BG106105A

BG106105A - Метод за растителна трансформация

Info

Publication number: BG106105A
Application number: BG106105A
Authority: BG
Inventors: Thierry Risacher; Melanie Craze
Original assignee: Rhobio
Priority date: 1999-04-19
Filing date: 2001-11-13
Publication date: 2002-06-28
Also published as: JP2002541853A; HU228627B1; CN1347457A; EP1171621B1; DE60024607T2; HUP0200926A2; CA2369428A1; DE60024607D1; WO2000063398A1; PL351895A1; US7285705B1; IL145686A0; AU775949B2; US20110078827A1; US20080047036A1; CZ20013744A3; PL202067B1; EP1171621A1; CA2369428C; ATE312183T1

Abstract

Методът включва инокулиране и съвместно култивиране на целева тъкан от целево растение с Agrobacterium във време, когато целевата тъкан е в своето естествено растително обкръжение. Следва създаване на трансгенно растение чрез дедиференциация и регенерация на целевата тъкан.

Description

Настоящото изобретение се отнася до метод за опосредствана от Agrobacterium трансформация на растения, по-специално едносемеделни растения.

Изобретението е в областта на растителната трансформация, по-специално трансформация на зърнени култури, особено в употребата на Agrobacterium или всеки друг вид Agrobacterium (понататък означен като ''‘'Agrobacterium’'¹). До неотдавна можеха да се използват само директни методи на трансформация за получаване на трансгенни зърнени растения. Бомбардиране с помощта на частици е най-широко приетият метод до тази момент. Съвсем наскоро в литературата се появиха доклади, показващи, че някои от зърнените култури могат да бъдат генетически модифицирани с помощта на Agrobacterium (Hiei at al, Plant Mol. Biol. (1997) 35:205-218); Ishida at al, Nature Biotechnol. (1996) 14:745-750; Cheng at al, Plant Physiol. (1997) 115:971-980; Tingay at al, The Plant Journal, 11:1369-1376 (1997)).

Посочените в литературата ефективности на трансформацията показват широка вариабилност за различни зърнени култури. Типично ниски са картините за царевица (Ishida 1996) в система, която силно зависи от генотипа. При ориза също са били докладвани ниски ефективности на трансформация, а за пшеницата са посочени особено ниски нива. Във всички тези системи Agrobacterium е прилаган in vitro към изолирана тъкан, която или е в процес на дедиференциация или вече е дедиференцирана.

Описаните по-горе системи за опосредствана от Agrobacterium трансформация на зърнени култури са били докладвани за ориз (Hiei, 1997), царевица (Ishida, 1996), пшеница (Cheng, 1997) и ечемик (Tingay, 1997). Обща черта за тези методи е, че експлантите, по-специално незрели ембриони или получени от тях ембриогенни калуси са изолирани от донорното растение и са инокулирани с Agrobacterium in vitro.

Hess и сътр. (Plant Science 72:233-244, 1990) опитаха трансформация на пшеница чрез пипетиране на Agrobacterium в класчета от пшеница. Целта на авторите в този доклад е да постигнат генен трансфер чрез трансформация на полен и след това да възстановят семето след нормално оплождане. Отстраняването на тъкан от заразеното класче за последваща селекция и регенерация в култура не е било целено или предполагано.

Други работещи в тази насока докладваха за опосредствана от Agrobacterium трансформация на царевица и ориз чрез инокулиране на издънкови връхчета (Gould J. (1991) Plant Physiol., 95:426-434; Park SH (1996) Plant Molecular Biology 32:1135-1158). И този път това е било с цел трансформиране на родителска линия и оттук възстановяване на трасформирано семе. Този път на регенерация е различен от използвания в метода на нашето изобретение: всъщност специфичната цел на тези методи е да се избегне всякакъв метод на растителна регенерация, преминаващ през дедиференциация на тъкан и случайна регенерация.

Американски патент 5,177,010 и 5,187,073 (Goldman, et al) разкрива метод за трансформиране съответно на царевица и житни, включващ нараняване на току що пораснали семеначета и инокулиране с Agrobacterium. И тук целта на този метод е да се трансформират в семеначето клетки от родителската линия, което по-късно ще даде начало на репродуктивни органи в зрялото растение и по този начин ще се получи трансформиран полен от растението.

Друг процес, който е бил изследван от тези, опитващи се да разработят зърнена трансформация, е агроинфекцията. Американски патент 5,569,597 (Grimsley, et al) разкрива метод за въвеждане на вирусна ДНК в растения с помощта на Agrobacterium. След инокулирането на царевични семеначета с Agrobacterium, имаща внедрен в своята Т-ДНК на ДНК от царевичен ивичест вирус, изобретателите наблюдаваха появата на болестни симптоми, показващи размножаване на вирус в растителните клетки. Agrobacterium следователно действа като средство за въвеждане на вирусната ДНК в растението, след което вирусът е в състояние да предизвика систематична инфекция. Обаче, няма доказателства, че агроинфекцията води до растителна трансформация, т.е. пренос на вирусна ДНК в растителния геном. От тук следва, че патентът разглежда трансформацията отново от страна на прицелване в меристемни тъкани, за да се постигне трансформация на клетки от родителската линия.

В този новаторски метод целевата тъкан се заразява и съвместно култивира с Agrobacterium, когато целевата тъкан е в своето нормално растително обкръжение. По този начин целевата тъкан все още се развива по нормалните физиологични и темпорални пътища. Целевата тъкан след това се отстранява от своето нормално обкръжение и се насочва по пътя на дедиференциация и регенерация, за да образува трансгенно растение. Преимуществото на този метод е, че трансгенното растение е фертилно трансгенно растение.

В това изобретение терминът “в своето естествено растително обкръжение” включва всички условия, в които целевата тъкан е способна да се развива по същностно нормални физиологични и темпорални пътища. Такива условия включват целевата тъкан да е in vivo, целевата тъкан все още да е във, върху или да е прикрепена към растението (напр. целевата тъкан, която е ембрио вътре в семе върху срязан тилер) или целева тъкан, която все още е в същото клетъчно обкръжение, както би било, ако тя все още е на растението (например целевата тъкан, която е ембрио в изолирано семе, или част от изолирано семе). Други примери включват незрели цветове все още в листния калъф или поне все още прикрепени към растението и незрял прашец, докато е все още в неотворената цветна пъпка.

Дедиференциация означава клетъчни кластери, такива като калус, които показват неорганизиран растеж.

В допълнение към целевата тъкан, която е в обкръжение, еднакво с това на на растението, Agrobacterium е в обкръжение, което е по-аналогично до естественото обкръжение на бактериите Съответно Agrobacterium е вероятно да действа по-ефективно при трансформирането на целевата тъкан, когато е насочен към изолирана тъкан в петриева паничка, както е известно в областта.

Едно следствие от тези два фактора е възможността да се получи по-висока ефективност на трансформация на желания трансген до целевите тъкани и оттук по-висока трансформационна ефективност за получаването на трансгенни растения.

Един от първите етапи, включени в повечето трансформационни протоколи, включва нараняване на целевата тъкан. При Agrobacterium това може да бъде по две причини - да се изложат клетките, за които се смята, че могат да отговорят на трансформацията и които са в състояние да регенерират (поспециално за видовете Gramineous) и да се въведе Agrobacterium, за да трансформира тяхната Т-ДНК. Един публикуван метод за пшеница, който не включва нараняване, все пак съдържа използването на овлажняващ агент (Silwet или плуронова киселина) или вакуум филтрация (WO 97/48814). Всички тези процеси включват известно наследствено увреждане на тъканта и свързано с това намаляване на регенаративния капацитет.

В предпочитано изпълнение на настоящото изобретение, нараняването на целевите клетки в целевата тъкан е поддържано на минимума или напълно се изключва - въпреки че може да се използва овлажнител, това не е от съществено значение. Някои макроскопични увреждания на тъкан може да настъпят по време на процедурата на доставка, но дори и тогава болшинството регенериращи клетки, които последователно са били прицелвани с Agrobacterium, остават неувредени и техният регенеративен капацитет не е засегнат.

Съгласно настоящото изобретение инокулирането на Agrobacterium по-специално се провежда чрез прилагане на суспензия на Agrobacterium към целевата тъкан посредством подходящо устройство за доставка, такова като спринцовка, напр. Спринцовка Хамилтон.

