CN112063652A - 一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法及其应用，本发明在石榴幼果时期，向石榴幼果的子房内注射农杆菌，农杆菌通过与石榴胚珠的充分接触，从而有效地将外源基因导入石榴幼胚细胞内，进一步发育成种子，经筛选检测获得石榴转基因植株。该方案成本低，可以有效地解决石榴转基因育种困难的问题。该发明直接侵染石榴的幼胚，转化后的幼胚在果实内发育成种子，每个石榴子房内胚珠数量大约在200粒左右，即使转化效率不高，所获得的转化植株的数量也是十分可观的；获得的阳性植株就是F1代，缩短了育种的周期。

Description

一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因 的方法及其应用
技术领域
本方法属于基因工程育种领域，通过使用根癌农杆菌介导技术将外源基因转入野生型石榴并成功表达外源基因相关性状，具体涉及一种石榴子房注射的转基因方法。
背景技术
石榴(Punica granatum)为石榴科石榴属植物，全世界的温带和热带都有种植。Lansky等人研究发现石榴的叶、花、果、根等部分，都具有特殊的药理作用。近年来，石榴的栽培及开发利用受到关注。目前石榴育种方法仍然以传统的杂交育种为主，效率低速度慢，难以满足需求。如何通过基因工程手段改变石榴的园艺性状或对石榴中的次生代谢相关基因进行调控，培育人们所需要的石榴品种，从而进一步培育出高产、品质优良的石榴新品种是当前需要解决的问题。
目前国内外用于植物转基因的技术手段有农杆菌介导转化法、基因枪法、花粉管通道法、微注射法、电穿孔法、微束激光打孔法等方法，其中农杆菌介导转化法因操作简便、成本较低，最为常用。农杆菌介导转化又分为离体愈伤组织侵染和活体直接侵染，其中离体愈伤组织侵染最为常用，活体直接侵染较为少见，有报道小型草本植物拟南芥的花序直接浸入农杆菌溶液中，因拟南芥的花器官特别小，子房壁细胞层数极少，农杆菌可侵入珠心进入受精卵或胚细胞，从而可以获得转基因阳性拟南芥种子，但该方法不适于花器官较大的植物。石榴的转基因育种多为离体组织根癌农杆菌介导技术，通过使用根癌农杆菌将外源基因导入石榴愈伤组织中，随后对阳性愈伤组织进行抗性筛选，最终通过植物激素诱导愈伤组织成苗，从而获得阳性植株。但是该方法成本较高，难度较大，获得的石榴转基因苗阳性率低，况且该方案在国内并不成熟。石榴作为一种木本植物，目前没有在石榴植株活体上直接遗传转化的报道。
子房是被子植物花器官的重要组成部分，位于花的雌蕊下面，一般略为膨大。子房里面有胚珠，胚珠受精后可以发育为种子。 是被子植物花中雌蕊的主要组成部分，子房由子房壁和胚珠组成。当传粉受精后，子房发育成果实。子房壁最终发育成果皮。
本发明在石榴幼果时期，向石榴幼果的子房内注射农杆菌，农杆菌通过与石榴胚珠的充分接触，从而有效地将外源基因导入石榴幼胚细胞内，进一步发育成种子，经筛选检测获得石榴转基因植株。该方案成本低，可以有效地解决石榴转基因育种困难的问题。
该发明直接侵染石榴的幼胚，转化后的幼胚在果实内发育成种子，每个石榴子房内胚珠数量大约在200粒左右，即使转化效率不高，所获得的转化植株的数量也是十分可观的；获得的阳性植株就是F1代，缩短了育种的周期。
发明内容
本发明的目的是针对目前缺乏有效的根癌农杆菌介导的石榴转化体系，本发明通过石榴幼果子房注射的方法，建立根癌农杆菌介导的石榴转化体系，为石榴转基因育种建立新的方法，为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是步骤如下：
步骤（1）制备农杆菌注射液：无菌操作，将处于对数生长期并携带有目的基因与抗性基因表达载体的根癌农杆菌菌液进行离心收集菌体，将菌体沉淀加入侵染液中，从而获得含有菌体的侵染液；
步骤（2）注射侵染液：石榴植株上选择子房略微膨大的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用酒精棉球对雌蕊基座周围的组织进行充分消毒，使用无菌针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用无菌微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入通过（1）制备的根癌农杆菌侵染液，注射体积为50-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，给整个幼果套上纸袋；
步骤（3）转化效果抽样检测：随机抽取已注射侵染液72小时的石榴幼果，解剖幼果取出胚珠进行GUS染色，观察根癌农杆菌瞬时转化效果；
步骤（4）阳性石榴苗的筛选：待石榴果实完全成熟后，收获健康的石榴种子，经过除菌种植在抗生素抗性的MS固体培养基中，对阳性苗进行筛选，培养温度为28~30℃，光照时间为18h.d-1，光照强度为2000lx，培养30天后获得石榴幼苗，对不同株石榴幼苗进行分子鉴定，从而筛选获得阳性植株。
所使用的载体为携带β-葡萄糖酸甘酶基因（GUS）与卡那霉素抗性基因的PBI121载体。
所述的石榴品种为大青皮石榴和大红袍石榴。
所述的农杆菌为GV3101根癌农杆菌，菌体具备利福平抗生素抗性。
一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是
（1）农杆菌注射液制备
CRISPR cas9 BGK01载体上携带有潮霉素抗性基因（HYG）与卡那霉素抗性基因（KaNa），使用酶切法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronic acid decarboxylase 5）部分外显子序列插入到BGK01载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因BGK01载体，将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种；
