CN106755083B - 一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法 - Google Patents

一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106755083B
CN106755083B CN201611200220.4A CN201611200220A CN106755083B CN 106755083 B CN106755083 B CN 106755083B CN 201611200220 A CN201611200220 A CN 201611200220A CN 106755083 B CN106755083 B CN 106755083B
Authority
CN
China
Prior art keywords
agrobacterium
injection
culture medium
protocorm
ovary
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611200220.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106755083A (zh
Inventor
曾宋君
张建霞
莫远琪
张雪莲
郑枫
吴坤林
张新华
马国华
段俊
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
South China Botanical Garden of CAS
Original Assignee
South China Botanical Garden of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by South China Botanical Garden of CAS filed Critical South China Botanical Garden of CAS
Priority to CN201611200220.4A priority Critical patent/CN106755083B/zh
Publication of CN106755083A publication Critical patent/CN106755083A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106755083B publication Critical patent/CN106755083B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8209—Selection, visualisation of transformants, reporter constructs, e.g. antibiotic resistance markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]

Abstract

本发明公开了一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法。它是将含有携带目的基因的植物表达载体的农杆菌注射到兜兰授粉后的子房内，然后将发育成的种子作为外植体进行无菌播种，经原球茎的诱导、抗性原球茎的筛选及分子检测获得转基因兜兰植株。本发明的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法具有操作简单、结果率高和转化率高的优点，有利于兜兰的分子育种及加速兜兰的育种进程。

Description

一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法
技术领域：
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法。
背景技术：
兜兰(Paphiopedilum)由于其独特的花朵造型、绚丽的花朵色彩、持久的观赏花期而具有极高的观赏价值，是国际花卉市场上十分流行的高档花卉。但由于人们对兜兰的过度采挖和生境的破坏，兜兰已成为世界上最濒危的植物物种之一，所有野生种类均被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》(CITES)附录I而被禁止贸易。通过各种育种方法能选育出在国际市场上自由交易、观赏价值高的兰花新品种来满足市场需要。兰科植物的转基因的方法有农杆菌介导法和基因枪法等，主要种类包括石斛兰、蝴蝶兰、文心兰和兰属植物等，但农杆菌介导法和基因枪法等均需建立在有效的再生体系的基础上。然而，兜兰属植物的再生体系难以建立，国内外还没有兜兰农杆菌介导法和基因枪法转基因方法的报道，利用农杆菌介导和花粉管通道法相结合的农杆菌子房注射法能有效地解决这个问题。
兰科植物种子数量巨大，一般一个果荚中种子量在数万至数十万个以上，应用农杆菌子房注射法进行活体遗传转化时，即使转化效率较低，也能获得较多的转化植株。但兰科植物从授粉到受精过程一般需要几十天，而在受精前的短暂时期，由于生殖细胞或者受精卵没有细胞壁或者细胞壁比较薄弱，处于较为敏感的感受态，较容易被转化，因此选择合适的注射时间是农杆菌子房注射法转基因成功的关键。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法。
本发明的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)农杆菌注射液制备：将对数生长期的含有携带目的基因的植物表达载体的农杆菌接种到含有150～250mg/L乙酰丁香酮的AAM培养基中培养，得到农杆菌注射液；所述的植物表达载体携带有抗性基因；
2)农杆菌子房注射：对兜兰进行人工授粉，选择授粉后30～53天的子房进行表面消毒，然后沿子房纵向垂直将农杆菌注射液注射到子房内部，注射量为15～25μL，注射后对注射部位进行密封；