Съгласно настоящото изобретение има разработена система за опосредствана от Agrobacterium трансформация на растения, поспециално зърнени култури, включваща заразяване на целева тъкан. Системата е показано, че е високо ефективна и много възпроизводима.

Целевата тъкан може да бъде всяка тъкан, която след това може да бъде поставена във фаза на тъканна култура да регенерира растение. Особено подходяща целева тъкан, съгласно настоящото изобретение, включва ембрио, цвят, яичник, листна основа или прашец. Ембриото, цветът, яйчникът или прашецът са за предпочитане незрели.

jWfaitMWiiW'H

В друго предпочитано изпълнение на изобретението, когато целевата тъкан е ембрио, целевата площ за инокулиране е пространството между два слоя клетки, които са много плътно една до друга, т.е. повърхността на развиващия се скутелум и граничещата скорбялна паренхима на ендосперма. Agrobacterium трябва да бъде доставен до тази повърхност с минимално увреждане на целевата тъкан до такава степен, че да не се засегне неблагоприятно нейният регенеративен капацитет. От известното в тази област не може да бъде предсказано, че би било възможно да се създаде такава ефективна и възпроизводима техника.

В трансформационния метод на изобретението целевата тъкан е инокулирана и съвместно култивирана с Agrobacterium. След това се регенерира трансгенно растение чрез дедиференциация и регенерация на целевата тъкан. Така след инокулирането и съкултивирането целевата тъкан се привежда към дедиференциация. От тази дедиференециирана тъкан се получава растение чрез стандартни процедури, познати в тази област. След инокулирането и съвместното култивиране целевата тъкан по-специално е прехвърлена в по-подходящо обкръжение за необходимата дедиференциация и последващата регенерация на растение. Така най-малко част от дедиференциацията на целевата тъкан (след инокулирането и култивирането) се провежда in vitro. Регенерацията на растението също е предпочитано да се провежда in vitro.

Една изненадваща черта на метода съгласно настоящото изобретение (най-малко за незрели пшенични зародиши) е честата продукция на множествени трансформационни събития от един изолиран експлант. В тази област (Cheng et al, 1997) всички растения, получени от един и същи експлант, обикновено се считат за клонове на дадено събитие. При този метод това предположение

Ί

не може да бъде направено, тъй като един експлант често дава начало на няколко растения, всяко с различен модел на интеграция, когато се анализа чрез southern blot. Едно възможно обяснение за това, което не би трябвало да се интерпретира като лимитиращо за изобретението, би могло да бъде отсъствието на нараняване на болшинството регенериращи клетки преди да се приложи Agrobacterium. Повечето от Т-ДНК трансферите е възможно да се осъществят в клетки, които все още имат капацитета да продължат да се развиват.

Една от чертите на трансформацията на зърнени култури, описвана често като критична, е индукцията на Agrobacterium с включване, в средата за инокулиране и/или съвместно култивиране, на индуциращ Agrobacterium vir агент (Hiei et al, 1997, Cheng et al, 1997). Такива индуциращи агенти обхващат ацетосирингон, ванилин, ферулова киселина, катехол и сирингинова киселина. Настоящото изобретение демонстрира успешна Agrobacterium трансформация на зърнени култури, при която не е необходим индуциращ агент. По-конкретно, беше постигната успешна Agrobacterium трансформация на зърнени култури без индуциращ агент, показвайки, че не е необходим индуциращ агент за ефективна доставка на Т-ДНК. Когато целевата тъкан на настоящото изобретение е незрял ембрион и неговото естествено обкръжение се осигурява от незряло семе, е постулирано, че Agrobacterium е достатъчно индуцирана по естествен начин от клетките на незрелия ембрион. Едно от възможните обяснения за това, което не би трябвало да се приема като ограничаващо за изобретението, е, че това са клетките, които образуват “естествената растителна среда”, съседна или околна на целевата тъкан, които са отговорни за индукцията на Agrobacterium. Отстраняването на ембриона от неговото естествено растително обкръжение изглежда, че лишава целевата тъкан от наличните вещества, които могат да подпомогнат индукцията на Agrobacterium.

Настоящото изобретение прави възможно въвеждането на желан трансген или хетероложна нуклеинова киселина в растителна тъкан и възможността да се получи фертилно трансгенно растение. Това е особено полезно за получаването на трансгенни едносемеделни растения, тъй като известните трансформационни методи са свързани с трудности и ниска ефективност на трансформация. Подходящи едносемеделни растения включват аспарагус, лук, маслена палма, сладък тропичен картоф, банан, поспециално всеки вид от семейство Gramineae, особено зърнени видове (онези тревни растения, чиито плодове се използват за храна на човека), такива като пшеница, ечемик, царевица, ориз, овес, ръж, сорго и просо.

Този метод е приложим и за двусемеделни видове, поспециално където съществува система за тъканни култури или може да бъде създадена такава, която включва калусна фаза. Подходящи двусемеделни растения са рапица, грах, пипер, соя, слънчоглед, захарно цвекло и тиква, и дървета като каучуково дърво, ела и евкалипт.

Съгласно настоящото изобретение хетероложната нуклеинова киселина е такава, която не се среща нормално в Т-ДНК на Agrobacterium или в растението, което трябва да бъде трансформирано. Както се използва тук, терминът хетероложна нуклеинова киселина включва всички изкуствено конструирани и биологично получени гени, които могат да бъдат въведени в растение чрез генно инженерство, включително, но не ограничено до нерастителни гени, модифицирани гени, синтетични гени, части от гени и гени от всеки растителен вид. Хетероложната нуклеинова киселина по-специално съдържа кодиращия регион на белтък или полипептид или безсмислена молекула, към която има интерес, с граничещи регулаторни последователности, които способстват експресията й в получения монокот.

На специалистите в тази област са добре познати методите за конструиране на нуклеинови киселини за успешни трансформации на растения, като същите методи за конструиране могат да бъдат използвани за получаване на хетероложните нуклеинови киселини, използвани тук. Wesing et al. (1988) (Annual Rev. Genet. 22:241), чиято същност е включена като референция тук, описва подходящи компоненти, които включват промотори, полиаденилиращи последователности, селективни маркерни гени, репортерни гени, усилители, интрони и други подобни, и посочва подходящи референции за различни препарати от тях. От Sambrook et al (1989) (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY) ca описани подходящи методи за конструиране.

Най-общо казано плазмидът, съдържащ хетероложния ген в нуклеиновата киселина, трябва да бъде относително малък, т.е. помалък от около 30 kb, за да намали до минимум всяка податливост на физическа, химическа или ензимна деградация, за която е известно, че нараства с повишаване размера на гена.

Подходящи трансгени или хетероложни нуклеинови киселини, които се използват тук, включват всички нуклеинови киселини, които вкарват или усилват дадена полезна черта в полученото трансгенно растение. Например нуклеиновата киселина може да кодира белтъци или безсмислени РНК транскрипти, за да способства за повишена хранителна стойност, по-високи добиви, устойчивост на вредители, устойчивост на болести и други подобни.

Представителни нуклеинови киселини включват, например, бактериален dap А ген за повишен лизин; ген на Bt-ендотоксин или протеазен инхибитор за устойчивост на инсекти; гени на литични пептиди за устойчивост на болести, бактериална или растителна EPSPS за устойчивост на хербицида глифозат (US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,312,910, US 5,633,435, US 5,627,061, US 5,310,667, WTO 97/04103); бактериална или растителна HPPD (WO 96/38567, WO 98/02562) за устойчивост на HHPD-инхибиторни хербициди (т.е. дикетони, изоксазоли и др.), bar или pat гени за устойчивост на глюфозинат, хитиназа или глюкан ендо-1,3-В-глюкозидаза за фунгицидни свойства. Освен това нуклеиновата киселина може да бъде вкарана да действа като генетично средство за генериране на мутанти и/или за подпомагане на идентификацията, генетичното картиране или изолирането на сегменти от растителни гени.

Примери на гени, полезни за модифицирането на качеството, включват: гени за ензими за биосинтеза или разграждане на скорбяла, напр. синтази на скорбяла, ензими за разклоняване на скорбяла (например SBEI, SBEII, SSSI и DBEI от пшеница, описани в WO 99/14314), и гени за белтъци, подпомагащи съхранението на зърното, напр. белтъци на субединицата на глутенин (напр. виж WO 97/25419), глиадини, хордеини. Гени за изкуствена мъжка стерилност, напр. барназа (ЕР-А-0344029) и PR-глюконаза (WO 92/11379) под контрола на подходящ помотор също са полезни за получаването на хибридно семе.