将该菌种在加入双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中，侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用；
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤）；
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl1 g，随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的卡那霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1；
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子，使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液，注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋；
（3）鉴定突变体石榴
九月中旬收获成熟的石榴种子，去掉外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在HYG抗性的MS固体培养基中（HYG在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，并已通过0.22µm水相滤头过滤），用消毒的剪刀剪取石榴幼苗植株1cm2面积真叶，使用CTAB法提取该真叶中的基因组DNA作为模板，对靶基因位点的外显子序列设计前后引物，使用Taq酶mix共同构建PCR体系，以扩增靶位点外显子全长序列，并将扩增结果进行测序，从而筛选阳性植株；对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定量与定量分析，从而确定该基因是否被真正的敲除；最终获得石榴突变体植株。
一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的应用，其特征是
步骤（1）制备农杆菌注射液：无菌操作，将处于对数生长期并携带有目的基因与抗性基因表达载体的根癌农杆菌菌液进行离心收集菌体，将菌体沉淀加入侵染液中，从而获得含有菌体的侵染液；
步骤（2）注射侵染液：石榴植株上选择子房略微膨大的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用酒精棉球对雌蕊基座周围的组织进行充分消毒，使用无菌针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用无菌微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入通过（1）制备的根癌农杆菌侵染液，注射体积为50-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，给整个幼果套上纸袋；
步骤（3）转化效果抽样检测：随机抽取已注射侵染液72小时的石榴幼果，解剖幼果取出胚珠进行GUS染色，观察根癌农杆菌瞬时转化效果；
步骤（4）阳性石榴苗的筛选：待石榴果实完全成熟后，收获健康的石榴种子，经过除菌种植在抗生素抗性的MS固体培养基中，对阳性苗进行筛选，培养温度为28~30℃，光照时间为18h.d-1，光照强度为2000lx，培养30天后获得石榴幼苗，对不同株石榴幼苗进行分子鉴定，从而筛选获得阳性植株；
所使用的载体为携带β-葡萄糖酸甘酶基因（GUS）与卡那霉素抗性基因的PBI121载体；
所述的石榴品种为大青皮石榴和大红袍石榴；
所述的农杆菌为GV3101根癌农杆菌，菌体具备利福平抗生素抗性。
一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的应用，其特征是：
（1）农杆菌注射液制备
pK7GWIWG2D(II)载体上携带有奇霉素（Spec）抗性基因与GFP标记基因，GFP蛋白可以在蓝色荧光激发下呈现绿色荧光，使用试剂盒法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronic acid decarboxylase 2）部分测序正确的cDNA序列插入到pK7GWIWG2D(II)载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因pK7GWIWG2D(II)-RNAi载体，将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种，
将该菌种在加入奇霉素（Spec）与利福平霉素（Rif）双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中，侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用，
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤），
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl1 g，随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的奇霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1，
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子，使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液，注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋，
（3）筛选石榴靶基因RNAi植株