3)抗性植株筛选和检测：摘取授粉后150～180天的注射有农杆菌注射液的蒴果进行无菌播种，将蒴果进行消毒处理，无菌条件下剖开蒴果，取出种子并进行消毒，然后将种子悬浮于无菌水中制成种子悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含有与植物表达载体携带的抗性基因相对应的抗生素的改良H26号培养基上进行连续筛选，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，获得抗性原球茎，将抗性原球茎转接到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养至形成小苗，经分子检测获得转基因兜兰植株；
所述的改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号1～2g、蔗糖10～20g、蛋白胨1～3g、琼脂5～6g、活性炭1～2g、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸0.5～1mg和椰子汁50～100mL，余量为水。
所述的抗性基因优选为潮霉素抗性基因。
所述的植物表达载体优选为质粒pCAMBIA1301。
所述的兜兰优选为摩帝兜兰。
所述的目的基因优选为建兰CeFT基因。
所述的将蒴果进行消毒处理具体为将蒴果用体积分数75％的酒精浸泡1～2分钟，再用质量分数0.1％～0.2％的升汞溶液浸泡消毒10～20min，无菌水冲洗3～5次。
所述的农杆菌优选为根癌农杆菌EHA105。
所述的将原球茎转接至含有与植物表达载体携带的抗性基因相对应的抗生素的改良H26号培养基上进行连续筛选，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，获得抗性原球茎具体为：将原球茎转接至含25～40mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d时将存活的原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d时将存活的原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d后将存活的原球茎转接至含25～40mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d天后获得抗性原球茎。
本发明采用的摩帝兜兰(Paphiopedilum Maudiae)是流行的观赏品种，但从种植到开花的时间长，希望通过转入建兰开花整合基因(CeFT)提早开花。
本发明的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法具有操作简单、结果率和转化率高的优点，有利于兜兰的分子育种及加速兜兰的育种进程。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.农杆菌注射液制备
表达载体：将建兰开花整合基因(CeFT)(GenBank登录号：HM803115)插入到质粒pCAMBIA1301的多克隆位点制备得到重组质粒pcubi1301，质粒pCAMBIA1301上携带有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A)、潮霉素抗性基因(Hpt)和卡那霉素抗性基因(kan)，然后将重组质粒pcubi1301转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，得到含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。
菌种活化：将置于-80℃冰箱的含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌种取出，用接种环从菌种保存液中挑取一环，在LB固体培养基上(含卡那霉素50mg/L)平板上划线，用封口膜封口后将平皿放在培养箱中，28℃，倒置，黑暗条件下培养2d即可看到分离的单菌落。
农杆菌注射液制备：经菌液PCR检测后，从平板上保存的含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中挑取单菌落，接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，置于摇床上，28℃，120rpm振荡培养过夜至OD600值为0.6，取1mL菌液于4℃，4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。将菌体重悬于10mL含有150mg/L乙酰丁香酮(AS)的AAM培养基中，28℃，120rpm振荡培养1.5小时，即得农杆菌注射液。
LB和AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。
2.农杆菌子房注射
在温室中对摩帝兜兰进行人工授粉，在完成授粉后的30天进行子房注射，每个子房的注射量为15μL。注射时，先用酒精棉(70％酒精)擦拭子房表面以去除附着在子房表面的杂物，再用已灭菌的微量注射器缓慢吸取农杆菌注射液沿子房纵向垂直注射入发育良好、长势一致的子房内部后，抽出针管用酒精棉擦拭注射处并用已消毒的纸胶布封住注射处，结果率75％。在授粉后180天摘取果实进行无菌播种。
3.抗性植株筛选