Гените може да бъдат внедрени и с цел получаване на фармацевтично активни съединения в растение или за подобряване на хранителната стойност на растения (биофарминг и функционални храни).

НИШИ*'''

Допълнителни примери могат да се намерят в Weising, supra.

Плазмидът, съдържащ хетероложната нуклеинова киселина, която трябва да бъде вкарана в растението, по-нататък съдържа обикновено или селективен маркер, или репортерен ген, или и двете, за да се улесни идентификацията и селекцията на трансформирани клетки. Алтернативно на това, селективният маркер може да бъде носен върху отделен вектор и да бъде използван в сътрансформационна процедура. Селективните маркери и репортерните гени могат да граничат с подходящи регулаторни последователности, което да позволява експресия в растения. Полезни селективни маркери са добре познати в тази област и включват, например, антибиотични гени и гени за устойчивост на хербициди. Специфични примери на подобни гени са описани в Weising et al., supra. Предпочитан селективен маркерен ген е sul генът, придаващ устойчивост на сулфонамиди (ЕР-В-0369637). Други селективни маркери, познати в тази област, включват хигромицин В фосфотрансфераза (hpt), кодиращ последователност, която може да бъде пренасяна от Е. coli, аминогликозид фосфотрансферазния ген на транспозон Tn5 (Aphll), който кодира устойчивост на антибиотиците канамицин, неомицин и G418, както и онези гени, които кодират устойчивост или толерантност към глифозат, биолафос, метотрексат, имидазолинони, сулфонилуреи, бромоксинил, далапон и други подобни. Селективни маркерни гени, които носят хербицидна толерантност имат и комерсиална стойност за получените трансформирани растения.

Репортерни гени, които кодират лесно анализируеми маркерни гени, са добре познати в областта. Като цяло репортерният ген е ген, който не присъства или не се експресира от реципиетния организъм или тъкан, и който кодира белтък, чиято експресия е манифестирана от някакво лесно откриваемо свойство, напр. Фенотипна промяна или ензимна активност. Примери за такива гени са дадени в Weising et al., supra. Предпочитани гени включват гена за хлорамфеникол ацетилтрансфераза (cat) гена от Тп9 на E.coli, гена на бета-глюкуроназа (gus) от локуса uidA на E.coli, гена на белтъка за зелени цветове (GFP) от Aequoria victoria и луциферазният (1ис) ген от светулката Photinus pyralis.

Използваните тук регулаторни последователности включват всеки конститутивен, индуцируем, тъканно или органно специфичен или специфичен за фазата на развитие промотор, който може да бъде експресиран в определената растителна клетка. Такива подходящи промотори са описани в Weising et al., supra. Следва частичен представителен списък на промотори, подходящи за използване: регулаторни последователности от Т-ДНК на А. tumefaciens, включващ манопин синтаза, нопалин синтаза и октопин синтаза; алкохол дехидрогеназен промотор от царевица; индуцируеми от светлина промотори, такива като гена на малката субединица на рибулозо-бифосфат-карбоксилаза от множество видове и промотора на гена на основния хлорофил а/б свързващ белтък; хистонови промотори (ЕР 507 698), актинови промотори (Christensen et al. (1996) Transgenic Res. 5:213); 35S и 19S промоторите на мозаечния вирус по цветното зеле; регулирани от развитието промотори като waxy, zein и bronze промоторите от царевица; както и синтетични или други естествени промотори, които или са индуцируеми или конститутивни, включително онези промотори, които показват органно специфична експресия или експресия в обособена фаза(фази) от развитието на растението, подобно на алфа-тубулиновия промотор, описан в US 5,635,618.

В нуклеиновата киселина могат да се съдържат и други елементи като интрони, усилители, полиаденилиращи последователности и други подобни. Тези гени трябва да бъдат съвместими с останалата част на гениите конструкции. Такива елементи може да са необходими, но може и да не са необходими за функционирането на гена, въпреки, че те могат да осигуряват подобра експресия или функциониране на гена чрез влияние върху транскрипцията, стабилността на иРНК или други подобни. Такива елементи могат да бъдат включени в нуклеиновата киселина, както е описано, за да се получи оптимално представяне на трансформиращия ген в растението. Например царевичният AdhlS първи интрон може да се намира между промотора и кодиращата последователност на дадена хетероложна нуклеинова киселина. Този интрон, когато е включен в генна конструкция, е известно, че като цяло повишава експресията на белтък в царевични клетки. (Callis et al. (1987) Genes Dev. 1:1183). Други подходящи интрони включват първия интрон на shrunken-) гена на царевицата (Maas et al., (1991) Plant Mol. Biol. 16:199); първия интрон на гена на фасулева каталаза (cat-1) (Ohta et al., (1990) Plant Cell Physiol. 31:805); втория интрон от ST-LSI гена на картофената каталаза (Vancanneyt et al., (1990) Mol. Gen. Genet. 220:245); DSV интрона на тютюневия вирус, предизвикващ жълто вджуджаване (Morris et al., (1992) Virology 187:633); актин-l (act-1) интрона от ориз (McElroy et al., (1990) Plant Cell 2:163) и триозофосфат изомеразния (ΤΡΙ) интрон 1 (Snowden et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:689). Ho достатъчна експресия на селективен маркер, често може да бъде постигната и без интрон (Battraw et al (1990) Plant Mol. Biol. 15:527).

Плазмидът, включващ хетероложната нуклеинова киселина, може да съдържа и последователности, кодиращи транзитен пептид, който да направлява кодирания от хетероложния ген белтък към хлоропластите на растителните клетки. Такива транзитни пептиди са добре познати на специалистите в тази област и могат да включват единични транзитни пептиди, както и множествени транзитни пептиди, получени чрез комбиниране на последователности, кодиращи най-малко два транзитни пептида. Един предпочитан транзитен пептид е Оптимизираният Транзитен Пептид, описан в US 5,635,618, включващ по посока на транскрипцията на първа ДНК последователност, кодираща първи хлоропластен транзитен пептид, втора ДНК последователност, кодираща N-терминален домен на зрял белтък, естествено насочен в хлоропластите и трета ДНК последователност, кодираща втори хлоропластен транзитен пептид.

Плазмидът може да съдържа репортерен ген, за да се определи дали особена комбинация на хетероложна нуклеинова киселина и реципиентни растителни клетки са подходящи за използване тук. След това може да се проведе анализ за експресия на репортерния ген в подходящо време, след като хетероложната нуклеинова киселина е била вкарана в реципиентните клетки. Предпочитан такъв анализ е завещаното използване на бета-глюкуроназния (gus) ген от E.coli, описан от Jefferson et al. (1987) EMBO J. 6:3901, включен като референция.

Използване на настоящото изобретение е получаването на фертилно трансгенно растение, което съдържа един или повече интересуващи гени. Семената или друг размножителен материал от такова растение може да бъде използван за получаване на последващи генерации трансгенни растения (включително потомство), които съдържат едния или повече трансгени от оригиналния метод. Такива последващи генерации растения

(включително потомство) и размножителния материал, включително семена, също са включени в обхвата на настоящото изобретение.

Втори аспект на изобретението се отнася до използването на Agrobacterium в трансформационен метод, включващ инокулиране и съвместно култивиране на целева тъкан с Agrobacterium, във време, когато целевата тъкан е в своето естествено растително обкръжение, последвани от генериране на дедиференцирана тъкан от целевата тъкан.

В дедиференцираната тъкан може по избор да бъде регенерирана до трансгенно растение. Но вторият аспект на изобретението е от предимство в ситуации, когато се използва дедиференцираната тъкан (самата тя или всяко нецяло растение, което е генерирано от нея). Такива ситуации включват: съхранение на дедиференцираната тъкан за определено време преди понататъшната употреба; и възстановяване на полезни растителни продукти, такива като вторични растителни метаболити, например, от клетъчна култура. Всички предпочитани черти на първия аспект на изобретението, както е описано по-горе, важат също и за втория.

Съгласно първия и втория аспект на изобретението получената трансформирана дедиференцирана тъкан може да бъде регенерирана. Тя може да бъде регенерирана, за да образува, например, калусна тъкан, цели растения, фертилни цели растения, корени, издънки, семена или друг размножителен материал.

