CN115605082A

CN115605082A - 转化方法

Info

Publication number: CN115605082A
Application number: CN202080082227.9A
Authority: CN
Inventors: 钟衡; 李常宝
Original assignee: Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Current assignee: Syngenta Crop Protection AG Switzerland
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2023-01-13
Also published as: EP4064827A1; WO2021108337A1; EP4064827A4; CA3157622A1

Abstract

本披露涉及转化方法和相关组合物。在一些方面，这些方法包括创伤包含上胚轴、芽顶端分生组织和子叶节的胚轴区域的至少一部分，或单子叶植物胚轴中的相应区域，以产生创伤外植体，并且使创伤外植体与异源多核苷酸接触。在一些方面，这些方法进一步包括一个或多个可以植物原位完成的选择步骤。

Description

转化方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年11月26日提交的临时申请62/940270和2020年5月1日提交的临时申请63/018612的优先权，将其通过援引以其全文并入本文。

技术领域

本发明涉及用于转化植物的组合物和方法。

背景技术

常规转化方法通常费时又低效，并且当使用这种常规方法时一些优良品系的转化效率非常低。转化对于转基因植物的产生和植物的基因组编辑而言非常重要。仍然需要更有效的、高通量的、和更少的基因型依赖性的转化方法。

发明内容

本披露涉及转化方法。如本文所述，开发了涉及转化创伤种子外植体以及利用一个或多个植物原位(in planta)选择步骤的方法。本文所述的方法可用于例如，将异源核酸或蛋白质引入植物细胞用于基因组编辑及转基因植物产生。与常规方法相比，此类方法可以提高效率、提高高通量能力、降低嵌合性和/或降低转化的基因型依赖性。

在一些方面，本披露提供了方法，该方法包括：a)提供种子的外植体，其中该外植体包含胚轴和子叶；b)创伤胚轴区域的至少一部分以产生创伤外植体，其中如果该种子是双子叶植物种子，则该区域包含上胚轴、芽顶端分生组织、和子叶节，并且如果该种子是单子叶植物种子，则该区域包含胚芽鞘、芽顶端分生组织、叶原基、和叶腋生区，以及c)使该创伤外植体与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中该异源多核苷酸和/或异源蛋白进入该外植体的条件下接触。在一些实施例中，种子是浸渗的种子。在一些实施例中，种子已在液体培养基中浸渗任选地长达48小时。在一些实施例中，通过由种子去除种皮产生外植体。在一些实施例中，通过包括切割、刺穿、压碎、加压、超声处理或离心的方法进行创伤。在一些实施例中，种子是双子叶植物种子，并且步骤b)包括(i)创伤上胚轴的至少一部分和子叶节的至少一部分，或(ii)创伤上胚轴的至少一部分、芽顶端分生组织的至少一部分、和子叶节的至少一部分。在一些实施例中，种子是单子叶植物种子，并且步骤b)包括创伤胚芽鞘的至少一部分、芽顶端分生组织的至少一部分、叶原基的至少一部分、和叶腋生区的至少一部分。在一些实施例中，该方法进一步包括从外植体中去除子叶。在一些实施例中，种子是双子叶植物种子，并且该方法进一步包括从外植体中去除一个或两个子叶。在一些实施例中，双子叶植物种子是大豆种子、烟草种子、豆种子、葵花种子、番茄种子或胡椒种子。在一些实施例中，该方法进一步包括从外植体中去除至少一个初生叶(例如，一个或两个初生叶)。在一些实施例中，该方法进一步包括由创伤外植体产生植物。在一些实施例中，步骤c)包括使创伤腋生分生组织区与异源多核苷酸接触，其中该异源多核苷酸包含选择性标记，并且其中该方法进一步包括使创伤外植体或由该创伤外植体产生的植物或植物部分、或其组合与选择剂接触以消除或减少未转化的组织。在一些实施例中，与选择剂接触包括(i)将选择剂添加到维持创伤外植体的培养基中，(ii)将该选择剂添加到维持植物的培养基中，(iii)用该选择剂喷洒该植物，或(iv)将该选择剂施用于外植体的创伤区域或该植物的相应区域、或其组合。在一些实施例中，与选择剂接触包括(i)将选择剂添加到维持创伤外植体的培养基中，(ii)将该选择剂添加到维持植物的培养基中，以及(iv)将该选择剂施用于该植物的相应区域。在一些实施例中，(i)持续长达4周，(ii)持续长达2周并且(iv)持续长达5周。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(iv)之前进行。在一些实施例中，步骤(ii)的至少一部分与步骤(iv)的至少一部分同时进行。在一些实施例中，选择剂是除草剂、抗生素、或不可代谢的糖。在一些实施例中，选择剂是草甘膦、草铵膦、壮观霉素、苄嘧磺隆-甲基、D-木糖、甘露糖或卡那霉素。在一些实施例中，该方法进一步包括对由创伤外植体产生的植物或该植物的样品进行测定，以评估转化细胞的存在或不存在和/或评估转化细胞的数目。在一些实施例中，该方法进一步包括使植物生长以产生种子，并且收获该种子，其中该种子任选地包含异源多核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，该方法进一步包括使种子生长以产生子代植物，任选地其中该子代植物包含异源多核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，异源多核苷酸编码或包含基因组编辑剂，或其中异源蛋白包含基因组编辑剂。在一些实施例中，基因组编辑剂是核酸酶或重组酶。在一些实施例中，异源多核苷酸包含编码Cas蛋白和/或指导RNA的一种或多种多核苷酸，或其中异源蛋白包含Cas蛋白。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9或Cas12a、或其功能变体。在一些实施例中，异源多核苷酸包含含有编码序列的表达盒。在一些实施例中，表达盒进一步包含可操作地连接至编码序列的启动子。在一些实施例中，编码序列编码目的蛋白或非编码RNA。在一些实施例中，步骤c)中的接触用土壤杆菌属、病毒颗粒、微粒、纳米颗粒、细胞膜穿透肽、气溶胶束、化学物、电穿孔、或压力进行。在一些实施例中，接触用土壤杆菌属或病毒颗粒进行，并且该接触包括感染步骤，以及任选地孵育步骤。在一些实施例中，感染步骤在黑暗中进行30分钟至24小时，并且孵育步骤在黑暗中进行至少2天，任选地4-5天。

在其他方面，本披露提供外植体或植物，该外植体或植物通过如上述实施例中任一项所述的方法产生。在其他方面，本披露提供外植体或植物，该外植体或植物通过实例中描述的方法产生。在其他方面，本披露提供子代种子，该子代种子通过使植物与第二植物杂交或通过该植物自交产生。在其他方面，本披露提供衍生物或商品产品，该衍生物或商品产品产生或获得自植物或其一部分。

在其他方面，本披露提供了方法，该方法包括：a)提供获得自种子的外植体，b)创伤该外植体以产生创伤外植体，c)使该创伤外植体与包含选择性标记的异源多核苷酸在其中该异源多核苷酸进入该创伤外植体的条件下接触；d)由创伤外植体产生植物，以及e)使该植物或其一部分与选择剂接触以消除或减少未转化的组织。

附图说明

图1是示出了示例转化过程的图。

图2是示出了在从浸渗的种子中去除的双子叶植物外植体上进行的示例创伤方法的一系列图。显示了胚轴、子叶、和胚轴的其他各种特征，但未按比例绘制。

定义

尽管认为以下术语可以很好地为本领域的普通技术人员所理解，但是提出以下定义是为了使本披露主题容易理解。

除非下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语旨在具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。在此采用的技术的参考文献旨在参考本领域中通常理解的技术，包括对本领域的普通技术人员而言很清楚的那些技术的变化或等效技术的替换。

本文引用的所有的专利、专利公布、非专利公布对于引用中提及的有关句子或段落的传授内容通过引用以其全文并入。在术语冲突的情况下，以本说明书为准。

如本文使用的，术语“一个或一种(a或an)”或“该(the)”可以是指一个或多于一个，除非上下文清楚地并明确地另外指明。例如，“一个”内源核酸可以意指一个内源核酸或多个内源核酸。

术语“约”在本文用于表示大约、大致、约或在……左右。当术语“约”结合数值范围来使用时，它通过将边界延伸至高于以及低于所阐明的数值来限定这个范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值限定至以20％的变化，优选地10％上下(更高或更低)地高于以及低于规定值。关于温度，术语“约”意指±1℃，优选±0.5℃。当术语“约”被用于本发明的上下文中(例如与温度或分子量值组合)时，确切值(即，无“约”)是优选的。

如本文使用的，“胚轴”包含上胚轴、芽顶端分生组织、下胚轴、胚根、以及至少一个初生叶(其也可被称为叶原基)，并且排除一个或多个子叶。

如本文所用，“外植体”是指源自植物或植物部分(例如种子)的组织、一个组织片或多个组织片。外植体可以是植物的一部分，如未成熟胚、成熟胚、叶分生组织，或者可以源自植物或种子的芽、叶、未成熟胚或任何其他组织的一部分。与本披露相关的示例外植体是完整的胚轴和作为单个组织从浸渗的种子中去除的子叶(参见图2的最左侧部分)。

如本文使用的，术语“表达盒”是指在宿主细胞中能够指导特定核酸序列表达的核苷酸。在一些实施例中，表达盒包含以下、基本上由以下组成、或由以下组成：可操作地连接至目的核酸的一种或多种启动子序列(例如，一种或多种组成型/诱导型启动子序列、一种或多种组织特异性和/或器官特异性启动子序列和/或一种或多种发育阶段特异性启动子序列)，该目的核酸可操作地连接至终止序列。表达盒通常包含在宿主细胞中适当翻译目的核酸序列所需的序列。表达盒可以是嵌合的，意味着它的组分中的至少一种相对于它的其他组分中的至少一种是异源的。该表达盒可以是天然存在的但已经是以对于异源表达有用的重组形式而获得的表达盒。然而，典型地，表达盒相对于宿主是异源的(即该表达盒的特定核酸序列不是天然存在于该宿主细胞中的，并且必须已经通过转化事件引入到该宿主细胞或该宿主细胞的祖先中)。