摘取授粉后180天的注射有农杆菌注射液的蒴果进行无菌播种。播种时，先将蒴果放在自来水下冲洗以去除粘附在蒴果表皮上的杂物，然后用体积分数75％酒精浸泡蒴果1分钟，再用质量分数0.1％的升汞溶液浸泡消毒10min后取出蒴果，无菌水冲洗3次后，吸干蒴果表面水分，在无菌操作台上用消毒后的手术刀沿着蒴果中缝线纵向剖开，取出种子并将其放入灭菌的三角瓶中，加入现配的质量分数0.5％的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡消毒40min，无菌水冲洗过滤3次后，将种子置于无菌水中制成悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含25mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上培养，每瓶接种50个，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养45d时将存活的原球茎转接到含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养45d时将存活的原球茎转接到含30mg/L潮霉素的改良H26号培养基上培养，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养45d时将存活的原球茎转接到含25mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上恢复培养，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养45d筛选获得潮霉素抗性原球茎，经过4轮筛选出的潮霉素抗性原球茎再转入无潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26℃，光照时间14h/d，光照强度1600lx，培养90d天后形成小苗。按如下公式计算转化率：转化率＝(小苗个数/用于筛选的原球茎个数)×100％。转化率为0.45％。
改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号(Hyponex I)1.0g、蔗糖(sugar)10g、蛋白胨(peptone)1.0g、琼脂(agar)5.0g、活性炭(AC)1.0g、维生素B1 10mg、维生素B61mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸(NAA)0.5mg和椰子汁50mL，余量为水。
改良H26号培养基的配制方法是将1.0g花宝1号、10g蔗糖、1.0g蛋白胨、5.0g琼脂、1.0g活性炭、10mg维生素B1、1mg维生素B6、1mg烟酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、0.5mg萘乙酸和50mL椰子汁，加到少量水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
4.抗性植株检测
对获得的小苗进行GUS染色、PCR检测和Southern blot检测。GUS染色均呈蓝色，PCR检测和Southern blot检测同时存在Gus A基因和CeFT基因，确定获得的小苗即为转基因兜兰植株。
实施例2：
1.农杆菌注射液制备
表达载体：将建兰开花整合基因(CeFT)(GenBank登录号：HM803115)插入到质粒pCAMBIA1301的多克隆位点制备得到重组质粒pcubi1301，质粒pCAMBIA1301上携带有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A)、潮霉素抗性基因(Hpt)和卡那霉素抗性基因(kan)，然后将重组质粒pcubi1301转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，得到含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。
菌种活化：将置于-80℃冰箱的含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌种取出，用接种环从菌种保存液中挑取一环，在LB固体培养基上(含卡那霉素50mg/L)平板上划线，用封口膜封口后将平皿放在培养箱中，28℃，倒置，黑暗条件下培养2d即可看到分离的单菌落。
农杆菌注射液制备：经菌液PCR检测后，从平板上保存的含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中挑取单菌落，接种到含有50mg/L卡那霉素LB液体培养基中，置于摇床上，28℃，120rpm振荡培养过夜至OD600值为0.6，取1mL菌液于4℃，4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。将菌体重悬于10mL含有200mg/L乙酰丁香酮(AS)的AAM培养基中，28℃，120rpm振荡培养1.5小时，即得农杆菌注射液。
LB和AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。
2.农杆菌子房注射
在温室中对摩帝兜兰进行人工授粉，在完成授粉后的43天进行子房注射，每个子房的注射量为20μL。注射时，先用酒精棉(75％酒精)擦拭子房表面以去除附着在子房表面的杂物，再用已灭菌的微量注射器缓慢吸取农杆菌注射液沿子房纵向垂直注射入发育良好、长势一致的子房内部后，抽出针管用酒精棉擦拭注射处并用已消毒的纸胶布封住注射处，结果率80％。在授粉后170天摘取果实进行无菌播种。
3.抗性植株筛选