Трети аспект на изобретението се отнася до използването на Agrobacterium в трансформационен метод, включващ инокулиране и съвместно култивиране на целева тъкан с Agrobacterium, във време, когато целевата тъкан е в своето естествено растително обкръжение, —‘-.'тим

последвано от генерирането на трансгенен растителен материал чрез дедиференциране и по избор регенериране на целевата тъкан.

Трансгенния растетителен материал, получен съгласно трети аспект на настоящото изобретение, може да бъде калус, цяло растение (по-специално плодовито растение), корени или филизи, семена или друг размножителен материал.

Всички предпочитани особености от аспекти 1 и 2 също така могат да бъдат приложени по отношение на третия аспект.

Четвърти аспект на изобретението осигурява трансформирана растителна тъкан, получена чрез метод съгласно първия или втория аспект на настоящото изобретение. Такава трансформирана растителна тъкан включва калус, материал на корен, материал на филиз, цели растения, семена или друг размножителен материал. По-специално растенията са плодовити растения.

Има няколко причини, поради които настоящото изобретение е успешно и, които обясняват защо целевите тъкани са по-податливи на трансформация чрез Agrobacterium в условията на естествената околна среда на растението. Без да се цели ограничаване на изобретението по никакъв начин, предложените причини защо настоящото изобретение е успешно са както следва:

1. В своята естествена растителна среда, целевите клетки се делят бързо, вероятно по-бързо отколкото в тъканни култури;

2. Избягването на пост-изолационно третиране (т.е. инокулиране и съвместно култивиране) увеличава потенциала за образуване на калуси и потенциала за регенериране;

3. Различни клетки от развиващите се целеви тъкани са експозирани на Agrobacterium (сравнени със съществуващото ниво на техниката), по-специално тези, които могат да бъдат

суб-епидермални и, за които се счита, че се регенерират в повисока степен;

4. Липсата на нараняване (предпоставка за повечето други протоколи за трансформации на зърнени култури) задържа способността за последващо развитие на почти всички клетки, които са били трансформирани;

5. Обединяването на двата етапа на инокулиране и съвместно култивиране намалява стреса, прилаган винаги върху целевите тъкани от тези два отделни етапа при тъканното култивиране;

6. Естествената околна среда на семената е по-благоприятна за нормално клетъчно развитие в присъствието на Agrobacterium, отколкото прехвърлянето в среда за тъканна култура;

7. Повърхностните клетки ще бъдат по-меки в целевата тъкан и осигуряват по-малка бариера за Agrobacterium отколкото след като веднаж са експозирани на въздуха.

Методът на трансформация от настоящото изобретение може да бъде описан съгласно следната “принципна” методология. По-подробно описание на метода е представено в примерите.

Следната принципна методология е описана съгласно прилагането й при инокулиране на ембриони (семена). Всеки с опит в съществуващото ниво на техниката ще оцени, че принципният метод може да бъде адаптиран към други целеви тъкани.

Получаване на конструкт и прехвърляне в Agrobacterium

Бинарни, супербинарни, pGreen и съвместно интегрирани вектори, съдържащи подходящи гени и селекционирани маркери и/или репортер гени са прехвърлени в Agrobacterium чрез един от различните налични методи, например три-родителско съединяване, електропорация. Използваният Agrobacterium може да бъде всеки стандартен щам, обикновено обезоръжен Agrobacterium tumefaciens или rhizogenes, включващ, без да се ограничава до, по-долу описаните:

LBA4404 (Hoekma et al., Nature (1983) 303:179-180)

EHA101 (Hood et al., J. bacteriol. (1986) 168:1291-1301) Обезоръжен C58, например pMP90 (Koncz & Schell, M.G.G. (1986) 204, 386-396), LBA4404 съдържащ pTOK233 (Hiei et al., Plant J. (1944)6:271-282).

Подготовка на Agrobacterium за експериментите

Agrobacterium е инкубиран в или върху среда с подходящи селективни антибиотици при температура 25 - 30°С за 2 до 3 дни. След това бактериите са събрани и ре-суспендирани в TSIM1 (MS среда със 100mg/l мио-инозитол, 10 g/Ι глюкоза, 50 mg/1 MES буфер, pH 5.5) или друга подобна хранителна среда, която може да съдържа ацетосирингон. Може също така да бъде включен омокрящ агент, например плуронова киселина F68 и могат да бъдат използвани по избор други индуциращи агенти за Agrobacterium, например опини или други вторични растителни метаболити.

Подготовка на растителния материал

Началният материал за този протокол са цветове на едносемеделно (обикновено житно) растение, на определен етап след протичането на атензис. Всички етапи на инокулирането и съвместното култивиране са проведени върху цветове, които са върху интактното растение. Обаче за улеснение и задържане, се предпочита отделяне на частите на растението, които носят цветовете. Въпреки това, цветовете остават в своята естествена за растението среда дори когато растителната част, която ги носи е отстранена от растението.

Например пшеничени филизи или такива от каквото и да е житно растение приблизително 8-16 дни след антезиса са събрани от растения, отгледани в инкубатор или Конвирон (помещение с контролирана околна среда). След това незрелите семена са експозирани, но оставени прикрепени към растението с помощта на каквото и да е необходимо средство. Например, при пшеницата, покривната люспа на всяко класовидно съцветие и лемата от първите две цветчета са внимателно отстранени, за да бъдат експозирани незрелите семена. Само тези две семена във всяко класовидно съцветие са по принцип непокрити. Тази процедура е проведена по цялата дължина на цвета.

Инокулиране на незрелите семена

Суспензия от Agrobacterium е инокулирана върху незрелите семена приблизително в позицията на щитовидната люспица: повърхността на ендосперма, използвайки подходящо устройство, например спринцовка Хамилтън. Обикновено обемът на нанесената бактериална суспензия е 1 μΐ, но може да варира например в зависимост от размера на семената.

Например след това филизите се поставят във вода или в хранителен разтвор (по избор покрити с полиетиленова торбичка за да се предотврати дехидратирането на семената) и поставени в светлинен инкубатор за 2 - 5 дни (по-специално 2 или 3 дни). Температурата на инкубатора може да варира в зависимост от вида на житното растение, но обикновено е в диапазона 20 - 25°С.

Изолиране на ембриони и култивиране

След инокулирането, незрелите семена са отстранени и повърхностно стерилизирани. Незрелите семена са изолирани и поставени в подходяща среда за образуване на калуси, както е показано от Weeks et al., Plant Physiol., 102:1077-1084, 1993; Vasil et al., Biotech. 11:1553-1558, 1993; Ishida et al., 1996. След това ембрионите са успешно прехвърлени, чрез която и да е процедура за тъканни култури, включително ако е необходимо и етап на селекция, която води до регенерирането на трансгенно растение, по-специално трансгенно растение.

Настоящото изобретение ще бъде сега описано по отношение на следните, неограничаващи го примери.

Към примерите следните фигури се отнасят до:

На Фигура 1 е показана стратегията на клониране за pSCVsulugi

На Фигура 2 е показана плазмидна карта на pSCVsulugi

На Фигура 3 е показана краткотрайна GUS експресия в незрял ембрион, хистохимично оцветен 4 дни след инокулацията с съвместното култивиране in vivo, показвайки сини петна и “чертички”.

На Фигура 4 е показана площта на GUS експресия на калуса, хистохимично оцветена един месец след in vivo инокулация и съвместно култивиране, показваща обширна тъмно синьо оцветена площ.

На фигура 5 е показан детайл от фигура 4: показващ тъмно синьо оцветена и силно очертана площ от калус с потенциал за регенериране.

На фигура 6 е показана плазмидна карта на pSB 11 Sulugi.

На фигура 7 е показана плазмидна карта на pSCVl .2GI.

На фигура 8 е показана преходна GUS експресия в соеви незрели семедели.

Пример 1. Трансформация на пшеница чрез метод за инокулиране на семена - преходна експресия и продукция на трансформирани калуси

Получаване на конструкт

За целите на трансформацията бяха получени следните конструкти (Фигура 1): Hindlll фрагмент 4175 базови двойки от рАНС 25 (Christensen et al., Plant Mol. Biol. (1992) 18:675-689) беше въведен в pIC19H (Marsh eta al., Gene (1984) 32:481-485), срязан c Hindlll (в резултат, на което е получен плазмид рААА). ВатШ, SstI GUS интронен фрагмент от pUC-ToplO-GUS INT (Weinmann et al., Plant J. (1994) 5:559-569) замества BamHI, SstI GUS фрагмент от рААА, при което се получава рВВВ. Xhol, Xbal фрагмент, съдържащ Sul^R от pWP258 (описан в патентна заявка WO98/49316) е въведен в pSCVl, срязан с Sall, Xbal (Firek et al., Plant Mol. Biol. (1993) 22:129-142), при което се получава рЕЕЕ. Hindlll pUbi-GUSint фрагмент от рВВВ е клониран в рЕЕЕ, срязан с Hindlll, при което се получава pSCVSulugi (виж Фигура 2).