九月中旬收获成熟的石榴种子，将新鲜的携带外种皮的石榴种子在蓝色荧光下进行观察，挑选绿色自发荧光的石榴种子，去掉种子的外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在KaNa卡那霉素抗性的MS固体培养基平板上（KaNa在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，已通过0.22µm水相滤头过滤），30天之后种子萌发获得阳性石榴幼苗，剪取阳性幼苗植株2-3片真叶提取总RNA，并对靶基因进行半定量与定量检测，从而筛选阳性植株，对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定量分析，从而确定该基因是否被真正RNAi，从而最终获得石榴RNAi植株。
本发明成本低，可以有效地解决石榴转基因育种困难的问题。本发明直接侵染石榴的幼胚，转化后的幼胚在果实内发育成种子，每个石榴子房内胚珠数量大约在200粒左右，即使转化效率不高，所获得的转化植株的数量也是十分可观的；获得的阳性植株就是F1代，缩短了育种的周期。
附图说明
图1是本发明石榴胚珠GUS染色压片图。
具体实施方式
下面结合说明书附图图1对本发明进行进一步的说明：
实施例1：
（1）农杆菌注射液制备
PBI121载体上携带有β-葡萄糖酸甘酶基因（GUS）与卡那霉素抗性基因（KaNa），将PBI121载体转化入GV3101根癌农杆菌，得到含有PBI121载体的GV3101根癌农杆菌，将该菌种在加入双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中。侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用。
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤）。
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g。随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的卡那霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1。
（2）注射侵染液
户外挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子。使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液。注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋。
（3）转化结果抽样检测
随机抽取已注射侵染72h的石榴幼果胚珠从石榴子房胎座上取下，使用GUS染色液对石榴胚珠进行染色，染色过程如下：将石榴胚珠装入离心管中。先用预冷过的90%丙酮溶液洗去多余的杂质，随后将丙酮溶液吸干，加入适量体积的未添加X-Gluc溶液的GUS染色液，用真空泵进行负压抽滤10min，从而让GUS染色液充分的进入到胚珠内部细胞，随后弃去GUS染色液，再次加入等体积的未添加X-Gluc溶液的GUS染色液，最后加入适量体积的X-Gluc溶液，真空抽滤5 min，放入培养箱中37℃黑暗培养24 h，次日使用奥林巴斯解剖台进行观察，并拍照，如图1所示。
所述的GUS染色液配方：每100 mL去离子水中加入0.237 g NaH2PO4，0.895 gNa2HPO4，0.067 g K3(Fe(CN)6)，0.0084 g K4(Fe(CN)6)，0.149 g Na2EDTA（使用NaOH水溶液进行助溶，最终PH=8.0），甲醇10 mL，Triton X-100 24 µL，10 mg.mL-1的X-Gluc 4 mL（X-Gluc使用DMSO进行溶解，现用现加）。
（4）筛选转基因石榴阳性植株
九月中旬收获成熟的石榴种子，去掉外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在KaNa抗性的MS固体培养基中（KaNa在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，并已通过0.22µm水相滤头过滤）。30天之后种子萌发获得石榴幼苗，对不同株石榴幼苗进行分子鉴定与GUS染色观察，从而筛选获得阳性植株。
用消毒的剪刀剪取不同植株1cm2面积的真叶，使用CTAB法提取该真叶中的基因组DNA作为模板，使用GUS报告基因的上下游引物以及Taq酶mix共同构建PCR体系，以扩增相应的GUS报告基因，从而筛选阳性植株。剪取一片阳性植株的幼嫩真叶，使用GUS染色液进行染色。通过分子鉴定与GUS染色方法共同筛选阳性石榴幼苗。
CTAB法提取DNA与PCR克隆以及定量与半定量分析相关基因表达量方法参考《植物基因工程实验技术指南》第二版，王关林、方宏筠主编，页码范围：10-60。
实施例2：
（2）农杆菌注射液制备
CRISPR cas9 BGK01载体上携带有潮霉素抗性基因（HYG）与卡那霉素抗性基因（KaNa），使用酶切法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronic acid decarboxylase 5）部分外显子序列插入到BGK01载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因BGK01载体。将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种。
将该菌种在加入双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中。侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用。
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤）。
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g。随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的卡那霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1。
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子。使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液。注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋。
（3）鉴定突变体石榴
九月中旬收获成熟的石榴种子，去掉外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在HYG抗性的MS固体培养基中筛选（HYG在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，并已通过0.22µm水相滤头过滤）。用消毒的剪刀剪取石榴幼苗植株1cm2面积真叶，使用CTAB法提取该真叶中的基因组DNA作为模板，对靶基因位点的外显子序列设计前后引物，使用Taq酶mix共同构建PCR体系，以扩增靶位点外显子全长序列，并将扩增结果进行测序，从而筛选阳性植株。对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定量与定量分析，从而确定该基因是否被真正的敲除。最终获得石榴突变体植株。
CTAB法提取DNA与PCR克隆以及定量与半定量分析相关基因表达量方法参考《植物基因工程实验技术指南》第二版，王关林、方宏筠主编，页码范围：10-60。
实施例3：
（1）农杆菌注射液制备
pK7GWIWG2D(II)载体上携带有奇霉素（Spec）抗性基因与GFP标记基因，GFP蛋白可以在蓝色荧光激发下呈现绿色荧光。使用试剂盒法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronic acid decarboxylase 2）部分测序正确的cDNA序列插入到pK7GWIWG2D(II)载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因pK7GWIWG2D(II)-RNAi载体。将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种。
将该菌种在加入奇霉素（Spec）与利福平霉素（Rif）双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中。侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用。
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤）。
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g。随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的奇霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1。
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子。使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液。注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋。
（3）筛选石榴靶基因RNAi植株
九月中旬收获成熟的石榴种子，将新鲜的携带外种皮的石榴种子在蓝色荧光下进行观察，挑选绿色自发荧光的石榴种子，去掉种子的外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在KaNa卡那霉素抗性的MS固体培养基平板上（KaNa在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，已通过0.22µm水相滤头过滤）。30天之后种子萌发获得阳性石榴幼苗，剪取阳性幼苗植株2-3片真叶提取总RNA，并对靶基因进行半定量与定量检测，从而筛选阳性植株。对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定量分析，从而确定该基因是否被真正RNAi。从而最终获得石榴RNAi植株。
PCR克隆以及定量与半定量分析相关基因表达量方法参考《植物基因工程实验技术指南》第二版，王关林、方宏筠主编，页码范围：10-60。
实施例4：
（1）农杆菌注射液制备
Psuper1300过表达载体上携带有潮霉素与卡那霉素抗性基因以及GFP标记基因，使用酶切法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronic acid decarboxylase 1）cDNA正确全长序列插入到BGK01载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因Psuper1300载体。将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种。
将该菌种在加入双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中。侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用。
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤）。
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl 1 g。随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟。灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的卡那霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1。
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子。使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液。注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋。
（3）筛选靶基因过表达石榴植株
九月中旬收获成熟的石榴种子，将新鲜的携带外种皮的石榴种子在蓝色荧光下进行观察，挑选绿色自发荧光的石榴种子，去掉种子的外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在HYG潮霉素抗性的MS固体培养基平板上（HYG在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，已通过0.22µm水相滤头过滤）。30天之后种子萌发获得阳性石榴幼苗，剪取阳性幼苗植株2-3片真叶提取总RNA，并对靶基因进行半定量与定量检测，从而筛选阳性植株。通过对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定量分析，从而确定该基因是否被真正过表达。从而最终获得石榴靶基因过表达植株。
PCR克隆以及定量与半定量分析相关基因表达量方法参考《植物基因工程实验技术指南》第二版，王关林、方宏筠主编，页码范围：10-60。

Claims (7)

1.一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是步骤如下：
步骤（1）制备农杆菌注射液：无菌操作，将处于对数生长期并携带有目的基因与抗性基因表达载体的根癌农杆菌菌液进行离心收集菌体，将菌体沉淀加入侵染液中，从而获得含有菌体的侵染液；
步骤（2）注射侵染液：石榴植株上选择子房略微膨大的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用酒精棉球对雌蕊基座周围的组织进行充分消毒，使用无菌针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用无菌微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入通过（1）制备的根癌农杆菌侵染液，注射体积为50-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，给整个幼果套上纸袋；
步骤（3）转化效果抽样检测：随机抽取已注射侵染液72小时的石榴幼果，解剖幼果取出胚珠进行GUS染色，观察根癌农杆菌瞬时转化效果；
步骤（4）阳性石榴苗的筛选：待石榴果实完全成熟后，收获健康的石榴种子，经过除菌种植在抗生素抗性的MS固体培养基中，对阳性苗进行筛选，培养温度为28~30℃，光照时间为18h.d-1，光照强度为2000lx，培养30天后获得石榴幼苗，对不同株石榴幼苗进行分子鉴定，从而筛选获得阳性植株。
2.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是所使用的载体为携带β-葡萄糖酸甘酶基因（GUS）与卡那霉素抗性基因的PBI121载体。
3.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是所述的石榴品种为大青皮石榴和大红袍石榴。
4.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是所述的农杆菌为GV3101根癌农杆菌，菌体具备利福平抗生素抗性。
5.根据权利要求1所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的方法，其特征是
农杆菌注射液制备
CRISPR cas9 BGK01载体上携带有潮霉素抗性基因（HYG）与卡那霉素抗性基因（KaNa），使用酶切法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronic acid decarboxylase 5）部分外显子序列插入到BGK01载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因BGK01载体，将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种；
将该菌种在加入双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中，侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用；
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤）；
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl1 g，随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的卡那霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1；
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子，使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液，注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋；
（3）鉴定突变体石榴
九月中旬收获成熟的石榴种子，去掉外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在HYG抗性的MS固体培养基中（HYG在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，并已通过0.22µm水相滤头过滤），用消毒的剪刀剪取石榴幼苗植株1cm2面积真叶，使用CTAB法提取该真叶中的基因组DNA作为模板，对靶基因位点的外显子序列设计前后引物，使用Taq酶mix共同构建PCR体系，以扩增靶位点外显子全长序列，并将扩增结果进行测序，从而筛选阳性植株；对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定量与定量分析，从而确定该基因是否被真正的敲除；最终获得石榴突变体植株。
6.一种如权利要求1、2、3、4、5所述的通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的应用，其特征是
步骤（1）制备农杆菌注射液：无菌操作，将处于对数生长期并携带有目的基因与抗性基因表达载体的根癌农杆菌菌液进行离心收集菌体，将菌体沉淀加入侵染液中，从而获得含有菌体的侵染液；
步骤（2）注射侵染液：石榴植株上选择子房略微膨大的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用酒精棉球对雌蕊基座周围的组织进行充分消毒，使用无菌针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用无菌微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入通过（1）制备的根癌农杆菌侵染液，注射体积为50-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，给整个幼果套上纸袋；
步骤（3）转化效果抽样检测：随机抽取已注射侵染液72小时的石榴幼果，解剖幼果取出胚珠进行GUS染色，观察根癌农杆菌瞬时转化效果；
步骤（4）阳性石榴苗的筛选：待石榴果实完全成熟后，收获健康的石榴种子，经过除菌种植在抗生素抗性的MS固体培养基中，对阳性苗进行筛选，培养温度为28~30℃，光照时间为18h.d-1，光照强度为2000lx，培养30天后获得石榴幼苗，对不同株石榴幼苗进行分子鉴定，从而筛选获得阳性植株；
所使用的载体为携带β-葡萄糖酸甘酶基因（GUS）与卡那霉素抗性基因的PBI121载体；
所述的石榴品种为大青皮石榴和大红袍石榴；
所述的农杆菌为GV3101根癌农杆菌，菌体具备利福平抗生素抗性。
7.根据权利要求6所述的一种通过农杆菌注射技术对石榴幼果子房内胚珠进行转基因的应用，其特征是：
（1）农杆菌注射液制备
pK7GWIWG2D(II)载体上携带有奇霉素（Spec）抗性基因与GFP标记基因，GFP蛋白可以在蓝色荧光激发下呈现绿色荧光，使用试剂盒法将石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因（UDP-glucuronic acid decarboxylase 2）部分测序正确的cDNA序列插入到pK7GWIWG2D(II)载体的多克隆位点上，从而构建石榴葡萄糖醛酸脱羧酶基因pK7GWIWG2D(II)-RNAi载体，将构建完毕的载体转入GV3101根癌农杆菌感受态细胞中，从而获得目的菌种，
将该菌种在加入奇霉素（Spec）与利福平霉素（Rif）双抗的LB液体培养基中摇菌扩繁，随后离心收集菌体，菌体加入侵染液中，侵染液中菌体浓度为OD600=1.0，静置3h后使用，
侵染液配方为：每300 mL去离子水中加入MgCl20.2856 g，MES 0.63g，随后使用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入AS 11.772mg（AS使用DMSO进行溶解，通过0.22 µm有机相滤头进行无菌过滤），
配制LB液体抗性培养基：每100 mL蒸馏水中加入胰蛋白胨1 g，酵母提取物0.5 g，NaCl1 g，随后将培养基用封口膜封口，放入高温高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，灭菌条件为121℃，20分钟，灭菌完毕冷凉至室温，在无菌台上加入过滤好的奇霉素与利福平抗生素，抗生素在培养基中的浓度为50 mg.L-1，
（2）注射农杆菌
在果园石榴植株上挑选子房膨大且直径在1.5cm以内的健康石榴幼果作为实验材料，使用尖头镊去除石榴幼果的花冠以及雄蕊部分，使用沾有75%乙醇的脱脂棉对雌蕊基座周围的组织进行充分擦拭，以尽量清除细菌与真菌孢子，使用直径0.16 mm的针灸针在雌蕊基部位置缓慢垂直扎入石榴幼果子房部位，随即取出，切记不可扎伤石榴胎座组织，使用1 mL微量注射器在针眼部位浅层处垂直缓慢注入根癌农杆菌侵染液，注射体积为100-150 µL，注射完毕取下注射器，使用酒精棉球再次轻微擦拭伤口，并给整个幼果套上纸袋，
（3）筛选石榴靶基因RNAi植株
九月中旬收获成熟的石榴种子，将新鲜的携带外种皮的石榴种子在蓝色荧光下进行观察，挑选绿色自发荧光的石榴种子，去掉种子的外种皮，使用75%乙醇对种子进行消毒，随即种植在KaNa卡那霉素抗性的MS固体培养基平板上（KaNa在MS固体培养基中的浓度为20mg.L-1，已通过0.22µm水相滤头过滤），30天之后种子萌发获得阳性石榴幼苗，剪取阳性幼苗植株2-3片真叶提取总RNA，并对靶基因进行半定量与定量检测，从而筛选阳性植株，对筛选到的阳性植株进行靶基因的半定量分析，从而确定该基因是否被真正RNAi，从而最终获得石榴RNAi植株。
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