摘取授粉后170天的注射有农杆菌注射液的蒴果进行无菌播种。播种时，先将蒴果放在自来水下冲洗以去除粘附在蒴果表皮上的杂物，然后用体积分数75％酒精浸泡蒴果1.5分钟，再用质量分数0.15％的升汞溶液浸泡消毒15min后取出蒴果，无菌水冲洗4次后，吸干蒴果表面水分，在无菌操作台上用消毒后的手术刀沿着蒴果中缝线纵向剖开，取出种子并将其放入灭菌的三角瓶中，加入现配的质量分数1.0％的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡消毒30min，无菌水冲洗过滤4次后，将种子置于无菌水中制成悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上培养，每瓶接种50个，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养50d时将存活的原球茎转接到含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养50d时将存活的原球茎转接到含40mg/L潮霉素的改良H26号培养基上培养，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养50d时将存活的原球茎转接到含30mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上恢复培养，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养50d筛选获得潮霉素抗性原球茎，经过4轮筛选出的潮霉素抗性原球茎再转入无潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度28℃，光照时间16h/d，光照强度1800lx，培养75d天后形成小苗。按如下公式计算转化率：转化率＝(小苗个数/用于筛选的原球茎个数)×100％。转化率为2.16％。
改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号(Hyponex I)1.5g、蔗糖(sugar)15g、蛋白胨(peptone)2g、琼脂(agar)5.5g、活性炭(AC)1.5g、维生素B1 10mg、维生素B61mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸(NAA)0.75mg和椰子汁75mL，余量为水。
改良H26号培养基的配制方法是将1.5g花宝1号、15g蔗糖、2g蛋白胨、5.5g琼脂、1.5g活性炭、10mg维生素B1、1mg维生素B6、1mg烟酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、0.75mg萘乙酸和75mL椰子汁，加到少量水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
4.抗性植株检测
对获得的小苗进行GUS染色、PCR检测和Southern blot检测。GUS染色均呈蓝色，PCR检测和Southern blot检测同时存在Gus A基因和CeFT基因，确定获得的小苗即为转基因兜兰植株。
实施例3：
1.农杆菌注射液制备
表达载体：将建兰开花整合基因(CeFT)(GenBank登录号：HM803115)插入到质粒pCAMBIA1301的多克隆位点制备得到重组质粒pcubi1301，质粒pCAMBIA1301上携带有β-葡萄糖酸甘酶基因(Gus A基因)、潮霉素抗性基因(Hpt基因)和卡那霉素抗性基因(kan)，然后将重组质粒pcubi1301转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中，得到含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105。
菌种活化：将置于-80℃冰箱的含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌种取出，用接种环从菌种保存液中挑取一环，在LB固体培养基上(含卡那霉素50mg/L)平板上划线，用封口膜封口后将平皿放在培养箱中，30℃，倒置，黑暗条件下培养2d即可看到分离的单菌落。
农杆菌注射液制备：经菌液PCR检测后，从平板上保存的含有重组质粒pcubi1301的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中挑取单菌落，接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，置于摇床上，30℃，120rpm振荡培养过夜至OD600值为0.8，取1mL菌液于4℃，4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体。将菌体重悬于10mL含有250mg/L乙酰丁香酮(AS)的AAM培养基中，28℃，120rpm振荡培养2.0小时，即得农杆菌注射液。
LB和AAM培养基为本领域常用培养基，其配方参考J.萨姆布鲁克等《分子克隆实验指南》。
2.农杆菌子房注射
在温室中对摩帝兜兰进行人工授粉，在完成授粉后的53天进行子房注射，每个子房的注射量为25μL。注射时，先用酒精棉(80％酒精)擦拭子房表面以去除附着在子房表面的杂物，再用已灭菌的微量注射器缓慢吸取农杆菌注射液沿子房纵向垂直注射入发育良好、长势一致的子房内部后，抽出针管用酒精棉擦拭注射处并用已消毒的纸胶布封住注射处，结果率85％。在授粉后150天摘取果实进行无菌播种。
3.抗性植株筛选
摘取授粉后150天的注射有农杆菌注射液的蒴果进行无菌播种。