Този конструкт е въведен в обезоръжен, супервирулентен щам Agrobacterium tumefaciens ЕНА101, съдържащ pEHAlOl (Hood et al., J Bacteriol. (1986) 168:1291-1301) чрез електропорация и последваща селекция върху среда с 50 mg/Ι канамицин и 70 mg/Ι гентамицин.

Получаване на Agrobacterium за експерименти

Agrobacterium беше инкубиран върху агаризирана YEP среда с 20 mg/Ι канамицин сулфат при температура 27°С за 2 дни. След това бактериите бяха събрани и ре-суспендирани в TSIM1 (MS среда със 100 mg/Ι мио-инозитол, 10 g/Ι глюкоза, 50 mg/1 MES буфер pH 5.5), съдържаща 400 μΜ ацетосирингон до оптическа плътност 2.4 при 650 nm.

Получаване на растителен материал

Пшеничени филизи от NB1 (пролетен вариетет пшеница получена от Nickerson Seeds Ltd., Rothwell, Lincs), приблизително 14 дни след антезиса (ембриони с дължина приблизително 1 mm) бяха събрани от отгледани в инкубатор растения с 50 cm стъбло на филиза (22/15°С температура ден / нощ, с осветяване, което да осигурява продължителност на деня 16 часа). След това всички листа бяха събрани освен лошия стрък и стръка беше почистен за да се отстранят контаминиращите гъбни спори. Покривните люспи на всеки клас и лемата на първите две цветчета бяха внимателно отстранени за да се покажат незрелите семена. Само тези две семена от всеки клас бяха по принцип непокрити. Тази процедура беше проведена по цялата дължина на цвета. След това класовете бяха напръскани със 70 % IMS за бърза повърхностна стерилизация.

Инокулиране на филизите

Суспензия Agrobacterium (1 μΐ) беше инокулирана в незрелите семена приблизително в позицията на щитовидната люспица: повърхността на ендосперма, използвайки 10 μΐ спинцовка Хамилтън, така че да бъдат инокулирани всички експозирани семена. След това филизите бяха поставени във вода, покрити с полупрозрачна полиетиленова торбичка, за да се предотврати дехидратацията на семената и поставени в инкубатор с осветяване за 3 дни при температура 23°С, 16 часов ден, 45 pEm’V’PAR.

Изолиране на ембриони и култивиране

След три дни съвместно култивиране, инокулираните незрели семена бяха отстранени и повърхностно стерилизирани (30 секунди в 70 % етанол, след това 20 минути в Domestos, последвано от пълно промиване в стерилна дестилирана вода). Незрелите ембриони (общо 136) бяха асептично изолирани и поставени върху W3 среда (както е описано в патентна заявка WO98/49316) с добавка на 150 mg/Ι тиментин (W3T) и с преобладаващи щитовидни люспици (20 ембриона на петри). Културите бяха поставени при температура 25°С на светлина (16 часов ден, 80 pEm^s^PAR).

След три дни, култивиране върху W3T, ембрионите бяха отстранени и бяха поставени в разтвор на Х-глюкоза (Jefferson, Plant Mol. Biol. rep. (1987) 5:386-405) при температура 37°C за 16 часа, за да се постигне GUS експресия. Развитието на ембионалните стъбла върху оставащите ембриони беше оценено 5 дни след изолирането и стеблата бяха отстранени, където е необходимо за да се подобри продукцията на калуси. Осем дни след изолирането, още 31 ембриона бяха отстранени и оцветени както беше описано по-горе.

Оставащите 55 ембриона бяха поддържани на W3T за 4 седмици с прехвърляне върхо свежа хранителна среда на втората седмица след изолирането.

Един месец след като бяха изолирани ембрионите, оставащите произлезли от ембриони калуси бяха оценени за ембриогенния им капацитет и оцветени за GUS експресия.

Резултати

Хистохимично оцветяване 4 дни след инокулирането

Някои изолирани ембриони показват данни за нараняване от иглата като резултат от процедурата на инокулиране. Това беше много рядко свързано с хистохимично определената GUS експресия.

GUS експресията в тези ембриони се проявява в три форми:

1. Стандартни сини GUS петна както е показано в съществуващото ниво на техниката, виж Фиг. 3

2. Малки сини чертички, включващи няколко свързани клетки, всички видимо експресиращи GUS в една и съща степен, виж Фигура 3

3. Обширни блокове от тъмно синьо оцветяване на щитовидната люспица и ембрионалното стъбло, което започва развитието си като точки и чертички и бързо обхваща големи площи от тъкан, така че количественото определяне не беше възможно.

Комбинирането на резултатите от 1 и 2 показа средно 6 точки на ембрион с обхват 0-64 точки.

Контролните ембриони (30), произтичащи от инокулации с ЕНА101, носещи само рЕНА 101 и без векторен плазмиден щам не дадоха какъвто и да е вид синьо оцветяване с Х-глюкоза. Освен това не беше наблюдавано оцветяване на ЕНА101, съдържаща SCVsulugi.

Хистохимично оцветяване 14 дни след инокулирането

Профилът на оцветяване в тези ембриони беше малко поразличен от този наблюдаван на 4 ден. Оцветяването обикновено беше под формата на малки петна или понякога като малки зони. Средния брой петна / зони за ембрион беше 3 с диапазон 0-25. Ембрионът с максимален брой оцветявания също така притежаваше повече от по рядко наблюдаваните сини “зони” върху тъканта на щитовидната люспица.

Развитие на калусите

След 4 седмичен растеж, калусите получени от инокулираните ембриони бяха подобни на контролните калуси, получени от неинокулирани ембриони. Присъствието на бактериите очевидно не води до забележимо намаляване на ембриогенния капацитет на калусите, произлезли от инокулираните ембриони.

Хистохимично оцветяване един месец след инокулирането

От оставащите 55 незрели, произлезли от ембриони, калуси, които бяха оцветени с Х-глюкоза, 16 показаха доказателства за GUS експресия под формата на тъмно синьо оцветени клетки. В 6 от тези калуси, бяха наблюдавани доста големи тъмно сини региони от оцветяване до 1 mm диаметър и явявящи се като силно очертани области, виж Фигура 4. Три от сините региони показаха тримерна структура под формата на клетъчни издатини от повърхността на калуса (както е показано на фигура 5) и бяха оценени като ембриогенни калуси с добър потенциал за регенериране.

Възстановяването на три стабилни интеграционни събития с добър регенериращ потенциал от този експеримент предполага, че този метод притежава висока трансформираща ефикасност.

Пример 2. Трансформация на пшеница, използвайки метода на инокулиране на семена - трансформация и регенерация на трансгенни растения

Процедурата е проведена както в Пример 1, с изключение на това, че бяха инокулирани и изолирани 187 ембриона и те бяха подложени на етап на селекция.

Селекция на трансформирани калуси

След 12 дневно култивиране на W3T, ембриогенните калуси бяха прехвърлени на W3 среда с 2mg/l Асилам и 150 mg/1 Тиментин (W32AT). Калусите бяха поддържани на тази среда за допълнителни 2 седмици и след това всеки калус беше разделен на парченца от 2 mm и те бяха повторно инокулирани върху W32AT.

След допълнително култивиране от 2 седмици, всички тъкани бяха оценени за развитието на ембриогенни калуси: всеки калус показващ белези на продължаващо развитие след 4 седмично селекциониране беше прехвърлен на регенерираща среда (RMT - MS с 40 g/Ι малтоза и 150 mg/1 Тиментин, pH 5.8, агаризирана с 6 g/Ι агароза, Sigma, тип I). Филизите бяха регенерирани за 4 седмици на тази среда и след това прехвърлени на MS30 със 150 mg/1 Тиментин за удължаване на покълняците и образуване на корени.

Резултати

Трансформацията беше определена по един или няколко от следните методи:

а) GUS хистохимично оцветяване (Jefferson, 1987) поне на корени и листа

б) PCR анализ за sul ген

PCR анализът беше проведен на геномна ДНК, екстрахирана от 1 - 2 cm² свеж растителен материал, използвайки минипреп метода описан от Stacey & Isaac (Methods in Molecular Biology, Vol. 28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes, 9-15, Humana Press Inc. Totawa, NJ (1994)). PCR реакцията беше проведена, използвайки праймери, конструирани за амплификацията на Sul фрагмента от 380 базови двойки (5’TTGTGCGGTTCTTCGAGGCG 3’ и 5’TGCGCTTCGCAGATCTCCAG 3’). Условията на реакцията бяха следните - “горещ старт” (94°С, 3min), последвано от 30 цикъла на денатуриране (95°С, 30 s), анелиране (60°С, 30 s), продължаване (73°С, 2 min) последвано от 1 цикъл при 73°С (5 min) и след това задържане при © 24°С.

в) Southern анализ

Southern анализът беше проведен върху ДНК от пълна (9 ml) екстракция на лиофилизирана основна тъкан (Stacey & Isaac, 1994). ДНК пробите бяха разредени до концентрация 0.2 mg/ml и подложени на рестрикционно смиланес ензимите Hindlll, EcoRI и KpnI. Смилането с рестрикционните ензими, гел електрофорезата и вакуум-блотинга бяха проведени както е описано от Stacey & Isaac (1994). Белязана с дигоксигенин Sul и GUS сонди бяха получени с PCR, съгласно метода на McCreery & Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Vol. 28: Protocols for nucleic acid analysis by nonradioactive probes, 67-71, Humana Ф Press Inc. Totawa, NJ (1994)). Хибридизирането на сондите към Southern блотовете и детекцията чрез хемилуминисценция беше проведено съгласно метода на McCreery & Helentjaris (Methods in Molecular Biology, Vol. 28: Protocols for nucleic acid analysis by non-radioactive probes, 107-112, Humana Press Inc. Totawa, NJ (1994)).

г) анализ за разделяне та Т1 поколение

Анализът беше проведен чрез хистохимично оцветяване на прорастващи семена.

Бяха регенерирани 2 растения представляващи две отделни трансформационни събития (1.1 % ефективност), пробите от корени и листа показаха силна GUS експресия чрез хистохимично оцветяване. Стабилна трансформация беше доказана чрез Southern анализа и оценка на генното разделяне в потомството.

В отделен експеримент, 116 ембриона бяха инокулирани и бяха регенерирани 4 отделни GUS положителни трансгенни линии.

Получената ефективност (1.1 и 3.4 %) е съизмерима с данните, получени за други комбинации от вектори и бактериални щамове (виж Пример 5).

Пример 3. Трансформация на царевица с метод на инокулиране на семена - преходна експресия, продукция на трансгенни калуси и регенериране на трансформираните растения

Получаване на конструкт

Съгласно описанието в Пример 1.

Получаване на Agrobacterium за експериментите

Agrobacterium беше инкубиран на агаризирана YEP среда с подходящи антибиотици при температура 27°С за 2 дни. След това бактериите бяха събрани, и ре-суспендирани в TSIM1 среда (MS среда със 100 mg/Ι мио-инозитол, 10 g/Ι глюкоза, 50 mg/1 MES буфер, pH 5.5), съдържаща 100 - 400 μΜ ацетосирингон до плътност на културата 2.0 2.4 при 650 ши.

Получаване на растителен материал

Части от царевични растения, вариетет А188 (отгледани в инкубатор при 20 - 35°С, 16 часа продължителност на деня) бяха изрязани така, че да включват поне раклонение на стъблото над класа/царевичен кочан, 6-14 ден след антезиса и с поне едно запазено листо. Обвивката на царевичния кочан беше внимателно издърпана надолу, за да се покажат незрелите семена и цялата коса беше отстранена.

С остър секач, всеки втори надлъжен ред от незрели семена беше внимателно отстранен и изхвърлен и цялата останала част беше леко напръскана със 70 % етанол.

Инокулиране на царевичните класове

Инокулирането беше проведено съгласно описанието в Пример 1. Растителните части бяха последователно поставени във вода и обвиващите листа бяха внимателно поставени върху кочана за да се предотврати дехидратиране на семената - също така се препоръчва покриването с полиетиленова торбичка. След това материалът беше поставен в инкубатор с осветяване при температура 23 - 25°С за 2 - 5 дни.

Изолиране на ембриони и култивиране

Процедурите са проведени съгласно описанието на Ishida et al., 1997. Ембрионите са отстранени два дни след изолирането за анализ на преходната експресия и останалите бяха подложени на етап на селекция, за да бъдат регенерирани стабилно трансформираните царевични растения.

Пример 4. Преходна експресия на незрели пшеничени ембриони след инокулиране на семена в отсътвието на индуктор ацетосирингон

Получаване на конструкт

Процедурата е проведена съгласно описанието в Пример 1.

Получаване на Agrobacterium за експериментите

Процедурата е проведена съгласно описанието в Пример 1, с изключение на това, че ацетосирингона беше изключен от средата за инокулация и беше използвана по-ниска концентрация на Agrobacterium (OD 2.1 при 650 nm).

Получаване на растителен материал

Инокулиране на филизи

Изолиране на ембриони и инокулиране

Изолирането е проведено съгласно описанието в Пример 1. След 2 дни на W3T среда, 77 ембриона бяха оценени за GUS експресия чрез хистохимичния анализ с Х-глюкоза.

Резултати

На горната и долна повърхности на щитовидната люспица, бяха наблюдавани сини петна / чертички, и в много случаи петната бяха инкорпорирани в структурата на щитовидната люспица, т.е. бяха между горния и долния епидермис. При някои ембриони нямаше данни за GUS експресия. Средния брой петна за ембрион беше 25.4 с диапазон 0 - 252.

Други методи

Трябва да се разбере, че докато изобретението беше описано, свързано с подробното описание, гореспоменатото описание на примерите е предназначено да илюстрира, а не да ограничи обхвата на изобретението. Други аспекти, преимущества и модификации са в рамките на обхвата на претенциите, които са представени по-долу.

Пример 5. Стабилна трансформация на пшеница чрез метода на инокулиране на семена

Получаване на конструкт и въвеждане на щам Agrobacterium LBA4404

Xhol, Xbal фрагмент, съдържащ SulR от pWP258 (виж Пример 1) е въведен в pSBl 1, срязан с Xhol и Xbal (Komari et al., Plant J. (1996)

10:165-174), при което се получава pFFFII. Hindlll pUbi-GUSint фрагмента от рВВВ (виж Пример 1) е клониран в pFFFII, срязан с Hindlll, при което се получава pSBl ISulugi (виж Фигура 6).

Конструктът беше внедрен в Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSBl) (Komari et al., 1996) чрез електропорация и последваща селекция с 50 mg/Ι спектиномицин за образуване на супер бинарния вектор pSBl 1 ISulugi чрез рекомбинация. Подготовка на бактериите за инокулиране.

Agrobacterium беше култивиран и ресуспендиран, прилагайки метода от пример 1, но с различни количества от ацетосирингон (0400 μΜ) в инокулационната среда.

Инокулиране на семената

Метод, съгласно пример 1, експериментите включваха 50-300 ембрии, виж Таблица 1.

Тъканни култури от изолирани ембрии

Виж пример 2.

Резултати

Виж Таблица 1.

Данните в Таблица 1 представят успешните експерименти няколкото неуспешни експерименти, които не доведоха до получаване на растения, бяха изключени. Трансформацията беше определена по един или повече от следните методи:

а) хистохимично оцветяване на GUS (Jefferson, 1987) поне на корените и листата

б) PCR анализ на гена sul

в) Southern анализ

г) Анализ на разпадането в поколението Т1.

Трансформационна ефективност

Трансформационната ефективност на успешните експерименти варираше между 0.5 и 5.8 % със средна стойност от 1.5 %. Трансформираните растения бяха регенерирани както от експериментите, инициирани с индуктор ацетосирингон в инокулационната среда, така и от тези без индуктор.

Предаването на гена GUS в Т1 поколението беше потвърдено за няколко линии, виж Таблица 1.

Постигнатата трансформационна ефективност беше сравнима с или по-висока от публикуваните трансформационни честоти за пшеница (Vasil et al., Bio/Technology (1992), 10: 667-674, Weeks et al., Plant Physiol. (1993), 102: 1077-1084, Nehra et al., Plant J. (1994), 5: 285-297, Becker et al., Plant J. (1994), 5: 299-307, Zhou et al., Plant Cell Rep. (1995), 15: 159-163, Cheng et al., (1997)).