如本文使用的，术语“基因组编辑剂”是指能够诱导细胞基因组中的缺失、插入、插入缺失(indel)、或其他修饰的药剂，例如，通过在该基因组中产生单链断裂或双链断裂。基因组编辑剂的实例包括CRISPR/Cas剂(例如，Cas蛋白和指导RNA)、转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、和锌指核酸酶。Cas蛋白包括Cas9、Cas12a(也称为Cpf1)、C2c1、C2c2、和C2c3、以及其功能变体。示例Cas9和Cas12a蛋白包括化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(SpCas9)、嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)Cas9(StCas9)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)(SpaCas9)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)Cas9(CjCas9)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SaCas9)、新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)Cas9(FnCas9)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)Cas9(NcCas9)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitis)Cas9(NmCas9)、新凶手弗朗西丝氏菌Cpf1(FnCpfl)、氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)Cpf1(AsCpfl)、或毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌ND2006 Cpf1(LbCpfl)。Cas蛋白的“变体”是指野生型Cas蛋白的蛋白或多肽衍生物，例如具有一个或多个点突变、插入、缺失、截短、融合蛋白、或其组合的蛋白。在某些实施例中，Cas变体是基本上保留了野生型Cas蛋白的核酸酶活性或具有比野生型Cas蛋白更好的核酸酶活性的功能变体。示例指导RNA包括单指导RNA和双指导RNA。

如本文使用的，术语“异源”是指以下多核苷酸/多肽，该多核苷酸/多肽的至少一部分源自外来物种，或者如果源自相同物种，则通过有意的人工介入对其天然形式在组成和/或基因组基因座方面进行了实质性的修饰。因此，源自与将其引入的细胞所属的生物体或物种不同的生物体或物种的核苷酸序列相对于那个细胞或细胞的后裔而言是异源的。另外，异源核苷酸序列包括一种核苷酸序列，该核苷酸序列源自并插入相同的天然原始细胞类型，但是却以非天然状态存在，例如，以不同拷贝数目存在，和/或处于与在该核酸分子的天然状态中发现的那些不同的调节序列的控制下。核酸序列还可以异源于与其相关的其他核酸序列，例如在核酸构建体中，例如像表达载体。作为一个非限制性实例，启动子可以与一种或多种调节元件和/或编码序列组合存在于核酸构建体中，该调节元件和/或编码序列不与那个特定启动子相关地天然存在，即它们与该启动子是异源的。

如本文使用的，当提及过程或方法步骤时，术语“植物原位”是指在植物上而不是在离体的或体外培养的植物组织或器官上进行的过程或方法步骤。为清楚起见，植物包括那些在其生命周期中的某个时刻受创伤的植物。

术语“核酸”或“多核苷酸”在本文可互换使用，并且是指可以对应于一系列核苷酸的单体单元的任何物理串，包括核苷酸的聚合物(例如，典型的DNA聚合物或聚脱氧核糖核苷酸或RNA聚合物或多核糖核苷酸)、经修饰的寡核苷酸(例如，包含生物RNA或DNA不典型的碱基的寡核苷酸，例如2'-O-甲基化寡核苷酸)等。在一些实施例中，核酸或多核苷酸可以是单链的、双链的、多链的或其组合。除非另有说明，否则除任何明确指示的多核苷酸之外，本发明的具体核酸或多核苷酸任选地还包含或编码互补多核苷酸。核酸可以存在于载体中，例如细胞、病毒或质粒中。

如在此所使用的，短语“可操作地连接”、“操作性地连接”、“操作性相关的”或“操作性相关”等意指核酸构建体的元件(如表达盒或核酸分子)被配置以便执行其通常的功能。因此，可操作地与核苷酸序列相关的调节或控制序列(例如，启动子)能够影响核苷酸序列的表达。例如，当启动子能够影响编码序列或者功能RNA的表达时(即该编码序列或功能RNA处于该启动子的转录控制之下)，则该启动子与编码序列或者功能RNA是可操作地连接的。正义方向或者反义方向的编码序列能够与调节序列可操作地连接。控制序列不需要与目的核苷酸序列相邻，只要它们起到指导其表达的作用。因此，例如，介入未翻译的、已转录的序列可以在启动子与编码序列之间存在，并且该启动子序列仍可以被认为“可操作地连接至”该编码序列上。

术语“植物”是指任何植物，特别是农艺上有用的植物(例如种子植物)，并且“植物细胞”是该植物的结构单元和生理单元(包含细胞壁)，还可以指原生质体。该植物细胞可以是处于分离的单细胞或经培养的细胞的形式、或作为高等组织化的单位(例如像，植物组织、或分化成植物发育的任一阶段存在的结构的植物器官)的一部分。植物可以是单子叶植物(monocot)或双子叶植物(dicot)物种。

术语“植物部分”是指植物的一部分，包括单细胞和细胞组织(例如植物中完整的植物细胞)、细胞团块和可以再生植物的组织培养物。植物部分的实例包括但不限于来自以下各项的单细胞和组织：花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽和种子；以及花粉、胚珠、叶、胚、根、根尖、花药、花、果实、茎、芽、接穗、根茎、种子、原生质体、愈伤组织等。术语“植物部分”还包括外植体。

术语“子代”是指特定杂交的一个或多个后裔。典型地，子代由两个个体的育种产生，但一些物种(特别是一些植物和雌雄同体的动物)可以自体受精(即，同一个植株充当雄性和雌性配子两者的供体)。该一个或多个后裔可以是例如F1、F2或任何后续世代。

“启动子”是指核苷酸序列，通常在它的编码序列的上游(5’)，它通过提供对适当的转录所需的RNA聚合酶以及其他因子的识别来控制该编码序列的表达。“启动子调节序列”由近端和更远端上游元件组成。启动子调节序列影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性、或翻译。调节序列包括增强子、启动子、非翻译的前导序列、内含子、以及聚腺苷酸化信号序列。它们包括天然序列以及合成序列、连同可能是合成序列与天然序列的组合的序列。“增强子”是DNA序列，它可以刺激启动子的活性并且可以是该启动子或插入的异源元件的固有元件以增强启动子的水平或组织特异性。它能够在两个方向(正常或翻转)上进行操作，并且甚至当移动到该启动子的上游或下游时还能够发挥作用。术语“启动子”的含义包括“启动子调节序列”。

如本文使用的，术语“芽顶端分生组织”、“芽尖分生组织”或“SAM”是指位于植物或植物幼苗茎尖的含有干细胞的植物区域。在植物幼苗中，芽顶端分生组织位于芽的尖端。

在被引入细胞中的多核苷酸的背景下，“稳定引入(stably introducing)”或“稳定引入的(stably introduced)”意指所引入的多核苷酸被稳定地合并到该细胞的基因组中，并且因此该细胞用该多核苷酸进行了稳定转化。

如本文所使用的，“稳定转化”或“被稳定地转化的”意指将核酸引入到细胞中并且整合到该细胞的基因组中。按照这样，整合的核酸能够被其子代遗传，更特别地，被多个连续世代的子代遗传。如本文所使用的，“基因组”还包括核基因组、线粒体基因组与质粒基因组，并且因此包括该核酸到例如叶绿体基因组的整合。如本文所使用的，稳定转化也可以是指以染色体外方式(例如，作为微型染色体)维持的转基因。

“选择剂”是指与选择性标记相互作用以给予植物细胞选择性优势的药剂(例如，化学物)。示例选择剂为本领域已知的并在本文中描述，如草甘膦、草铵膦、壮观霉素、和卡那霉素。

“选择性标记”或“选择性标记基因”是指一种基因，该基因在植物细胞中的表达给予该细胞选择优势。“正向选择”是指转化的细胞，该转化的细胞获得其以前不能使用或不能有效使用的底物代谢能力，典型地通过转化并表达正向选择性标记基因。因此，这种转化的细胞从非转化组织的群中生长出来。正向选择可以是来自植物生长调节剂的无活性形式的许多类型，然后通过转移的酶转化为活性形式来转化碳水化合物来源，这些碳水化合物来源不被非转化细胞(例如甘露糖)有效利用，其然后在转化后可得到酶，例如磷酸甘露糖异构酶，使其能够被代谢。与转化的细胞相比，不转化的细胞生长缓慢或根本不生长。与非转化细胞生长能力相比，其他类型的选择可能是由于用选择性标记基因的细胞转化，该选择性标记基因获得在阴性选择试剂(例如抗生素或除草剂)存在下生长的能力。转化细胞所具有的选择优势还可以是由于在所谓“阴性选择”中失去以前具有的基因。在这种情况下，所添加的化合物只对未失去亲本细胞(通常是转基因)中存在的特异性基因(阴性选择性标记基因)的细胞具有毒性。

如本文使用的，术语“转化”是指将核酸转移到宿主细胞中，包括整合到染色体、可遗传的染色体外事件和瞬时转移。在一些特定的实施例中，引入植物、植物部分和/或植物细胞中是经由细菌介导的转化、粒子轰击转化(也称为基因枪粒子转化)、磷酸钙介导的转化、环糊精介导的转化、电穿孔、脂质体介导的转化、纳米颗粒介导的转化、聚合物介导的转化、病毒介导的核酸递送、晶须介导的核酸递送、微量注射、超声波处理法、浸润法、聚乙二醇介导的转化、原生质体转化或导致向植物、植物部分和/或其细胞引入核酸的任何其他电学、化学、物理和/或生物学机制，或其组合进行的。本领域中已知的各种植物转化方法的一般指南包括Miki等人(“Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants[将外源DNA引入植物中的程序]”在Plant Molecular Biology and Biotechnology[植物分子生物学和生物技术]的方法中，Glick,B.R.和Thompson,J.E.,编辑(CRC Press,Inc.[CRC出版有限公司],波卡拉顿,1993),第67-88页)和Rakowoczy-Trojanowska(2002,Cell Mol BiolLett[细胞分子生物学快报]7:849-858(2002))。

如本文使用的，术语“转化”和“转基因”是指含有至少一种异源多核苷酸的全部或部分的任何植物、植物细胞、愈伤组织、植物组织、或植物部分。在一些实施例中，将异源多核苷酸的全部或部分稳定地整合到染色体或稳定的染色体外元件中，以便使得其传递到连续世代。

具体实施方式

本文提供了植物的转化方法，和相关组合物。

在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括(a)提供种子的外植体，其中该外植体包含胚轴和子叶，(b)创伤该外植体区域的至少一部分以产生创伤外植体，以(c)使该创伤外植体与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中该异源多核苷酸和/或异源蛋白进入该创伤外植体的条件下接触。在一些实施例中，如果种子是双子叶植物种子，则外植体区域包含上胚轴、芽顶端分生组织、和子叶节。在一些实施例中，如果种子是单子叶植物种子，则外植体区域包含胚芽鞘、芽顶端分生组织、叶原基、和叶腋生区。

