polipéptidos de la Lista de Secuencias y equivalogos. Dichos polipéptidos relacionados pueden comprender, por ejemplo, adiciones y/o eliminaciones de uno

o más sitios de glicosilación unidos a N o unidos a O, o una adición y/o una eliminación de uno o más restos de cisteína.

[0141] Por ejemplo, la tabla 3 ilustra, por ejemplo, que los codones AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, y TCT codifican todos el mismo aminoácido: la serina. Por consiguiente, en cada posición en la secuencia en la que hay un codón que codifica una serina, se puede usar cualquiera de las secuencias trinucleótidas anteriores sin alterar el polipéptido codificado.

Tabla 3

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[0142] Las alteraciones de secuencia que no cambien la secuencia de aminoácidos codificada por el polinucleótido se denominan variaciones “silenciosas”. Con la excepción de los codones ATG y TGG, que codifican la metionina y el triptófano, respectivamente, cualquiera de los posibles codones para el mismo aminoácido se puede sustituir por una variedad de técnicas, por ejemplo, mutagénesis dirigida, disponible en la técnica. Por consiguiente, todas y cualquiera de dichas variaciones de una secuencia seleccionada de la tabla anterior son una característica de la invención.

[0143] Además de las variaciones silenciosas, se pueden hacer otras variaciones conservativas que alteran uno o algunos restos de aminoácidos en el polipéptido codificado, sin alterar la función del polipéptido, y estas variantes conservativas son también una característica de la invención.

[0144] Por ejemplo, la invención también prevé sustituciones, eliminaciones e inserciones introducidas en las secuencias proporcionadas en la Lista de Secuencias. Dichas modificaciones de secuencia se pueden diseñar en una secuencia mediante mutagénesis dirigida (Wu (ed.) Methods Enzymol. (1993) vol. 217, Academic Press) o por otros procedimientos indicados más adelante. Las sustituciones de aminoácidos normalmente son de restos individuales; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente de 1 a 10 restos de aminoácidos; y las eliminaciones estarán en el intervalo de aproximadamente 1 a 30 restos. En una realización, las eliminaciones o inserciones se hacen en pares adyacentes, por ejemplo, una eliminación de dos restos o inserción de dos restos. Se pueden combinar sustituciones, eliminaciones, inserciones o cualquier combinación de los mismos para llegar a una secuencia. Las mutaciones que se hacen en el polinucleótido que codifica el factor de transcripción no deben poner a la secuencia fuera del marco de lectura y no deben crear regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Preferiblemente, el polipéptido codificado por el ADN realiza la función deseada.

[0145] Las sustituciones conservativas son aquellas en las que se ha eliminado al menos un resto en la secuencia de aminoácidos y se ha insertado un resto diferente en su lugar. Dichas sustituciones en general se hacen de acuerdo con la tabla 4 cuando se desea mantener la actividad de la proteína. La tabla 4 muestra los aminoácidos que se pueden sustituir por un aminoácido en una proteína y que se considera normalmente como sustituciones conservativas.

Tabla 4

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5 [0146] Sustituciones similares son aquellas en las que al menos un resto de la secuencia de aminoácidos se ha eliminado y se ha insertado en su lugar un resto diferente. Dichas sustituciones en general se hacen de acuerdo con la tabla 5 cuando se desea mantener la actividad de la proteína. La tabla 5 muestra los aminoácidos que se pueden sustituir por un aminoácido en una proteína y que se consideran normalmente como sustituciones

10 estructurales y funcionales. Por ejemplo, un resto en la columna 1 de la tabla 5 se puede sustituir por un resto en la columna 2; además, un resto en la columna 2 de la tabla 5 se puede sustituir por el resto de la columna 1.

Tabla 5

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[0147] Se pueden seleccionar sustituciones que son menos conservativas que las de la tabla 5 escogiendo restos que difieren de forma más significativa en su efecto en el mantenimiento de (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en la zona de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o de hélice, (b) la carga o hidrofobia de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera que en general produzcan cambios más grandes en las propiedades de la proteína serán aquellas en las que

(a) un resto hidrófobo, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo, se sustituye por un resto hidrófilo, por ejemplo, serilo o treonilo, (o a la inversa); (b) cualquier otro resto se sustituye por una cisteína o prolina (o a la inversa); (c) un resto electronegativo, por ejemplo, glutamilo o aspartilo, se sustituye por un resto que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo (o a la inversa); o (d) un resto que no tiene cadena lateral, por ejemplo, glicina, se sustituye por uno que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina (o a la inversa).

Modificación adicional de las secuencias de la invención -mutación/evolución forzada

[0148] Además de generar sustituciones silenciosas o conservativas como se ha indicado antes, la presente invención incluye opcionalmente procedimientos para modificar las secuencias de la lista de secuencias. En los procedimientos, se usan procedimientos de modificación de ácidos nucleicos o proteínas para alterar las secuencias dadas para producir más secuencias y/o para modificar química o enzimáticamente secuencias dadas para cambiar las propiedades de los ácidos nucleicos o proteínas.

[0149] Por lo tanto, en una realización, las secuencias de ácidos nucleicos dadas se modifican, por ejemplo, de acuerdo con la mutagénesis estándar o procedimientos de evolución artificial para producir secuencias modificadas. Las secuencias modificadas se pueden crear usando polinucleótidos naturales purificados aislados de cualquier organismo o se pueden sintetizar a partir de composiciones y productos químicos purificados usando medios químicos bien conocidos para el experto en la materia. Por ejemplo, Ausubel, véase antes, proporciona detalles adicionales de los procedimientos de mutagénesis. Los procedimientos de evolución forzada artificial se describen, por ejemplo, en Stemmer (1994) Nature 370: 389-391, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 1074710751, y patentes de EE.UU. 5.811.238, 5.837.500, y 6.242.568. Se describen procedimientos para diseñar factores de transcripción sintéticos y otros polipéptidos, por ejemplo, en Zhang y col. (2000) J. Biol. Chem. 275: 33850-33860, Liu y col. (2001) J. Biol. Chem. 276: 11323-11334, e Isalan y col. (2001) Nature Biotechnol. 19: 656-660. También están disponibles muchos otros procedimientos de mutación y de evolución y se basará en el criterio del experto.

[0150] Igualmente, se puede llevar a cabo la alteración química o enzimática de ácidos nucleicos expresados y polipéptidos mediante procedimientos estándar. Por ejemplo, una secuencia se puede modificar por adición de lípidos, azúcares, péptidos, compuestos orgánicos o inorgánicos, por la inclusión de nucleótidos o aminoácidos modificados, o similares. Por ejemplo, se ilustran técnicas de modificación de proteínas en Ausubel, véase antes. En el presente documento se pueden encontrar más detalles sobre las modificaciones químicas y enzimáticas. Estos procedimientos de modificación se pueden usar para modificar cualquier secuencia dada, o para modificar cualquier secuencia producida por los diferentes procedimientos de modificación por mutación y evolución artificial indicados en el presente documento.

[0151] Por consiguiente, la invención proporciona la modificación de cualquier ácido nucleico dado por mutación, evolución, modificación química o enzimática, u otros procedimientos disponibles, así como los productos producidos por la práctica de dichos procedimientos, por ejemplo, usando las secuencias del presente documento como un sustrato de partida para los diferentes procedimientos de modificación.

[0152] Por ejemplo, se puede usar una secuencia codificante optimizada que contiene codones preferidos por un hospedador procariota o eucariota particular, por ejemplo, para aumentar la velocidad de traducción o para producir transcritos de ARN recombinante que tienen las propiedades deseadas, tales como una semivida más prolongada, comparado con los transcritos producidos usando una secuencia no optimizada. Los codones de parada de la traducción también se pueden modificar para reflejar la preferencia del hospedador. Por ejemplo, los codones de parada preferidos para Saccharomyces cerevisiae y mamíferos son TAA y TGA, respectivamente. El codón de parada preferido para las plantas monocotiledóneas es TGA, mientras que los insectos y E. coli prefieren usar TAA como codón de parada.

[0153] Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención también se pueden diseñar con el fin de alterar una secuencia codificante por una variedad de razones, incluyendo, pero sin limitar, alteraciones que modifican la secuencia para facilitar la clonación, procesamiento y/o expresión del producto génico. Por ejemplo, se introducen opcionalmente alteraciones usando técnicas que son conocidas en la materia, por ejemplo mutagénesis dirigida, para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar patrones de glicosilación, para cambiar preferencias de codones, para introducir sitios de corte y empalme, etc.

[0154] Además, un fragmento o dominio derivado de cualquiera de los polipéptidos de la invención se puede combinar con dominios derivados de otros factores de transcripción o dominios sintéticos para modificar la actividad biológica de un factor de transcripción. Por ejemplo, un dominio de unión al ADN derivado de un factor de transcripción de la invención se puede combinar con el dominio de activación de otro factor de transcripción o con un dominio de activación sintético. Un dominio de activación de la transcripción ayuda en el inicio de la transcripción a partir de un sitio de unión al ADN. Los ejemplos incluyen la región de activación de la transcripción de VP16 o GAL4 (Moore y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 376-381; Aoyama y col. (1995) Plant Cell 7: 1773-1785), péptidos derivados de secuencias bacterianas (Ma y Ptashne (1987) Cell 51: 113-119) y péptido sintéticos (Giniger y Ptashne (1987) Nature 330: 670-672).

Expresión y modificación de polipéptidos

[0155] Típicamente, las secuencias de polinucleótidos de la invención se incorporan en moléculas de ADN (o ARN) recombinantes que dirigen la expresión de polipéptidos de la invención en células hospedadoras adecuadas, plantas transgénicas, sistemas de traducción in vitro, o similares. Debido a la degeneración inherente del código genético, cualquier secuencia listada se puede sustituir por secuencias de ácidos nucleicos que codifican sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una funcionalmente equivalente, para proporcionar la clonación y expresión del homólogo pertinente.

[0156] Las plantas transgénicas de la presente invención que comprenden secuencias de polinucleótidos recombinantes en general derivan de plantas parentales, que pueden ser ellas mismas plantas no transformadas (o no transgénicas). Estas plantas transgénicas pueden tener un gen del factor de transcripción “inactivado” (por ejemplo, con una inserción genómica por recombinación homóloga, una construcción no codificante o de ribozima) o expresado en una extensión normal o silvestre. Sin embargo, las plantas “descendientes” transgénicas que expresan en exceso, presentarán mayores niveles de ARNm, en las que el ARNm codifica un factor de transcripción, es decir, una proteína de unión al ADN que es capaz de unirse a una secuencia reguladora de ADN y que incluye la transcripción, y preferiblemente, la expresión de un gen del rasgo de la planta. Preferiblemente, el nivel de expresión del ARNm será al menos 3 veces mayor que el de la planta parental, o más preferiblemente al menos 10 veces mayor que los niveles de ARNm comparados con dicha planta parental, y lo más preferiblemente al menos 50 veces mayor comparado con dicha planta parental.

Vectores, promotores y sistemas de expresión

[0157] La presente invención incluye construcciones recombinantes que comprenden una o más secuencias de ácidos nucleicos del presente documento. Las construcciones típicamente comprenden un vector, tal como un plásmido, un cósmido, un fago, un virus (por ejemplo un virus de planta), un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), o similares, en el que se habrá insertado una secuencia de ácido nucleico de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, la construcción comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor operativamente unido a la secuencia. Los expertos en la materia conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y están disponibles en el comercio.

[0158] Los textos generales que describen técnicas de biología molecular útiles en el presente documento, incluyendo el uso y la producción de vectores, promotores y muchos otros temas relevantes, incluyen Berger, Sambrook, véase antes y Ausubel, véase antes. Cualquiera de las secuencias identificadas se puede incorporar en un casete o vector, por ejemplo, para la expresión en plantas. Se ha descrito una serie de vectores de expresión adecuados para la transformación estable de células de plantas o para el establecimiento de plantas transgénicas, incluyendo los descritos en Weissbach y Weissbach (1989) “Methods for Plant Molecular Biology” Academic Press, y Gelvin y col. (1990) “Plant Molecular Biology Manual”, Kluwer Academic Publishers. Los ejemplos específicos incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como los descritos en Herrera-Estrella y col. (1983) Nature 303: 209, Bevan (1984) Nucleic Acids Res. 12: 8711-8721, Klee (1985) Bio/Technology 3: 637642, para plantas dicotiledóneas.

[0159] Alternativamente, se pueden usar vectores no-Ti para transferir el ADN a plantas monocotiledóneas y células usando técnicas de suministro de ADN libre. Dichos procedimientos pueden implicar, por ejemplo, el uso de liposomas, electroporación, bombardeo de microproyectiles, filamentos de carburo de silicio y virus. Usando estos procedimientos se pueden producir plantas transgénicas tales como trigo, arroz (Gordon-Kamm (1990) Plant Cell 2: 603-618). Un embrión inmaduro también puede ser un buen tejido diana para monocotiledóneas para las técnicas de suministro directo de ADN usando la pistola de partículas (Weeks y col. (1993) Plant Physiol. 102: 1077-1084; Vasil (1993) Bio/Technology 10: 667-674; Wan y Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48, y para la transferencia de ADN mediada por Agrobacterium (Ishida y col. (1996) Nature Biotechnol. 14: 745-750).

[0160] Típicamente, los vectores de transformación de plantas incluyen una o más secuencias codificantes clonadas de la planta (genómicas o ADNc) bajo el control transcripcional de secuencias reguladoras 5’ y 3’ y un marcador seleccionable dominante. Dichos vectores de transformación de plantas típicamente contienen también un promotor (por ejemplo, una región reguladora que controla la expresión inducible o constitutiva, regulada por el medio ambiente o el desarrollo, específica de célula o tejido), un sitio de inicio de la transcripción, una señal de procesamiento del ARN (tal como sitios de corte y empalme, intrones), un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

[0161] Una utilidad potencial de los polinucleótidos de los factores de transcripción descritos en el presente documento es el aislamiento de elementos promotores de estos genes, que se pueden usar para programar la expresión en plantas de cualesquiera genes. Cada gen de factor de transcripción descrito en el presente documento se expresa de una forma única, determinada por los elementos promotores localizados en la dirección 5’ del inicio de la traducción, y además dentro de un intrón del gen del factor de transcripción o en la dirección 3’ del codón determinación del gen. Como se sabe en la técnica, para una parte significativa de los genes, las secuencias promotoras están situadas totalmente en la región directamente en la dirección 5’ del inicio de la traducción. En dichos casos, típicamente las secuencias promotoras están situadas dentro de 2,0 kb del inicio de la traducción, o dentro de 1,5 kb del inicio de la traducción, con frecuencia dentro de 1,0 kb del inicio de la traducción, y a veces dentro de 0,5 kb del inicio de la traducción.

[0162] Las secuencias promotoras se pueden aislar de acuerdo con procedimientos conocidos para el experto en la materia.

[0163] Los ejemplos de promotores de plantas constitutivos que pueden ser útiles para expresar la secuencia de TF incluyen: el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), que confiere expresión de alto nivel constitutiva en la mayoría de los tejidos de plantas (por ejemplo, en Odell y col. (1985) Nature 313: 810-812); el promotor de la nopalina sintasa (An y col. (1988) Plant Physiol. 88: 547-552); y el promotor de la octopina sintasa (Fromm y col. (1989) Plant Cell 1: 977-984).

[0164] Los factores de transcripción de la invención pueden estar operativamente unidos a un promotor específico que hace que el factor de transcripción sea expresado en respuesta a señales medioambientales, específicas de tejido o temporales. Se puede usar una variedad de promotores de genes de plantas que regulan la expresión de genes en respuesta a señales medioambientales, hormonales, químicas, de desarrollo, y de una forma activada por tejido, para la expresión de una secuencia de TF en plantas. La elección de un promotor se basa en gran medida en el fenotipo de interés y se determina por factores tales como el tejido (por ejemplo, semilla, fruta, raíz, polen, tejido vascular, flor, carpelo, etc.), capacidad de inducción (por ejemplo, en respuesta a heridas, calor, frío, sequía, luz, patógenos, etc.), el tiempo, la etapa de desarrollo, y similares. Se han caracterizado numerosos promotores conocidos y se pueden usar favorablemente para promover la expresión de un polinucleótido de la invención en una planta o célula transgénica de interés. Por ejemplo, los promotores específicos de tejido incluyen: promotores específicos de semilla (tal como el promotor de napina, faseolina o DC3 descritos en la patente de EE.UU. nº 5.773.697), promotores específicos de fruto que son activos durante la maduración del fruto (tal como el promotor dru 1 (patente de EE.UU. nº 5.783.393), o el promotor 2A11 (patente de EE.UU. nº 4.943.674) y el promotor de la poligalacturonasa del tomate (Bird y col. (1988) Plant Mol. Biol. 11: 651-662), promotores específicos de raíz, tales como los descritos en las patentes de EE.UU. Nº 5.618.988, 5.837.848 y 5.905.186, promotores activos en el polen tales como PTA29, PTA26 y PTA13 (patente de EE.UU. nº 5.792.929), promotores activos en el tejido vascular (Ringli y Keller (1998) Plant Mol. Biol. 37: 977-988), específicos de flores (Kaiser y col. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 231-243), polen (Baerson y col. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1947-1959), carpelos (Ohl y col. (1990) Plant Cell

2: 837-848), polen y óvulos (Baerson y col. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 255-267), promotores inducibles por auxina (tales como los descritos en van der Kop y col. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 979-990 o Baumann y col., (1999) Plant Cell 11: 323-334), promotor inducible por citoquinas (Guevara-Garcia (1998) Plant Mol. Biol. 38: 743-753), promotores que responden a la giberelina (Shi y col. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1053-1060, Willmott y col. (1998) Plant Molec. Biol. 38: 817-825) y similares. Son promotores adicionales los que producen expresión en respuesta al calor (Ainley y col. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 13-23), la luz (por ejemplo el promotor del guisante rbcS-3A, Kuhlemeier y col. (1989) Plant Cell 1: 471-478), y el promotor del maíz rbcS, Schaffner y Sheen (1991) Plant Cell 3: 997-1012); heridas (por ejemplo, wunI, Siebertz y col. (1989) Plant Cell 1: 961-968); patógenos (tales como el promotor PR-1 descrito en Buchel y col. (1999) Plant Mol. Biol. 40: 387-396, y el promotor PDFI.2 descrito en Manners y col. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1071-1080), y productos químicos tales como el jasmonato de metilo o ácido salicílico (Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108). Además, el momento de la expresión se puede controlar usando promotores tales como los que actúan en la senescencia (Gan y Amasino (1995) Science 270: 1986-1988); o tarde en el desarrollo de la semilla (Odell y col. (1994) Plant Physiol. 106: 447458).

[0165] Los vectores de expresión de plantas también pueden incluir señales de procesamiento del ARN que pueden estar situadas dentro, en dirección 5’ o en dirección 3’ de la secuencia codificante. Además, los vectores de expresión pueden incluir secuencias reguladoras adicionales a partir de la región 3’ no traducida de genes de plantas, por ejemplo, una región 3’ terminadora para aumentar la estabilidad del ARNm, tal como la región terminadora PI-II de la patata o las regiones 3’ terminadoras de la octopino o nopalina sintasa.

Elementos de expresión adicionales

[0166] Las señales de inicio específicas pueden ayudar a la traducción eficaz de las secuencias codificantes. Estas señales pueden incluir, por ejemplo, el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. Pueden no ser necesarias señales de control de la traducción adicionales cuando se insertan una secuencia codificante, su codón de inicio y secuencias en la dirección 5’ en el vector de expresión adecuado. Sin embargo, en los casos en los que sólo se inserta la secuencia codificante (por ejemplo, una secuencia codificante de proteína madura) o una parte de ella, se pueden proporcionar por separado señales de control de la transcripción exógenas incluyendo el codón de inicio ATG. El codón de inicio se proporciona en el marco de lectura correcto para facilitar la transcripción. Los elementos transcripcionales y codones de inicio exógenos pueden ser de diferentes orígenes, tanto natural como sintético. La eficacia de la expresión se puede potenciar por la inclusión de potenciadores adecuados para el sistema celular que se usa.

Hospedadores de expresión

[0167] La presente invención también se refiere a células hospedadoras que se transducen con vectores de la invención, y a la producción de polipéptidos de la invención (incluyendo fragmentos de los mismos) por técnicas recombinantes. Las células hospedadoras se transforman por ingeniería genética (es decir, se introducen ácidos nucleicos, por ejemplo, se transducen, transforman o transfectan), con los vectores de esta invención, que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión que comprenden los ácidos nucleicos relevantes del presente documento. El vector es opcionalmente un plásmido, una partícula vírica, un fago, un ácido nucleico desnudo, etc. Las células hospedadoras transformadas por ingeniería genética se pueden cultivar en medios nutrientes convencionales modificados según sea adecuado para la activación de promotores, selección de transformantes o amplificación el gen relevante. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, pH y similares, son las usadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión, y serán evidentes para el experto en la materia y se encuentran en la referencias citadas en el presente documento, incluyendo, Sambrook, véase antes, y Ausubel, véase antes.

[0168] La célula hospedadora puede ser una célula eucariota, tal como una célula de levadura o una célula de planta, o la célula hospedadora puede ser una célula procariota, tal como una célula bacteriana. Los protoplastos de planta también son adecuados para algunas aplicaciones. Por ejemplo, se introducen fragmentos de ADN en tejidos de planta, células de plantas cultivadas o protoplastos de planta por procedimientos estándar, que incluyen la electroporación (Fromm y col. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 5824-5828), infección por vectores víricos tales como el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Hohn y col., (1982) “Molecular Biology of Plant Tumors” Academic Press, Nueva York, NY, pág. 549-560; documento US 4.407.956), penetración balística de alta velocidad mediante partículas pequeñas con el ácido nucleico dentro de la matriz de perlas o partículas pequeñas o en la superficie (Klein y col. (1987) Nature 327: 70-73), uso de polen como vector (documento WO 85/01856), o uso de Agrobacterium tumefaciens o A. rhizogenes que lleva un plásmido de ADN-T en el que se clona fragmentos de ADN. El plásmido ADN-T se transmite a las células de la planta por infección mediante Agrobacterium tumefaciens, y una parte se integra establemente en el genoma de la planta (Horsch y col. (1984) Science 233: 496-498; Fraley y col. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 4803-4807).

[0169] La célula puede incluir un ácido nucleico de la invención que codifica un polipéptido, en el que la célula expresa un polipéptido de la invención. La célula también puede incluir secuencias de vectores, o similares. Además, las células y plantas transgénicas que incluyen cualquier polipéptido o ácido nucleico anterior o a lo largo de esta memoria descriptiva, por ejemplo, producidos por transducción de un vector de la invención, son una característica adicional de la invención.

[0170] Para la producción de alto rendimiento y a largo plazo de proteínas recombinantes, se puede usar la expresión estable. Las células hospedadoras transformadas con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la invención se cultivan opcionalmente en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína codificada del cultivo celular. La proteína o fragmento de la misma producida por una célula recombinante puede ser secretada, estar unida a membrana, o contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. Como entenderá el experto en la materia, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican proteínas maduras de la invención, se pueden diseñar con secuencias señal que dirigen la secreción de los polipéptidos maduros a través de la membrana celular procariota o eucariota.

Restos de aminoácidos modificados

[0171] Los polipéptidos de la invención pueden contener uno o más restos de aminoácidos modificados. La presencia de aminoácidos modificados puede ser ventajosa, por ejemplo, para aumentar la semivida del polipéptido, reducir la antigenicidad o toxicidad del polipéptido, aumentar la estabilidad en el almacenamiento del polipéptido, o similares. El o los restos de aminoácidos se modifican, por ejemplo, simultáneamente con la traducción o después de la traducción durante la producción recombinante o se modifican por medios sintéticos o químicos.

[0172] Los ejemplos no limitantes de un resto de aminoácido modificado incluyen la incorporación u otro uso de aminoácidos acetilados, aminoácidos glicosilados, aminoácidos sulfatados, aminoácidos prenilados (por ejemplo, farnesilados, geranilgeranilados), aminoácidos modificados con PEG (por ejemplo, “PEGilados”), aminoácidos biotinilados, aminoácidos carboxilados, aminoácidos fosforilados, etc. La bibliografía está llena de referencias adecuadas para guiar al experto en la modificación de los restos de aminoácidos.

[0173] Los restos de aminoácidos modificados pueden prevenir o aumentar la afinidad del polipéptido por otra molécula, incluyendo, pero sin limitar, polinucleótido, proteínas, hidratos de carbono, lípidos y derivados de lípidos, y otros compuestos orgánicos o sintéticos.

Identificación de factores de proteínas adicionales

[0174] Un factor de transcripción proporcionado por la presente invención también se puede usar para identificar moléculas endógenas o exógenas adicionales que pueden afectar al fenotipo o a un rasgo de interés. Dichas moléculas incluyen moléculas endógenas que actúan a un nivel transcripcional mediante un factor de transcripción de la invención para modificar un fenotipo como se desea. Por ejemplo, los factores de transcripción se pueden usar para identificar uno o más genes en la dirección 3’ que se someten a un efecto regulador del factor de transcripción. En un procedimiento, un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción de la invención se expresa en una célula hospedadora, por ejemplo, una célula de planta transgénica, tejido o explante, y se hace el seguimiento de los productos de expresión, ARN o proteína, de dianas probables o aleatorias, por ejemplo, por hibridación con una micromatriz de sondas de ácidos nucleicos correspondientes a los genes expresados en un tejido o tipo de célula de interés, mediante electroforesis en gel bidimensional de los productos proteínicos, o por cualquier otro procedimiento conocido en la técnica para evaluar la expresión de productos génicos a nivel del ARN

o proteína. Alternativamente, se puede usar un factor de transcripción de la invención para identificar secuencias promotoras (tales como sitios de unión en secuencias de ADN) implicadas en la regulación de una diana en la dirección 3’. Después de identificar una secuencia promotora, se pueden modificar las interacciones entre el factor de transcripción y la secuencia promotora mediante cambios en nucleótidos específicos en la secuencia promotora o aminoácidos específicos en el factor de transcripción que interacciona con la secuencia promotora, para alterar un rasgo de la planta. Típicamente, los sitios de unión al ADN de factores de transcripción se identifican mediante ensayos de desplazamiento en gel. Después de identificar las regiones promotoras, las secuencias de la región promotora se pueden usar en matrices de ADN de doble cadena para identificar moléculas que afectan a las interacciones de los factores de transcripción con sus promotores (Bulyk y col. (1999) Nature Biotechnol. 17: 573577).

[0175] Los factores de transcripción identificados también son útiles para identificar proteínas que modifican la actividad del factor de transcripción. Dicha modificación se puede producir por modificación covalente, tal como por fosforilación o por interacciones de proteína-proteína (homo o heteropolímero). Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para detectar interacciones de proteína–proteína. Entre los procedimientos que se pueden usar están la inmunoprecipitación simultánea, entrecruzamiento y purificación simultánea a través de gradientes o columnas cromatográficas, y el sistema de doble híbrido en levaduras.

[0176] El sistema de doble híbrido detecta interacciones de proteínas in vivo y se describen en Chien y col. ((1991) Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 9578-9582) y está disponible en el comercio en Clontech (Palo Alto, Calif.). En dicho sistema, se construyen plásmidos que codifican dos proteínas híbridas: una consiste en el dominio de unión al ADN de una proteína activadora de la transcripción fusionada con el polipéptido del TF y la otra consiste en el dominio de activación de la proteína activadora de la transcripción fusionado con una proteína desconocida que es codificada por un ADNc que se ha recombinado en el plásmido como parte de una biblioteca de ADNc. El plásmido de fusión del dominio de unión al ADN y la biblioteca de ADNc se transforman en una cepa de levaduras de Saccharomyces cerevisiae que contiene una gen indicador (por ejemplo, lacZ) cuya región reguladora contiene el sitio de unión al activador de la transcripción. Cualquiera de las proteínas híbridas sola no puede activar la transcripción del gen indicador. La interacción de las dos proteínas híbridas reconstituye la proteína activadora funcional y da como resultado de expresión del gen indicador, que se detecta mediante un ensayo para el producto del gen indicador. Después, los plásmidos de la biblioteca responsables de la expresión del gen indicador se aíslan y se secuencian para identificar las proteínas codificadas por los plásmidos de la biblioteca. Después de identificar las proteínas que interaccionan con los factores de transcripción, se pueden llevar a cabo ensayos para los compuestos que interfieren con las interacciones de proteína–proteína del TF.

Subsecuencias

[0177] También se contemplan usos de los polinucleótidos, denominados también en el presente documento como oligonucleótidos, que típicamente tienen al menos 12 o más bases que hibridan en condiciones rigurosas o muy rigurosas con una secuencia de polinucleótido descrita antes. Los polinucleótidos se pueden usar como sondas, cebadores, agentes de sentido directo y sentido contrario, y similares, de acuerdo con los procedimientos indicados antes.

[0178] Las subecuencias de los polinucleótidos de la invención, incluyendo fragmentos de polinucleótido y oligonucleótidos, son útiles como sondas de ácidos nucleicos y cebadores. Un oligonucleótido adecuado para usar como sonda o cebador tiene al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud, más a menudo al menos aproximadamente 18 nucleótidos, a menudo al menos aproximadamente 21 nucleótidos, con frecuencia al menos aproximadamente 30 nucleótidos, o aproximadamente 40 nucleótidos, o más de longitud. Una sonda de ácido nucleico es útil en protocolos de hibridación, por ejemplo, para identificar homólogos de polipéptidos adicionales de la invención, incluyendo protocolos para experimentos de micromatrices. Los cebadores se pueden volver a asociar con una cadena de ADN diana complementaria mediante hibridación de ácido nucleico para formar un híbrido entre el cebador y la cadena de ADN diana, y después extender a lo largo de la cadena de ADN diana mediante una enzima ADN polimerasa. Se pueden usar parejas de cebadores para la amplificación de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) u otros procedimientos de amplificación de ácidos nucleicos (Sambrook, véase antes, Ausubel, véase antes).

[0179] Además, la invención incluye un polipéptido aislado o recombinante que incluye una subsecuencia de al menos aproximadamente 15 aminoácidos contiguos codificados por los polinucleótidos recombinantes o aislados de la invención. Por ejemplo, dichos polipéptidos, o dominios o fragmentos de los mismos, se pueden usar como inmunógenos, por ejemplo, para producir anticuerpos específicos para la secuencia de polipéptido, o como sondas para detectar una secuencia de interés. El tamaño de una subsecuencia puede estar en el intervalo de aproximadamente 15 aminoácidos de longitud hasta e incluyendo la longitud completa del polipéptido.

[0180] Para que lo abarque la presente invención, un polipéptido expresado que comprende dicha subsecuencia de polipéptido realiza al menos una función biológica del polipéptido intacto sustancialmente de la misma forma, o en una extensión similar, a como lo hace el polipéptido intacto. Por ejemplo, un fragmento de polipéptido puede comprender un patrón estructural reconocible o dominio funcional tal como un dominio de unión al ADN que activa la transcripción, por ejemplo, mediante unión a una región promotora de ADN específica de un dominio de activación, o un dominio para interacciones de proteína–proteína.

Producción de plantas transgénicas

Modificación de rasgos

[0181] Los polinucleótidos de la invención se usan de forma favorable para producir plantas transgénicas con diferentes rasgos o características que se han modificado de una forma conveniente, por ejemplo, para mejorar las características de las semillas de una planta. Por ejemplo, la alteración de los niveles o patrones de expresión (por ejemplo, patrones de expresión espacial o temporal) de uno o más de los factores de transcripción (u homólogos de factores de transcripción) de la invención, comparado con los niveles de la misma proteína encontrados en una planta silvestre, se puede usar para modificar rasgos de una planta. Un ejemplo ilustrativo de la modificación de rasgos, características mejoradas, mediante la alteración de los niveles de expresión de un factor de transcripción particular se describe a continuación en los ejemplos y la lista de secuencias.

Arabidopsis como un sistema modelo

[0182] Arabidopsis thaliana es objeto de una atención que crece rápidamente como un modelo para la genética y el metabolismo en plantas. Arabidopsis tiene un genoma pequeño y están disponibles estudios bien documentados. Es fácil cultivarla en grandes cantidades y están disponibles mutantes que definen mecanismos genéticamente controlados importantes, o se pueden obtener fácilmente. Están disponibles diferentes procedimientos para introducir y expresar genes homólogos aislados (Koncz y col., eds., ”Methods in Arabidopsis Research” (1992) World Scientific, Nueva Jersey, NJ, en “Prólogo”). Debido a su pequeño tamaño, ciclo de vida corto, autogamia obligada y alta fertilidad, Arabidopsis también es un organismo de elección para el aislamiento de mutantes y estudios en rutas morfogenéticas y de desarrollo, y el control de estas rutas por factores de transcripción (Koncz (1992), véase antes, pág. 72). Una serie de estudios que introducen factores de transcripción en A. thaliana han demostrado la utilidad de esta planta para la comprensión de los mecanismos de regulación de genes y alteración de rasgos en plantas (por ejemplo, en Koncz (1992) véase antes, y en la patente de EE.UU. nº 6.417.428).

Genes de Arabidopsis en plantas transgénicas [0183] La expresión de genes que codifican factores de transcripción que modifican la expresión de genes endógenos, polinucleótidos y proteínas son bien conocidos en la materia. Además, las plantas transgénicas que comprenden polinucleótidos aislados que codifican factores de transcripción también pueden modificar la expresión de genes endógenos, polinucleótidos y proteínas. Los ejemplos incluyen Peng y col. (1997) Genes and Development

11: 3194-3205 y Peng y col. (1999) Nature 400: 256-261. Además, muchos otros han demostrado que un factor de transcripción de Arabidopsis expresado en una especie de planta exógena produce la misma respuesta fenotípica o muy similar (Fu y col. (2001) Plant Cell 13: 1791-1802; Nandi y col. (2000) Curr. Biol. 10: 215-218; Coupland (1995) Nature 377: 482-483; y Weigel y Nilsson (1995) Nature 377: 482-500.

Genes homólogos introducidos en plantas transgénicas

[0184] Se pueden introducir en plantas genes homólogos que se pueden obtener de cualquier planta, o de cualquier fuente sea natural, sintética o semisintética o recombinante, y que comparte una identidad o similitud de secuencia significativa con las proporcionadas por la presente invención, por ejemplo, en plantas cultivadas, para conferir los rasgos mejorados o deseados. Por consiguiente, se pueden producir plantas transgénicas que comprenden un vector o casete de expresión recombinante con un promotor operativamente unido a una o más secuencias homólogas con las presentes secuencias descritas. El promotor puede ser, por ejemplo, un promotor de planta o vírico.

[0185] La invención proporciona, por lo tanto, procedimientos para preparar plantas transgénicas y para modificar rasgos de las plantas. Estos procedimientos incluyen introducir en una planta un vector o casete de expresión recombinante que comprende un promotor funcional operativamente unido a una o más secuencias homólogas con las presentes secuencias descritas. Las plantas y los kits para producir estas plantas que resultan de la aplicación de estos procedimientos también están incluidos en la presente invención.

Factores de transcripción de interés para la modificación de rasgos de plantas

[0186] Actualmente, la existencia de una serie de grupos de maduración para diferentes latitudes representa una barrera importante para la producción de nuevos rasgos valiosos. Cualquier rasgo (por ejemplo, resistencia a una enfermedad) debe cultivarse en cada uno de los diferentes grupos de maduración por separado, un ejercicio laborioso y costoso. Por lo tanto, la disponibilidad de una sola cepa, que podría cultivarse a cualquier latitud, aumentaría mucho el potencial para introducir nuevos rasgos en especies de cultivo tales como la soja y el algodón.

[0187] Para los efectos, rasgos y utilidades específicos conferidos a las plantas, se puede usar uno o más de los genes de los factores de transcripción de la presente invención, para aumentar o disminuir, o mejorar o demostrar pernicioso para un rasgo dado. Por ejemplo, la inactivación de un gen de un factor de transcripción que se produce de forma natural en una planta, o la eliminación del gen (con, por ejemplo, eliminación de sentido contrario), puede producir una disminución de la tolerancia a la sombra o al estrés por sequía con respecto a las plantas no transformadas o silvestres. Mediante el exceso de expresión de este gen, la planta puede experimentar un aumento de la tolerancia a estos estreses. Se puede introducir más de un gen de factor de transcripción en una planta, transformando la planta con uno o más vectores que comprenden dos o más factores de transcripción, o mediante cultivo selectivo de plantas para dar cruces de híbridos que comprenden más de un factor de transcripción introducido.

Genes, rasgos y utilidades que afectan a las características de la planta

[0188] Los factores de transcripción de la planta puede modular la expresión de genes, y a su vez, ser modulados por la experiencia medioambiental de la planta. Las alteraciones significativas del entorno de una planta producen de forma invariable un cambio en el patrón de expresión de los genes de los factores de transcripción de la planta. Los patrones de expresión de los factores de transcripción alterados en general dan como resultado cambios fenotípicos en la planta. El o los productos génicos de factores de transcripción en las plantas transgénicas difieren entonces en las cantidades o proporciones de las encontradas en las plantas silvestres o no transformadas, y es probable que estos factores de transcripción representen polipéptidos que son usados para alterar la respuesta al cambio medioambiental. A modo de ejemplo, está aceptado en la técnica que los procedimientos analíticos basados en patrones de expresión alterados se pueden usar para cribar cambios fenotípicos en una planta de forma mucho más eficaz que la lograda usando procedimientos tradicionales.

[0189] Potenciales aplicaciones de las presentes secuencias descritas que regulan la tolerancia al estrés abiótico

[0190] Sensores de azúcares. Además de su importante función como una fuente de energía y componente estructural de la célula de la planta, los azúcares son moléculas reguladoras centrales que controlan varios aspectos de la fisiología, metabolismo y desarrollo de la planta (Hsieh y col. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 13965-13970). Se cree que este control se logra mediante la regulación de la expresión de genes y, en plantas superiores, se ha mostrado que los azúcares reprimen o activan los genes de la planta implicados en muchos procesos esenciales tales como la fotosíntesis, metabolismo del glioxilato, respiración, síntesis y degradación de almidón y sacarosa respuesta a patógenos, respuesta a heridas, regulación del ciclo celular, pigmentación, florecimiento y senescencia. Los mecanismos por los cuales los azúcares controlan la expresión de genes no se comprenden.

[0191] Varios mutantes de la detección de azúcares han resultado ser alélicos de ABA y mutantes de etileno. ABA se encuentra en todos los organismos fotosintéticos y actúa como un regulador clave en la transcripción, respuestas al estrés, embriogénesis, y germinación de semillas. La mayoría de los efectos de ABA están relacionados con el compuesto que actúa como una señal de la menor disponibilidad de agua, por lo que produce una reducción en la pérdida de agua, ralentiza el crecimiento y media las respuestas adaptativas. Sin embargo, ABA también influye en el crecimiento y desarrollo de la planta mediante interacciones con otras fitohormonas. Estudios fisiológicos y moleculares indican que el maíz y Arabidopsis tienen rutas casi idénticas con respecto a la biosíntesis de ABA y la transducción de señales (por ejemplo, en Finkelstein y Rock (2002) "Abscisic acid biosynthesis and response", en The Arabidopsis Book, Somerville y Meyerowitz, editores (American Society of Plant Biologists, Rockville, MD).

[0192] Esto un implica potencialmente que cuando las secuencias de la invención son expresadas en exceso, confieren un fenotipo de sensores de azúcares o señalización de hormonas en las plantas. Por otra parte, el tratamiento de sacarosa usado en estos experimentos (al 9,4% en p/v) también podría ser un estrés osmótico. Por lo tanto, se podrían interpretar estos datos como una indicación de que en estas líneas transgénicas son más tolerantes al estrés osmótico. Sin embargo, es bien conocido que las respuestas de la planta a ABA, estrés osmótico y otros pueden estar conectadas, y éstos diferentes tratamientos pueden incluso actuar de una forma sinérgica para aumentar el grado de una respuesta. Por ejemplo, Xiong, Ishitani, y Zhu ((1999) Plant Physiol. 119: 205-212) han mostrado que se pueden usar estudios moleculares y genéticos para mostrar la interacción extensiva entre el estrés osmótico, el estrés por temperatura y las respuestas al ABA en plantas. Estos investigadores analizaron la expresión de RD29A-LUC en respuesta a diferentes regímenes de tratamiento en Arabidopsis. El promotor RD29A contiene tanto elemento de respuesta a ABA como de respuesta a la deshidratación, denominado también la repetición C, y puede ser activado por estrés osmótico, temperatura baja o tratamiento con ABA; la transcripción del gen RD29A en respuesta a estreses osmóticos y por frío es mediada tanto por rutas dependientes del ABA como independientes del ABA (Xiong, Ishitani, y Zhu (1999) véase antes). LUC se refiere a la secuencia que codifica la luciferasa de luciérnaga, que en este caso era dirigida por el promotor RD29A de respuesta al estrés. Los resultados pusieron de manifiesto tanto interacciones positivas como negativas dependiendo de la naturaleza y la duración de los tratamientos. Se encontró que el estrés por temperatura baja deteriora la señalización osmótica pero el estrés por calor moderado potenciaba mucho la inducción de estrés osmótico, actuando así de forma sinérgica con las rutas de señalización osmótica. En este estudio, los autores describieron que el estrés osmótico y ABA pueden actuar de forma sinérgica mostrando que los tratamientos inducen simultáneamente expresión de transgenes y de genes endógenos. Describían resultados similares Bostock y Quatrano ((1992) Plant Physiol. 98: 1356-1363), quienes encontraron que el estrés osmótico y ABA actúan de forma sinérgica e inducen la expresión del gen Em del maíz. Ishitani y col. (1997) Plant Cell 9: 1935-1949) aislaron un grupo de mutaciones de un solo gen de Arabidopsis que conferían una mayor respuesta tanto al estrés osmótico como a ABA. La naturaleza de la recuperación de estos mutantes del estrés osmótico y del tratamiento con ABA sugería que aunque existen rutas de señalización separadas para el estrés osmótico y ABA, las rutas comparten una serie de componentes; estos componentes comunes pueden mediar interacciones sinérgicas entre el estrés osmótico y ABA. Por lo tanto, contrariamente a la creencia que se mantenía previamente de que las rutas de señalización del estrés dependientes de ABA e independientes de ABA actúan de una forma paralela, los datos de los autores de la invención ponen de manifiesto que estas rutas se superponen y convergen para activar la expresión del gen del estrés.

[0193] Como los azúcares son importantes moléculas de señalización, la capacidad para controlar la concentración de un azúcar de señalización o cómo la planta percibe o responde a un azúcar de señalización, se podría usar para controlar el desarrollo, fisiología o metabolismo de la planta. Por ejemplo, se ha mostrado que el flujo de sacarosa (un azúcar disacárido usado para el transporte sistémico de carbono y energía en la mayoría de las plantas) afecta a la expresión de genes y altera la acumulación de compuestos de almacenamiento en las semillas. Por lo tanto, la manipulación de la ruta de señalización de la sacarosa en semillas hace que las semillas tengan más proteínas, aceite o hidratos de carbono, dependiendo del tipo de manipulación. Igualmente, en tubérculos, la sacarosa se convierte en almidón que es usado como un almacén de energía. Se cree que las rutas de señalización de azúcares pueden determinar parcialmente los niveles de almidón sintetizado en los tubérculos. La manipulación de la señalización de azúcares en tubérculos podría conducir a tubérculos con un mayor contenido de almidón.

[0194] Por lo tanto, la alteración de la expresión de los presentes genes de factores de transcripción descritos que manipulan la ruta de transducción de señales de azúcares, incluyendo, por ejemplo, G175, G303, G354, G481, G916, G922, G1069, G1073, G1820, G2053, G2701, G2789, G2839, G2854, junto con sus equivalogos, o que presentan un fenotipo de estrés osmótico, incluyendo, por ejemplo, G47, G482, G489 o G1069, G1073, como se pone de manifiesto por su tolerancia, por ejemplo, al manitol superior, sal o PEG, se puede usar para producir plantas con rasgos deseables, incluyendo una mayor tolerancia a la sequía. En particular, la manipulación de las rutas de transducción de señales de azúcares se podría usar para alterar las relaciones fuente-sumidero en semillas, tubérculos, raíces y otros órganos de almacenamiento conduciendo a un aumento del rendimiento.

[0195] Estrés abiótico: tolerancia a la sequía y la humedad baja. La exposición a la deshidratación invoca estrategias de supervivencia similares en plantas que el estrés por helada (por ejemplo, en Yelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) y el estrés por sequía induce tolerancia a la congelación (por ejemplo, en Siminovitch y col. (1982) Plant Physiol 69: 250-255; y Guy y col. (1992) Planta 188: 265-270). Además de la inducción de proteínas de aclimatación al frío, las estrategias que permiten a la planta sobrevivir en condiciones de poca agua pueden incluir, por ejemplo, una menor superficie específica, o producción de aceite o cera superficiales. La modificación de la expresión de los presentes genes de factores de transcripción descritos, incluyendo G2133, G1274, G922, G2999, G3086, G354, G1792, G2053, G975, G1069, G916, G1820, G2701, G47, G2854, G2789, G634, G175, G2839, G1452, G3083, G489, G303, G2992, y G682, y sus equivalogos, se puede usar para aumentar la tolerancia de una planta a condiciones de poca agua y proporcionar los beneficios de una mayor supervivencia, mayor rendimiento y zona de cultivo temporal y geográfica extendida.

[0196] Estrés osmótico. La modificación de la expresión de una serie de los presentes genes de factores de transcripción descritos, por ejemplo, G47, G482, G489 o G1069, G2053 y sus equivalogos, se puede usar para aumentar la velocidad de germinación o el crecimiento en condiciones osmóticas adversas, que podrían tener impacto en la supervivencia y rendimiento de las semillas y las plantas. Los estreses osmóticos se pueden regular mediante mecanismos de control molecular específicos que incluyen genes que controlan los movimientos de agua e iónicos, proteínas funcionales y estructurales inducidas por estrés, percepción y transducción de señales, y depuración de radicales libres, y muchos otros (Wang y col. (2001) Acta Hort. (ISHS) 560: 285-292). Los instigadores del estrés osmótico incluyen heladas, sequía y alta salinidad, cada uno de los cuales se discuten a continuación con más detalle.

[0197] De muchas maneras, la helada, salinidad alta y sequía tienen efectos similares en las plantas, no siendo el menor de ellos la inducción de polipéptidos comunes que responden a estos estreses diferentes. Por ejemplo, la helada es similar a la deficiencia de agua en cuanto que la helada reduce la cantidad de agua disponible para una planta. La exposición a temperaturas de helada puede conducir a la deshidratación celular ya que el agua sale de las células y forma cristales de hielo en espacios intracelulares (Buchanan y col. (2000) en “Biochemistry and Molecular Biology of Plants”. American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD). Como con la alta concentración de sales y la helada, los problemas de las plantas producidos por la poca disponibilidad de agua incluyen el estrés mecánico producido por la extracción del agua celular. Por lo tanto, la incorporación de factores de transcripción que modifican la respuesta de una planta al estrés osmótico, por ejemplo, en un cultivo o planta ornamental, puede ser útil para reducir los daños o pérdidas. Los defectos específicos producidos por helada, salinidad alta y sequía de abordan a continuación.

[0198] Relación entre la tolerancia a las sales, sequía y helada. Las plantas están sometidas a una variedad de estímulos medioambientales. Algunos de éstos, incluyendo el estrés por sequía, tienen la capacidad de impactar a la planta entera y a la disponibilidad de agua celular. Por lo tanto, no es sorprendente que las respuestas de las plantas a esta colección de estreses estén relacionadas. En una revisión reciente, Zhu indica que “la mayoría de los estudios sobre la señalización del estrés por agua se han centrado en el estrés salino principalmente porque las respuestas de la planta a las sales y a la sequía están estrechamente relacionadas y los mecanismos se superponen.” (Zhu (2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53: 247-273). Se han documentado muchos ejemplos de respuestas y rutas similares a este conjunto de estreses. Por ejemplo, se ha mostrado que los factores de transcripción CBF condicionan la resistencia a las sales, helada y sequía (Kasuga y col. (1999) Nature Biotech. 17: 287-291). El gen rd29B de Arabidopsis es inducido en respuesta tanto al estrés salino como por deshidratación, un procedimiento que es mediado en gran medida a través del proceso de transducción de señales de ABA (Uno y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:11632-11637), dando como resultado la actividad alterada de los factores de transcripción que se unen a un elemento en la dirección 5’ en el promotor de rd29B. En Mesembryanthemum crystallinum (planta de hielo), Patharker y Cushman han mostrado que se induce una proteína quinasa dependiente de calcio (McCDPKl) por exposición tanto a estreses por sequía como salinos (Patharker y Cushman (2000) Plant J. 24: 679-691). También se mostró que la quinasa inducida por estrés fosforilaba un factor de transcripción, alterando presuntamente su actividad, aunque los niveles transcritos del factor de transcripción diana no se alteran en respuesta al estrés salino o por sequía. Igualmente, Saijo y col. Demostraron que una proteína quinasa dependiente de calmodulina inducida por sal/sequía en el arroz (OsCDPR7) confería una mayor tolerancia a la sal y a la sequía al arroz cuando se expresaba en exceso (Saijo y col. (2000) Plant J. 23: 319-327).

[0199] La exposición a la deshidratación invoca la estrategias de supervivencia similares en plantas a las del estrés por helada (por ejemplo, en Yelenosky (1989) Plant Physiol. 89: 444-451) y el estrés por sequía induce tolerancia a la helada (por ejemplo, en Siminovitch y col. (1982) Plant Physiol. 69: 250-255; y Guy y col. (1992) Planta 188: 265-270). Además de la inducción de proteínas de aclimatación al frío, las estrategias que permiten a las plantas sobrevivir en condiciones de poca agua pueden incluir, por ejemplo, una menor superficie específica o producción de aceite o cera superficiales.

[0200] Por consiguiente, un experto en la materia esperaría que algunas rutas implicadas en la resistencia a uno de estos estreses, y por lo tanto reguladas por un factor de transcripción individual, estuvieran también implicadas en la resistencia a otro de estos estreses, regulados por los mismos factores de transcripción u homólogos. Por supuesto, las rutas de resistencia generales están relacionadas, pero no son idénticas, y por lo tanto no todos los factores de transcripción que controlan la resistencia a uno de estos estreses controlarán la resistencia a los otros estreses. No obstante, si un factor de transcripción condiciona la resistencia a uno de estos estreses, será evidente para el experto en la materia probar la resistencia a los estreses relacionados.

[0201] Por lo tanto, los genes de la lista de secuencias, incluyendo por ejemplo, G175, G922, G1452, G1820, G2701, G2999, G3086 y sus equivalogos, que proporcionan tolerancia a la sales, se pueden usar para diseñar cultivos tolerantes a la sales y árboles que puedan florecer en suelos con un alto contenido salino o en condiciones de sequía. En particular, el aumento de la tolerancia salina durante la etapa de germinación de una planta potencia la supervivencia y el rendimiento. Los presentes genes de factores de transcripción descritos que proporcionar una mayor tolerancia salina durante la germinación, la etapa de plántulas y a lo largo de todo el ciclo de vida de la planta, tendrán un valor particular para impartir supervivencia y rendimiento en zonas en las que un cultivo particular normalmente no prosperaría.

[0202] Resumen de las características alteradas de la planta relacionadas con la sequía. Se proporcionan clados de secuencias estructural y funcionalmente relacionadas que derivan de una amplia variedad de plantas, incluyendo polinucleótidos de la lista de secuencias y sus polipéptidos codificados, fragmentos de los mismos, parálogos, ortólogos, equivalogos y fragmentos de los mismos. Se ha mostrado en el laboratorio y en experimentos de campo que estas secuencias confieren fenotipos alterados de tolerancia al estrés abiótico y de tamaño en las plantas. La invención también proporciona los polipéptidos de la lista de secuencias, fragmentos de los mismos, dominios conservados de los mismos, parálogos, ortólogos, equivalogos y fragmentos de los mismos. Se ha observado que las plantas que expresan en exceso estas secuencias presentan un fenotipo de sensores de azúcares y/o son más tolerantes a una amplia variedad de estreses abióticos, incluyendo estrés por sequía y salinidad alta. Muchos de los ortólogos de estas secuencias están listados en la lista de secuencias, y debido al alto grado de similitud estructural con las secuencias de la invención, se espera que estas secuencias también funcionen para aumentar la tolerancia al estrés por sequía. La invención también abarca los complementos de los polinucleótidos. Los polinucleótidos son útiles para cribar bibliotecas de moléculas o compuestos que tienen unión específica y para crear plantas transgénicas que tienen una mayor tolerancia al estrés por sequía.

Sentido contrario y supresión simultánea

[0203] Además de la expresión de los ácidos nucleicos de la invención como sustitución de genes o ácidos nucleicos modificadores del fenotipo de la planta, los ácidos nucleicos también son útiles para la supresión de la expresión en sentido directo y sentido contrario, por ejemplo, para reducir la expresión de un ácido nucleico de la invención. Es decir, los ácidos nucleicos de la invención, o subsecuencias o secuencias de sentido contrario de las mismas, se pueden usar para bloquear la expresión de ácidos nucleicos homólogos naturales. Se conocen en la técnica una variedad de tecnologías de sentido directo o sentido contrario, por ejemplo, como se expone en Lichtenstein y Nellen (1997) “Antisense Technology: A Practical Approach”, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, Reino Unido. La regulación de sentido contrario también se describe en Crowley y col. (1985) Cell 43: 633641; Rosenberg y col. (1985) Nature 313: 703-706; Preiss y col. (1985) Nature 313: 27-32; Melton (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82:144-148; Izant y Weintraub (1985) Science 229: 345-352; y Kim y Wold (1985) Cell 42:129-138. Se conocen procedimientos adicionales de regulación de sentido contrario en la técnica. La regulación de sentido contrario se ha usado para reducir o inhibir la expresión de genes de plantas, por ejemplo, en la publicación de patente europea nº 271988. El ARN de sentido contrario se puede usar para reducir la expresión de genes para producir un cambio fenotípico visible o bioquímico en la planta (Smith y col. (1988) Nature, 334: 724-726; Smith y col. (1990) Plant Mol. Biol. 14: 369-379). En general, las secuencias de sentido directo o sentido contrario se introducen en la célula donde son opcionalmente amplificadas, por ejemplo, por transcripción. Dichas secuencias incluyen tanto secuencias de oligonucleótidos sencillas como secuencias catalíticas tales como ribozimas.

[0204] Por ejemplo, una reducción o eliminación de la expresión (es decir, una “inactivación”) de un factor de transcripción o polipéptido homólogo del factor de transcripción en una planta transgénica, por ejemplo, para modificar un rasgo de la planta, se puede obtener introduciendo una construcción de sentido contrario correspondiente al polipéptidos de interés como un ADNc. Para la supresión de sentido contrario, el ADNc del factor de transcripción u homólogo se dispone en orientación contraria (con respecto a la secuencia codificante) con respecto a la secuencia del promotor en el vector de expresión. No es necesario que la secuencia introducida sea el ADNc o gen de longitud completa, y no es necesario que sea idéntica al ADNc o gen que se encuentra en el tipo de planta que se va a transformar. Típicamente, solo es necesario que la secuencia de sentido contrario sea capaz de hibridar con el gen o ARN diana de interés. Por lo tanto, cuando la secuencia introducida es de menor longitud, será necesario un mayor grado de homología con la secuencia del factor de transcripción endógeno para la supresión de sentido contrario eficaz. Aunque se pueden usar secuencias de sentido contrario de diferentes longitudes, preferiblemente, la secuencia de sentido contrario introducida en el vector será de al menos 30 nucleótidos de longitud, y típicamente se observará una mejor supresión de sentido contrario al aumentar la longitud de la secuencia de sentido contrario. Preferiblemente, la longitud de la secuencia de sentido contrario en el vector tendrá más de 100 nucleótidos. La transcripción de una construcción de sentido contrario como se describe, da como resultado la producción de moléculas de ARN que son el complemento inverso de las moléculas de ARNm transcritas a partir del gen del factor de transcripción endógeno en la célula de la planta.

[0205] La supresión de la expresión del gen del factor de transcripción endógeno también se puede lograr usando la interferencia de ARN, o ARNi. La ARNi es una técnica de silenciamiento de genes dirigida, postranscripcional, que usa ARN bicatenario (ARNdc) para incitar la degradación del ARN mensajero (ARNm) que contiene la misma secuencia que el ARNdc (Constans, (2002) The Scientist 16:36). Los ARN interferentes pequeños, o ARNip, se producen en al menos 2 etapas: una ribonucleasa endógena escinde el ARNdc más largo en ARN más cortos de 21-23 nucleótidos de longitud. Los segmentos de ARNip median entonces la degradación del ARNm diana (Zamore, (2001) Nature Struct. Biol., 8:746-50). La ARNi se ha usado para la determinación de la función de genes de una forma similar a los oligonucleótideos de sentido contrario (Constans, (2002) The Scientist 16:36). Los vectores de expresión que expresan continuamente ARNip en células transfectadas transitoria y establemente se han diseñado para expresar ARN en horquilla pequeños (ARNhp), que son procesados in vivo en moléculas de tipo ARNip capaces de llevar a cabo el silenciamiento específico de genes (Brummelkamp y col., (2002) Science 296:550-553, y Paddison, y col. (2002) Genes & Dev. 16:948-958). El silenciamiento de genes postranscripcionales por el ARN bicatenario se discute con más detalle en Hammond y col. (2001) Nature Rev Gen

2: 110-119, Fire et, al. (1998) Nature 391: 806-811 y Timmons y Fire (1998) Nature 395: 854. Los vectores en las que el ARN codificado por un ADNc de factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción es expresado en exceso, también se pueden usar para obtener la supresión simultánea de un gen endógeno correspondiente, por ejemplo de la forma descrita en la patente de EE.UU. nº 5.231.020 de Jorgensen. Dicha supresión simultánea (denominada también supresión de sentido contrario), no requiere que se introduzca el ADNc del factor de transcripción entero en las células de la planta, ni requiere que la secuencia introducida sea exactamente igual al gen del factor de transcripción endógeno de interés. Sin embargo, como con la supresión de sentido contrario, la eficacia de la supresión aumentará al aumentar la especificidad de la hibridación, por ejemplo, cuando la secuencia introducida se alarga y/o se aumenta la similitud de secuencia entre la secuencia introducida y el gen del factor de transcripción endógeno.

[0206] Los vectores que expresan una forma no traducible del ARNm del factor de transcripción (por ejemplo, secuencias que comprenden uno o más codones de parada o mutaciones sin sentido) también se pueden usar para suprimir la expresión de un factor de transcripción endógeno, reduciendo o eliminando así su actividad y modificando uno o más rasgos. Se describen procedimientos para producir dichas construcciones en la patente de EE.UU. nº

5.583.021. Preferiblemente, dichas construcciones se hacen introduciendo un codón de parada prematuro en el gen del factor de transcripción. Alternativamente, se puede modificar un rasgo de la planta mediante el silenciamiento de genes usando ARN de doble cadena (Sharp (1999) Genes and Development 13: 139-141). Otro procedimiento para abolir la expresión de un gen es mediante inserción de mutagénesis usando el ADN-T de Agrobacterium tumefaciens. Después de generar los mutantes de inserción, los mutantes se pueden cribar para identificar aquellos que contienen la inserción en un gen del factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción. Las plantas que contienen un solo suceso de inserción de transgén en el gen deseado se pueden cruzar para generar plantas homocigotas para la mutación. Dichos procedimientos son bien conocidos para el experto en la materia (por ejemplo, en Koncz y col. (1992) “Methods in Arabidopsis Research”. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd., River Edge, NJ).

[0207] Alternativamente, el fenotipo de una planta se puede alterar eliminando una gen endógeno, tal como un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción, por ejemplo, mediante recombinación homóloga (Kempin y col. (1997) Nature 389: 802-803).

[0208] Un rasgo de una planta también se puede modificar usando el sistema Cre-lox (por ejemplo, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.658.772). Se puede modificar el genoma de una planta para incluir un primer y un segundo sitio lox que después se ponen en contacto con una Cre recombinasa. Si los sitios lox están en la misma orientación, entonces la secuencia de ADN intermedia entre los dos sitios se escinde. Si los sitios lox están en orientación opuesta, la secuencia intermedia se invierte.

[0209] Los polinucleótidos y polipéptidos de esta invención también se pueden expresar en una planta en ausencia de un casete de expresión, manipulando la actividad o nivel de expresión del gen endógeno por otros medios, tales como por ejemplo, mediante la expresión ectópica de un gen mediante marcaje de activación de ADNT (Ichikawa y col. (1997) Nature 390 698-701; Kakimoto y col. (1996) Science 274: 982-985). Este procedimiento conlleva transformar una planta con un marcador de gen que contiene múltiples potenciadores transcripcionales y una vez que se ha insertado el marcador en el genoma, queda desregulada la expresión de un gen flanqueador que codifica la secuencia. En otro ejemplo, la maquinaria transcripcional de una planta se puede modificar para que aumente los niveles de transcripción de un polinucleótido de la invención (por ejemplo, en las publicaciones PCT WO 96/06166 y WO98/53057, que describen la modificación de la especificidad de unión al ADN de proteínas de dedos de cinc cambiando aminoácidos particulares en el patrón de unión al ADN).

[0210] La planta transgénica también puede incluir la maquinaria necesaria para expresar o alterar la actividad de un polipéptido codificado por un gen endógeno, por ejemplo, alterando el estado de fosforilación del polipéptido para mantenerlo en un estado activado.

[0211] Las plantas transgénicas (o células de plantas o explantes de plantas o tejidos de plantas) que incorporan los polinucleótidos de la invención y/o expresan los polipéptidos de la invención se pueden producir por una variedad de técnicas bien establecidas como se ha descrito antes. Después de la construcción de un vector, lo más típico un casete de expresión, que incluye un polinucleótido que codifica, por ejemplo, un factor de transcripción u homólogo del factor de transcripción de la invención, se pueden usar técnicas estándar para introducir el polinucleótido en una planta, una célula de planta, un explante de planta o un tejido de planta de interés. Opcionalmente, la célula, explante o tejido de planta se pueden regenerar para producir una planta transgénica.

[0212] La planta puede ser cualquier planta superior, incluyendo plantas gimnospermas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Están disponibles protocolos adecuados para Leguminosae (alfalfa, soja, trébol, etc.), Umbeliferae (zanahoria, apio, chirivía), Cruciferae (col, rábano, colza, brócoli, etc.), Cucurbitaceae (melón y pepino), Gramineae (trigo, maíz, arroz, cebada, mijo, etc.), Solaneceae (patata, tomate, tabaco, pimientos, etc.), y otros cultivos diferentes (por ejemplo, en los protocolos descritos en Ammirato y col., eds., (1984) “Handbook of Plant Cell Culture-Crop Species”, Macmillan Publ. Co., Nueva York, NY; Shimamoto y col. (1989) Nature 338: 274-276; Fromm y col. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839; y Vasil y col. (1990) Bio/Technol. 8: 429-434.

[0213] La transformación y regeneración de células de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas ahora es rutinario, y la selección de la técnica de transformación más adecuada la determinará el experto. La elección del procedimiento variará con el tipo de planta que se va a transformar; los expertos en la materia reconocerán la idoneidad de procedimientos particulares para tipos de plantas dados. Los procedimientos adecuados pueden incluir, pero sin limitar: electroporación de protoplastos de plantas; transformación mediada por liposomas; transformación mediada por polietilenglicol (PEG); transformación usando virus; microinyección de células de plantas; bombardeo con microproyectiles de células de plantas; infiltración al vacío; y transformaciones mediada por Agrobacterium tumefaciens. La transformación significa introducir una secuencia de nucleótidos en una planta de una forma para producir la expresión estable o transitoria de la secuencia.

[0214] Los ejemplos satisfactorios de modificación de características de las plantas mediante transformación con secuencias clonadas que sirven para ilustrar el conocimiento actual en este campo de tecnología, y que se incorporan en el presente documento por referencia, incluyen: patente de EE.UU. nº 5.571.706; 5.677.175; 5.510.471; 5.750.386; 5.597.945; 5.589.615; 5.750.871; 5.268.526; 5.780.708; 5.538.880; 5.773.269; 5.736.369 y

5.610.042.

[0215] Después de la transformación, las plantas se seleccionan preferiblemente usando un marcador seleccionable dominante incorporado en el vector de transformación. Típicamente, dicho marcador conferirá resistencia a un antibiótico o herbicida a las plantas transformadoras, y la selección de los transformantes se puede llevar a cabo exponiendo las plantas a concentraciones adecuadas del antibiótico o herbicida.

[0216] Después de seleccionar las plantas transformadas y cultivarlas hasta la madurez, se identifican aquellas plantas que presentan un rasgo modificado. El raso modificado puede ser cualquiera de los rasgos descritos antes. Además, para confirmar que el rasgo modificado se debe a los cambios en los niveles de expresión

o actividad del polipéptido o polinucleótido de la invención, se puede determinar analizando la expresión del ARNm usando transferencias Northern, RT-PCR o micromatrices, o la expresión de proteínas usando inmunotransferencias

o transferencias Western o ensayos de desplazamiento en gel.

Sistemas integrados -identidad de secuencias

[0217] Además, la presente invención puede ser un sistema integrado, ordenador o medio de lectura por ordenador que comprende un conjunto de instrucciones para determinar la identidad de una o más secuencias en una base de datos. Además, el conjunto de instrucciones se puede usar para generar o identificar secuencias que cumplen cualquiera de los criterios especificados. Además, el conjunto de instrucciones se puede usar para asociar

o conectar determinados beneficios opcionales, tales como características mejoradas, con una o más secuencias identificadas.

[0218] Por ejemplo, el conjunto de instrucciones puede incluir, por ejemplo, una comparación de secuencias u otro programa de alineamiento, por ejemplo, un programa disponible tal como, por ejemplo, Wisconsin Package Versión 10.0, tales como BLAST, FASTA, PILEUP, FINDPATTERNS o similares (GCG, Madison, WI). Se pueden buscar bases de datos de secuencias públicas tales como GenBank, EMBL, Swiss-Prot y PIR o bases de datos de secuencias privadas tales como la base de datos de secuencias PHYTOSEQ (Incyte Genomics, Palo Alto, CA).

[0219] El alineamiento de secuencias para la comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Adv. AppL Math. 2: 482-489, mediante el algoritmo de alineamiento de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, mediante la búsqueda por el procedimiento de similitud de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448, mediante implementaciones computerizadas de estos algoritmos. Después del alineamiento, típicamente se llevan a cabo las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos comparando las secuencias de las dos secuencias a lo largo de una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. La ventana de comparación puede ser un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, normalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 200, más habitualmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 posiciones contiguas. Se proporciona una descripción del procedimiento en Ausubel y col., véase antes.

[0220] Se puede usar una variedad de procedimientos para determinar las relaciones de las secuencias, incluyendo el alineamiento manual y el alineamiento y análisis de secuencias asistido por ordenador. Este último procedimiento es un procedimiento preferido en la presente invención, debido al mayor rendimiento que se logra mediante los procedimientos asistidos por ordenador. Como se ha indicado antes, están disponibles una variedad de programas de ordenador para llevar a cabo el alineamiento de secuencias, o los puede producir el experto.

[0221] Un algoritmo de ejemplo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencias y la similitud de secuencias es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403

410. El software para llevar a cabo los análisis con BLAST está disponible al público, por ejemplo, a través del National Library of Medicine’s National Center for Biotechnology Information (ncbi.nlm.nih; página web (www) del National Institutes of Health US government (gov)). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias con una puntuación alta (HSP) identificando palabras cortas de longitud W en la secuencia de consulta, que se corresponden o satisfacen alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. T se denomina umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul y col., véase antes). Estos aciertos de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar las búsquedas para encontrar HSP más largas que los contienen: los aciertos de palabras se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia hasta tan lejos como se pueda aumentar la puntuación acumulativa de alineamiento. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos de emparejamiento; siempre >0) y N (puntuación de penalización para los restos de emparejamiento erróneo; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de palabras en cada dirección se detiene cuando: la puntuación acumulativa del alineamiento disminuye en la cantidad X desde su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa va a cero o por debajo, debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa; o se llega al extremo de cualquiera de las secuencias. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) de 10, un punto de corte de 100, M=S, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 10915-10919). Salvo que se indique lo contrario, la “identidad de secuencia” en el presente documento se refiere al % de identidad de secuencia generado a partir de tblasx usando la versión de NCBI del algoritmo con los parámetros por defecto usando alineamientos incompletos con el filtro apagado (por ejemplo, en la página web de NIH NLM NCBI ncbi.nlm.nih, véase antes).

[0222] Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias (por ejemplo, en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 5873-5787). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de la suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad con la que ocurriría por azar un emparejamiento entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Por ejemplo, se considera que un ácido nucleico es similar a una secuencia de referencia (y, por lo tanto, en este contexto, homóloga) si la probabilidad de la suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de ensayo respecto al ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, o menor de aproximadamente 0,01, o incluso menor de aproximadamente 0,001. Un ejemplo adicional de un algoritmo de alineamiento de secuencias útiles PILEUP. PILEUP crea un alineamiento de secuencias múltiples a partir de un grupo de secuencias relacionadas usando alineamientos por pares, progresivos. El programa puede lineal, por ejemplo, hasta 300 secuencias de una longitud máxima de 5.000 letras.

[0223] El sistema integrado, u ordenador, típicamente incluye un interfaz de entrada de usuario que permite al usuario ver selectivamente uno o más registros de secuencias correspondientes a una o más cadenas de caracteres, así como un conjunto de instrucciones que alinea la una o más cadenas de caracteres entre sí o con una cadena de caracteres adicional para identificar una o más regiones de similitud de secuencia. El sistema puede incluir una conexión de una o más cadenas de caracteres con un fenotipo particular o función génica. Típicamente, el sistema incluye un elemento de salida de lectura por el usuario que presenta un alineamiento producido por el conjunto de instrucciones de alineamiento.

[0224] Los procedimientos de esta invención se pueden implementar en un entorno de computación localizado o distribuido. En un entorno distribuido, los procedimientos se pueden implementar en un solo ordenador que comprende múltiples procesadores o en una multiplicidad de ordenadores. Los ordenadores pueden estar conectados, por ejemplo, a través de un bus común, más preferiblemente el o los ordenadores son nodos en una red. La red ha de ser una red generalizada o local y dedicada o de área amplia, y en determinadas realizaciones preferidas, los ordenadores pueden ser componentes de una intranet o un internet.

[0225] Por lo tanto, la invención proporciona procedimientos para identificar una secuencia similar u homóloga a uno o más polinucleótidos como se indica en el presente documento, o uno o más polipéptidos diana codificados por los polinucleótidos, o indicados de otra forma en el presente documento, y pueden incluir la conexión

o asociación de un fenotipo o función génica de una planta dada con una secuencia. En los procedimientos, se proporciona una base de datos de secuencias (localmente o a través de una intranet o internet) y se hace una consulta a la base de datos de secuencias usando las secuencias relevantes del presente documento y fenotipos o funciones génicas asociados de la planta.

[0226] Se puede introducir cualquier secuencia del presente documento en la base de datos, antes o después de la consulta en la base de datos. Esto proporciona tanto la expansión de la base de datos como, si se hace antes de la etapa de consulta, la inserción de secuencias de control en la base de datos. Las secuencias de control se pueden detectar mediante la consulta para asegurar la integridad general tanto de la base de datos como de la consulta. Como se ha indicado, la consulta se puede llevar a cabo usando un interfaz basado en un navegador de internet. Por ejemplo, la base de datos puede ser una base de datos pública centralizada tal como las indicadas en el presente documento, y la consulta se puede hacer desde un terminal u ordenador remotos a través de internet

5 o intranet.

[0227] Cualquier secuencia del presente documento se puede usar para identificar una secuencia similar, homóloga, paráloga u ortóloga en otra planta. Esto proporciona medios para identificar secuencias endógenas en otras plantas que pueden ser útiles para alterar un rasgo de las plantas descendientes, que resulta del cruce de dos 10 plantas de cepas diferentes. Por ejemplo, se pueden identificar secuencias que codifican un ortólogo de cualquiera de las secuencias del presente documento que están de forma natural en una planta con un rasgo deseado, usando las secuencias descritas en el presente documento. Después, la planta se cruza con una segunda planta de la misma especie pero que no tiene el rasgo deseado, para producir descendencia que después se puede usar en experimentos de cruce posteriores para producir el rasgo deseado en la segunda planta. Por lo tanto, la planta 15 descendiente resultante no contiene transgenes; la expresión de la secuencia endógena también se puede regular por el tratamiento con un producto químico particular u otros medios, tales como EMR. Algunos ejemplos de dichos compuestos bien conocidos en la técnica incluyen: etileno; citoquinas; compuestos fenólicos; los cuales estimulan la transcripción de los genes necesarios para la infección; monosacáridos específicos y entornos ácidos que potencian la inducción de genes; polisacáridos ácidos que inducen uno o más genes cromosómicos; y opines; otros

20 mecanismos incluyen tratamiento de luz u oscuridad (por ejemplo, en Winans (1992) Microbiol. Rev. 56: 12-31; Eyal y col. (1992) Plant. Mol. Biol. 19: 589-599; Chrispeels y col. (2000) Plant Mol. Biol. 42: 279-290; Piazza y col. (2002) Plant Physiol. 128:1077-1086).

[0228] La tabla 6 lista el número de identificación de gen (GID) y las relaciones homólogas encontradas

25 usando análisis de acuerdo con los ejemplos para las secuencias de la lista de secuencias. Las secuencias listadas como “secuencias de referencia” se determinaron originalmente por experimentación para conferir tolerancia a la sequía cuando se alteraba su expresión. En general, cada secuencia de referencia se usó para identificar el clado en el que se pueden encontrar las secuencias homólogas funcionalmente relacionadas.

30 Tabla 6. Genes homólogos y otros genes relacionados de genes de factores de transcripción de Arabidopsis representativos identificados usando BLAST

SEQ ID NO

GID Nº Polinucleótido (ADN) o polipéptido (PRT) Especies de las que se obtienen secuencias homólogas Redacción de la SEQ ID NO con otros genes

1

G47 ADN Arabidopsis thaliana Secuencia de referencia; la secuencia del polipéptido predicha es paráloga con G2133

2

G47 PRT Arabidopsis thaliana Secuencia de referencia; paráloga con G2133

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G2133 ADN Arabidopsis thaliana Secuencia de referencia; la secuencia del polipéptido predicha es paráloga con G47

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G214 PRT Arabidopsis thaliana Secuencia de referencia; paráloga con G47

Modelización molecular

35 [0229] Otro medio que se puede usar para confirmar la utilidad y función de secuencias de factores de transcripción que son ortólogas o parálogas con los presentes factores de transcripción descritos, es mediante el uso de software de modelización molecular. La modelización molecular se usa rutinariamente para predecir la estructura de polipéptidos, y están disponibles en el comercio para este propósito una variedad de programas de modelización

40 de estructuras de proteínas tales como "Insight II" (Accelrys, Inc.). Por lo tanto, la modelización se puede usar para predecir qué restos de un polipéptido se pueden cambiar sin alterar la función (Crameri y col. (2003) patente de EE.UU. nº 6.521.453). Por lo tanto, se puede mostrar que los polipéptidos que son de secuencia similar tienen una alta probabilidad de tener función similar por su similitud estructural, lo cual se puede establecer, por ejemplo, por comparación de regiones de superestructura. Las tendencias relativas de los aminoácidos a formar regiones de

45 superestructura (por ejemplo, hélices y láminas β) están bien establecidas. Por ejemplo, O’Neil y col. ((1990) Science

250: 646-651) han discutido con detalle las tendencias de los aminoácidos a formar hélices. Se pueden usar tablas de actividad de formación de estructura relativa como tablas de sustitución para predecir qué restos se pueden sustituir funcionalmente en una región dada, por ejemplo, en dominios de unión al ADN de factores de transcripción conocidos y equivalogos. Se pueden identificar los homólogos que es probable que sean funcionalmente similares.

[0230] Es de interés particular la estructura de un factor de transcripción en la región de sus dominios conservados, tal como los identificados en la tabla 1 y tabla 3. Se pueden llevar a cabo análisis estructurales comparando la estructura del factor de transcripción conocido alrededor de su dominio conservado con las de ortólogos y parólogos. El análisis de una serie de polipéptidos dentro de un grupo o clado de factores de transcripción, incluyendo los polipéptidos funcional o secuencialmente similares proporcionados en la lista de secuencias, también puede proporcionar comprensión de los elementos estructurales necesarios para regular la transcripción dentro de una familia dada.

EJEMPLOS

[0231] La invención, descrita ahora de forma general, se entenderá mejor por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con el propósito de ilustrar determinados aspectos y realizaciones de la presente invención y no se pretende que limiten la invención. El experto en la materia reconocerá que un factor de transcripción que está asociado con un primer rasgo particular también puede estar asociado con al menos otro segundo rasgo no relacionado e inherente que no se había predicho por el primer rasgo.

[0232] Las descripciones completas de los rasgos asociados con cada polinucleótido de la invención se describen con detalle en los ejemplos VIII, IX y X.

Ejemplo I: identificación y clonación del gen de longitud completa

[0233] Se identificaron secuencias de factores de transcripción presuntos (genómicas o EST) relacionadas con factores de transcripción conocidos en la base de datos de GenBank de Arabidopsis thaliana usando el programa de análisis de secuencias tblastn usando los parámetros por defecto y un umbral del valor de punto de corte P de -4 o -5 o inferior, dependiendo de la longitud de la secuencia de consulta. Después se cribaron los aciertos de la secuencia del factor de transcripción presunto para identificar aquellos que contienen cadenas de secuencia particulares. Si los aciertos de secuencia contenían dichas cadenas de secuencias, las secuencias se confirmaban como factores de transcripción.

[0234] Alternativamente, se cribaron bibliotecas de ADNc de Arabidopsis thaliana obtenidas de diferentes tejidos o tratamientos, o bibliotecas genómicas, para identificar nuevos miembros de una familia de transcripción usando un procedimiento de hibridación en condiciones rigurosas bajas. Se sintetizaron sondas usando cebadores específicos de genes en una reacción de PCR estándar (temperatura de reasociación 60ºC) y se marcaron con 32P dCTP usando el kit de marcaje High Prime DNA Labeling (Roche Diagnostics Corp., Indianapolis, IN). Las sondas radiomarcadas purificadas se añadieron a filtros sumergidos en medio de hibridación Church (NaPO4 0,5 M pH 7,0, SDS al 7%, albúmina de suero bovino al 1% en p/v) y se hibridaron durante la noche a 60ºC con agitación. Los filtros se lavaron dos veces durante 45 a 60 minutos con 1 x SCC, SDS al 1% a 60ºC.

[0235] Para identificar secuencias adicionales 5’ o 3’ de una secuencia de ADNc parcial en una biblioteca de ADNc, se llevó a cabo la amplificación rápida 5’ y 3’ de los extremos del ADNc (RACE) usando el kit de amplificación de ADNc MARATHON (Clontech, Palo Alto, CA). En general, el procedimiento implica aislar primero el poli(A)-ARNm, llevando a cabo la síntesis de la primera y segunda cadena de ADNc para generar ADNc de doble cadena, hacer los extremos romos del ADNc, seguido de la unión del adaptador MARATHON al ADNc para formar una biblioteca de ADNc de doble cadena ligado al adaptador.

[0236] Se diseñaron cebadores específicos de gen para usar junto con cebadores específicos del adaptador para la reacciones RACE tanto 5’ como 3’. Se usaron cebadores anidados en lugar de cebadores sencillos, para aumentar la especificidad de la PCR. Usando las reacciones RACE de 5’ y 3’, se obtuvieron fragmentos de RACE 5’ y 3’, se secuenciaron y se clonaron. El procedimiento se puede repetir hasta identificar los extremos 5’ y 3’ del gen de longitud completa. Después se generó el ADNc de longitud completa por PCR usando cebadores específicos para los extremos 5’ y 3’ del gen mediante PCR de extremo a extremo.

Ejemplo II: Construcción de vectores de expresión

[0237] La secuencia se amplificó a partir de una biblioteca genómica o de ADNc usando cebadores específicos para las secuencias en dirección 5’ y dirección 3’ de la región codificante. El vector de expresión era pMEN20 o pMEN65, que derivan ambos de pMON316 (Sanders y col. (1987) Nucleic Acids Res. 15:1543-1558) y contienen el promotor 35S de CaMV. Para clonar la secuencia en el vector, se digirieron tanto pMEN20 como el fragmento de ADN amplificado por separado con las enzimas de restricción SalI y NotI a 37ºC durante 2 horas. Los productos de digestión se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 0,8% y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN que contenían la secuencia y el plásmido linealizado se escindieron y se purificaron usando un kit de extracción en gel de QIAQUICK (Qiagen, Valencia CA). Los fragmentos de interés se ligaron en una relación de 3:1 (vector a inserto). Las reacciones de ligación usando la ADN ligasa T4 (New England Biolabs, Beverly MA) se llevaron a cabo a 16ºC durante 16 h. Los ADN ligados se transformaron en células competentes de la cepa de E. coli DH5α usando el procedimiento de choque térmico. Las transformaciones se cultivaron en placas LB que contenían kanamicina 50 mg/l (Sigma Chemical Co. St. Louis MO). Las colonias individuales se cultivaron durante la noche en 5 ml de caldo LB que contenía kanamicina 50 mg/l a 37ºC. El ADN plasmídico se purificó usando los kits Qiaquick Mini Prep kits (Qiagen).

Ejemplo III: transformación de Agrobacterium con el vector de expresión

[0238] Después de construir el vector plasmídico que contenía el gen, el vector se usó para transformar células de Agrobacterium tumefaciens que expresaban los productos génicos. La cepa de células de Agrobacterium tumefaciens para la transformación se hizo como describen Nagel y col. (1990) FEMS Microbiol Letts. 67: 325-328. Se cultivó la cepa ABI de Agrobacterium en 250 ml de medio LB (Sigma) durante la noche a 28ºC con agitación hasta que se alcanzó una absorbancia a lo largo de 1 cm a 600 nm (A600) de 0,5 -1,0. Las células se recogieron por centrifugación a 4.000 x g durante 15 min a 4ºC. Después las células se volvieron a suspender en 250 ml de tampón enfriado (HEPES 1 mM, pH ajustado a 7,0 con KOH). Las células se centrifugaron otra vez como se ha descrito antes y se volvieron a suspender en 125 μl de tampón enfriado. Después, las células se centrifugación y se volvieron a suspender dos veces más en el mismo tampón HEPES como se ha descrito antes con un volumen de 100 μl y 750 μl, respectivamente. Después, las células resuspendidas se distribuyeron en partes alícuotas de 40 μl, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC.

[0239] Las células de Agrobacterium se transformaron con plásmidos preparados como se ha descrito antes siguiendo el protocolo descrito por Nagel y col. (1990), véase antes. Para cada construcción de ADN que se iba a transformar, se mezclaron 50-100 ng de ADN (en general resuspendido en Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) con 40 μl de células de Agrobacterium. La mezcla de ADN/células después se transfirió a una cubeta enfriada con un hueco de electrodo de 2 mm y se sometió a una carga de 2,5 kV disipada a 25 μF y 200 μF usando un aparato Gene Pulser II (Bio-Rad, Hercules, CA). Después de electroporación, las células se volvieron a suspender inmediatamente en 1,0 ml de LB y se dejaron recuperar sin selección con antibiótico durante 2-4 h a 28ºC en un incubador con agitación. Después de recuperación, las células se cultivaron en medio de caldo LB que contenía estreptomicina 100 μg/ml (Sigma) y se incubaron durante 24-48 horas a 28ºC. Después se recogieron colonias individuales y se inocularon en medio reciente. La presencia de la construcción del plásmido se verificó por amplificación por PCR y análisis de secuencia.

Ejemplo IV: Transformación de plantas de Arabidopsis con Agrobacterium tumefaciens con vector de expresión

[0240] Después de la transformación de Agrobacterium tumefaciens con vectores plasmídicos que contenían el gen, se identificaron colonias individuales de Agrobacterium, se propagaron y se usaron para transformar plantas de Arabidopsis. Brevemente, se inocularon cultivos de 500 ml de medio LB que contenía kanamicina 50 mg/ml con las colonias y se cultivaron a 28ºC con agitación durante 2 días hasta alcanzar una absorbancia óptica a 600 nm de longitud de onda a lo largo de 1 cm (A600) de >2,0. Después, se recogieron las células por centrifugación a 4.000 x g durante 10 min y se volvieron a suspender en medio de infiltración (1/2 X sales de Murashige y Skoog (Sigma), 1 X vitaminas B-5 de Gamborg (Sigma), sacarosa al 5,0% (p/v) (Sigma), bencilamino-purina 0,044 μM (Sigma), Silwet L77 200 μl/l (Lehle Seeds)) hasta alcanzar una A600 de 0,8.

[0241] Antes de la transformación, las semillas de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia) se sembraron con una densidad de ∼10 plantas por maceta de 5 cm en medio de siembra en maceta Pro-Mix BX (Hummert International) cubiertas con malla de fibra de vidrio (18 mm X 16 mm). Las plantas se cultivaron con iluminación continua (50-75 μE/m2/s) a 22-23ºC con una humedad relativa de 65-70%. Después de aproximadamente 4 semanas, se cortan los tallos de inflorescencias primarias (espigas) para potenciar el crecimiento de múltiples espigas secundarias. Después de florecer las espigas secundarias maduras, las plantas se prepararon para la transformación retirando todas las silicuas y flores abiertas.

[0242] Después, las macetas se sumergieron boca abajo en la mezcla de medio de infiltración de Agrobacterium como se ha descrito antes durante 30 s, y se pusieron de lado para permitir el drenaje en una superficie plana de 2,54 x 5 cm cubiertas con una envoltura plástica. Después de 24 h, se retiró la envoltura plástica y las macetas se pusieron derechas. El procedimiento de inmersión se repitió una semana después, durante un total de 2 inmersiones por maceta. Después se recogieron las semillas de cada maceta de transformación y se analizaron siguiente el siguiente protocolo descrito.

Ejemplo V: Identificación de transformantes primarios de Arabidopsis

[0243] Las semillas recogidas de las macetas de transformación se esterilizaron esencialmente como sigue. Las semillas se dispersaron en una disolución que contenía Triton X-100 (Sigma) al 0,1% (v/v) y agua estéril y se lavaron agitando la suspensión durante 20 min. La disolución de lavado después se drenó y se sustituyó por una disolución de lavado reciente para lavar las semillas durante 20 min con agitación. Después de eliminar la disolución de etanol/detergente, se añadió a las semillas una suspensión que contenía Triton X-100 al 0,1 % (v/v) y lejía al 30% (v/v) (CLOROX; Clorox Corp. Oakland CA), y la suspensión se agitó durante 10 min. Después de separar la disolución de lejía/detergente, las semillas se lavaron 5 veces en agua destilada estéril. Las semillas se almacenaron en el último agua de lavado a 4ºC durante 2 días en la oscuridad antes de cultivarlas en placa en medio de selección con antibiótico (1 X sales de Murashige y Skoog (pH ajustado a 5,7 con KOH 1 M), 1 X vitaminas B-5 de Gamborg, Phytagar al 0,9% (Life Technologies) y kanamicina 50 mg/l). Las semillas se germinaron con iluminación continua (50-75 μE/m2/s) a 22-23ºC. Después de 7-10 días de crecimiento en estas condiciones, se obtuvieron los transformantes primarios resistentes a la kanamicina (generación T1) que eran visibles. Estas plántulas se transfirieron primero a placas de selección recientes, en las que las plántulas continuaron creciendo durante 3-5 días más, y después al suelo (medio de siembra en macetas Pro-Mix BX).

[0244] Los transformantes primarios se cruzaron con semillas de la descendencia (T2) recogidas; se seleccionaron las plántulas resistentes a la kanamicina y se analizaron. Los niveles de expresión de los polinucleótidos recombinantes en los transformantes varía de aproximadamente un aumento del nivel de expresión de 5% hasta al menos un aumento del nivel de expresión de 100%. Se hicieron observaciones similares con respecto al nivel de expresión del polipéptido.

Ejemplo VI: Identificación de plantas de Arabidopsis con inactivaciones de genes de factores de transcripción

[0245] El cribado de las colecciones de Arabidopsis mutegenizadas por inserción para mutantes nulos en un gen diana conocido, se hizo esencialmente como describen Krysan y col. (1999) Plant Cell 11: 2283-2290. Brevemente, se diseñaron cebadores específicos de gen, anidados por 5-250 pares de bases entre sí, a partir de las regiones 5’ y 3’ de un gen diana conocido. Igualmente, también se crearon grupos de cebadores anidados específicos para cada uno de los ADN-T o extremos de transposones (los bordes “derecho” e “izquierdo”). Se usaron todas las posibles combinaciones de cebadores específicos de gen y ADN-T/transposón para detectar por PCR un suceso de inserción dentro o cerca del gen diana. Después, los fragmentos de ADN amplificados se secuenciaron, lo que permite la determinación precisa del punto de inserción del ADN-T/transposón con respecto al gen diana. Los sucesos de inserción dentro de la secuencia codificante o intermedia de los genes se desconvolucionaron de un grupo que comprendía una pluralidad de sucesos de inserción en una sola planta mutante única para la caracterización funcional. El procedimiento se describe con más detalle en Yu y Adam, solicitud de EE.UU. nº de serie 09/177.733 presentada el 23 de octubre, 1998.

Ejemplo VII: Identificación de fenotipos modificados en plantas con expresión en exceso o inactivación de genes

[0246] Se usó Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Col-0) para crear todas las líneas que expresaban en exceso. Las plantas de control para el ensayo eran plantas Col-0 transformadas con un vector de transformación vacío (pMEN65).

Experimentos en micromatrices

[0247] En algunos casos, los patrones de expresión de los genes inducidos por estrés se pueden seguir por experimentos de micromatrices. En estos experimentos, los ADNc se generan por la PCR y se vuelven a suspender a una concentración final de ∼100 ng/μl en 3x SSC o fosfato-Na 150 mM (Eisen y Brown (1999) Methods Enzymol.

303: 179-205). Los ADNc se aplican como manchas puntuales sobre portaobjetos de vidrio de microscopio recubiertos con polilisina. Los ADNc preparados se dividen en partes alícuotas en placas de 384 pocillos y se aplican como manchas puntuales sobre los portaobjetos usando, por ejemplo, una estructura de soporte x-y-z (OmniGrid) que se puede adquirir en (Menlo Park, CA) equipado con clavijas de tipo vaina que se pueden adquirir en Telechem International (Sunnyvale, CA). Después de la aplicación en manchas puntuales, las matrices se curan durante un mínimo de una semana a temperatura ambiente y, se rehidratan y se bloquean siguiendo el protocolo recomendado por Eisen y Brown (1999) véase antes.

[0248] Las muestras de ARN total (10 μg) se marcan usando colorantes de Cy3 y Cy5 fluorescentes. Las muestras marcadas se vuelven a suspender en 4X SSC/SDS al 0,03%/4 μg de ADN de esperma de salmón/2 μg de ARNt/pirofosfato de sodio 50 mM, se calientan a 95ºC durante 2,5 min, se centrifugan y se ponen sobre la matriz. Después la matriz se cubre con un cubreobjetos de vidrio y se pone en una cámara herméticamente cerrada. Después la cámara se mantiene en un baño de agua a 62ºC durante una noche. Las matrices se lavan como describen Eisen y Brown (1999), véase antes, y se escanean en un escáner láser General Scanning 3000. Los archivos resultantes posteriormente se cuantifican usando el software IMAGENE, (BioDiscovery, Los Angeles CA).

[0249] Se pueden llevar a cabo experimentos de RT-PCR para identificar aquellos genes inducidos después de exposición a estreses abióticos. En general, se examinan los patrones de expresión de genes de tejidos foliares de plantas de suelo.

[0250] Se llevó a cabo la PCR con transcriptasa inversa usando cebadores específicos de gen con la región codificante de cada secuencia identificada. Los cebadores se diseñaron cerca de la región 3’ de cada secuencia de unión al ADN identificada inicialmente.

[0251] Los ARN totales de estos tejidos foliares del suelo se aislaron usando los protocolos de extracción de CTAB. Una vez extraído, el ARN total se normalizó en concentración con todos los tipos de tejidos para asegurar que la reacción de la PCR para cada tejido recibía la misma cantidad de molde de ADNc usando la banda 28S como referencia. Se purificó el poli(A+) ARN usando un protocolo modificado del protocolo del lote del kit de purificación Qiagen OLIGOTEX. El ADNc se sintetizó usando protocolos estándar. Después de la síntesis de la primera cadena de ADNc, se usaron cebadores para actina 2 para normalizar la concentración de ADNc en todos los tipos de tejidos. Se encontró que la actina 2 es expresada de forma constitutiva en niveles bastante iguales en todos los tipos de tejidos que se investigan.

[0252] Para la RT-PCR, los moldes de ADNc se mezclaron con los cebadores correspondientes y la ADN polimerasa Taq. Cada reacción consistía en 0,2 μl de molde de ADNc, 2 μl de 10X tampón de Tricina, 2 μl de 10X tampón de Tricina y 16,8 μl de agua, 0,05 μl de cebador 1, 0,05 μl, de cebador 2, 0,3 μl de ADN polimerasa Taq y 8,6 μl de agua.

[0253] La placa de 96 pocillos se cubre con micropelícula y se pone en el termociclador para iniciar el ciclo de reacción. A modo de ilustración, el ciclo de reacción puede comprender las siguientes etapas:

ETAPA 1: 93ºC durante 3 minutos; ETAPA 2: 93ºC durante 30 segundos; ETAPA 3: 65ºC durante 1 minuto; ETAPA 4: 72ºC durante 2 minutos; Las ETAPAS 2, 3 y 4 se repiten durante 28 ciclos; ETAPA 5: 72ºC durante 5 minutos; y ETAPA 6: 4ºC.

[0254] Para amplificar más productos, por ejemplo, para identificar genes que tienen expresión muy baja, se pueden llevar a cabo etapas adicionales: el siguiente procedimiento ilustra un procedimiento que se puede usar en relación con esto; la placa de PCR se vuelve a poner en el termociclador durante 8 ciclos más de etapas 2-4.

ETAPA 2: 93ºC durante 30 segundos; ETAPA 3: 65ºC durante 1 minuto; ETAPA 4: 72ºC durante 2 minutos, repetida 8 ciclos; y ETAPA 5: 4ºC.

[0255] Se cargan 8 μl de producto de la PCR y 1,5 μl de colorante de carga en un gel de agarosa al 1,2% para el análisis después de 28 ciclos y 36 ciclos. Los niveles de expresión de transcritos específicos se consideran bajos si son detectables sólo después de 36 ciclos de PCR. Los niveles de expresión se consideran medios o altos dependiendo de los niveles de transcritos comparados con los niveles de transcritos observados para un control interno tal como la actina 2. Los niveles de transcritos se determinan en experimentos repetidos y se comparan con los niveles de transcritos en plantas de control (p. ej., no transformadas).

Ensayos de estrés abiótico

[0256] Los fenotipos modificados observados para plantas particulares que expresan en exceso pueden incluir una mayor biomasa y/o mayor o menor tolerancia o resistencia al estrés abiótico. Para una expresión en exceso en particular que muestra una característica menos beneficiosa, tal como una menor tolerancia o resistencia al estrés abiótico, puede ser más útil seleccionar una planta con una menor expresión de un factor de transcripción particular. Para una inactivación particular que muestra una característica menos beneficiosa, tal como una menor tolerancia al estrés abiótico, puede ser más útil seleccionar una planta con una mayor expresión de un factor de transcripción particular.

[0257] Los ensayos de germinación en este ejemplo siguieron las modificaciones del mismo protocolo básico. Se sembraron semillas estériles en los medios condicionados listados a continuación. Las placas se incubaron a 22ºC con 24 h de luz (120-130 μEin/m2/s) en una cámara de crecimiento. La evaluación de la germinación y el vigor de las plántulas se llevó a cabo de 3 a 15 días después de plantarlas. El medio basal era medio Murashige-Skoog al 80% (MS) + vitaminas.

[0258] Para los experimentos de estrés llevados a cabo con plantas más maduras, las semillas se germinaron y cultivaron durante varios días en MS + vitaminas + sacarosa al 1% a 22ºC y después se transfirieron a condiciones de estrés por frío y calor. Las plantas se expusieron o bien a estrés por frío (exposición de 6 h a 4-8ºC)

o a estrés por calor (se aplicaron 32ºC durante 5 días), después de lo cual las plantas se volvieron a transferir a 22ºC para la recuperación y se evaluaron 5 días después con respecto a los controles que no se habían expuesto a temperatura reducida o elevada.

[0259] Los ensayos de estrés salino pretendían encontrar genes que confirieran mejores germinación, vigor de las plántulas o crecimiento en concentración salina alta. La evaporación desde la superficie del suelo produce el movimiento del agua hacia arriba y la acumulación de sal en la capa superior del suelo donde se ponen las semillas. Por lo tanto, normalmente la germinación se produce con una concentración salina mucho más alta que la concentración salina media del perfil de todo el suelo. Las plantas difieren en su tolerancia al NaCl dependiendo de la etapa de desarrollo, por lo tanto se evaluaron las respuestas en la germinación de la semilla, vigor de la plántula, y crecimiento de la planta.

[0260] Los ensayos de estrés osmótico (incluyendo ensayos de NaCl y manitol) se llevaron a cabo para determinar si un fenotipo de estrés osmótico era específico de NaCl o era un fenotipo de estrés osmótico general. Las plantas tolerantes al estrés osmótico podrían haber tenido también mayor tolerancia a la sequía y/o helada.

[0261] Para los experimentos de germinación para el estrés salino y osmótico, el medio se complementó con NaCl 150 mM o manitol 300 mM. Se llevaron a cabo ensayos de sensibilidad de reguladores del crecimiento en medio MS, vitaminas y, o bien ABA 0,3 μM, sacarosa al 9,4%, o bien glucosa al 5%.

[0262] Los experimentos se llevaron a cabo para identificar los transformantes que presentaban sensores de azúcar modificados. Para dichos estudios, se germinaron semillas de transformantes en medio que contenía una alta concentración de azúcar (glucosa al 5%, sacarosa al 9,4%) que normalmente restringen parcialmente el alargamiento del hipocotilo. Las plantas con los sensores de azúcar alterados pueden tener hipocotilos más largos o más cortos que las plantas normales cuando crecen en este medio. Además, se pueden variar otros rasgos de la planta tales como la masa de la raíz. Los ensayos de sensores de azúcar pretendían encontrar genes implicados en los sensores de azúcar, por germinación de semillas en concentraciones altas de sacarosa y glucosa y buscar los grados de alargamiento de los hipocotilos. El ensayo de germinación en manitol controlaba las respuestas relacionadas con el estrés osmótico. Los azúcares son moléculas reguladoras clave que afectan a diversos procesos en las plantas superiores incluyendo la germinación, crecimiento, floración, senescencia, metabolismo de azúcares y fotosíntesis. La sacarosa es la forma de transporte principal de la fotosíntesis y su flujo a través de las células se ha mostrado que afecta a la expresión de genes y altera la acumulación de compuestos de almacenamiento en semillas (relaciones fuente–sumidero). También se han descrito los sensores de hexosa específicos de glucosa en plantas y se han implicado en la división celular y en la represión de los genes “famina” (ciclos fotosintéticos o de glioxilato).

[0263] Los ensayos de estrés por temperatura se llevaron a cabo para descubrir genes que conferían una mejor germinación, vigor a las plántulas o crecimiento de las plantas en condiciones de estrés por temperatura (frío, helada y calor). Los experimentos de germinación en frío para el estrés por temperatura se llevaron a cabo a 8ºC. Los experimentos de germinación para el estrés por calor se llevaron a cabo de 32ºC a 37ºC durante 6 h de exposición.

[0264] Los cribados para la sequía basados en suelo se llevaron a cabo en plantas de Arabidopsis que expresaban en exceso los factores de transcripción listados en la Lista de Secuencias. Semillas de plantas de Arabidopsis silvestres o plantas que expresaban en exceso un polipéptido de la invención, se pusieron en capas durante 3 días a 4ºC en agarosa al 0,1%. Después se sembraron 14 semillas de cada uno del tipo de expresión en exceso o silvestre en macetas de arcilla de 7,6 cm que contenían una mezcla de vermiculita:perlita 50:50 con una pequeña capa en la parte superior de MetroMix 200 y se cultivaron durante 15 días con luz las 24 h. Las macetas que contenían las plántulas silvestres y que expresaban en exceso se pusieron en pletinas en orden aleatorio. El estrés por sequía se inició poniendo las macetas sobre papel absorbente durante 7 a 8 días. Se consideró que las plántulas estaban suficientemente estresadas cuando la mayoría de las macetas que contenían las plántulas silvestres en una pletina se habían marchitado gravemente. Las macetas entonces se volvieron a regar y se puntuó la supervivencia de 4 a 7 días después. Las plantas se clasificaron frente a los controles silvestres para cada uno de 2 criterios: tolerancia a las condiciones de sequía y recuperación (supervivencia) después de volver a regar.

[0265] Al final del periodo de sequía inicial, se asignó a cada maceta una puntuación con valor numérico dependiendo de los criterios anteriores. Se asignaron puntuaciones de 0-6 (tabla 11), con el valor inferior de “0” asignado a plantas con un aspecto extremadamente pobre (es decir, plantas que estaban uniformemente marrones) y se dio un valor de “6” a plantas que se valoraron como de aspecto muy saludable (es decir, las plantas estaban todas verdes). Después de volver a regar las plantas e incubarlas durante 4 a 7 días adicionales, se volvieron a evaluar las plantas para indicar el grado de recuperación desde el tratamiento de privación de agua.

[0266] Después, se llevó a cabo un análisis para determinar que plantas sobrevivían mejor a la falta de agua, identificando los transgenes que conferían de forma consistente los fenotipos de tolerancia a la sequía y la capacidad para recuperarse de este tratamiento. El análisis se llevó a cabo comparando tabulaciones generales y dentro de una pletina con un conjunto de modelos estadísticos para dar cuenta de las variaciones entre lotes. Se tabularon varias medidas de supervivencia, incluyendo (a) la proporción media de plantas que sobrevivían con respecto a la supervivencia de las silvestres dentro de la misma pletina; (b) la proporción mediana de supervivencia con respecto a la supervivencia de las silvestres dentro de la misma pletina; (c) la supervivencia media general (tomando todos los lotes, pletinas y macetas); (d) la supervivencia media general con respecto a la supervivencia de silvestres general: y (e) la puntuación visual media de la salud de las plantas antes de volver a regarlas.

[0267] A continuación se indican ejemplos de genes y homólogos que confieren mejoras significativas a plantas inactivadas o que expresan en exceso. También se presentan las observaciones experimentales hechas por los autores de la invención con respecto a genes específicos cuya expresión se ha modificado en plantas inactivadas o que expresan en exceso, y potenciales aplicaciones basadas en estas observaciones.

Ejemplo VIII: resultados del análisis de estrés por sequía

[0268] Este ejemplo proporciona pruebas experimentales para la mayor tolerancia al estrés abiótico controlada por polipéptidos de factores de transcripción y polipéptidos de la invención.

Resultados:

[0269] Como se indica a continuación, se mostró que el exceso de expresión de G2133 aumentaba la tolerancia al estrés por sequía en plantas. Una serie de ortólogos de algunas de estas secuencias también eran capaces de aumentar la tolerancia al estrés abiótico, como se indica a continuación.

El clado G47 de polipéptidos de factores de transcripción

G47 (SEQ ID NO: 1 y 2)

[0270] Información publicada. G47 corresponde al gen T22J18.2 (AAC25505). No hay información disponible sobre la o las funciones de G47.

[0271] Observaciones experimentales. La función de G47 se estudió usando plantas de Arabidopsis transgénicas en las que el gen se expresaban bajo el control del promotor 35S. El exceso de expresión de G47 daba como resultado una variedad de alteraciones fenotípicas morfológicas y fisiológicas.

[0272] Las plantas 35S::G47 presentaban una mayor tolerancia al estrés osmótico; los ensayos de estrés osmótico se llevaron a cabo usando medio de crecimiento que contenían polietilenglicol (PEG). Después de germinación, las plántulas de las líneas 35S::G47 que expresaban en exceso, en general aparecieron más grandes y tenían más crecimiento de las raíces que las plántulas de control silvestre.

[0273] Como se había predicho por estos ensayos de estrés osmótico, las plantas G47 también presentaban mayor supervivencia y tolerancia a la sequía en un ensayo de sequía basado en el suelo.

[0274] La expresión en exceso de G47 también producía un retraso sustancial en el tiempo de floración y producía un cambio notable en la arquitectura de los brotes. Los transformantes 35S::G47 eran pequeños en las primeras etapas y cambiaban para florecer más de una semana más tarde que los controles silvestres (condiciones de luz continua). Es interesante que, las inflorescencias de estas plantas aparecían densas y carnosas, tenían menor dominancia apical y presentaban un menor alargamiento entre nudos conduciendo a una estatura compacta baja. El patrón de ramificación de los tallos también aparecía anormal, volviéndose los brotes primarios “retorcidos” en cada nudo de coflorescencia. Además, las plantas mostraron una fertilidad ligeramente reducida y formaban silicuas bastante pequeñas que nacían en pedicelos cortos y se mantenían en vertical, cercanos contra el tallo.

[0275] Se detectaron alteraciones adicionales en los tallos de inflorescencias de plantas 35S::G47. Las secciones de los tallos de plantas T2-21 y T2-24 eran de diámetro más ancho, y tenían haces vasculares irregulares grandes que contenían un número mucho mayor de vasos de xilema que el tipo silvestre. Además algunos de los vasos de xilema dentro de los haces aparecían estrechos y posiblemente estaban más lignificados que los de los controles.

[0276] G47 se expresaba con niveles mayores en hojas en roseta, y los transcritos se podían detectar en otros tejidos (flor, embrión, silicua y plántulas en germinación), pero aparentemente no en las raíces.

[0277] Utilidades. G47 o sus equivalogos se pueden usar para aumentar la tolerancia de las plantas a la sequía y a otros estreses osmóticos. G47 o sus equivalogos también se podían usar para manipular el tiempo de floración, para modificar la arquitectura de la planta y la estructura del tallo, incluyendo el desarrollo del tejido vascular y el contenido de lignina. El uso de G47 o sus equivalogos de especies de árboles podría ofrecer el potencial de modular el contenido de lignina. Esto podría permitir mejorar la calidad de la madera usada para el mobiliario o la construcción. G47 y sus equivalogos incluyen, por ejemplo Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 12 (G2133); Oryza sativa (grupo de variedad de cultivo japonica) SEQ ID NO: 98 (G3649), SEQ ID NO: 100 (G3651), y SEQ ID NO: 90 (G3644); Glycine max SEQ ID NO: 88 (G3643); Zinnia elegans SEQ ID NO: 96 (G3647); Brassica rapa subsp. Pekinensis SEQ ID NO: 92 (G3645); y Brassica oleracea SEQ ID NO: 94 (G3646).

G2133 (SEQ ID NO: 11 y 12)

[0278] Información publicada. G2133 es un parálogo de G47. G2133 corresponde al gen F26A9.11 (AAF23336). No hay información disponible sobre la o las funciones de G2133.

[0279] Observaciones experimentales. La función de G2133 se estudió usando plantas de Arabidopsis transgénicas en las que el gen se expresaban bajo el control del promotor 35S.

[0280] La expresión de G2133 se detectó en una variedad de tejidos: muestras de flor, hoja, embrión y silicua. Su expresión se puede alterar mediante varias condiciones, incluyendo el tratamiento con auxina, estrés osmótico, infección por Fusarium. El exceso de expresión de G2133 causaba una variedad de alteraciones en el crecimiento y desarrollo de la planta: floración retrasada, arquitectura alterada de la inflorescencia y una disminución en el tamaño general y fertilidad.

[0281] En las primeras etapas, los transformantes 35S::G47 eran notablemente más pequeños que los controles y presentaban hojas retorcidas y verde oscuro. La mayoría de estas plantas permanecía en una fase vegetativa del desarrollo sustancialmente más larga que la de los controles, y producía un mayor número de hojas antes de la floración temprana. En las plantas más gravemente afectadas, la floración temprana se produjo más de un mes más tarde que en las silvestres (24 h de luz). Además, las plantas presentaron una reducción de la dominancia apical y formaron números mayores de brotes simultáneamente, de las axilas de las hojas en roseta. Estos tallos con inflorescencias tenían entrenudos más cortos y llevaban un número mayor de nudos de hojas caulinares, dándoles un aspecto muy carnoso. La fertilidad de las plantas 35S::G47 en general era muy baja. Además, se encontró que las líneas G2133 que expresaban en exceso, eran más resistentes al herbicida glifosato en los experimentos iniciales y repetidos.

[0282] No se detectaron alteraciones en las plantas 35S::G47 en los análisis bioquímicos que se llevaron a cabo.

[0283] G2133 es un parálogo de G47, sabiéndose de este último por estudios previos, que confiere un fenotipo de tolerancia a la sequía cuando se expresa en exceso. Por lo tanto, no fue sorprendente cuando se mostró que G213 también inducía tolerancia a la sequía en una serie de líneas de 35S::G2133 estimuladas en ensayos de sequía basados en suelo (tablas 11 y 12). Los experimentos que comparaban la recuperación de controles silvestres y dos líneas de plantas de Arabidopsis que expresaban en exceso G2133 (un parálogo de G47), de un tratamiento de sequía, se llevaron a cabo con luz constante. Las líneas de 35S::G2133 y de control se cultivaron en macetas, conteniendo cada maceta varias plantas. Se privó a todas de agua durante 8 días y después se volvieron a regar. Después de volver a regarlas, todas las plantas de ambas líneas de G2133 que expresaban en exceso se revigorizaron, y todas las plantas de control murieron o estaban gravemente afectadas por el tratamiento de sequía (tabla 12).

[0284] Utilidades. G2133 y sus equivalogos se pueden usar para aumentar la tolerancia de las plantas a la sequía y a otros estreses osmóticos. G2133 también se podría usar para la generación de plantas resistentes al glifosato y para aumentar la resistencia de la planta al estrés oxidativo. G2133 y sus equivalogos incluyen, por ejemplo, Arabidopsis thaliana SEQ ID NO: 2 (G47); Oryza sativa (grupo de variedad cultivada japonica) SEQ ID NO: 98 (G3649), SEQ ID NO: 100 (G3651), y SEQ ID NO: 90 (G3644); Glycine max SEQ ID NO: 88 (G3643); Zinnia elegans SEQ ID NO: 96 (G3647); Brassica rapa subsp. Pekinensis SEQ ID NO: 92 (G3645); y Brassica oleracea SEQ ID NO: 94 (G3646).

G3643 (SEQ ID NO: 87 and 88)

[0285] G3643 es un ortólogo de la soja de G47 y G2133.

[0286] Observaciones experimentales. La función de G3643 se estudió usando plantas de Arabidopsis transgénicas en las que el gen se expresaba bajo control del promotor 35S.

[0287] Las plantas de Arabidopsis que expresaban en exceso G3643 eran más tolerantes al frío que las plantas de control silvestres cultivadas en condiciones similares en ensayos de germinación basados en placa. Una de estas líneas también era más tolerante a la desecación y al crecimiento en condiciones de frío en ensayos basados en la placa.

[0288] Utilidades. G3643 y sus equivalogos se pueden usar para aumentar la tolerancia de las plantas a condiciones de frío y condiciones de poca agua, incluyendo sequía.

G3644 (SEQ ID NO: 89 y 90)

[0289] G3644 es un ortólogo del arroz de G47 y G2133.

[0290] Observaciones experimentales. La función de G3644 se estudió usando plantas de Arabidopsis transgénicas en las que el gen se expresaba bajo control del promotor 35S.

[0291] Se encontró que varias plantas de Arabidopsis que expresaban en exceso G3644 eran más tolerantes a la desecación que las plantas de control silvestres cultivadas en condiciones similares en ensayos basados en placa. Se mostró que dos líneas también eran más tolerantes a la sal que la silvestre.

[0292] Utilidades. G3644 o sus equivalogos se pueden usar para aumentar la tolerancia de las plantas a concentraciones altas de sal y condiciones de poca agua, incluyendo sequía.

G3649 (SEQ ID NO: 97 y 98)

[0293] G3649 es un ortólogo del arroz de G47 y G2133.

[0294] Observaciones experimentales. La función de G3649 se estudió usando plantas de Arabidopsis transgénicas en las que el gen se expresaba bajo control del promotor 35S.

[0295] Varias plantas de Arabidopsis que expresaban en exceso G3649 eran más tolerantes al frío que las plantas de control silvestres cultivadas en condiciones similares en ensayos basados en placa. Dos líneas que expresaban en exceso eran más tolerantes al calor que las plantas silvestres, y una línea 35S::G47 se encontró que era más tolerante a la desecación que la silvestre.

[0296] Utilidades. G3649 o sus equivalogos se pueden usar para aumentar la tolerancia de las plantas a condiciones de frío y condiciones de poca agua, incluyendo sequía.

Resumen de los resultados de los ensayos de sequía

[0297] La tabla 7 presenta los resultados obtenidos en un ensayo en el que plantas de Arabidopsis se sometieron a la privación de agua durante 7 a 8 días. Al final de este periodo de sequía, se asignó a cada maceta una puntuación numérica dependiendo de la salud de sus plantas. Se asignó una puntuación de 0 a 6 basándose en el color de la planta y el aspecto general, recibiendo “0” las plantas que eran todo marrones, y en el otro extremo del espectro, las plantas que tenían una aspecto excelente (todo verdes el) recibieron un “6”. La media de la puntuación numérica registrada de todas las macetas de un genotipo dado por línea de todas las pletinas ensayadas se presenta en orden de salud decreciente.

Tabla 7. Comparación de la puntuación numérica registrada para las plantas sometidas a tratamiento de sequía.

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[0298] La tabla 8 compara las clasificaciones de supervivencia de plantas de Arabidopsis que expresan en exceso varios polipéptidos, evaluadas después de 7 a 8 días de tratamiento de sequía, volver a regarlas y un

5 periodo de recuperación de 2 a 3 días. Los valores indican la probabilidad mediana de supervivencia dentro de una pletina dada (los percentiles 50 de supervivencia dentro de cada maceta de un genotipo dado por línea dividido entre la supervivencia media de las silvestres en la pletina).

Tabla 8. Valoraciones de supervivencias para plantas de Arabidopsis después de tratamiento de sequía y volver a 10 regarlas

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Ejemplo IX: Identificación de secuencias homólogas

5 [0299] Este ejemplo describe la identificación de genes que son ortólogos a los factores de transcripción de Arabidopsis thaliana a partir de una búsqueda de homología por ordenador.

[0300] Las secuencias homólogas, incluyendo las de parálogos y ortólogos de Arabidopsis y otras especies

10 de plantas, se identificaron usando herramientas de búsqueda de secuencias en bases de datos, tales como la herramienta Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul y col. (1990) véase antes; y Altschul y col. (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402). Los programas de análisis de secuencias tblastx se usaron con la matriz de puntuación BLOSUM-62 (Henikoff y Henikoff (1992) Proc Natl. Acad Sci. 89: 10915-10919). Se filtró la base de datos de NCBI GenBank entera para buscar secuencias de todas las plantas excepto de Arabidopsis thaliana

15 seleccionando todas las entradas en la base de datos NCBI GenBank asociadas con el ID taxonómico de NCBI 33090 (Viridiplantae; todas las plantas) y excluyendo las entradas asociadas con el ID taxonómico 3701 (Arabidopsis thaliana).

[0301] Estas secuencias se comparan con secuencias que representan genes de la invención, por ejemplo,

20 polinucleótidos encontrados en la lista de secuencias, usando el algoritmo TBLASTX de la universidad de Washington (versión 2.0a19MP) con los parámetros por defecto usando los alineamientos incompletos con el filtro “apagado”. Para cada secuencia de polinucleótido encontrada en la Lista de Secuencias, se ordenaron comparaciones individuales por puntuaciones de probabilidad (valor P), donde las puntuaciones reflejan la probabilidad de que se produzca un alineamiento particular al azar. Por ejemplo, una puntuación de 3,6E-40 es 3,6 x 10-40. Además de los valores P, también se puntuaron las comparaciones por el porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad refleja el grado con el que dos segmentos de ADN o proteínas son idénticos a lo largo de una longitud particular. Los ejemplos de secuencias identificadas de esta forma se presentan en la tabla 6. El porcentaje de identidad de secuencias entre estas secuencias puede ser tan bajo como 47%, o incluso una identidad de secuencia menor.

[0302] Las secuencias parálogas candidatas se identificaron entre factores de transcripción de Arabidopsis por el alineamiento, identidad y relaciones filogénicas. Se identificaron secuencias ortólogas candidatas del conjunto de la base de datos de Unigene de marca registrada de secuencias de genes de plantas en Zea mays, Glycine max y Oryza sativa, basándose en la homología significativa con los factores de transcripción de Arabidopsis. Estos candidatos se compararon recíprocamente con el conjunto de factores de transcripción de Arabidopsis. Si el candidato mostraba una similitud máxima en el dominio de proteína con el factor de transcripción que se provocaba

o con un parálogo del factor de transcripción que se provocaba, entonces se consideraba que era un ortólogo. Las secuencias que no eran de Arabidopsis que se mostró de esta forma que eran ortólogas a las secuencias de Arabidopsis se proporcionan en la tabla 6.

Ejemplo 7. Cribado de biblioteca de ADNc de planta para la secuencia que codifica el dominio de unión al ADN del factor de transcripción que se une a un elemento promotor de unión al factor de transcripción y demostración de la actividad reguladora de transcripción de la proteína

[0303] Se usa la estrategia de “un híbrido” (Li y Herskowitz (1993) Science 262:1870-1874) para cribar clones de ADNc de planta que codifican un polipéptido que comprende un dominio de unión al ADN del factor de transcripción, un dominio conservado. Brevemente, se construyen cepas de levadura que contienen un gen indicador lacZ con las secuencias del elemento promotor de unión del factor de transcripción silvestre o mutante en lugar de la UAS normal (secuencia activadora en dirección 5’) del promotor GALA. Se construyen cepas indicadoras de levadura que llevan las secuencias del elemento promotor de unión del factor de transcripción como elementos UAS que están operativamente unidos en dirección 5’ de un gen indicador lacZ con un promotor GAL4 mínimo. Las cepas se transforman con una biblioteca de expresión de planta que contiene insertos de ADNc aleatorios fusionados con el dominio de activación de GALA (GAL4-ACT) y se criban las formaciones de colonias azules en filtros tratados con X-gal (X-gal: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactosida; Invitrogen Corporation. Carlsbad CA). Alternativamente, las cepas se transformaron con un polinucleótido de ADNc que codifica una secuencia de polipéptido de dominio de unión al ADN de factor de transcripción conocida.

[0304] Las cepas de levadura que llevan estas construcciones indicadoras producen niveles bajos de βgalactosidasa y forman colonias blancas en los filtros que contienen X-gaL. Las cepas indicadoras que llevan las secuencias del elemento promotor de unión del factor de transcripción silvestres se transforman con un polinucleótido que codifica un polipéptido que comprende un dominio de unión al ADN de factores de transcripción de planta operativamente unidos a un dominio activador ácido del factor de transcripción GALA de levadura, “GAL4ACT”. Los clones que contienen un polinucleótido que codifica un dominio de unión al ADN de factor de transcripción operativamente unido a GALA-ACT pueden unirse en dirección 5’ de los genes indicadores lacZ que llevan la secuencia del elemento promotor de unión del factor de transcripción silvestre, activar la transcripción del gen lacZ y dar como resultado levaduras que forman colonias azules en los filtros tratados con X-gal.

[0305] Tras el cribado de aproximadamente 2 x 106 transformantes de levadura, se aíslan clones de ADNc positivos; es decir, clones que hacen que cepas de levaduras que llevan los indicadores lacZ operativamente unidos a elementos promotores de unión de factores de transcripción silvestres formen colonas azules en filtros tratados con X-gal. Los clones de ADNc no hacen que una cepa de levaduras que lleva elementos promotores de unión de factor de transcripción de tipo mutante fusionados con LacZ se vuelva azul. Por lo tanto, se muestra que un polinucleótido que codifica el dominio de unión al ADN de factor de transcripción, un dominio conservado, activa la transcripción de un gen.

Ejemplo XI: Ensayos de desplazamiento en gel.

[0306] La presencia de un factor de transcripción que comprende un dominio de unión al ADN que se une a un elemento de unión al ADN del factor de transcripción se evalúa usando el siguiente ensayo de desplazamiento en gel. El factor de transcripción se expresa de forma recombinante y se aísla de E. coli o se aísla de un material de planta. La proteína soluble total, que incluye el factor de transcripción, (40 ng) se incuba a temperatura ambiente en 10 μl de 1x tampón de unión (HEPES 15 mM (pH 7,9), EDTA 1 mM, KCl 30 mM, glicerol al 5%, albúmina de suero bovino al 5%, DTT 1 mM) más 50 ng poli(dl-dC):poli(dl-dC) (Pharmacia, Piscataway NJ) con o sin 100 ng de ADN competidor. Después de 10 minutos de incubación, se añade un ADN sonda que comprende un elemento de unión al ADN del factor de transcripción (1 ng) que se ha marcado con 32P mediante carga en el extremo (Sambrook y col. véase antes) y la mezcla se incuba durante 10 minutos adicionales. Las muestras se cargan en geles de poliacrilamida (al 4% en p/v) y se fraccionan por electroforesis a 150 V durante 2 h (Sambrook y col. véase antes). El grado de unión del factor de transcripción-ADN sonda se visualiza mediante autorradiografía. Las sondas y ADN competidores se preparan a partir de insertos oligonucleótidos ligados en un sitio BamHI de pUC118 (Vieira y col. (1987) Methods Enzymol. 153: 3-11). La orientación y el número de concatenaciones de insertos se determinan mediante análisis de secuencia de ADN por el procedimiento didesoxi (Sambrook y col. véase antes). Los insertos se recuperan después de digestión con enzimas de restricción con EcoRI y HindIII y se fraccionan en geles de poliacrilamida (al 12% en p/v) (Sambrook y col. véase antes).

Ejemplo XII. Transformación de dicotiledóneas

[0307] Se ha mostrado experimentalmente que las especies de cultivos que expresan en exceso miembros del clado G1792 de polipéptidos de factores de transcripción, producen plantas con una mayor tolerancia a la enfermedad. Esta observación indica que estos genes, cuando son expresados en exceso, darán como resultado rendimientos mayores de diferentes especies de plantas, en particular durante condiciones de estrés abiótico.

[0308] Por lo tanto, las secuencias de factores de transcripción listadas en la Lista de Secuencias recombinadas en vectores de expresión pMEN20 o pMEN65 se pueden transformar en una planta con el propósito de modificar rasgos de la planta. El vector de clonación se puede introducir en una variedad de plantas de cereales mediante medios bien conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, la transferencia de ADN directa o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Ahora es rutinario producir plantas transgénicas usando la mayoría de las plantas dicotiledóneas (véase Weissbach y Weissbach, (1989) véase antes; Gelvin y col. (1990) véase antes; Herrera-Estrella y col. (1983) véase antes; Bevan (1984) véase antes; y Klee (1985) véase antes). Los procedimientos de análisis de rasgos son rutinarios en la técnica y se han descritos ejemplos antes.

[0309] Se pueden encontrar procedimientos para transformar el algodón en las patentes de EE.UU. nº 5.004.863, 5.159.135 y 5.518.908; para transformar especies de brassica se pueden encontrar en la patente de EE.UU. nº 5.463.174; para transformar plantas del cacahuete se pueden encontrar en Cheng y col. (1996) Plant Cell Rep. 15: 653-657, y McKently y col. (1995) Plant Cell Rep. 14: 699-703; y para transformar plantas del guisante se pueden encontrar en Grant y col. (1995) Plant Cell Rep. 15: 254-258.

[0310] Se han descrito previamente numerosos protocolos para la transformación de plantas del tomate y la soja, y son bien conocidos en la técnica. Gruber y col. ((1993) en “Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”, pág. 89-119, Glick y Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton) describen varios vectores de expresión y procedimientos de cultivo que se pueden usar para la transformación de células o tejidos y la posterior regeneración. Para la transformación de la soja, describen procedimientos Miki y col. (1993) en “Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology”, pág. 67-88, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Raton; y en la patente de EE.UU. nº 5.563.055, (Townsend and Thomas), presentada el 8 de octubre, 1996.

[0311] Hay un número sustancial de alternativas a los protocolos de transformación mediados por Agrobacterium, y otros procedimientos para el propósito de transferir genes endógenos a la soja o a tomates. Uno de dichos procedimientos es la transformación mediada por microproyectiles, en la que el ADN sobre la superficie de partículas de microproyectiles se dirige a los tejidos de las plantas con un dispositivo biobalístico (véase, por ejemplo, Sanford y col., (1987) Part. Sci. Technol. 5:27-37; Christou y col. (1992) Plant. J. 2: 275-281; Sanford (1993) Methods Enzymol. 217: 483-509; Klein y col. (1987) Nature 327: 70-73; patente de EE.UU. nº 5.015.580 (Christou y col), presentada el 14 de mayo, 1991; y patente de EE.UU. nº 5.322.783 (Tomes y col.), presentada el 21 de junio, 1994.

[0312] Alternativamente, se han usado procedimientos de tratamiento por ultrasonidos (véase, por ejemplo, Zhang y col. (1991) Bio/Technology 9: 996-997); absorción directa de ADN en protoplastos usando precipitación con CaCl2, poli(alcohol vinílico) o poli-L-ornitina (véase, por ejemplo, Hain y col. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 161-168; Draper y col., Plant Cell Physiol. 23: 451-458 (1982)); fusión de liposomas o esferoplastos (véase, por ejemplo, Deshayes y col. (1985) EMBO J., 4: 2731-2737; Christou y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3962-3966); y electroporación de protoplastos y células enteras y tejidos (véase, por ejemplo, Donn y col.(1990) en Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38: 53; D’Halluin y col. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505; y Spencer y col. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 51-61), para introducir ADN extraño y vectores de expresión en plantas.

[0313] Después de transformar una planta o célula de planta (y esta última regenerada en una planta), la planta transformada se puede cruzar consigo misma o con una planta de la misma línea, una planta no transformada

o silvestre, u otra planta transformada de una línea de plantas transgénicas diferentes. El cruzamiento proporciona la ventaja de producir variedades transgénicas nuevas y a menudo estables. Los genes y los rasgos que confieren, que se han introducido en una línea del tomate o la soja se puede mover a líneas de plantas diferentes usando técnicas de retrocruzamiento tradicionales conocidas en la técnica. La transformación de plantas de tomate se puede llevar a cabo usando los protocolos de Koornneef y col. (1986) en “Tomato Biotechnology”: Alan R Liss, Inc., 169-178, y en la patente de EE.UU. 6.613.962, describiéndose este último procedimiento brevemente en el presente documento. Explantes de cotiledones de 8 días de edad se precultivan durante 24 h en placas Petri que contienen una capa alimentadora de células en suspensión de Petunia híbrida cultivadas en medio MS con sacarosa al 2% (p/v) y agar al 0,8% complementado con ácido α-naftalenoacético 10 μM y 6-bencilaminopurina 4,4 μM. Después los explantes se infectan con un cultivo diluido de una noche de Agrobactrium tumefaciens que contiene un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención, durante 5-10 minutos, se secan por absorción sobre papel de filtro estéril y se cocultivan durante 48 horas en las placas de capa alimentadora originales. Las condiciones de cultivo son como se describen antes. Los cultivos durante la noche de Agrobactrium tumefaciens se diluyen en medio MS líquido con sacarosa al 2% (p/v), pH 5,7, hasta una DO600 de 0,8.

[0314] Después de cultivar simultáneamente, los explantes de cotiledones se transfieren a placas Petri con medio selectivo que comprende medio MS con zeatina 4,56 μM, vancomicina 67,3 mM, cefotaxima 418,9 mM y sulfato de kanamicina 171,6 mM, y se cultivan en las condiciones descritas antes. Los explantes de subcultivan cada 3 semanas en medio reciente. Los brotes que emergen se diseccionan del callo subyacente y se transfieren a jarras de vidrio con medio selectivo sin zeatina para formar raíces. La formación de raíces en un medio que contiene sulfato de kanamicina es una indicación positiva de una transformación exitosa.

[0315] La transformación de plantas de soja se puede llevar a cabo usando los procedimientos que se encuentran, por ejemplo, en la patente de EE.UU. 5.563.055. En este procedimiento, se esteriliza la superficie de la semilla de soja por exposición a cloro gaseoso que se desarrolla en una campana de vidrio. Las semillas se germinan mediante cultivo en placa en medio solidificado de agar con una concentración 1/10 sin reguladores del crecimiento de plantas y se cultivan a 28ºC con una longitud del día de 16 h. Después de 3 o 4 días, la semilla se puede preparar para el cultivo simultáneo. Se elimina el recubrimiento de la semilla y el alargamiento radicular se elimina 3-4 mm por debajo de los cotiledones.

[0316] Los cultivos durante la noche de Agrobactrium tumefaciens que albergan el vector de expresión que comprende un polinucleótido de la invención se cultivan hasta la fase logarítmica, se agrupan y se concentran por centrifugación. Se llevan a cabo inoculaciones en lotes de modo que cada placa de semillas se trató con un sedimento recién suspendido de Agrobacterium. Los sedimentos se vuelven a suspender en 20 ml de medio de inoculación. El inóculo se vierte en una placa Petri que contiene semillas preparadas y los nodos cotiledonares se maceran con una hoja de bisturí. Después de 30 minutos, los explantes se transfieren a placas del mismo medio que se ha solidificado. Los explantes se insertan con la cara adaxial hacia arriba y se nivelan con la superficie del medio y se cultivan a 22ºC durante 3 días con luz fluorescente blanca. Después, estas plantas se pueden regenerar de acuerdo con procedimientos bien establecidos en la técnica, tal como moviendo los explantes después de 3 días a un medio de contraselección líquido (véase la patente de EE.UU. 5.563.055).

[0317] Después se pueden coger los explantes, insertarlos y cultivarlos en medio de selección solidificado. Después de 1 mes en medio selectivo, el tejido transformado se hace visible como sectores verdes de tejido regenerado contra un fondo de tejido menos sano, decolorado. Los explantes con sectores verse se transfieren a un medio de alargamiento. El cultivo se continúa en este medio con transferencias a placas recientes cada 2 semanas. Cuando los brotes tienen 0,5 cm de longitud se pueden cortar por la base y poner en un medio de enraizamiento.

Ejemplo XIII: Tolerancia alterada al estrés abiótico en monocotiledóneas

[0318] Las plantas de cereales tales como, pero sin limitar, maíz, trigo, arroz, sorgo o cebada, se pueden transformar con las presentes secuencias de polinucleótidos, incluyendo secuencias derivadas de mono o dicotiledóneas tales como las presentadas en las tablas 1, 3 ó 6, clonadas en un vector tal como pGA643 y que contienen un marcador de resistencia a la kanamicina, y expresar de forma constitutiva, por ejemplo, bajo los promotores CaMV 35S o COR15. También se pueden usar pMEN20 o pMEN65 y otros vectores de expresión con el propósito de modificar rasgos de la planta. Por ejemplo, pMEN020 se puede modificar para sustituir la región codificante NptII con el gen BAR de Streptomyces hygroscopicus que confiere resistencia a la fosfinotricina. Los sitios KpnI y BglII del gen Bar se eliminan mediante mutagénesis dirigida con cambios de codones silenciosos.

[0319] El vector de clonación se puede introducir en una variedad de plantas de cereales por medios bien conocidos en la técnica, incluyendo la transferencia directa de ADN o transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens. Este último procedimiento se puede llevar a cabo por una variedad de medios, incluyendo, por ejemplo, el de la patente de EE.UU. No. 5.591.616, en el que se transforma un callo monocotiledóneo poniendo en contacto tejido desdiferenciado de Agrobacterium que contiene el vector de clonación.

[0320] Los tejidos de muestra se sumergen en una suspensión de 3x10-9 células de Agrobacterium que contienen el vector de clonación, durante 3-10 minutos. El material calloso se cultiva en un medio sólido a 23ºC en la oscuridad durante algunos días. Los callos desarrollados en este medio se transfieren a medio de regeneración. Las transferencias se continúan cada 2-3 semanas (2 o 3 veces) hasta que se desarrollan brotes. Después, los brotes se transfieren a medio de brote-alargamiento cada 2-3 semanas. Los brotes que parecen sanos se transfieren a medio de enraizamiento y después de desarrollarse las raíces, las plantas se ponen en suelo de cultivo en maceta húmedo.

[0321] Después, se analiza en las plantas transformadas la presencia del gen NPTII/resistencia a la kanamicina por ELISA, usando el kit ELISA NPTII kit de 5Prime-3Prime Inc. (Boulder, CO).

[0322] También es rutinario el uso de otros procedimientos para producir plantas transgénicas de la mayoría de cultivos de cereales (Vasil (1994) Plant Mol. Biol. 25: 925-937) tales como maíz, trigo, arroz, sorgo (Cassas y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216, y cebada (Wan y Lemeaux (1994) Plant Physiol. 104:37-48). Los procedimientos de transferencia de ADN tales como el procedimiento de microproyectiles se pueden usar para el maíz (Fromm y col. (1990) Bio/Technol. 8: 833-839); Gordon-Kamm y col. (1990) Plant Cell 2: 603-618; Ishida (1990) Nature Biotechnol. 14:745-750), trigo (Vasil y col. (1992) Bio/Technol. 10:667-674; Vasil y col. (1993). Bio/Technol. 11:1553-1558; Weeks y col. (1993) Plant Physlol. 102:1077-1084), y arroz (Christou (1991) Bio/Technol. 9:957-962; Hiei y col. (1994) Plant J. 6:271-282; Aldemita y Hodges (1996) Planta 199:612-617; y Hiei y col. (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218). Para la mayoría de las plantas de cereales, las células embrionarias despojadas de los tejidos escutelares inmaduros, son las dianas celulares preferidas para la transformación (Hiei y col. (1997) Plant Mol. Biol. 35:205-218; Vasil (1994) Plant Mol. Biol. 25: 925-937). Para la transformación de células embrionarias de maíz despojadas de los tejidos escutelares inmaduros, usando el bombardeo de microproyectiles, se prefiere el genotipo A188XB73 (Fromm y col. (1990) Bio/ Technol. 8: 833-839; Gordon-Kamm y col. (1990) Plant Cell 2: 603-618). Después del bombardeo con microproyectiles, los tejidos se seleccionan en fosfinotricina para identificar las células embrionarias transgénicas (Gordon-Kamm y col. (1990) Plant Cell 2: 603-618). Las plantas transgénicas se regeneran mediante técnicas estándar de regeneración del maíz (Fromm y col. (1990) Biol/ Technol.

8: 833-839; Gordon-Kamm y col. (1990) Plant Cell 2: 603-618).

[0323] Se pueden usar los análisis de transferencia Northern, RT-PCR o micromatrices de las plantas transformadas y regeneradas para mostrar la expresión de G1792 y genes relacionados que son capaces de conferir tolerancia al estrés biótico o abiótico.

[0324] Para verificar la capacidad de conferir tolerancia al estrés abiótico, las plantas maduras que expresan en exceso un factor de transcripción de la invención, o alternativamente, plántulas descendientes de estas plantas, se pueden estimular mediante un ensayo de estrés abiótico, tal como un ensayo de sequía, calor, alta salinidad o helada, en condiciones de estrés osmótico que también pueden medir los sensores de azúcar alterados, tales como condiciones de alta concentración de azúcar, en un ensayo de tolerancia a la sombra, o en un ensayo de detección de C/N para identificar plantas con estrés alterado o tolerancia a la sombra o detección de C/N alterada. Comparando las plantas silvestres y transgénicas tratadas de forma similar, se puede mostrar que las plantas transgénicas tienen una mayor tolerancia al estrés abiótico.

[0325] Después de que una planta monocotiledónea o célula de planta se ha transformado (y ésta última se ha regenerado en una planta) y se ha mostrado que tiene una mayor tolerancia al estrés biótico o abiótico, o produce un mayor rendimiento con respecto a una planta de control en las condiciones de estrés, la planta monocotiledónea transformada se puede cruzar consigo misma o con una planta de la misma línea, una planta monocotiledónea no transformada o silvestre, u otra planta monocotiledónea transformada de una línea de plantas transgénicas diferente.

Ejemplo XIV: Genes que confieren mejoras significativas a especies que no son Arabidopsis

[0326] Se ha analizado función de ortólogos específicos de los factores de transcripción de la invención y se pueden caracterizar mejor mediante la incorporación en plantas de cultivo. La función de ortólogos específicos de las secuencias en la Lista de Secuencias se puede analizar mediante su expresión alterada (p. ej., expresión en exceso ectópica o inactivación de la expresión) en plantas, usando elementos reguladores constitutivos, inducibles o específicos de tejido, como se ha descrito antes. Estas secuencias incluyen secuencias de polinucleótidos encontradas en la Lista de Secuencias tales como por ejemplo: SE ID NO: 12 (G2133).

[0327] Las secuencias de polinucleótidos y polipéptidos derivadas de monocotiledóneas se pueden usar para plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas aleatoriamente, y las derivadas de dicotiledóneas se pueden usar para transformar cualquiera de los grupos, aunque algunas de estas secuencias funcionarán mejor si el gen se transforma en una planta del mismo grupo del que deriva la secuencia.

[0328] En estos ejemplos se proporcionan procedimientos de transformación, y se pueden usar en un vector de expresión. Después de introducir el vector en una célula de planta, la planta se puede regenerar a partir de la célula, después de lo cual se puede dejar que la planta exprese en exceso uno de los polipéptidos de la invención que tienen la propiedad de aumentar la tolerancia al estrés abiótico, tolerancia a la sombra o detección de C/N alterada en la planta transgénica. Las plantas con estos rasgos alterados se pueden identificar mediante comparación con plantas silvestres o no transformadas que no expresan en exceso el polipéptido, después de lo cual se pueden seleccionar una o más plantas con el grado deseado de uno o más de los rasgos mejorados. De esta forma, se pueden seleccionar las plantas con una mayor tolerancia a la sombra, mayor tolerancia al estrés abiótico, detección alterada de C/N, o más de uno de estos rasgos alterados.

[0329] Para los análisis relacionados con la tolerancia a la sequía, las semillas de estas plantas transgénicas se someten a ensayos de germinación para medir los sensores de sacarosa. Las semillas monocotiledóneas estériles, incluyendo, pero sin limitar, maíz, arroz, trigo, centeno y sorgo, así como las dicotiledóneas incluyendo, pero sin limitar, soja y alfalfa, se siembran en medio MS al 80% más vitamina con sacarosa al 9,4%; el medio de control carece de sacarosa. Después, todas las placas de ensayo se incuban a 22ºC con 24 horas de luz, 120-130 μEin/m2/s, en una cámara de crecimiento. La evaluación de la germinación y el vigor de las plántulas se lleva a cabo entonces 3 días después de la plantación. Se pueden encontrar que las que tienen exceso de expresión de estas secuencias son más tolerantes a un contenido alto de sacarosa al tener mejor germinación, radículas más largas y mayor expansión de cotiledones. Estos resultados indicarían que el exceso de expresión de los ortólogos de la Lista de Secuencias está implicada en los sensores de azúcar específicos de sacarosa.

[0330] Las plantas que expresan en exceso estos ortólogos se pueden someter a ensayos de sequía basados en suelo para identificar aquellas líneas que son más tolerantes a la falta de agua que las plantas de control silvestres. En general, las plantas que expresan en exceso ortólogos aparecerán significativamente más grandes y más verdes, con menos marchitamiento o desecado, que las plantas de control silvestres, en particular después de un periodo de carencia de agua al que le sigue el regado de nuevo y un periodo de incubación posterior.

[0331] Las plantas que expresan en exceso estos ortólogos se pueden someter a ensayos de estrés abiótico para identificar aquellas líneas que son más tolerantes al estrés abiótico que las plantas de control silvestres en estas condiciones. En general, las plantas que expresan en exceso los ortólogos presentarán características morfológicas que están asociadas con un fenotipo de evitación de sombra (p. ej., cotiledones alterados, hipocotilos alterados, orientación de las hojas alterada, peciolos alterados, y/o fotomorfogénesis constitutiva) y pueden aparecer también más grandes, más verdes y más sanas que las plantas de control silvestres.

Ejemplo XV: identificación de secuencias ortólogas y parálogas

[0332] Los ortólogos de genes de Arabidopsis se pueden identificar por varios procedimientos, incluyendo la amplificación por hibridación o por procedimientos bioinformáticos. Este ejemplo describe cómo se pueden identificar homólogos del factor de transcripción CBF1 de la familia AP2 de Arabidopsis, que confieren tolerancia a estreses abióticos (Thomashow y col. (2002) patente de EE.UU. nº 6.417.428), y un ejemplo para confirmar la función de secuencias homólogas. En este ejemplo se encontraron ortólogos de CBF1 en la canola (Brassica napus) usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

[0333] Se designaron cebadores degenerados para las regiones del dominio de unión AP2 y fuera del AP2 (dominio carboxi terminal patente de EE.UU. nº 6.417.428):

Mol 368 (inverso) 5’-CAY CCN ATH TAY MGN GGN GT -3’ Mol 378 (directo) 5’-GGN ARN ARC ATN CCY TCN GCC -3’

(Y: C/T, N: A/C/G/T, H: A/C/T, M: A/C, R: A/G)

[0334] El cebador Mol 368 está en el dominio de unión AP2 de CBF1 (secuencia de aminoácidos: His-Pro-Ile-Tyr-Arg-Gly-Val) mientras que el cebador Mol 378 está fuera del domino AP2. (dominio carboxilo terminal) (secuencia de aminoácidos: Met-Ala-Glu-Gly-Met-Leu-Pro).

[0335] El ADN genómico aislado de B. napus se amplificó usando estos cebadores siguiendo estas condiciones: una etapa de desnaturalización de 2 min a 93ºC; 35 ciclos de 93ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, y 72ºC durante 1 min; y una incubación final de 7 min a 72ºC al final de los ciclos.

[0336] Los productos de la PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1,2% y se transfirieron a membranas de nailon y se hibridaron con la sonda AT CBF1 preparada a partir de ADN genómico de Arabidopsis por amplificación por la PCR. Los productos hibridados se visualizaron mediante un sistema de detección colorimétrico (Boehringer Mannheim) y las correspondientes bandas de un gel de agarosa similar se aislaron usando el kit de extracción de Qiagen (Qiagen). Los fragmentos de ADN se ligaron en el vector clon TA del kit de clonación TOPO TA (Invitrogen) y se transformaron en la cepa de E. coli TOP10 (Invitrogen).

[0337] Se recogieron 7 colonias y los insertos se secuenciaron en un aparato ABI 377 a partir de ambas cadenas de sentido directo y sentido contrario después de aislar los plásmidos de ADN. La secuencia de ADN se editó mediante el secuenciador y se alineó con AtCBF1 con el software GCG y la búsqueda con Blast de NCBI.

[0338] La secuencia de ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de un ortólogo de canola encontrado de esta forma (bnCBF1; patente de EE.UU. nº: 6.417.428) identificado por este procedimiento, se muestra en la Lista de Secuencias.

[0339] Las secuencias de aminoácidos alineadas muestran que el gen bnCBF1 tiene una identidad de 88% con la secuencia de Arabidopsis en la región del dominio AP2 y una identidad de 85% con la secuencia de Arabidopsis fuera del dominio AP2 cuando se alinean para dos secuencias de inserción que están fuera del dominio AP2.

[0340] De forma similar, también se pueden identificar las secuencias parálogas de los genes de Arabidopsis, tales como CBF1.

[0341] Se han clonado dos parálogos de CBF1 de Arabidopsis thaliana: CBF2 y CBF3. CBF2 y CBF3 se han clonado y secuenciado como se describe a continuación. Las secuencias de ADN y las proteínas codificadas se presentan en la patente de EE.UU. nº 6.417.428.

[0342] Se cribaron en una biblioteca de ADNc lambda preparada a partir de ARN aislado de Arabidopsis thaliana ecotipo Columbia (Lin y Thomashow (1992) Plant Physiol. 99: 519-525) los clones recombinantes que llevaban insertos relacionados con el gen CBF1 (Stockinger y col. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 1035-1040). CBF1 se radiomarcó con 32P por cebado aleatorio (Sambrook y col. véase antes) y se usó para cribar una biblioteca mediante la técnica de placa elevada usando condiciones de hibridación y lavado rigurosas (Hajela y col. (1990) Plant Physiol. 93:1246-1252; Sambrook y col. véase antes, 6 X tampón SSPE, 60ºC para la hibridación y 0,1 X tampón SSPE y 60ºC para los lavados). Se obtuvieron 12 clones de hibridación positivos y se determinaron las secuencias de ADN de los insertos de ADNc. Los resultados indican que los clones entran en 3 clases. Una clase lleva insertos que corresponden a CBF1. Las otras dos clases llevan secuencias que corresponden a dos homólogos diferentes de CBF1, denominados CBF2 y CBF3. Las secuencias de ácidos nucleicos y secuencias que codifican la proteína predicha para CBF1, CBF2, CBF3 de Arabidopsis y el ortólogo CBF de Brassica napus se exponen en la patente de EE.UU. nº 6.417.428.

[0343] Una comparación de las secuencias de ácidos nucleicos de CBF1, CBF2 y CBF3 de Arabidopsis indica que son de 83 a 85% idénticas como se muestran en la tabla 9.

TABLA 9

Porcentaje de identidada

ADNb

Polipéptido

cbf1/cbf2

85 86

cbf1/cbf2

83 84

cbf2/cbf3

84 85

aEl porcentaje de identidad se determinó usando el algoritmo Clustal del programa MEGALIGN (DNASTAR, Inc.).bSe muestran las comparaciones de las secuencias de ácidos nucleicos de los marcos de lectura abiertos

[0344] Igualmente, las secuencias de aminoácidos de los 3 polipéptidos CBP están en el intervalo de

5 identidad de 84 a 86%. Un alineamiento de las 3 secuencias de aminoácidos pone de manifiesto que la mayoría de las diferencias en la secuencia de aminoácidos se producen en la mitad C-terminal ácida del polipéptido. Esta región de CBF1 sirve como dominio de activación tanto en levaduras como en Arabidopsis (no se muestra).

[0345] Los restos 47 a 106 de CBF1 corresponden al dominio AP2 de la proteína, un patrón de unión al ADN

10 que, hasta la fecha, sólo se había encontrado en proteínas de plantas. Una comparación de los dominios AP2 de CBF1, CBF2 y CBF3 indica que hay algunas diferencias en la secuencia de aminoácidos. Estas diferencias en la secuencia de aminoácidos pueden tener un efecto en la especificidad de unión al ADN.

Ejemplo XVI: Transformación de canola con un plásmido que contiene CBF1, CBF2 o CBF3

15 [0346] Después de identificar los genes homólogos de CHF1, la canola se transformó con un plásmido que contenía los genes CBF1, CBF2 o CBF3 de Arabidopsis clonados en el vector pGA643 (An (1987) Methods Enzymol. 253: 292). En estas construcciones, los genes CBF se expresaban de forma constitutiva bajo el promotor 35S de CaMV, además, el gen CBF1 se clonó bajo los controles del promotor COR15 de Arabidopsis en el mismo

20 vector pGA643. Cada construcción se transformó en la cepa de Agrobacterium GV3101. Las agrobacterias transformadas se cultivaron durante 2 días en medio AB mínimo que contenía los antibióticos adecuados.

[0347] La canola de primavera (B. napus variedad cultivada Westar) se transformó usando el protocolo de Moloney y col. ((1989) Plant Cell Reports 8: 238) con algunas modificaciones como se describe. Brevemente, las

25 semillas se esterilizaron y se cultivaron en placa en medio MS de media concentración, que contenía sacarosa al 1%. Las placas se cultivaron a 24ºC con luz de 60-80 μE/m2/s usando un periodo de iluminación de 16 horas de luz/8 horas de oscuridad. Los cotiledones de las plántulas de 4-5 días de edad se recogieron, se cortaron los peciolos y se sumergieron en disolución de Agrobacterium. Los cotiledones sumergidos se pusieron en medio de cultivo simultáneo con una densidad de 20 cotiledones/placa y se incubaron como se ha descrito antes durante 3

30 días. Los explantes se transfirieron al mismo medio, pero que contenía 300 mg/l de timentina (SmithKline Beecham, PA) y se redujeron a 10 cotiledones/placa. Después de 7 días, los explantes se transfirieron a medio de selección/regeneración. Las transferencias se continuaron cada 2-3 semanas (2 o 3 veces) hasta que se desarrollaron los brotes. Los brotes se transfirieron a medio de brote-alargamiento cada 2-3 semanas. Los lotes que tenían un aspecto sano se transfirieron a medio de enraizamiento. Una vez que se desarrollaron raíces buenas, las

35 plantas se plantaron en suelo para macetas húmedo.

[0348] Después se analizó en las plantas transformadas la presencia del gen NPTII/resistencia a la kanamicina mediante ELISA, usando el kit de ELISA NPTII de 5Prime-3Prime Inc. (Boulder, CO). Aproximadamente 70% de las plantas cribadas eran positivas para NPTII. Solamente estas plantas se siguieron analizando.

40 [0349] Los análisis de transferencia Northern de las plantas que se transformaron con las construcciones de expresión constitutiva mostraron expresión de los genes CBF y todos los genes CBF fueron capaces de inducir el gen BN115 regulado por el frío de Brassica napus (homólogo del gen COR15 de Arabidopsis). La mayor parte de las plantas transgénicas presentaron un fenotipo de crecimiento normal. Como se esperaba, las plantas transgénicas

45 son más tolerantes a la helada que las plantas silvestres. Usando el ensayo de pérdida de electrolitos de las hojas, el control mostró una pérdida de 50% de -2 a -3ºC. La canola de primavera transformada como CBF1 o CBF2 mostró una pérdida de 30% de -6 a -7ºC. La canola de primavera transformadas con CBF3 mostró una pérdida de 50% de aproximadamente -10 a -15ºC. La canola de invierno transformada con CBF3 puede presentar una pérdida de 50% de aproximadamente -16ºC a -20ºC. Además, si la canola de primavera o invierno se aclimatan al frío, las

50 plantas transformadas pueden presentar una mayor aumento de la tolerancia a la helada de al menos -2ºC.

[0350] Para ensayar la tolerancia a la salinidad de las plantas transformadas, las plantas se regaron con NaCl 150 mM. Las plantas que expresaban en exceso CBF1, CBF2 o CBF3 crecieron mejor comparadas con las plantas que no se habían transformado con CBF1, CBF2 o CBF3.

[0351] Estos resultados demuestran que los homólogos de factores de transcripción de Arabidopsis se pueden identificar y se muestra que confieren funciones similares en especies de plantas que no son Arabidopsis.

Ejemplo XVII: clonación de promotores de factores de transcripción

[0352] Los promotores se aislaron de genes de factores de transcripción que tienen patrones de expresión de genes útiles para una serie de aplicaciones, determinadas por los procedimientos bien conocidos en la técnica (incluyendo el análisis del perfil de transcritos con micromatrices de ADNc u oligonucleótidos, análisis de transferencia Northern, RT-PCR semicuantitativa o cuantitativa). Se ponen de manifiesto perfiles de expresión de genes interesantes determinando la abundancia de transcritos para un gen de factor de transcripción seleccionado, después de la exposición de las plantas a una serie de condiciones experimentales diferentes, y en una serie de tejidos o tipos de órganos diferentes, o etapas del desarrollo. Las condiciones experimentales a las que se exponen las plantas para este propósito incluyen frío, calor, sequía, estimulación osmótica, concentraciones de hormonas diferentes (ABA, GA, auxina, citoquinina, ácido salicílico, brasinoesteroide), estimulación con patógenos y plagas. Los tipos de tejidos y que etapas del desarrollo incluyen tallo, raíz, flor, hojas en roseta, hojas caulinares, silicuas, semillas en germinación y meristema. El conjunto de niveles de expresión proporciona un patrón que se determina mediante el elemento regulador del promotor génico.

[0353] Los promotores de factores de transcripción para los genes descritos en el presente documento se obtienen mediante clonación de 1,5 kb a 2,0 kb de secuencia genómica inmediatamente en la dirección 5’ del codón de inicio de la traducción para la secuencia codificante de la proteína del factor de transcripción codificado. Esta región incluye la 5’-UTR del gen del factor de transcripción, que puede comprender elementos reguladores. La región de 1,5 kb a 2,0 kb se clona por procedimientos de PCR, usando cebadores que incluyen uno en la dirección 3’ situado en el codón de inicio de la traducción (incluyendo una secuencia adaptadora adecuada), y otro en la dirección 5’ situado a partir de 1,5 kb a 2,0 kb en la dirección 5’ del condón de inicio de la traducción (incluyendo una secuencia adaptadora adecuada). Los fragmentos deseados se amplificaron por la PCR a partir del ADN genómico de Arabidopsis Col-0 usando ADN polimerasa Taq de alta fidelidad para minimizar la incorporación de mutación o mutaciones puntuales. Los cebadores de clonación incorporan dos sitios de restricción raros, tales como NotI y Sfi1, encontrados con frecuencia baja en el genoma de Arabidopsis. Se usan sitios de restricción adicionales en los casos en los que está presente un sitio de restricción NotI o Sfi1 dentro del promotor.

[0354] El fragmento de 1,5-2,0 kb en la dirección 5’ desde el codón de inicio de la traducción, incluyendo la región 5’ no traducida del factor de transcripción, se clona en un vector de transformación binario inmediatamente en la dirección 5’ de un gen indicador adecuado, o un gen transactivador que es capaz de programar la expresión de un gen indicador en una segunda construcción génica. Los genes indicadores usados incluyen la proteína fluorescente verde (y variantes de color de la proteína fluorescente verde), β-glucuronidasa y luciferasa. Los genes transactivadores adecuados incluyen LexA-GAL4, junto con un indicador transactivable en un segundo plásmido binario (como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. 09/958.131, incorporada en el presente documento por referencia). El o los plásmidos binarios se transfieren a Agrobacterium y la estructura del plásmido se confirma por PCR. Estas cepas se introducen en plantas de Arabidopsis como se describe en otros ejemplos, y los patrones de expresión de genes se determinan de acuerdo con procedimientos estándar conocidos para el experto en la materia, para el seguimiento de la fluorescencia de la GFP, actividad de β-glucuronidasa, o luminiscencia.

[0355] La presente invención no está limitada por las realizaciones específicas descritas en el presente documento. Habiéndose descrito ahora la invención completamente, será evidente para el experto en la materia que se pueden hacer muchos cambios y modificaciones de la misma sin salirse del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las modificaciones que son evidentes a partir de la descripción anterior y las figuras que acompañan entran dentro del alcance de las reivindicaciones.

LISTA DE SECUENCIAS

[0356]

<110> Mendel Biotechnology, Inc.

<120> REGULADORES TRANSCRIPCIONALES DE PLANTAS

<130> AHB/FP6379341

<160> 64

<170> PatentIn versión 3.2

<210> 1

<211> 785 5 <212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G47; identificador de clado

<400> 1

imagen2

<210> 2

<211> 144

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana 15 <220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G47; identificador de clado

<400> 2

imagen1

imagen1

<210> 3

<211> 1449

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G922; identificador de clado

<400> 3

<210> 4

<211> 482

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G922; identificador de clado

<400> 4

<210> 5

<211> 585

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<220>

<223> secuencia de referencia G1274; identificador de clado

<400> 5

imagen1

10 <210> 6

<211> 194

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G1274; identificador de clado

<400> 6

imagen1

<210> 7 5 <211> 696

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G1792; identificador de clado 10 <400> 7

imagen1

<210> 8

<211> 139

<212> PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G1792; identificador de clado

<400> 8

imagen1

<210> 9

<211> 1029

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G2053; identificador de clado 5 <400> 9

imagen1

<210> 10

<211> 342

<212>

PRT 10 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia de polipéptido G2053; identificador de clado

<400> 10

<210> 11

<211> 485

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

imagen1

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G2133 es paráloga de G47

<400> 11

imagen1

10 <210> 12

<211> 143

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 15 <223> polipéptido G2133 parálogo de G47

<400> 12

imagen1

<210> 13

<211> 891

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G2999: identificador de clado

<400> 13

<210> 14

<211> 262

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia de polipéptido G2999; identificador de clado

<400> 14

<210> 15

<211> 1621

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G3086; identificador de clado

<400> 15

<210> 16

<211> 379

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G3086; identificador de clado

<400> 16

<210> 49

<211> 729

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G2992 es paráloga de G2999

<400> 49

imagen1

10 <210> 50

<211> 242

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 15 <223> polipéptido G2992 parálogo de G2999

<400> 50

imagen1

<210> 87

<211> 1082

<212>

ADN 5 <213> Glycine max

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G3643 es ortóloga de G47

<400> 87

<210> 88

<211> 179

<212>

PRT 5 <213> Glycine max

<220>

<223> polipéptido G3643 ortólogo de G47

<400> 88

<210> 89

<211> 687

<212>

ADN 5 <213> Oryza sativa (grupo de variedad cultivada japonica)

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G3644 es ortóloga de G47

<400> 89

<210> 90

<211> 228

<212>

PRT 5 <213> Oryza sativa (grupo de variedad cultivada japonica)

<220>

<223> polipéptido G3644 ortólogo de G47

<400> 90

<210> 91

<211> 656

<212>

ADN 5 <213> Brassica rapa subsp. Pekinensis

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G3645 es ortóloga de G47

<400> 91

imagen1

10 <210> 92

<211> 144

<212> PRT

<213> Brassica rapa subsp. Pekinensis

<220> 15 <223> polipéptido G3645 ortólogo de G47

<400> 92

imagen1

<210> 93

<211> 649

<212> ADN 5 <213> Brassica oleracea

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G3646 es ortóloga de G47

<400> 93

imagen1

<210> 94

<211> 138

<212> PRT

<213> Brassica oleracea 5 <220>

<223> polipéptido G3646 ortólogo de G47

<400> 94

imagen1

<210> 95 10 <211> 495

<212> ADN

<213> Zinnia elegans

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G3647 es ortóloga de G47 15 <400> 95

imagen1

<210> 96

<211> 127

<212> PRT 5 <213> Zinnia elegans

<220>

<223> polipéptido G3647 ortólogo de G47

<400> 96

imagen1

10 <210> 97

<211> 594

<212> ADN

<213> Oryza sativa (grupo de variedad cultivada japonica)

<220> 15 <223> la secuencia de polipéptido predicha G3649 es ortóloga de G47

<400> 97

imagen1

<210> 98

<211> 197

<212>

PRT 5 <213> Oryza sativa (grupo de variedad cultivada japonica)

<220>

<223> polipéptido G3649 ortólogo de G47

<400> 98

<210> 99

<211> 702

<212>

ADN 5 <213> Oryza sativa (grupo de variedad cultivada japonica)

imagen1

imagen1

<220>

<223> la secuencia de polipéptido predicha G3651 es ortóloga de G47

<400> 99

imagen1

10 <210> 100

<211> 233

<212> PRT

<213> Oryza sativa (grupo de variedad cultivada japonica)

<220> 15 <223> polipéptido G3651 ortólogo de G47

<400> 100

imagen1

<210> 223

<211> 2217

<212> ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

94

<221> misc_feature

<222> (2192)..(2192)

<223> n es a, c, g, o t

<220> 5 <223> secuencia de referencia G175; la secuencia de polipéptido predicha es paráloga de G1274

<400> 223

imagen1

imagen1

<210> 224

<211> 568

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia de polipéptido G175; paráloga de G1274

<400> 224

<210> 225

<211> 1072

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G303

<400> 225

<210> 226

<211> 296

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G303

<400> 226

imagen1

imagen1

<210> 227

<211> 628

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana 5 <220>

<223> secuencia de referencia G354

<400> 227

imagen1

<210> 228 10 <211> 168

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G354 15 <400> 228

imagen1

imagen1

<210> 229

<211> 869

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G489

<400> 229

<211> 220

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G489

<400> 230

<210> 231

<211> 798

<212>

ADN 10 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G634

<400> 231

<210> 232

<211> 265

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G634

<400> 232

<210> 233

<211> 341

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G682

<400> 233

<210> 234

<211> 77

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen3

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G682

<400> 234

imagen1

10 <210> 235

<211> 1797

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 15 <223> secuencia de referencia G916

<400> 235

imagen1

imagen1

<210> 236

<211> 528

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G916

<400> 236

<210> 237

<211> 768

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

imagen1

imagen1

<220>

<223> secuencia de referencia G975

<400> 237

imagen1

10 <210> 238

<211> 199

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 15 <223> secuencia de referencia del polipéptido G975

<400> 238

imagen1

imagen1

<210> 239

<211> 1116

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> Secuencia de referencia G1069; funcionalmente relacionada, homóloga de G1073

<400> 239

<210> 240

<211> 281

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> Secuencia de referencia G1069; funcionalmente relacionada, homóloga de G1073

<400> 240

<210> 241

<211> 1371

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> Secuencia de referencia G1452; funcionalmente relacionada, homóloga de G512

<400> 241

<210> 242

<211> 373

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G1452; funcionalmente relacionada, homóloga de G512

<400> 242

<210> 243

<211> 732

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

imagen1

<220>

<223> Secuencia de referencia G1820

<400> 243

imagen1

10 <210> 244

<211> 202

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 15 <223> secuencia de referencia del polipéptido G1820

<400> 244

imagen1

<210> 245

<211> 866

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G270; la secuencia de polipéptido predicha es paráloga de G1634

<400> 245

<210> 246

<211> 263

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G2701; paráloga de G1634

<400> 246

<210> 247

<211> 1040

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> Secuencia de referencia G2789; la secuencia de polipéptido predicha es paráloga de G596

<400> 247

<210> 248

<211> 265

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G2789; paráloga de G596

<400> 248

<210> 249

<211> 495

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> Secuencia de referencia G2839; la secuencia de polipéptido predicha es paráloga de G354

<400> 249

<210> 250

<211> 164

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

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imagen1

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imagen1

imagen1

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G2839; paráloga de G354

<400> 250

imagen1

<210> 251

<211> 1569

<212> ADN

<213> Arabidopsis thaliana

<220> 5 <223> Secuencia de referencia G2854; la secuencia de polipéptido predicha es paráloga de G1940

<400> 251

imagen1

<210> 252 10 <211> 415

<212> PRT

<213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia del polipéptido G2854; paráloga de G1940

<400> 252 <210> 253

imagen1

imagen1

<211> 914

<212>

ADN 5 <213> Arabidopsis thaliana

<220>

<223> secuencia de referencia G3083

<400> 253

<210> 254

<211> 237

<212>

PRT 5 <213> Arabidopsis thaliana

imagen1

<220>

<223> polipéptido G3083: secuencia de referencia

<400> 254

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Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para producir una planta transgénica que tiene mayor tolerancia a la falta de agua que una planta de control, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

   (a)

   producir un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12; en el que el polipéptido tiene una propiedad de la SEQ ID NO: 12 de aumentar la tolerancia a la falta de agua en una planta con respecto a la planta de control; y

   (b)

   introducir el vector de expresión en una planta objetivo para producir una planta transgénica; en el que el polipéptido es expresado en exceso en la planta transgénica y dicho exceso de expresión da como resultado que la planta transgénica tiene una mayor tolerancia a la falta de agua que la planta de control.

2. 2.

   El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el dominio conservado tiene una identidad de secuencia de al menos 89% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12.

3. 3.

   El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el vector de expresión comprende un promotor constitutivo, inducible o específico de tejido operativamente unido a la secuencia de nucleótidos.

4. 4.

   Una semilla transgénica que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12; producido por una planta transgénica producida por cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 1 a 3, en el que una planta descendiente que ha crecido a partir de la semilla transgénica tiene una mayor tolerancia a la sequía con respecto a la planta de control, y en el que dicha secuencia está operativamente unida a un promotor que es inducible en respuesta al calor o sequía.

5. 5.

   Una semilla, fruta, hoja, raíz o descendiente de una planta que comprende un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12; en el que el polipéptido tiene una propiedad de la SEQ ID NO:12 de aumentar la tolerancia a la falta de agua en una planta con respecto a la planta de control, que se puede obtener por el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha planta, semilla, fruta, hoja, raíz, célula de planta o descendiente tiene una mayor tolerancia a la falta de agua que la planta de control, y en el que dicha secuencia está operativamente unida a un promotor que es inducible en respuesta al estrés por calor o sequía.

6. 6.

   Uso de un vector de expresión para producir una planta transgénica que tiene una mayor tolerancia a la falta de agua con respecto a una planta de control, en el que el vector de expresión codifica un polipéptido que comprende un dominio conservado con una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 70% con las coordenadas de aminoácidos 10-77 de la SEQ ID NO: 12.