Модели на интегриране

Моделите на генно интегриране в трансформираните линии варираха от единично внедряване с Менделов модел на у наследяване до множествен брой линии с до седем копия от ТДНК.

Пример 6 Трансформация на царевица чрез метода на инокулиране на семена - кратковременна експресия и регенерация на трансформираните растения.

Изготвяне на конструкта

Както при пример 1.

Или LBA 4404 (pSB 131), описан от Ishida et al., 1997 Подготовка на Agrobacterium за експериментите

Agrobacterium беше инкубиран върху твърда YEP среда с подходящи антибитици при 27°С за 2 дни. След това бактериите бяха събрани и ресуспендирани в TSIM1 (среда MS със 100 mg/1 мио-инозитол, 10 g/Ι глюкоза, 50 mg/1 буфер MES, pH 5.5), съдържаща 100 - 400 μΜ ацетосирингон с 0 - 0.5 % плуронова киселина F68 до клетъчна плътност от 2.0 - 2.4 при 650 nm. Подготовка на растителния материал

Срези от царевични растения (Zea mays L.), сорт Al88 или Hi II, (отгледан в оранжерийни условия при 20-35°С, 16 h ден) бяха изготвени така, че да включват най-малко стъблените възли под и над кочана, 6-14 дни след образуването на метлици и поне с един запазен лист. Пазвените листа на кочана бяха внимателно отстранени, за да се стигне да незрелия зародиш, и цялата свила премахната. Кочанът беше леко напръскан със 70 % етанол за стерилизация.

Инокулиране на царевичните кочани

Инокулацията бе проведена, както в пример 1. Растителните срези бяха последователно поставени във вода и отстранените пазвени листа бяха заместени с покриващ филм, за да се предпазят семената от изсъхване. След това материалът беше поставен в осветен инкубатор при 22-25°С за 2 - 5 дни.

Изолиране и култивиране на ембриите

След съвместното култивиране кочанът беше стерилизиран за 20 минути с 20% разтвор на Доместос. След това ембриите бяха изолирани в стерилни условия, промити двукратно с LSinf (Ishida et al., 1997), който съдържаше 250 mg/1 цефотаксим и прехвърлени в среда LSD (Ishida et al., 1997) за 2 - 10 дни на тъмно при 25°С, за образуване на калуси.

Ембриите бяха отстранени 2 дни след изолирането за кратковременен експресионен анализ и останалите бяха подложени на селекционна процедура с цел да се регенерират устойчиво трансформирани царевични растения, както е описано от Ishida et al., 1997.

Резултати

Както е показано в Таблица 2, инокулирането на незрели зародиши от семена на царевица доведе до пренос на Т-ДНК и експресия на гена GUS във всичките използвани щамове и в двата сорта. Въпреки че само 3-10 % от незрелите зародиши експресираха гена GUS след съвместното култивиране, бяха регенерирани растения, устойчиви на фосфинотрицин и експресиращи гена GUS. Трансформационната честота можеше да се приеме като относително висока, имайки предвид, че броят на зародишите заложен за селекция на стабилни трансформанти, беше нисък. Тя показва също така, че дори при по-ниския пренос на Т-ДНК при традиционно пълна in vitro система (Ishida et al., 1997), инокулацията на зародиша в неговата естествена среда - семето - е насочена към клетки, които имат по-добър потенциал за регенерация.

Тези резултати показват също така, че този метод е приложим и за други едносемеделни видове и не е зависим от сорта, по отношение на трансформационния етап.

Пример 7 Продукция на трансгенни растения Brassica napus чрез инокулиране на Agrobacterium в основата на котиледонните петиоли.

Изготвяне на конструкта

Фрагментът P35S-nptII-tNOS Hind III, изолиран от pCaMVNEO (Fromm et al., Nature (1996), 319: 791-793), беше внедрен в pSCVl (Firek et al., Plant Mol. Biol. (1993) 22:129-142), за да се получи pSCVl.2. Фрагментът p35S-gus-intron-polyACaMVHind III (Vancanneyet et al., M.G.G. (1990), 220: 245-250) беше внедрен в мястото за срязване Sma I на pSCV1.2, което доведе до получаване на pSCV1.2GI (Фигура 7)

Този конструкт беше внедрен в Agrobacterium tumefaciens, щам С58рМР90 (Koncz and Schell, 1986).

Подготовка на семената

Семена от Brassica napus RV31, пролетен сорт, бяха стерилизирани повърхностно с помощта на 15 % разтвор на Доместос за 20 минути, последвано от интензивно миене със стерилна вода за отстраняване на гъбните и бактериални патогени. Семената (110) бяха поставени след това в среда за прорастване (MS среда с 20 g/Ι захароза) в стъкленици на Beatson (10 семена за стъкленица) и инкубирани при 25°С с 16 ч фотопериод за 3 дни. Така прорастналите семена са на стадий, при който котиледоните и свързаните с тях петиоли, са възникнали, но все още не са напълно развити.

Подготовка на Agrobacterium

С58рМР90 SCV1.2GI беше инокулиран в 10 ml от среда mg/1 с подходяща антибиотикова селекция и култивиран при 28°С на ротационна клатачка за приблизително 24 часа. Така получената култура беше центрофугирана при 2000 rpm за 20 минути и супернатантата - отстранена. Утаените бактерии бяха ресуспендирани в MS30 течна (среда MS съдържаща 30 g/Ι захароза) до OD₆₅onm от около 2.0 (2.175).

Инокулиране на Agrobacterium

Бактериалната суспензия (0.5 - 1.0 μΐ) беше инжектирана в областта в основата на всяка котиледонна петиола с помощта на 10μ1 спринцовка Хамилтон. След това семената бяха прехвърляни на 20°С за 2 дни.

Образуване на калус и регенериране на растения

Котиледоните бяха изрязани от семената и култивирани точно както при метода на Moloney et al., Plant cell Reports (1989) 8: 238242. Повърхността на изрязаните котиледонни петиоли на Brassica napus, отглеждани по този начин преминаха през кратък период на развитие на калус, от оголени тъкани с проводящи снопчета до стъблени меристеми, образувани в този калус, за 8 дни на култивиране (Ono et al., Plant Cell Reports (1994) 14: 13-17). Резултати

Бяха регенерирани 6 трансформирани стъбла от 200 изрязани котиледонни петиоли, както бе определено чрез x-gluc оцветяването за гена GUS и PCR анализа на гена Nptll, което е равно на 3.0 % трансформационна ефективност. Допълнително, чрез PCR беше доказано, че още една линия съдържа ген, но не проявява GUS активност чрез оцветяване с x-gluc. Анализът на Т1 поколението на 5 от експресиращите GUS трансформирани линии чрез оцветяване с x-gluc показа предаване на гена GUS в следващото поколение при следните резултати:

Т1 растения, изследвани за GUS активност

Линия Положителни Отрицателни Съотношение

1	10	10	1:1
2	9	0	9:0
3	21	0	21:0
4	19	0	19:0
5	14	1	14:1

Обсъждане

Инокулирането на Agrobacterium в основата на котиледонните петиоли докато те са все още прикрепени към семената, представлява забележително разграничаване от публикуваните трансформационни системи, където първо се изрязват петиолите и после се прилага Agrobacterium. Въпреки че физически това е трудно осъществимо, този метод доказа, че е забележимо ефективен с малко практика. Само с няколко години опит, използвайки стандартния публикуван метод и същия сорт Brassica napus, може да се достигне рутинна трансфомационна ефективност от 5-10 %. Да се получат 3 % при втория опит (първоначалният експеримент имаше като резултат 1 трансформирано стъбло от 80 експланта - 1.25 %) е направо изненадващо. Това допълнително показва приложимостта на този метод за пренос на гени към всеки вид, при едносемеделни или двусемеделни, при които съществува система от тъканна култура с калусна фаза.

Пример 8: Трансформация на соя чрез метода на инокулиране на семена - кратковременна експресия

Изготвяне на конструкта

Agrobacterium tumefaciens, щам LBA 4404 беше трансформиран със супербинарния вектор pVec 035, съдържащ гена с интрон GUS, под контрола на промотора CaMV 35S (Предоставен от В. Pelissier, Aventis Crop Science, Lyon, Fr).