播种时，先将蒴果放在自来水下冲洗以去除粘附在蒴果表皮上的杂物，然后用体积分数75％酒精浸泡蒴果2分钟，再用质量分数0.2％的升汞溶液浸泡消毒20min后取出蒴果，无菌水冲洗5次后，吸干蒴果表面水分，在无菌操作台上用消毒后的手术刀沿着蒴果中缝线纵向剖开，取出种子并将其放入灭菌的三角瓶中，加入现配的质量分数2.0％的次氯酸钠(NaClO)溶液浸泡消毒20min，无菌水冲洗过滤5次后，将种子置于无菌水中制成悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上培养，每瓶接种50个，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养60d时将存活的原球茎转接到含50mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养60d时将存活的原球茎转接到含50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上培养，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养60d时将存活的原球茎转接到含40mg/L潮霉素(Hyg)的改良H26号培养基上恢复培养，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养60d筛选获得潮霉素抗性原球茎，经过4轮筛选出的潮霉素抗性原球茎再转入无潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度30℃，光照时间18h/d，光照强度2000lx，培养60d天后形成小苗。按如下公式计算转化率：转化率＝(小苗个数/用于筛选的原球茎个数)×100％。转化率为2.48％。
改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号(Hyponex I)2g、蔗糖(sugar)20g、蛋白胨(peptone)3g、琼脂(agar)6g、活性炭(AC)2g、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸(NAA)1mg和椰子汁100mL，余量为水。
改良H26号培养基的配制方法是将1g花宝2号、20g蔗糖、3g蛋白胨、6g琼脂、2g活性炭、10mg维生素B1、1mg维生素B6、1mg烟酸、2mg甘氨酸、0.1mg肌醇、1mg萘乙酸和100mL椰子汁，加到少量水中，然后用水补齐至1L，混合均匀，灭菌备用。
4.抗性植株检测
对获得的小苗进行GUS染色、PCR检测和Southern blot检测。GUS染色均呈蓝色，PCR检测和Southern blot检测同时存在Gus A基因和CeFT基因，确定获得的小苗即为转基因兜兰植株。

Claims (6)

1.一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)农杆菌注射液制备：将对数生长期的含有携带目的基因的植物表达载体的农杆菌接种到含有150-250mg/L乙酰丁香酮的AAM培养基中培养，得到农杆菌注射液；所述的植物表达载体携带有潮霉素抗性基因；
2)农杆菌子房注射：对兜兰进行人工授粉，选择授粉后30～53天的子房进行表面消毒，然后沿子房纵向垂直将农杆菌注射液注射到子房内部，注射量为15～25μL，注射后对注射部位进行密封；
3)抗性植株筛选和检测：摘取授粉后150～180天的注射有农杆菌注射液的蒴果进行无菌播种，将蒴果进行消毒处理，无菌条件下剖开蒴果，取出种子并进行消毒，然后将种子悬浮于无菌水中制成种子悬浮液播种到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，种子萌发形成原球茎，将原球茎转接至含25～40mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d时将存活的原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d时将存活的原球茎转接至含30～50mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d后将存活的原球茎转接至含25～40mg/L潮霉素的改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养45～60d天后获得抗性原球茎，将抗性原球茎转接到改良H26号培养基上，培养温度26～30℃，光照时间14～18h/d，光照强度1600～2000lx，培养至形成小苗，经分子检测获得转基因兜兰植株；
所述的改良H26号培养基为：每升培养基含有花宝1号1～2g、蔗糖10～20g、蛋白胨1～3g、琼脂5～6g、活性炭1～2g、维生素B1 10mg、维生素B6 1mg、烟酸1mg、甘氨酸2mg、肌醇0.1mg、萘乙酸0.5～1mg和椰子汁50～100mL，余量为水。
2.根据权利要求1所述的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的植物表达载体为质粒pCAMBIA1301。
3.根据权利要求1所述的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的兜兰为摩帝兜兰。
4.根据权利要求1所述的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的目的基因为建兰CeFT基因。
5.根据权利要求1所述的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的将蒴果进行消毒处理具体为将蒴果用体积分数75％的酒精浸泡1～2分钟，再用质量分数0.1％～0.2％的升汞溶液浸泡消毒10～20min，无菌水冲洗3～5次。
6.根据权利要求1所述的兜兰农杆菌子房注射法转基因方法，其特征在于，所述的农杆菌为根癌农杆菌EHA105。
CN201611200220.4A 2016-12-22 2016-12-22 一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法 Active CN106755083B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611200220.4A CN106755083B (zh) 2016-12-22 2016-12-22 一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611200220.4A CN106755083B (zh) 2016-12-22 2016-12-22 一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106755083A CN106755083A (zh) 2017-05-31