在一些实施例中，种子是浸渗的种子。在一些实施例中，种子是成熟的种子，例如，成熟的浸渗的种子。在一些实施例中，种子是成熟的经消毒的种子，例如，成熟的经消毒的浸渗的种子。在一些实施例中，种子是双子叶植物种子，例如，大豆种子、烟草种子、豆种子、葵花种子、番茄种子或胡椒种子。在一些实施例中，种子是单子叶植物种子，例如，玉蜀黍(玉米)种子、大麦种子、燕麦种子、稻种子、高梁种子、甘蔗种子或小麦种子。在一些实施例中，种子已在液体培养基中浸渗或在固体培养基中孵育长达48小时(例如，4-48小时、4-24小时、或12-18小时之间)。在一些实施例中，液体或固体培养基包含有或没有蔗糖、以及任选地细胞分裂素如玉米素或BAP的Gamborg的B5基础培养基。

在一些实施例中，通过由种子(例如，双子叶植物种子)去除种皮以释放外植体并在该外植体上进行上述方法的步骤产生创伤外植体。在一些实施例中，通过提供具有胚轴和正从其萌现或已萌现出的子叶的种子(例如，单子叶植物种子)并在正萌现或已萌现出的胚轴和子叶上进行上述方法的步骤产生外植体。

在一些实施例中，本披露提供产生具有至少一个转基因芽的嵌合植物的方法，该方法包括：(a)提供包含腋生分生组织和芽顶端分生组织的植物，(b)去除或创伤该腋生分生组织的至少一部分以产生创伤腋生分生组织区，(c)使该创伤腋生分生组织区与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中该异源多核苷酸和/或异源蛋白进入创伤腋生分生组织区的条件下接触，(d)在步骤b)或步骤c)的同时或在步骤c)之后，去除该芽顶端分生组织或抑制该芽顶端分生组织的生长以产生创伤外植体，(e)在培养基中体外培养该创伤外植体以促进细胞增殖和再生，以及(f)使该创伤外植体在适当培养基中生长，并将选择剂植物原位施用于所得植物以选择转基因芽。

在一些实施例中，步骤c)包括使创伤腋生分生组织区与异源多核苷酸接触，其中该异源多核苷酸包含选择性标记，并且其中该方法进一步包括使创伤外植体或由该创伤外植体产生的植物或植物部分、或其组合与选择剂接触以消除或减少未转化的组织。

在一些实施例中，与选择剂接触包括将该选择剂添加到维持创伤外植体的培养基中。

在一些实施例中，将选择剂植物原位施用于所得植物包括(i)将该选择剂添加到维持该植物的培养基中，(ii)用该选择剂喷洒该植物，或(iii)将该选择剂施用于外植体的创伤区域或该植物的相应区域，或其组合。

在一些实施例中，将选择剂植物原位施用于植物包括(i)将该选择剂添加到维持该植物的培养基中，(ii)用该选择剂喷洒该植物，或(iii)将该选择剂施用于外植体的创伤区域或该植物的相应区域，任选地其中(i)持续长达4周，(ii)持续长达2周并且(iii)持续长达5周。

在一些实施例中，步骤(i)在步骤(iii)之前进行。

在一些实施例中，步骤(i)的至少一部分与步骤(iii)的至少一部分同时进行。

在一些实施例中，通过以下方法进行创伤，该方法包括切割(例如，用手术刀或其他有刀刃的器械)、刺穿(例如，用针或其他有尖头的器械)、压碎(例如，用手术刀刀片或其他合适的器械的平边)、压力(例如，真空)、超声处理、或离心(例如，用颗粒)。

在一些实施例中，种子是双子叶植物种子，并且创伤胚轴区域的至少一部分包括创伤上胚轴的至少一部分、芽顶端分生组织的至少一部分、或子叶节的至少一部分、或其组合。在一些实施例中，创伤胚轴区域的至少一部分包括(i)创伤上胚轴的至少一部分和子叶节的至少一部分，或(ii)创伤上胚轴的至少一部分、芽顶端分生组织的至少一部分、和子叶节的至少一部分。

在一些实施例中，种子是单子叶植物种子，并且创伤胚轴区域的至少一部分包含创伤胚芽鞘的至少一部分、芽顶端分生组织的至少一部分、叶原基的至少一部分、叶腋生区的至少一部分、或其组合。在一些实施例中，创伤胚轴区域的至少一部分包含创伤胚芽鞘的至少一部分、芽顶端分生组织的至少一部分、叶原基的至少一部分、和叶腋生区的至少一部分。

在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括从外植体中去除子叶。在一些实施例中，种子是单子叶植物种子，并且该方法进一步包括从外植体中去除一个子叶。在一些实施例中，单子叶植物种子是玉蜀黍(玉米)种子、大麦种子、燕麦种子、稻种子、高梁种子、甘蔗种子或小麦种子。在一些实施例中，种子是双子叶植物种子，并且该方法进一步包括从外植体中去除一个或两个子叶。在一些实施例中，双子叶植物种子是大豆种子、烟草种子、豆种子、葵花种子、番茄种子或胡椒种子。

在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括从外植体中去除至少一个初生叶。在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括从外植体中去除一个或两个初生叶。在一些实施例中，从外植体上切下初生叶完成去除。

在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括由创伤外植体产生植物。在一些实施例中，产生包括在复苏培养基中复苏创伤外植体，例如，长达4周。在一些实施例中，选择培养基包含Gamborg的B5基础培养基、MS铁、Gamborg的B5维生素、MES、谷氨酰胺、天冬酰胺、特美汀和细胞分裂素(例如，BAP或玉米素核苷)。

在该方法的一些实施例中，异源多核苷酸包含选择性标记，并且该方法进一步包括使创伤外植体或由该创伤外植体产生的植物或植物部分、或其组合与选择剂接触以消除或减少未转化的组织。在一些实施例中，选择剂是除草剂、抗生素、或不可代谢的糖。在一些实施例中，选择剂是草甘膦、草铵膦、硝草酮、异噁唑草酮、二环吡喃酮、环磺酮、氟丙嘧草酯、壮观霉素、苄嘧磺隆-甲基、灭草烟、麦草畏、2,4-D、吡氟氯禾灵、吡氟禾草灵、D-木糖、甘露糖或卡那霉素。

在一些实施例中，选择过程方法包括使用实例中描述的一个或多个选择步骤、选择性标记(例如，EPSPS或ALS)和/或选择剂(例如，草甘膦或苄嘧磺隆-甲基)。

选择性标记的实例包括但不限于，提供对以下抗生素抗性或耐受性的基因，如卡那霉素(Dekeyser等人1989,Plant Phys[植物生理学]90:217-23)、壮观霉素(Svab和Maliga 1993,Plant Mol Biol[植物分子生物学]14:197-205)、链霉素(Maliga等人1988,Mol Gen Genet[分子基因遗传]214:456-459)、潮霉素B(Waldron等人1985,Plant MolBiol[植物分子生物学]5:103-108)、博来霉素(Hille等人1986,Plant Mol Biol[植物分子生物学]7:171-176)、磺胺剂(sulphonamides)(Guerineau等人1990,Plant Mol Biol[植物分子生物学]15:127-136)、链丝菌素(Jelenska等人2000,Plant Cell Rep[植物细胞报告]19:298-303)、或氯霉素(De Block等人1984,EMBO J 3:1681-1689)。其他选择性标记包括提供对除草剂抗性或耐受性的基因，如赋予除草剂(包括磺胺尿素类、咪唑啉酮类、三唑嘧啶类、和嘧啶基硫代苯酸盐类(thiobenzoates))耐受性的乙酰乳酸合酶(ALS)的S4和/或Hra突变；5-烯醇-丙酮-莽草酸-3-磷酸-合酶(EPSPS)基因，包括但不限于描述在美国专利号4,940,935、5,188,642、5,633,435、6,566,587、7,674,598中的那些(连同全部相关的应用)和草甘膦N-乙酰转移酶(GAT)，其赋予对草甘膦的抗性(Castle等人2004,Science[科学]304:1151-1154，和美国专利申请公开号20070004912、20050246798、和20050060767)；BAR，其赋予对草铵膦的抗性(参见例如，美国专利号5,561,236)；芳氧基链烷酸酯双加氧酶或AAD-1、AAD-12、或AAD-13，其赋予对2,4-D的抗性；如假单胞菌(Pseudomonas)HPPD的基因，其赋予对HPPD抗性；卟啉酮氧化酶(PPO)突变体和变体，其赋予对过氧化除草剂的抗性，这些除草剂包括氟磺胺草醚、氟羧草醚钠、乙氧氟草醚、乳氟禾草灵、氟噻甲草酯、嘧啶肟草醚、丙炔氟草胺、氟烯草酸、唑酮草酯、甲磺草胺)；以及赋予对麦草畏抗性的基因，如麦草畏单加氧酶(Herman等人2005,J Biol Chem[生物化学杂志]280:24759-24767和美国专利号7,812,224，以及相关的申请和专利)。选择性标记的其他实例可以在Sundar和Sakthivel(2008,J Plant Physiology[植物生理学杂志]165:1698-1716)中发现，通过引用结合在此。用于在本披露中使用的另外的选择性标记为本领域已知的，如草丁膦N-乙酰转移酶(PAT)和氨基糖苷3’-腺苷酸转移酶(aadA)(参见例如，Rosellini(2012)SelectableMarkers and Reporter Genes:A Well Furnished Toolbox for Plant Science andGenetic Engineering[选择性标记和报告基因：植物科学和基因工程的完善的工具箱],Critical Reviews in Plant Sciences[植物科学评论性综述],31:5,401-453)。

其他选择系统包括使用药物、代谢物类似物、代谢中间体和酶用于转基因植物的正向选择或有条件的正向选择。实例包括但不限于编码其中甘露糖是选择剂的磷酸甘露糖异构酶(PMI)的基因，或编码其中D-木糖是选择试剂的木糖异构酶的基因(Haldrup等人1998,Plant Mol Biol[植物分子生物学]37:287-96)。最后，其他选择系统可以使用无激素培养基作为选择剂。一个非限制性实例玉米同源盒基因kn1，其异位表达导致转化效率3倍增加(Luo等人2006,Plant Cell Rep[植物细胞报告]25:403-409)。各种选择性标记和编码他们的基因的实例披露在Miki和McHugh(J Biotechnol[生物技术杂志],2004,107:193-232；通过引用结合)中。

在本披露的一些实施例，选择性标记可以是植物来源的。可以是植物衍生的选择性标记的实例包括但不限于5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)。酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)催化植物中芳香族氨基酸生物合成常见的莽草酸通路中的重要步骤。除草剂草甘膦抑制EPSPS，因此杀死植物。可以通过引入修饰的EPSPS转基因产生转基因草甘膦耐受植物，该植物不由草甘膦影响(例如美国专利6,040,497；通过引用结合)。在草甘膦的存在下可以被用作选择性标记的修饰的植物EPSPS的其他实例包括稻EPSPS的P106L突变(Zhou等人2006,Plant Physiol[植物生理学]140:184-195)和在蟋蟀草EPSPS中的P106S突变(Baerson等人2002,Plant Physiol[植物生理学]129:1265-1275)。不是植物来源的并可以被赋予草甘膦耐受性的EPSPS的其他来源包括但不限于来自鼠伤寒沙门氏菌的EPSPS P101S突变(Comai等人1985,Nature[自然]317:741-744)以及来自土壤杆菌属菌株的CP4的CP4 EPSPS的突变的版本(Funke等人2006,PNAS 103:13010-13015)。尽管植物EPSPS基因是细胞核，但是成熟酶位于叶绿体(Mousdale和Coggins 1985,Planta[植物]163:241-249)。EPSPS合成为包含转运肽的前蛋白，随后该前体随后转运至叶绿体基质中并进行蛋白质水解以产生成熟酶(della-Cioppa等人1986,PNAS83:6873-6877)。因此，为了产生对草甘膦具有耐受性的转基因植物，可以引入正确地易位至叶绿体的EPSPS的适当的突变形式。然后此类转基因植物具有天然的、基因组的EPSPS基因，连同突变的EPSPS转基因。然后草甘膦可以被用作在转化和再生过程中的选择剂，由此仅用突变的EPSPS转基因成功地转化的那些植物或植物组织存活。

在该方法的一些实施例中，与选择剂接触包括将该选择剂添加到植物生长的培养基(例如，土壤或水培)中(例如，通过浇水或向土壤或其他培养基中施用组合物，该组合物包含选择剂，如1uM至1M之间的选择剂，例如，10uM至500uM的草甘膦或0.1uM至10uM的苄嘧磺隆-甲基)，用选择剂喷洒植物(例如，用可喷雾组合物，该可喷雾组合物包含选择剂，如1uM至1M的选择剂，例如，10uM至50mM之间的草甘膦或0.1uM至10uM的苄嘧磺隆-甲基)，或将选择剂(如1uM至1M之间的选择剂，例如，10uM至200uM的草甘膦或0.1uM至10uM的苄嘧磺隆-甲基)施用于对应于外植体创伤区域的植物区域(例如，使用可释放选择剂(如到对应于外植体创伤区域的植物区域上)的溶液、凝胶、可吸收的材料(例如，棉球)或其他材料。在一些实施例中，与选择剂接触持续至少一天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、或更长。在一些实施例中，与选择剂接触持续1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、或5-6周。在一些实施例中，与选择剂接触持续1天至6周之间。在一些实施例中，与选择剂接触的至少一个步骤植物原位发生。

在一些实施例中，与选择剂接触包括(i)将选择剂添加到维持创伤外植体的培养基中，(ii)将该选择剂添加到维持植物的培养基(例如，土壤或水培)中，(iii)用该选择剂喷洒该植物，或(iv)将该选择剂施用于外植体的创伤区域或该植物的相应区域，或其组合(例如，i和ii；i、ii、和iii；i、ii、和iv；i、ii、iii和iv；i、iii和iv；i和iii；i和iv；ii和iii；ii和iv；等)。在一些实施例中，与选择剂接触包括(i)将选择剂添加到维持创伤外植体的培养基中，(ii)将该选择剂添加到维持植物的培养基(例如，土壤或水培)中，以及(iv)将该选择剂施用于该植物的相应区域。在一些实施例中，(i)持续长达4周(例如，1至14天、1至10天、1至2天、或2至7天)，(ii)持续长达2周并且(iv)持续长达5周。在一些实施例中，步骤(ii)在步骤(iv)之前进行。在一些实施例中，步骤(ii)的至少一部分与步骤(iv)的至少一部分同时进行，例如，步骤(ii)和(iv)重叠至少1、2、3、4、5、6、7天或更多天。

在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括对由创伤外植体产生的植物或该植物的样品进行测定，以评估转化细胞的存在或不存在和/或评估转化细胞的数目。示例测定包括荧光蛋白检测、qPCR、实时PCR、免疫测定等。

在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括使植物生长以产生任选地包含异源多核苷酸的至少一部分的种子(例如，一个种子、两个种子、十个种子、二十个种子、五十个种子或更多)，以及收获该种子。在一些实施例中，由植物产生的所有种子包含异源多核苷酸的至少一部分。在一些实施例中，由植物产生的种子中的至少一个种子或多个种子(例如，至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、或至少90％)包含异源多核苷酸的至少一部分。在该方法的一些实施例中，该方法进一步包括使一个或多个种子生长以产生一个或多个子代植物，任选地该子代植物包含异源多核苷酸的至少一部分。

在该方法的一些实施例中，异源多核苷酸编码基因组编辑剂，例如，CRISPR/Cas剂、TALEN、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、或锌指核酸酶。在该方法的一些实施例中，异源蛋白包含基因组编辑剂，例如，Cas蛋白、TALEN、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、或锌指核酸酶。在一些实施例中，异源多核苷酸包含编码Cas蛋白和/或指导RNA的一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，异源多核苷酸包含一种或多种指导RNA，任选地其中该异源多核苷酸包含在具有Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)内。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9或Cas12a、或其功能变体。

在该方法的一些实施例中，异源多核苷酸包含含有编码序列的表达盒。在该方法的一些实施例中，编码序列编码目的蛋白或非编码RNA。在一些实施例中，目的蛋白或非编码RNA赋予植物一个或多个所希望的性状，如增强的生长、提高的产量、耐旱性、耐盐性、除草剂耐受性、昆虫抗性、有害生物抗性、疾病抗性、温度耐受性、提高的氮利用等。在一些实施例中，编码序列编码基因组编辑剂，如Cas蛋白和/或指导RNA。在一些实施例中，异源多核苷酸包含编码目的蛋白或非编码RNA的编码序列和编码序列选择性标记。在该方法的一些实施例中，表达盒进一步包含可操作地连接至一个或多个编码序列的启动子。启动子可以是例如，组成型启动子、组织特异性启动子、或诱导型启动子。

在该方法的一些实施例中，步骤c)中的接触用土壤杆菌属、病毒颗粒、微粒或纳米颗粒(例如，金或钨微粒或纳米颗粒)、细胞膜穿透肽、气溶胶束、化学物、电穿孔、或压力(例如，真空)进行。在一些实施例中，步骤(d)中的接触用土壤杆菌属进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用病毒颗粒进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用金或钨颗粒，如微粒或纳米颗粒进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用细胞膜穿透肽进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用气溶胶束进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用化学物进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用电穿孔进行。在一些实施例中，步骤(c)中的接触用压力(例如，真空)进行。

在该方法的一些实施例中，接触用土壤杆菌属或病毒颗粒进行，并且该接触包括感染步骤，以及孵育步骤。在该方法的一些实施例中，感染步骤在黑暗中或在光照下或在光照/黑暗周期中进行至少30分钟，例如，30分钟至24小时，如1-12、2-12、3-12、4-12、5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12、11-12、1-11、2-11、3-11、4-11、5-11、6-11、7-11、8-11、9-11、10-11、1-10、2-10、3-10、4-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10、1-9、2-9、3-9、4-9、5-9、6-9、7-9、8-9、1-8、2-8、3-8、4-8、5-8、6-8、7-8、1-7、2-7、3-7、4-7、5-7、6-7、1-6、2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5、4-5、1-4、2-4、3-4、1-3、2-3、或1-2小时，并且孵育步骤在黑暗中或在光照下或在光照/黑暗周期中进行至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天或更长时间，例如，1-7、2-7、3-7、4-7、5-7、6-7、1-6、2-6、3-6、4-6、5-6、1-5、2-5、3-5、4-5、1-4、2-4、3-4、1-3、2-3、或1-2天。在一些实施例中，感染步骤包括使创伤外植体与含有土壤杆菌属或病毒颗粒的溶液、凝胶、可吸收的材料或其他材料接触。在一些实施例中，孵育后，施用抗生素(例如，特美汀、头孢噻肟和/或万古霉素)以消除土壤杆菌属或病毒颗粒。

土壤杆菌属介导的转化是用于转化植物的常用方法，这是由于它具有相对较高的转化效率和增加的转化通量以及因为它对于许多不同物种的广泛实用性。土壤杆菌属介导的转化通常涉及将携带外来目的DNA的二元载体转移至适当的土壤杆菌属菌株，这可能取决于由宿主土壤杆菌属菌株在共同存在的Ti质粒上或在染色体上携带的vir基因的互补物(参见例如，Uknes等人1993,Plant Cell[植物细胞]5:159-169)。将重组二元载体转移至土壤杆菌属可以例如，使用携带该重组二元载体的大肠杆菌——辅助大肠杆菌菌株(该辅助菌株携带能够将该重组二元载体移动到靶土壤杆菌属菌株中的质粒)通过三亲本交配程序实现。可替代地，可以通过核酸转化将重组二元载体转移至土壤杆菌属中(参见例如，

和Willmitzer 1988,Nucleic Acids Res[核酸研究]16:9877)。通过重组土壤杆菌属进行的植物转化通常涉及该土壤杆菌属与来自该植物的外植体的孵育。将转化的组织通常在位于二元质粒T-DNA边界之间的选择性标记的选择剂存在下再生。

在其他方面，本披露提供了方法，该方法包括：创伤获得自种子(例如，浸渗或发芽的种子)的外植体，转化创伤外植体，由该创伤外植体产生植物，使该创伤外植体与包含选择性标记的异源多核苷酸在其中该异源多核苷酸进入该创伤外植体的条件下接触，以进行至少一个植物原位选择步骤。在一些实施例中，创伤外植体是如上文或实例中所述的外植体。在一些实施例中，创伤外植体是去除子叶的胚轴(参见例如，美国专利号US 7001754中所述的外植体)。在一些实施例中，创伤外植体是其中一个子叶和胚根已被去除的胚轴(参见例如，美国专利申请公开号US 2004034889中所述的外植体)。在一些实施例中，创伤外植体是种子的一半(参见例如，美国专利号US 7473822中所述的外植体)。

在一些实施例中，一个或多个植物原位选择步骤包括使用实例中描述的一个或多个选择步骤、选择性标记(例如，EPSPS或ALS)和/或选择剂(例如，草甘膦或苄嘧磺隆-甲基)。在该方法的一些实施例中，一个或多个植物原位选择步骤包括将选择剂添加到植物生长的培养基(例如，土壤或水培)中(例如，通过浇水或向土壤或其他培养基中施用组合物，该组合物包含选择剂)，用选择剂喷洒植物(例如，用可喷雾组合物，该可喷雾组合物包含选择剂)，或将选择剂施用于对应于外植体创伤区域的植物区域(例如，使用可释放选择剂(如到对应于外植体创伤区域的植物区域上)的溶液、凝胶、可吸收的材料(例如，棉球)或其他材料，或其组合。在一些实施例中，植物原位选择步骤持续至少一天、至少一周、至少两周、至少三周、至少四周、至少五周、或更长。在一些实施例中，与选择剂接触持续1-11、1-10、1-9、1-8、1-7、1-6、1-5、1-4、1-3、1-2、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、或5-6周。

本披露的其他方面涉及转化方法，该转化方法包括实例中所述的方法的任何一个或多个步骤。本披露的其他方面涉及通过以上或本文别处(包括实例)所述的方法中的任一种产生的外植体、植物或植物部分。本披露的其他方面涉及子代种子，该子代种子通过使以上或本文别处所述的方法中的任一种产生的植物与第二植物杂交或通过该植物自交产生。本披露的其他方面涉及产生或获得自植物或植物部分的衍生物或商品产品，该植物或植物部分通过以上或本文别处所述的方法中的任一种产生。在一些实施例中，商品产品选自由以下组成的组：完整或加工过的种子、粉、蛋白质分离物、浓缩物、液体、糖浆、糊状物、酱汁或由植物或植物部分产生的其他食物或产品。

在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括(a)提供种子的外植体，其中该外植体包含胚轴和子叶，以及(b)使该外植体与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中该异源多核苷酸和/或异源蛋白进入该外植体的条件下接触。在一些实施例中，如果种子是双子叶植物种子，则外植体区域包含上胚轴、芽顶端分生组织、和子叶节。在一些实施例中，如果种子是单子叶植物种子，则外植体区域包含胚芽鞘、芽顶端分生组织、叶原基、和叶腋生区。

在一些实施例中，本披露提供了方法，该方法包括(a)提供种子的外植体，其中该外植体包含胚轴和子叶，以及(b)使该外植体与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中该异源多核苷酸和/或异源蛋白进入该外植体的条件下接触。在一些实施例中，如果种子是双子叶植物种子，则外植体区域包含上胚轴、芽顶端分生组织、和子叶节。在一些实施例中，如果种子是单子叶植物种子，则外植体区域包含胚芽鞘、芽顶端分生组织、叶原基、和叶腋生区。在一些实施例中，步骤(b)中的接触用金或钨颗粒，如微粒或纳米颗粒进行。在该方法的一些实施例中，异源多核苷酸编码基因组编辑剂，例如，CRISPR/Cas剂、TALEN、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、或锌指核酸酶。在该方法的一些实施例中，异源蛋白包含基因组编辑剂，例如，Cas蛋白、TALEN、受DNA指导的核酸酶、大范围核酸酶、重组酶、或锌指核酸酶。在一些实施例中，异源多核苷酸包含编码Cas蛋白和/或指导RNA的一种或多种多核苷酸。在一些实施例中，异源多核苷酸包含一种或多种指导RNA，任选地其中该异源多核苷酸包含在具有Cas蛋白的核糖核蛋白(RNP)内。在一些实施例中，Cas蛋白是Cas9或Cas12a、或其功能变体。

在下文中，将通过以下实例详细描述本发明。然而，以下实例是对本发明的说明，本发明的范围不受以下实例限制。

实例

实例1：新颖半植物原位转化方法的工艺流程

适用于范围广泛的作物及其品种的通用半植物原位转化方案如下所述并示于图1中。

1.靶组织制备：

使用经消毒的或未消毒的成熟或未成熟的种子，优选地经消毒的成熟种子。在土壤杆菌属接种前，将种子在水或其他液体培养基中浸泡4-48小时，优选地过夜。可替代地，经消毒的种子也可以在固体培养基中发芽过夜。将种子在22℃-24℃下孵育至少16-20小时。

将种皮从浸泡或发芽的种子中去除。然后通过小心地切割包含上胚轴和芽顶端分生组织的区域(例如，用手术刀刀片)将种子创伤，而不将该下胚轴与子叶完全分离。优选的可替代的方法是小心地去除并丢弃子叶中的一个，然后创伤包含上胚轴、顶端分生组织和子叶节的区域(例如，用手术刀刀片的尖端)。作为另一种选择，可以在创伤该区域之前去除初生叶和子叶中的一个。

2.土壤杆菌属悬浮液制备：

不同的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株可用于转化，优选地如EHA101或Chry5(可以使用每种菌株的不同形式，包括recA-)。土壤杆菌属具有含有选择性标记和一种或多种目的基因的二元载体。示例构建体含有EPSPS或乙酰乳酸合酶(ALS)选择性标记。将土壤杆菌属培养物从-80℃的甘油储备液中划线到含有适当抗生素的板上，并在22℃-28℃的培养箱，优选地23℃中生长。在用外植体接种之前，将土壤杆菌属细胞从板中收集，均匀地悬浮在无菌一次性50ml离心管中的液体感染培养基中，并稀释至OD A660大约为0.20至1.0，优选地OD大约为0.3至0.6。添加乙酰丁香酮以诱导毒力基因表达。优选地，添加二硫苏糖醇(DTT)。

3.感染与孵育

通过将创伤外植体浸入土壤杆菌属悬浮液中来立即用土壤杆菌属感染它们，然后在室温下在黑暗中孵育至少30分钟或长达过夜。可替代地，外植体的感染也可以在土壤杆菌属悬浮液的存在下进行，例如先在创伤区域添加土壤杆菌属悬浮液，然后创伤植体；或通过将手术刀刀片浸入土壤杆菌属悬浮液中，然后使用该刀片创伤外植体，或通过直接在土壤杆菌属悬浮液中创伤外植体。感染后，将外植体从土壤杆菌属悬浮液中取出并转移到密闭塑料容器或不使用DTT的固体培养基中的培养皿上孵育。将孵育板在21℃-23℃下在黑暗中孵育3至6天(优选地4-5天)，外植体近轴面向上放置。

4.体外恢复与任选的预选

孵育后，添加优选地具有或不具有相应选择剂的液体培养基，以将外植体浸入孵育板中。可替代地，可以将外植体在具有或不具有相应选择剂的固体或半固体培养基上培养。然后将培养物在23℃-28℃，优选的25℃下在光照下孵育长达4周，然后移植到土壤中用于进一步的选择和转基因芽再生和恢复。EPSPS基因的选择剂是25-500μM草甘膦，优选地100μM。ALS基因的选择剂是0.01-1mM苄嘧磺隆-甲基，优选地1-3μM。也可以使用其他相应选择剂。

5.转基因植物的选择和恢复

在恢复和任选的预选后，将感染的外植体移植到土壤中，用于转基因芽的进一步选择和发育。在16小时光照/8小时黑暗条件下，将植物置于生长箱中的托盘中。将浸泡在选择溶液中的小棉球放置在每株植物的感染区域(“顶部选择”)上。将托盘用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换1-2次。顶部选择可以进行长达2周。顶部选择一周后，可以将选择溶液浇灌到土壤盆中(“底部选择”)。可替代地，可以使用仅底部或仅顶部选择，或仅将具有相应选择剂的选择溶液喷洒在外植体上持续1至5周。每周完成一次选择浇水，持续3至5周。

6.转基因植物鉴定和确定

转基因芽的发育没有明显的异常表型，并且可以与嵌合体区分开来，这些嵌合体预期在发育的芽中具有黄叶和绿叶，或者在转基因叶中具有嵌合扇区。真正的转基因芽可以通过分子分析如Taqman分析来确定。在一个转基因芽中从三叶的不同组中取样两到三片叶子，并对其选择性标记、二元载体骨架和目的基因的存在进行分析。

7.转基因的遗传分析

使收获自独立的转基因芽的种子发芽，并将叶子取样用于分子分析，如Taqman分析，用于确定选择性标记、二元载体骨架和目的基因的存在。

实例2：大豆转化

半植物原位大豆转化方法的详细说明

1.靶组织制备：

使用经消毒的成熟大豆(Glycine max)种子。在土壤杆菌属接种之前，将种子在22℃-24℃下，在经消毒的H2O或液体培养基Soy1中浸泡过夜(12-18小时)。液体培养基Soy 1含有3.1g/L Gamborg的B5基础培养基和2mg/L BAP。

将种皮从浸泡种子中去除。将子叶中的一个和两片初生叶小心地去除并丢弃。接下来，通过用手术刀刀片的尖端进行几次切割来创伤含有上胚轴、顶端分生组织和子叶节的区域。创伤方法示于图2中。

2.土壤杆菌属悬浮液制备：

使用根癌农杆菌菌株[Chry5d3 recA-]。土壤杆菌属具有含有选择性标记和目的基因的二元载体，特别地含有由翻译延伸因子EF-1α/Tu启动子驱动的EPSPS选择性标记和由夜香树属(Cestrum)黄叶卷曲病毒启动子(prCMP)驱动的AmCyan基因的构建体23093、含有来自大豆普通烟草(Nicotiana tabacum)的密码子优化的乙酰乳酸合酶(ALS)双突变体(P191A，W568L)和由prCMP驱动的AmCyan基因的构建体18891、和含有来自大豆普通烟草由翻译延伸因子EF-1α/Tu启动子(包括来自大豆(Williams 82)prGmEF-02的第一内含子和相邻的5’-UTR)驱动的密码子优化的乙酰乳酸合酶(ALS)双突变体(P191A，W568L)的构建体22296。将土壤杆菌属培养物从-80℃的甘油储备液中划线到含有100mg/L氨苄青霉素和500mg/L壮观霉素的适当抗生素的YP板上，并在23℃的培养箱中生长。在用外植体接种之前，将土壤杆菌属细胞从板中收集，并且均匀地悬浮在无菌一次性50ml离心管中的液体感染培养基SoyInf中，并稀释至OD A660大约为0.3至0.6。添加最终浓度为40-80mg/L(200-400uM)的乙酰丁香酮以诱导毒力基因的表达。添加二硫苏糖醇(DTT)至最终浓度为150μg/ml。SoyInf含有1.1g/L MS基础盐混合物、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、4g/L MES、1ml/LGamborg的B5维生素(1000X)和2mg/L玉米素核苷。

3.感染与共培养

通过将创伤外植体浸入土壤杆菌属悬浮液中来立即用土壤杆菌属感染它们，然后在室温下在黑暗中孵育18小时。感染后，将外植体从土壤杆菌属悬浮液中取出并转移到密闭塑料容器中的培养皿上用于共培养。将共培养板在22+1℃下在黑暗中孵育3-5天，外植体近轴面向上放置。

4.体外恢复与预选

共培养后，添加具有或不具有相应选择剂(草甘膦或苄嘧磺隆-甲基)的液体培养基Soy 2，以将外植体浸入共培养板中。然后将培养物在25℃下在光照下孵育长达4周，然后移植到土壤中用于进一步的选择和转基因芽再生和恢复。测试的不同实验条件的预选步骤详见表1和表2。Soy2含有3.1g/L Gamborg的B5基础培养基、5ml MS铁(200X)、1ml/LGamborg的B5维生素(1000X)、1g/L MES、100mg/L谷氨酰胺、100mg/L天冬酰胺、300mg/L特美汀和2mg/L BAP。EPSPS基因的选择剂是100-300μM的草甘膦。ALS基因的选择剂是1至5μM的苄嘧磺隆-甲基。

5.转基因植物的选择和恢复

在预选后，将感染的外植体移植到土壤中，用于转基因芽的进一步选择和发育。

1).草甘膦选择以产生转基因事件：

事件再生的选择：在16小时光照/8小时黑暗条件下，将植物置于生长箱中。将浸泡在选择溶液中的小棉球放置在感染区域(“顶部选择”)上。顶部选择溶液含有100μM草甘膦、1-2mg/L 6-苄基氨基嘌呤和1g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。将托盘用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换2次。顶部选择持续2周。顶部选择一周后，将300-500μM草甘膦溶液浇灌到土壤盆中(“底部选择”)。选择浇水每周完成一次，持续至少3周。

2).ALS选择以产生转基因事件：

事件再生的选择：在16小时光照/8小时黑暗条件下，将植物置于生长箱中。将浸泡在选择溶液中的小棉球放置在感染区域(“顶部选择”)上。顶部选择溶液含有3μM苄嘧磺隆-甲基、1-2mg/L 6-苄基氨基嘌呤和1g/L 2-(N-吗啉代)乙磺酸。将托盘用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换2次。顶部选择持续2周。顶部选择一周后，将1.5μM灭草烟溶液浇灌到土壤盆中(“底部选择”)。选择浇水每周完成一次，持续至少3周。

在两种选择方案中，首先基于它们的生长和叶子形态鉴定假定的事件。假定的转基因芽生长迅速并且具有正常的叶子。非转基因芽发育不良、生长缓慢或叶片小而窄。来自完全转基因芽的叶子保持深绿色并继续生长而没有异常表型，而来自嵌合体的转基因叶子没有出现在黄色或黄绿色扇区。

6.在温室内喷洒除草剂，优化转基因植物的选择和恢复

1)草甘膦选择以产生转基因事件

在Soy2培养基中2天并在含有100μM草甘膦的Soy2培养基中5天后，将外植体移植到土壤中用于转基因芽的进一步选择和发育。通过使用放置好的棉球或每日液体喷洒方法施用各种浓度的草甘膦，将选择在GH中进行三周。各种浓度的草甘膦列于表3中。对从每次处理回收的芽进行Taqman测定，以确定转基因频率。施用溶液含有草甘膦、1g/L MES和BAP(第一周2mg/L、第二周和第三周1mg/L、或三周2mg/L或1mg/l)。

2)ALS选择以产生转基因事件

将外植体在Soy2培养基中浸泡2天并在含有2μM苄嘧磺隆-甲基的Soy2培养基中浸泡5天后，移植到土壤中用于转基因芽的进一步选择和发育。通过使用放置好的棉球或每日液体喷洒方法施用各种浓度的苄嘧磺隆-甲基，将选择在GH中进行三周。各种浓度的苄嘧磺隆-甲基列于表4中。对来自每次处理的回收的芽进行Taqman测定，以确定转基因频率。施用溶液含有苄嘧磺隆-甲基、1g/L MES和BAP(第一周2mg/L、第二周和第三周1mg/L、或三周2mg/L或1mg/l)。可替代地，可以将土壤中的移植外植体直接用含有商业除草剂Ecomazayr(1-8μM灭草烟的异丙胺盐)、1-2mg/L BAP和1g/L MES的选择溶液喷洒3周。

7.双重除草剂选择：

将创伤外植体与含有具有23093或18891的两种土壤杆菌属菌株(每株菌株的ODA660大约为0.6)的混合物的土壤杆菌属悬浮液在室温下在黑暗中共感染18小时。感染后，将外植体从土壤杆菌属悬浮液中取出并转移到密闭塑料容器中的培养皿上用于共培养。将共培养板在22+1℃下在黑暗中孵育4天，外植体近轴面向上放置。共培养后，将外植体用液体培养基Soy 2浸泡两天，随后用含有100μM草甘膦和2μM苄嘧磺隆-甲基的液体培养基Soy2浸泡5天。然后将外植体转移到土壤中，并用含有包含100μM草甘膦和3μM苄嘧磺隆-甲基的选择溶液的小棉球固定在创伤区域。将托盘中的土壤中的外植体用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换2次，持续两周，然后每天用含有100μM草甘膦和3μM苄嘧磺隆-甲基的选择溶液喷洒，再持续一周。可替代地，也可以将外植体用含有100μM草甘膦和3μM苄嘧磺隆-甲基的选择溶液喷洒。然后将再生的芽取样用于Taqman测定。

8.来自不同成熟度组的不同大豆种质的应用

1)应用草甘膦用于EPSPS选择

除了优良品系06KG218440(RM 5.5)之外，还选择了来自表5中列出的RM1.9至RM8.2的不同成熟度组的8个不同大豆优良品系用于转化。该组还代表了基于组织培养的转化方法中转化性的巨大变化，转化频率范围从2％至32％。共培养后，将外植体在不含草甘膦的Soy2中浸泡2天，随后在含100μM草甘膦的Soy2培养基中预选5天。然后，在将外植体转移到2英寸的土壤盆中后，将外植体的感染区域用小棉球固定，该小棉球浸泡有含有100μM草甘膦的选择溶液。将托盘中的土壤中的外植体用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换2次，持续两周，然后用300μM草甘膦溶液浇灌土壤盆，再持续一周。然后将再生的芽取样用于Taqman测定。

2)应用苄嘧磺隆-甲基用于ALS选择

除了优良品系06KG218440(RM 5.5)之外，还选择了来自表5中列出的RM1.9至RM8.6的不同成熟度组的13个不同大豆优良品系用于转化。该组还代表了基于组织培养的转化方法中转化性的巨大变化，转化频率范围从1％至33％。共培养后，将外植体在不含苄嘧磺隆-甲基的Soy2中浸泡2天，随后在含2μM苄嘧磺隆-甲基的Soy2培养基中预选5天。然后，将外植体转移到2英寸的土壤盆中。将外植体第一周用含有3μM苄嘧磺隆-甲基、1-g/LMES和2mg/L BAP的选择溶液喷洒，随后用含有3μM苄嘧磺隆-甲基、1g/L MES和1mg/L BAP的选择溶液喷洒两周。将托盘中的土壤中的外植体用圆顶覆盖以保持高湿度。然后将再生的芽取样用于Taqman测定。

9.转基因遗传

从总共75个非骨架、单拷贝转基因事件中检查未成熟种子的AmCyan基因表达，代表使用ALS或EPSPS选择性标记的5个独立的转化实验。在温室中将从转基因事件中随机挑选的10盆植物的未成熟种子收获，并且将种皮小心地从子叶上去除，然后在显微镜下观察未成熟胚的AmCyan基因的荧光表达。

上述方法的大豆转化实验的结果

1.表1总结了在感染具有二元载体23093的土壤杆菌属四周后，对恢复的植物的主要的Taqman分析结果。结果显示了导致转化频率显著提高的处理条件的比较。使用液体培养基用于预选，转化频率显著提高达45％。用不含草甘膦的培养基预处理2天，随后用100μM草甘膦预选5天的条件提高了转化频率。总体而言，每种经过选择的测试方法都可以产生转化事件。

表1.使用EPSPS作为选择性标记比较不同选择条件下的转化频率

2.表2总结了在感染具有二元载体18891的土壤杆菌属四周后，对恢复的植物的主要的Taqman分析结果。结果显示，使用ALS作为选择性标记，转化频率高达超过51％。通过2天恢复和5天预选与1-2μM苄嘧磺隆-甲基组合，显著提高转化频率。

表2.使用ALS作为选择性标记比较不同选择条件下的转化频率

3.草甘膦浓度和EPSPS选择应用方法的优化

为了获得EPSPS选择的最佳选择条件和方法，进行了并行比较实验。结果汇总在表3中。转基因事件可以在温室中以18％的转化频率和超过80％的逃逸率而不经选择恢复。通过使用棉球方法施用175μM草甘膦，在没有任何逃逸事件下获得了高转化频率(约48％)和高单拷贝事件率(>50％)。通过每天喷洒150μM或更多的草甘膦也可以达到类似的效果，几乎没有逸出。

表3.施用方法和草甘膦浓度对转化频率、逃逸率和单拷贝事件率的影响

4.苄嘧磺隆-甲基浓度和ALS选择应用方法的优化

为了获得ALS选择的最佳选择条件和方法，进行了并行比较实验。结果汇总在表3中。转基因事件可以在温室中以超过18％的转化频率和73％的逃逸率而不经选择恢复。施用3μM或更高浓度的苄嘧磺隆-甲基时没有恢复逃逸事件。通过使用棉球方法施用苄嘧磺隆-甲基，获得了高转化频率(约40％)和高单拷贝事件率(50％)。通过每天喷洒3μM苄嘧磺隆-甲基也可以达到类似的高转化频率，单拷贝率超过60％。

表4.施用方法和苄嘧磺隆-甲基浓度对转化频率、逃逸率和单拷贝事件率的影响

5.将草甘膦或苄嘧磺隆-甲基应用于来自不同成熟度组的不同大豆种质

表5总结了在用具有23093或18891的土壤杆菌属感染外植体五周后，对来自不同大豆种质的转基因植物进行Taqman测定的分析结果。结果表明，该方法适用于来自不同成熟度组的大豆种质，具有高转化频率，是非基因型依赖性转化。特定地，在基于组织培养的转化方法中，对于那些顽固的品系，转化频率显著提高5-10倍。

表5.草甘膦或苄嘧磺隆-甲基应用于不同大豆种质的结果

NA：不适用。

6.双重除草剂选择

表6总结了在应用双重除草剂选择后，在不同土壤杆菌属菌株中存在的两种选择性标记EPSPA和ALS的共转化结果。在双重除草剂选择中，共转化频率大于30％，而整体转化频率大于50％。

表6.在大豆优良品系06KG218440中使用双重除草剂选择的23093和18891的共转化频率

7.转基因的遗传分析

转基因AmCyan存在于23093和18891中。从这两种构建体产生的所有转基因植物都将携带可见标记基因AmCyan和选择性标记基因EPSPS或ALS。通过观察转基因植物的未成熟胚中的AmCyan基因(CFP荧光)在UV光下的表达，可以证明转基因的遗传。表7总结了在来自总共75个转基因事件的后代的未成熟胚中检查的CFP表达的结果，这些转基因事件含有没有载体骨架的单拷贝基因。使用草甘膦选择的45个转基因事件中有41个在未成熟胚中是CFP阳性，而使用苄嘧磺隆-甲基选择的30个转基因事件中有29个在子代中是CFP阳性。结果表明，从T0代到T1代转基因的遗传传递效率很高。

表7.T1子代中的转基因遗传

8.商业除草剂Ecomazayr 2SL的应用

进行实验来比较BSU与商业除草剂Ecomazayr在温室中使用当前转化方法对ALS选择性标记的选择效果。表8中总结的结果表明，商业除草剂Ecomazayr与BSU一样有效，并且在温室选择中可用于在当前转化方法中恢复ALS转基因植物

表8.BSU与商业除草剂Ecomazayr 2SL之间的选择效果的比较

9.体外选择和温室选择过程的优化

进行实验以改进和简化选择过程和条件。开发了Soy 3培养基以改进体外回收和预选阶段的转化效率。Soy3培养基含有所有Soy2培养基成分，但用1mg/L BA和1mg/L玉米素核苷替代2mg/L BA。在温室选择中，将3周的一步配制的选择溶液替换为3周的2步选择。结果表明，转化频率从两步温室选择的21％提高到具有1或2mg/L BA的一步选择的28.6％。当将Soy3培养基用于体外恢复和预选时，与一步温室选择(处理C对D)相比，转化频率提高了50％，而单拷贝率保持相似。

表9.体外和温室选择过程的优化

实例3：用半植物原位法对大豆进行基因枪转化

1)用DNA转化

将约1x 10¹⁰-10¹¹个目的DNA分子(载体23092或18891和22296)添加到50μl的制备的金甘油浆液的试管中，并通过涡旋充分混合，随后添加等体积的冷2.5M CaCl₂至最终浓度为1.25M CaCl₂和10μl的冷0.1M亚精胺中，然后立即混合。将DNA-金颗粒混合物在冰中保持至少30min以将DNA沉淀到金颗粒上后，将DNA-金颗粒混合物以14,000rpm旋转5秒，并且将上清液用移液器小心地除去。添加200μl的冷100％(200proof)乙醇并充分混合后，以14,000rpm旋转DNA-金颗粒混合物5秒，并且将上清液用移液器小心地除去。然后将混合物重悬于约50μl的冷100％(200proof)乙醇中9次。将5μl的混合物均匀地移取到制备的大运载体支架单元的中心，并在轰击前使其干燥。

通过从浸泡的种子小心地去除并丢弃种皮、子叶中的一个和两片初生叶来制备外植体。在含有MS基础培养基2mg/L BAP的靶板中，将约30个外植体排列成一圈，暴露的芽顶端区域面向轰击方向。使用PDS Helium-1000设备在27.5mm Hg的真空下以1100或1300psi轰击每个靶板三次。

轰击后，将含有轰击的外植体的板在24℃下在16小时光照/8小时方案和>80μE/m2/s下培养2-3天。然后将外植体转移到具有100μM草甘膦或2μM BSU的适当的Soy2培养基中5-7天。将外植体移植到土壤中后，通过使用含有100μM草甘膦或2μM BSU、1mg/L MES和2mg/LBAP的选择溶液在生长箱或温室下进行选择，持续三周。对来自每次处理的回收的芽进行Taqman测定，以确定转基因频率。

表9中总结的结果表明，所描述的转化方法可应用于基因枪介导的转基因植物恢复的转化。通过Taqman测定确定的转基因植物在轰击后小于6周内使用BSU和草甘膦选择通过不同的基因递送条件和选择方案从轰击的外植体产生。它适用于目的基因的转化和共转化。

表10.使用ALS或EPSPS选择性标记从质粒DNA的基因枪轰击中恢复转基因事件

2)用核糖核蛋白(RNP)转化

为了制备RNP复合物，在使用前用无核酸酶水将AsCas12a核酸酶和gRNA(rLbgRNACas12aGmFAD2-03,TAATTTCTAC TAAGTGTAGA TGAACCCTTG AGAGAGGCTT CTTC)制备至所希望的体积。可从IDT购买AsCas12a和crRNA。将0.3nmol的AsCas12核酸酶(5μl的60μM)和0.3nmol的crRNA(6μl的50μM)轻轻混合至总体积为11μl，并在室温下孵育10min。用金颗粒进行超声处理并用100％乙醇消毒后，用1mg 0.6μm的金颗粒在50μl无核酸酶水中制备一管50μl的金浆液。然后将RNP复合物添加到50μl金浆液中，然后轻轻混合。任选地，将含有选择性标记的目的质粒DNA(1x10¹⁰个22296的DNA分子)与RNP复合物一起添加，以允许恢复编辑的事件。在冰上孵育10min后，然后将RNP/DNA包被的金颗粒以8,000x g离心40s(用Eppendorf微量离心管5410，以约11,000rpm)，并将上清液除去。将沉淀用30μl的无菌水通过简短的超声处理重悬，然后加载到大运载体(每个10μl)上，随后在层流净化罩中风干2小时。

轰击后，将含有轰击的外植体的板在24℃下在16小时光照/8小时方案和>80μE/m2/s下培养2-3天。然后将外植体转移到具有100μM草甘膦或2μM BSU的适当的Soy2培养基中5-7天。将外植体移植到土壤中后，通过使用含有100μM草甘膦或2μM BSU、1mg/L MES和2mg/LBAP的选择溶液在GH中进行选择，持续三周。对来自每次处理的回收的芽进行Taqman测定，以确定转基因和编辑频率。

通过ALS选择性标记DNA(22296)、gRNA(rLbgRNACas12aGmFAD2-03，TAATTTCTACTAAGTGTAGA TGAACCCTTG AGAGAGGCTT CTTC)和LbCas12a核糖核蛋白的共转化进行大豆FAD2基因编辑实验。在6周内恢复植株后，对来自事件的叶组织取样，并进行Taqman测定用于分析。结果表明，从780个轰击的外植体中鉴定出7个假定的编辑事件。

实例4：用半植物原位方法转化野生大豆属物种短绒野大豆

野生大豆属物种短绒野大豆(Glycine tomentella)是疾病抗性(R)基因(例如大豆胞囊线虫和亚洲大豆锈病)的丰富来源。短绒野大豆的转化方法对于R基因的鉴定和验证非常有用。将短绒野大豆的种子在灭菌前用硫酸处理40分钟。用15％Clorox消毒15分钟后，将种子用无菌水洗涤三次，然后在含有2mg/L BA和30g/L蔗糖的MS基础培养基上在黑暗中或在光照下发芽。将发芽的幼苗小心地取出，并丢弃一个子叶和两个初生叶。如上文所述，通过用手术刀刀片的尖端进行几次切割来创伤含有上胚轴、顶端分生组织和子叶节的区域，用于大豆转化。遵循上述用于大豆土壤杆菌属体外转化和GH选择条件的相同方案，对来自恢复的植物的叶子取样并进行Taqman测定，以确认是否存在转基因事件。

进行实验以用具有载体18891的土壤杆菌属转化短绒野大豆。遵循上述方法，将植物在用土壤杆菌属感染4周后回收。对来自恢复的植物的叶子组织取样并进行Taqman测定。结果表明，从感染土壤杆菌属的25个外植体中鉴定出一个转基因事件。

实例5：用半植物原位方法转化葵花(向日葵(Helianthus annuus))

将葵花种子的果皮小心地取出并丢弃。然后将种子在灭菌前浸泡在水中2-4小时。用20％Clorox消毒15分钟后，将种子用无菌水洗涤三次，然后在含有2mg/L BA和30g/L蔗糖的MS基础培养基上在黑暗中或在光照下发芽。将发芽的幼苗小心地取出，并丢弃一个子叶和两个初生叶。如上文所述，通过用手术刀刀片的尖端进行几次切割来创伤含有上胚轴、顶端分生组织和子叶节的区域，用于大豆转化。遵循上述用于大豆土壤杆菌属体外转化和GH选择条件的相同方案，对来自恢复的植物的叶子取样并进行Taqman测定，以确认是否存在转基因事件。

实例6：通过与表达一个或多个形态发生因子或一个或多个发育调节因子的载体共转化提高半植物原位方法在顽固作物中的转化效率

1)靶组织制备

使用大豆和玉米的顽固性品种以及顽固作物，如葵花、棉花、西瓜或甜菜的经消毒的或未消毒的成熟或未成熟种子，优选地经消毒的成熟种子。在土壤杆菌属接种前，将种子在水或其他液体培养基中浸泡4-48小时，优选地过夜。可替代地，经消毒的种子也可以在固体培养基中发芽过夜。将种子在22℃-24℃下孵育至少16-20小时。

将种皮从浸泡或发芽的种子中去除。然后通过小心地切割包含上胚轴和芽顶端分生组织的区域(例如，用手术刀刀片)将种子创伤，而不将该下胚轴与子叶完全分离。优选的可替代的方法是小心地去除并丢弃子叶中的一个，然后创伤包含上胚轴、顶端分生组织和子叶节的区域(例如，用手术刀刀片的尖端)。作为另一种选择，可以在创伤该区域之前去除初生叶和子叶中的一个。任选地，制备的外植体可以通过其他方法，如超声处理或晶须介导的磨损进一步创伤。

3)土壤杆菌属悬浮液制备

不同的根癌农杆菌菌株可用于转化，优选地如EHA101或Chry5(可以使用每种菌株的不同形式，包括recA-)。土壤杆菌属具有含有选择性标记和一种或多种目的基因的二元载体。示例构建体含有EPSPS或乙酰乳酸合酶(ALS)选择性标记。将土壤杆菌属培养物从-80℃的甘油储备液中划线到含有适当抗生素的板上，并在22℃-28℃的培养箱，优选地23℃中生长。在用外植体接种之前，将土壤杆菌属细胞从板中收集，均匀地悬浮在无菌一次性50ml离心管中的液体感染培养基中，并稀释至OD A660大约为0.20至1.0，优选地OD大约为0.3至0.6。添加乙酰丁香酮以诱导毒力基因表达。优选地，添加二硫苏糖醇(DTT)。

还包括第二土壤杆菌属菌株。该第二土壤杆菌属用含有表达盒的二元载体转化，该表达盒驱动形态发生因子(MF)或发育调节因子(DR)如Baby Boom(BBM)、Wuschel(WUS/Wox)、生长调节因子(GRF)、生长调节因子4(GRF4)及其辅因子GRF-相互作用因子1(GIF1)、芽分生组织(STM)或异戊烯基转移酶(IPT)。MF/DR的表达通过从头分生组织诱导改进了顽固植物的转化。第二表达盒驱动1)针对配子及其共转化的MF/DR转基因选择的芽孢杆菌RNA酶的花粉特异性表达，或2)在种子、胚或幼苗中表达的荧光标记物基因允许使用目的基因(GOI)/基因组编辑(GE)子代中的MF/DR转基因鉴定和去除事件。

4)感染与孵育

通过将创伤外植体浸入土壤杆菌属悬浮液中来立即用土壤杆菌属感染它们，然后在室温下在黑暗中孵育至少30分钟或长达过夜。可替代地，外植体的感染也可以在土壤杆菌属悬浮液的存在下进行，例如先在创伤区域添加土壤杆菌属悬浮液，然后创伤植体；或通过将手术刀刀片浸入土壤杆菌属悬浮液中，然后使用该刀片创伤外植体，或通过直接在土壤杆菌属悬浮液中创伤外植体。外植体/土壤杆菌属混合物也可以用热休克、超声处理或真空处理以增强感染。感染后，将外植体从土壤杆菌属悬浮液中取出并转移到塑料容器中的培养皿或固体培养基上孵育。将孵育板在21℃-23℃下在黑暗中孵育3至6天(优选地4-5天)，外植体近轴面向上放置。

5)体外恢复与任选的预选

孵育后，添加具有或不具有相应选择剂的液体培养基，以将外植体浸入孵育板或容器中。然后将培养物在23℃-28℃，优选的25℃下在光照下孵育长达4周，然后移植到土壤中用于进一步的选择和转基因芽再生和恢复。EPSPS基因的选择剂是25-500μM草甘膦，优选地100μM。ALS基因的选择剂是0.01–1μM苄嘧磺隆-甲基，优选地0.1-0.3μM。也可以使用其他相应选择剂。

6)转基因植物的选择和恢复

在恢复和任选的预选后，将感染的外植体移植到土壤中，用于转基因芽的进一步选择和发育。在16小时光照/8小时黑暗条件下，将植物置于生长箱中的托盘中。将浸泡在选择溶液中的小棉球放置在每株植物的感染区域(“顶部选择”)上。将托盘用圆顶覆盖以保持高湿度。将棉球每周更换1-2次。顶部选择可以进行长达2周。顶部选择一周后，可以将选择溶液浇灌到土壤盆中(“底部选择”)。可替代地，可以使用具有除草剂的仅底部或顶部选择。对于顶部选择，将植物用亚致死水平的除草剂喷洒以抑制非转化的组织的生长并允许转化芽的生长。对于底部选择，每周一次通过浸灌(在水中提供亚致死水平的除草剂选择剂)完成选择，持续3-5周。

7)转基因植物鉴定和确定

8)转基因的遗传

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Claims

1.一种产生具有至少一个转基因芽的嵌合植物的方法，所述方法包括：

a)提供包含腋生分生组织和芽顶端分生组织的植物，

b)去除或创伤所述腋生分生组织的至少一部分以产生创伤腋生分生组织区，

c)使所述创伤腋生分生组织区与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中所述异源多核苷酸和/或异源蛋白进入创伤腋生分生组织区的条件下接触，

d)在步骤b)或步骤c)的同时或在步骤c)之后，去除所述芽顶端分生组织或抑制所述芽顶端分生组织的生长以产生创伤外植体，

e)在培养基中体外培养所述创伤外植体以促进细胞增殖和再生，以及

f)使所述创伤外植体在适当培养基中生长，并将选择剂植物原位施用于所得植物以选择转基因芽。

2.如权利要求1所述的方法，其中通过包括切割、刺穿、压碎、加压、超声处理或离心的方法进行所述创伤。

3.如权利要求1至2中任一项所述的方法，其中种子是双子叶植物种子，并且步骤b)包括(i)创伤上胚轴的至少一部分和子叶节的至少一部分，或(ii)创伤所述上胚轴的至少一部分、所述芽顶端分生组织的至少一部分、和所述子叶节的至少一部分。

4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述种子是单子叶植物种子，并且步骤b)包括创伤胚芽鞘的至少一部分、所述芽顶端分生组织的至少一部分、叶原基的至少一部分、和叶腋生区的至少一部分。

5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述外植体中去除子叶。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述种子是双子叶植物种子，并且所述方法进一步包括从所述外植体中去除一个或两个子叶，任选地其中所述双子叶植物种子是大豆种子、烟草种子、豆种子、葵花种子、番茄种子或胡椒种子。

7.如权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括从所述外植体中去除至少一个初生叶。

8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括由所述创伤外植体产生植物。

9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，步骤c)包括使所述创伤腋生分生组织区与异源多核苷酸接触，其中所述异源多核苷酸包含选择性标记，并且其中所述方法进一步包括使所述创伤外植体或由所述创伤外植体产生的植物或植物部分、或其组合与选择剂接触以消除或减少未转化的组织。

10.如权利要求9所述的方法，其中与所述选择剂的所述接触包括将所述选择剂添加到维持所述创伤外植体的培养基中。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述将选择剂植物原位施用于所得植物包括(i)将所述选择剂添加到维持所述植物的培养基中，(ii)用所述选择剂喷洒所述植物，或(iii)将所述选择剂施用于所述外植体的所述创伤区域或所述植物的相应区域，或其组合。

12.如权利要求11所述的方法，其中将选择剂植物原位施用于所述植物包括(i)将所述选择剂添加到维持所述植物的培养基中，(ii)用所述选择剂喷洒所述植物，或(iii)将所述选择剂施用于所述外植体的所述创伤区域或所述植物的所述相应区域，任选地其中(i)持续长达4周，(ii)持续长达2周并且(iii)持续长达5周。

13.如权利要求12所述的方法，其中步骤(i)在步骤(iii)之前进行。

14.如权利要求12所述的方法，其中步骤(i)的至少一部分与步骤(iii)的至少一部分同时进行。

15.如权利要求9至15中任一项所述的方法，其中所述选择剂是除草剂、抗生素、或不可代谢的糖，任选地其中所述选择剂是草甘膦、草铵膦、硝草酮、异噁唑草酮、二环吡喃酮、环磺酮、氟丙嘧草酯、壮观霉素、苄嘧磺隆-甲基、灭草烟、麦草畏、2,4-D、吡氟氯禾灵、吡氟禾草灵D-木糖、甘露糖或卡那霉素。

16.如权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括对由所述创伤外植体产生的植物或所述植物的样品进行测定，以评估转化细胞的存在或不存在和/或评估转化细胞的数目。

17.如权利要求10至17中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述植物生长以产生种子，并且收获所述种子，其中所述种子任选地包含所述异源多核苷酸的至少一部分。

18.如权利要求18所述的方法，其中所述方法进一步包括使所述种子生长以产生子代植物，任选地其中所述子代植物包含所述异源多核苷酸的至少一部分。

19.如权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸编码或包含基因组编辑剂，或其中所述异源蛋白包含基因组编辑剂，任选地其中所述基因组编辑剂是核酸酶或重组酶。

20.如权利要求20所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含编码Cas蛋白和/或指导RNA的一种或多种多核苷酸，或其中所述异源蛋白包含Cas蛋白，任选地其中所述Cas蛋白是Cas9或Cas12a、或其功能变体。

21.如权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述异源多核苷酸包含含有编码序列的表达盒。

22.如权利要求22所述的方法，其中所述表达盒进一步包含可操作地连接至所述编码序列的启动子。

23.如权利要求22或23所述的方法，其中所述编码序列编码目的蛋白或非编码RNA。

24.如权利要求1至24中任一项所述的方法，其中步骤c)中的所述接触用土壤杆菌属、病毒颗粒、微粒、纳米颗粒、细胞膜穿透肽、气溶胶束、化学物、电穿孔、或压力进行。

25.如权利要求25所述的方法，其中所述接触用土壤杆菌属或病毒颗粒进行，并且所述接触包括感染步骤，以及任选地孵育步骤。

26.如权利要求26所述的方法，其中所述感染步骤在黑暗中进行30分钟至24小时，并且所述孵育步骤在黑暗中进行至少2天，任选地4至5天。

27.一种外植体或植物，所述外植体或植物通过如权利要求1至27中任一项所述的方法产生。

28.一种子代种子，所述子代种子通过使如权利要求28所述的植物与第二植物杂交或通过如权利要求28所述的植物自交产生。

29.一种衍生物或商品产品，所述衍生物或商品产品从如权利要求28所述的植物或其一部分产生或获得。

30.一种方法，所述方法包括：

a)提供获得自种子的外植体，

b)创伤所述外植体以产生创伤外植体，

c)使所述创伤外植体与包含选择性标记的异源多核苷酸在其中所述异源多核苷酸进入所述创伤外植体的条件下接触；

d)由所述创伤外植体产生植物，以及

e)使所述植物或其一部分与选择剂接触以消除或减少未转化的组织。

31.一种方法，所述方法包括：

a)提供种子的外植体，其中所述外植体包含胚轴和子叶；

b)使所述外植体与异源多核苷酸和/或异源蛋白在其中所述异源多核苷酸和/或异源蛋白进入所述外植体的条件下接触。