Подготовка на Agrobacterium за експериментите

Agrobacterium беше инкубиран върху твърда YEP среда с подходящи антибитици при 27°С за 2 дни. След това бактериите бяха събрани и ресуспендирани в TSIM1 (среда MS със 100 mg/1 мио-инозитол, 10 g/Ι глюкоза, 50 mg/Ι буфер MES, pH 5.5), съдържаща Ο - 400 μΜ ацетосирингон до плътност от 0.5 - 2.0 при 650 nm.

Подготовка на растителния материал

Соевите растения Clycine max сорт Jack бяха отгледани в оранжерийни условия при температура 23-25°С, с допълнително осветление до постигането на 14 часов ден.

Инокулиране на соевите семена

Незрелите семена бяха инокулирани, когато зародишите бяха 3-7 mm по размер. Беше проведено инжектиране на 0.5 - Ιμΐ от суспензията с Agrobacterium, както е описано в пример 1, чрез пренасянето на суспензията в позиция между двата котиледона, през шушулката, надлъжно на зародиша. Растенията бяха инкубирани при 23-25°С за 2 - 5 дни.

Изолиране и култивиране на ембриите

След съвместното култивиране незрелите семена бяха отстранени и стерилизирани за 20 минути с 20% разтвор на Доместос. След това ембриите бяха изолирани в стерилни условия, прехвърлени в среда за образуване на калус MSI (среда MS и витамини В 5 с 60 g/Ι захароза и 40 mg/Ι 1,2-Д, втвърдена с 3 g/1 О Phytagel, с коригирано pH на 7), която съдържаше 350 mg/1 цефотаксим, на светло при 27°С. След 2-10 дни зародишите бяха използвани за хистохимично оцветяване на GUS, за оценка на ефективността на Т-ДНК преноса.

Резултати

Както е показано в Таблица 3, инокулирането на незрелите соеви зародиши в семената и шушулките доведе до пренос на ТДНК и експресия на гена GUS. GUS-положителните петна или области бяха широко разпространени върху незрелите зародиши и не задължително се свързваха с наранените места (Фигура 8). За разлика от трансформацията на соя по SAAT котиледоновия метод (Santarem et al., Plant cell report (1998), 17: 752-759), тази техника осигурява по -лесен трансформационен протокол и по-висок регенерационен потенциал, тъй като клетките мишени не са наранени.

Пример 9: Трансформация на слънчоглед чрез метода на инокулиране на семена - кратковременна експресия

Изготвяне на конструкта

C58Cl(pGV2260) (Simpson et al., Plant Mol. Biol. (1986), 6: 403416) (pBinl9) (Bevan, Nuc. Acids Res. (1984), 12: 8711-8121)

C58pMP90 (pSCV1.2GI)(BH)K пример 7)

Подготовка на Agrobacterium за експериментите

Agrobacterium беше инкубиран върху твърда YEP среда с подходящи антибитици при 27°С за 2 дни. След това бактериите бяха събрани и ресуспендирани в TSIM1 (среда MS със 100 mg/1 мио-инозитол, 10 g/Ι глюкоза, 50 mg/Ι буфер MES, pH 5.5), съдържаща 0 - 400 μΜ ацетосирингон до плътност от 2.0 - 2.4 при 650 nm.

Подготовка на растителния материал

Слънчогледовите растения Helianthus annuus сорт НА300В бяха отгледани в оранжерийни условия при температура 15-30°С, с допълнително осветление до осигуряване на 14 часов ден. Инокулиране на слънчогледовите семена

Незрелите семена бяха инокулирани 10 до 20 дни след узряване на прашниците. Инжектирането на 1 μΐ от суспензията с Agrobacterium беше проведено както е описано в пример 1, през микропила, за да се пренесе суспензията между двата котиледона.

След това главичката на слънчогледа беше инкубирана при 22-25°С за 2 - 5 дни.

Изолиране и култивиране на ембриите

След съвместното култивиране незрелите семена бяха отстранени и стерилизирани за 20 минути с 20% разтвор на Доместос. След това ембриите бяха изолирани в стерилни условия, прехвърлени в среда за образуване на калус (MS с 30 g/Ι захароза, втвърдена с 10 g/Ι агар-агар, pH на 5.7, която съдържаше 0.5 mg/1 NAA, 0.5 g/Ι ВАР и 500 mg/1 цефотаксим) и култивирани 21-24°С, 16 часа на ден, 30 pEm’ s’ PAR. След 2-10 дни зародишите бяха използвани за хистохимично оцветяване на GUS, за оценка на ефективността на Т-ДНК преноса.

Резултати

Както е показано в Таблица 4, инокулирането на незрелите слънчогледови зародиши в семената, доведе до пренос на Т-ДНК и експресия на гена GUS при всеки използван щам (5.9 % - 65.4 %). GUS-положителните петна бяха локализирани главно върху котиледоните, но трансформационните събития бяха локализирани също така и върху хипокотила. Само два експеримента бяха оставени за оценка на потенциала на метода на семенна иконулация да трансформира слънчогледови незрели зародиши. Изненадващо беше доказано, че той е много ефективен, дори да изглежда че развитието на незрелия зародиш е критичен параметър.

Claims

1. Метод за трансформация, характеризиращ се с това, че включва инокулиране и съвместно култивиране на целева тъкан от целево растение с Agrobacterium по време, когато целевата тъкан е в своята естествена растителна околна среда, последвана от генериране на трансгенно растение чрез дедиференциация и регенерация на целевата тъкан.

2. Метод на трансформация, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че трансгенното растение е фертилно растение.

3. Метод за трансформация, характеризиращ се с това, че включва инокулиране и съвместно култивиране на целева тъкан от целево растение с Agrobacterium по време, когато целевата тъкан е в своята естествена растителна околна среда, последвана от генериране на дедиференцирана тъкан от целевата тъкан.

4. Метод на трансформация, съгласно претенции 1 до 3, характеризиращ се с това, че нараняването на целевите клетки в целевата тъкан се свежда до минимум или напълно се изключва.

5. Метод на трансформация, съгласно претенции 1 до 4, характеризиращ се с това, че поне част от дедиференциацията на целевата тъкан се провежда in vitro.

6. Метод на трансформация, съгласно претенции 1 до 5, характеризиращ се с това, че целевото растение е двусемеделен или едносемеделен вид.

7. Метод на трансформация, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че целевото растение е от семейство Gramineae (Житни).

8. Метод на трансформация, съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че целевото растение е рапица, пипер, соя, слънчоглед, захарно цвекло или тиква.

9. Метод на трансформация, съгласно всяка една от претенции 1 до 8, характеризиращ се с това, че целевата тъкан е зародиш, цвят, яйчник, листна основа или антера.

10. Метод на трансформация, съгласно всяка една от претенции 1 до 7, характеризиращ се с това, че целевата тъкан е незрял зародиш, незрял цвят, незрял яйчник, или незряла антера.

11. Метод на трансформация, съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че целевата област за инокулиране е пространството между два слоя клетки, които са в здрав контакт.

12. Метод на трансформация, съгласно всяка една от претенции 1 до 11, характеризиращ се с това, че не се добавя агент, предизвикващ Agrobacterium vir по време на инокулирането с Agrobacterium.

13. Метод на трансформация, съгласно всяка една от претенции 1 до 12, характеризиращ се с това, че не се добавя агент, предизвикващ Agrobacterium vir по време на съвместното култивиране с Agrobacterium.

14. Употреба на Agrobacterium в метод за трансформация, характеризиращ се с това, че включва инокулиране и съвместно култивиране на целева тъкан от целево растение с Agrobacterium по време, когато целевата тъкан е в своята естествена растителна околна среда, последвана от образуване на трансгенен растителен материал чрез дедиференциация на целевата тъкан.

15. Употреба на Agrobacterium, съгласно претенция 14, характеризираща се с това, че трансгенният растителен материал е дедиференциран и по избор регенериран, за да формира калус, коренов, стъблен или растителен (за предпочитане фертилен) материал.

16. Трансформирана растителна тъкан, получена чрез метод, съгласно всяка една от претенции 1 до 13.

17. Трансформирана растителна тъкан, съгласно претенция 16, която е калусен, коренов, стъблен растителен материал или цяло растение (за предпочитане фертилно).

18. Трансформирана растителна тъкан, получена от растителна тъкан, съгласно претенция 16 или 17.

19. Трансформирана растителна тъкан, съгласно претенция 18, която е семенен или друг размножителен материал.