CN106755083B true CN106755083B (zh) 2019-06-14

Family

ID=58899607

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611200220.4A Active CN106755083B (zh) 2016-12-22 2016-12-22 一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106755083B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107177628A (zh) * 2017-07-26 2017-09-19 黔西南州绿缘动植物科技开发有限公司 一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法
CN107326044A (zh) * 2017-07-28 2017-11-07 黔西南州绿缘动植物科技开发有限公司 一种转基因白花兜兰的种植方法
CN108374020A (zh) * 2017-12-28 2018-08-07 南京农业大学 一种改良的农杆菌介导大豆整体转化方法
CN112063652A (zh) * 2020-09-29 2020-12-11 枣庄学院 一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法及其应用
CN115386591A (zh) * 2022-09-05 2022-11-25 中国科学院华南植物园 一种单座苣苔的分子育种方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063398A1 (en) * 1999-04-19 2000-10-26 Rhobio Plant transformation method
CN101696422A (zh) * 2009-11-12 2010-04-21 山东农业大学 植物子房注射转基因方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000063398A1 (en) * 1999-04-19 2000-10-26 Rhobio Plant transformation method
CN101696422A (zh) * 2009-11-12 2010-04-21 山东农业大学 植物子房注射转基因方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Methods for genetic transformation in Dendrobium;da Silva, JAT等;《PLANT CELL REPORTS》;201603;第35卷(第3期);第483-504页 *
农杆菌子房注射法对金钗石斛的活体转化研究;刘其府等;《华南农业大学学报》;20130613;第34卷(第3期);第378-382页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106755083A (zh) 2017-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106755083B (zh) 一种兜兰农杆菌子房注射法转基因方法
CN105145352B (zh) 一种白芨种苗高效组培快繁技术
CN101822220B (zh) 一种春兰名品茎尖组织培养快速繁殖方法
CN101904262B (zh) 甘蔗试管苗的瓶外生根方法
CN106665357B (zh) 一种建立石蒜再生体系的方法
CN105993956A (zh) 一种茅苍术快速繁殖方法
CN107466857A (zh) 一种高杆万寿菊组培培养基及其制备方法
CN110169327A (zh) 花生青枯病抗性鉴定圃的建立方法
CN101180950B (zh) 春石斛组织培养快繁方法
CN104170668A (zh) 甘蔗实生苗进行黑穗病高效接种方法
CN107466862A (zh) 一种快速繁殖鼓槌石斛组培苗的方法
CN105145366B (zh) 一种沿阶草ems同质突变体库快速构建的方法
CN105191803B (zh) 一种铁皮石斛组培袋苗生产方法
CN109479718A (zh) 一种文冠果组培苗的生根方法
Park et al. In-vitro seed germination of Calanthe sieboldii, an endangered orchid species
CN108588119A (zh) 一种诱导长豇豆转基因发状根的方法及使用的优异基因型
CN105409773B (zh) 一种乌羽玉无菌播种及再生体系建立的方法
CN104263752A (zh) 一种柑桔成年态茎段的转基因方法
CN106755073B (zh) 一种兜兰质粒子房注射法转基因方法
CN106811482A (zh) 三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法
CN115152352B (zh) 一种工业大麻无菌实生苗繁育方法
CN106489730A (zh) 一种火焰兰一次成苗快速繁殖方法及培养基
CN104221648B (zh) 室内培养获得小麦矮腥黑粉菌发病植株的方法
CN102533633B (zh) 抑制发芽/生根的大麦成熟胚组织培养法及所用培养基
CN101695282A (zh) 一种抗性处理提高齿瓣石斛试管苗移栽成活率的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant