CN106755080A

CN106755080A - 一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法

Info

Publication number: CN106755080A
Application number: CN201710034405.0A
Authority: CN
Inventors: 刘新; 马倩; 侯丽霞; 郝杰
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2017-01-18
Filing date: 2017-01-18
Publication date: 2017-05-31

Abstract

本发明提供了一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法。本发明将载有重组质粒的GV3101农杆菌菌株和p19菌株分别培养，等体积混合备用；选择5周龄的葡萄组培苗的植物组织，采用注射器法高压将菌液完全浸入植物组织；之后植物组织保持水分和透气；经黑暗培养和光照培养后，经检测即可用于后续实验。本发明将葡萄组培苗叶片直接置于注射器内，依靠注射器拉动带来的瞬时高压迅速的实现了农杆菌菌液的浸入，操作简单，同时减少了操作的时间，节省了人力物力和财力。另外这种方法还保证了叶片不会出现传统真空泵抽气制造高压时，由于抽气时间过长而造成的植物细胞膜破裂而引起细胞的死亡，极大地提高了转化的效率。

Description

一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及葡萄组织瞬时转化技术领域，具体涉及一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法。

背景技术

葡萄是多年生藤本落叶植物，生长期长且高度杂合，品质优良的葡萄品种主要依靠无性方式进行繁殖，而且一些品种携带有害等位基因易出现近交衰退，且相关品质性状遗传方式尚不清楚、杂交后代分子标记辅助筛选困难，使得利用传统方法选育优质抗病葡萄品种时周期长且操作困难。而一些重要的性状是由单一基因显性遗传，因此葡萄分子生物学相关研究为葡萄有利基因的挖掘和随之而来的品质改良开辟了新的途径。利用分子生物学进行有利基因的挖掘是建立在对有利基因功能鉴定的基础之上的，而基因功能的鉴定又离不开正反向遗传学中利用遗传转化进行相应基因功能的鉴定。但是葡萄的稳定遗传转化技术手段目前极不成熟，周期很长，因此相对较容易实现的葡萄瞬时转化技术在葡萄分子生物学和遗传育种学的研究其基因功能有重要应用价值。

目前用于植物组织的瞬时转化方法主要包括基因枪法和农杆菌介导的Ti质粒法。基因枪法又称粒子轰击等，将直径4um的钨粉或金粉在供体DNA中浸泡，然后用基因枪将这些粒子打入细胞、组织或器官中，具有一次处理多个细胞的优点，但转化效率较低，成本较高，稳定性差，易出现沉默现象等。农杆菌介导的方法是将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合。农杆菌介导法的转化效率较高，可以导入的DNA片段较大，表达效果较好，方法和使用的仪器简单，费用较低。

不管是基因的稳定转化和瞬时转化都面临一个转化成功率的问题。基因转化的成功率受很多因素的调控。对农杆菌介导的瞬时遗传转化主要受转染的农杆菌菌株，目标植物的基因型，植物受侵染的部位，农杆菌侵染浓度和时间，侵染后共培养的温度、湿度、PH值等因素的影响，因而过程非常复杂。除了上述因素以外，农杆菌介导的瞬时转化还受到一些诱导物和抑制物质的影响。如p19基因是一个非常特殊的抑制因子，它分离于番茄丛矮病毒(Tomato bushy stunt virus，TBSV)，编码一个19kD的多功能蛋白质。在瞬时表达实验中，p19则可以对RNA沉默起抑制作用，因而极大了提高了瞬时转化的效率。

在瞬时转化过程中，农杆菌如何进入细胞也是一个很重要的问题。到目前为止，一般采用高压的方法将农杆菌浸入细胞。根据目标植物组织覆盖蜡质的量和角质层的厚度，采用不同的方法进行高压浸入。如对含蜡质较少的烟草叶片，采用无针头针管注入的方式；对含蜡质较多的组织，则一般采用高压真空泵抽气辅助农杆菌菌液进入细胞中。但总的来说，高压处理是在破坏细胞膜的情况下将农杆菌菌液浸入植物细胞。长时间的高压处理可以导致植物膜结构大规模的破坏，最终使植物细胞死亡，遗传转化失败。因而高压处理的方式也对葡萄瞬时转化的效率起着至关重要的作用。

发明内容

本发明提供了一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，本发明的技术方案可以缩短转化操作的时间，提高转化的效率，可以解决葡萄分子生物学研究中存在的难以在同源生物体中验证基因功能，以及由于葡萄转基因技术不成熟而导致的成功率低、操作复杂和耗时等问题。

为达到解决上述技术问题的目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，所述转化方法包括以下步骤：

（1）葡萄组培苗的培养：剥取葡萄的茎尖生长点，置于组培苗培养基中进行培养5周获得5周龄的葡萄组培苗；

（2）侵染菌液的制备：将农杆菌菌株和p19菌株分别置于含抗生素的YEB液体培养基中进行恢复培养；将恢复培养后的菌液转移至含抗生素的YEB液体培养基中进行扩大培养；将扩培的菌液离心，去除上清液；将沉淀以悬浮液悬浮并培养菌液；然后将获得的农杆菌菌液与p19菌液等体积混匀后，摇匀得到混合菌液备用；

（3）农杆菌对葡萄组培苗组织的侵染：从所述5周龄的葡萄组培苗中选择叶片，将叶片表面扎若干小孔，置于装有所述混合菌液的注射器中；封注射器口，迅速拉至最大刻度处，反复抽拉直至菌液完全浸入叶片，侵染后的叶子呈半透明状态；

（4）农杆菌侵染后的培养：拭去葡萄叶片上残留的菌液，置于湿润的双层脱脂棉中，密封保持湿度，并扎小孔透气；经过培养获得转基因材料。

进一步的：所述步骤（2）中农杆菌菌株为含35S::GFP质粒的GV3101菌株。

进一步的：所述步骤（2）中恢复培养和扩大培养的条件为在28℃，250转/分钟的振荡培养箱中培养。

进一步的：所述步骤（2）中农杆菌的悬浮液配方为：pH 5.6的10mM MES，10mMMgCl₂，质量体积比为2％的蔗糖，150μM乙酰丁香酮。

进一步的：所述步骤（2）中将以悬浮液悬浮后获得的菌液培养至600nm波长下光密度值达到0.6。

进一步的：所述步骤（3）中选择处于第3、4叶位的叶片。

进一步的：所述步骤（3）中注射器的容量为50ml。

进一步的：所述步骤（4）中经过黑暗培养12 h和光照培养4-5 d获得转基因材料。

进一步的：所述步骤（4）中光照培养的条件为：26℃，2000 Lux 光照14 h/黑暗10h。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：

1、本发明将含35S::GFP质粒的GV3101农杆菌菌液与P19菌液等体积混合后进行植物组织侵染。有效地利用了p19对RNA沉默的抑制作用，极大了提高了葡萄组培叶片瞬时转化的效率。

2、本发明采用50ml注射器，利用抽拉注射器制造高压，促进菌液进入植物细胞。比传统的高压真空泵抽气制造高压，操作起来简单易行，效果明显，造价低廉。

3、本发明选择5周龄的葡萄组培苗中处于第3、4叶位的叶片，将叶片表面扎若干小孔后，再进行菌液侵染。这种叶位的葡萄组培苗叶片既生长到了一定的面积，足够进行转基因工作完成后的后续鉴定和下游基因表达量的鉴定。同时这个叶位的叶片又不至于过于成熟，以致积累过多的蜡质，导致农杆菌菌液浸入困难。

4、在构建重组载体时，选择含有35S::GFP的质粒，便于后期进行转基因效果的鉴定。

附图说明

图1是本发明中5周龄的葡萄“左优红”组培苗。

图2是本发明中注射器法无法实现对葡萄组培苗根部组织的侵染。

图3是本发明中注射器法无法实现对葡萄组培苗茎的侵染。

图4是本发明中注射器法处理葡萄组培苗组织的演示图。

图5是本发明中采用注射器法处理的葡萄组培苗叶片。

图6是本发明中采用真空泵法处理的葡萄组培苗叶片。

图7是本发明中真空泵法和注射器法处理葡萄组培叶片后的效果对比。

图8是本发明中农杆菌侵染后，培养状态下的葡萄组培苗叶片。

图9是本发明中培养4天后的葡萄叶片瞬时转化效果的PCR鉴定。

图10是本发明中培养5天后的葡萄叶片瞬时转化效果的PCR鉴定。

图11是本发明中五周龄的葡萄“赤霞珠”组培苗。

图12是本发明中农杆菌侵染后，培养了3-5天后的葡萄组培苗叶片。

图13是本发明中以重组载体中的GFP为标签，用PCR对培养4天的葡萄叶片瞬时转化效果的验证。其中阳性对照是含35S::GFP的空质粒，阴性对照是用H₂O代替DNA的扩增样品。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。

实施例1

本发明所述快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法具体包括如下步骤：

1、葡萄组培苗的培养：

将市售葡萄品种“左优红”的幼嫩组织从大田取回，消毒水处理后，在超净工作台上剥取茎尖生长点，进行组织培养。葡萄组培苗培养基为MS固体培养基，配方为：NH₄NO₃ 33000mg/L、KNO₃ 38000 mg/L、CaCl₂•2H₂O 8800 mg/L、MgSO₄•7H₂O 7400 mg/L、KH₂PO₄ 3400 mg/L、KI 166 mg/L、H₃BO₃ 1240 mg/L、MnSO₄•4H₂O 4460 mg/L、ZnSO₄•7H₂O 1720 mg/L、Na₂MoO₄•2H₂O 50 mg/L、CuSO₄•5H₂O 5 mg/L、CoCl₂•6H₂O 5 mg/L、FeSO₄•7H₂O 5560 mg/L、Na₂-EDTA•2H₂O 7460 mg/L、肌醇20000 mg/L、烟酸100 mg/L、盐酸吡哆醇（维生素B6）100 mg/L、盐酸硫胺素（维生素B1）20 mg/L、甘氨酸400 mg/L。培养5周后，待用。五周龄的葡萄“左优红”组培苗如图1所示。

2、侵染菌液的制备：

（1）将保存于-80℃的含35S::GFP质粒的GV3101农杆菌菌株和p19菌株（购自生物工程公司）于3毫升含抗生素的YEB液体培养基中，在28℃，250转/分钟下的振荡培养箱中恢复培养10-12个小时。培养农杆菌所用的YEB液体培养基配方为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物1g/L，蔗糖5 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，pH 7.0。分装后121℃高压灭菌20 min，待冷却至室温后加入50 mg/L过滤灭菌的卡那霉素和利福平。

（2）恢复培养后，将它们转移至50毫升含抗生素的YEB液体培养基中，置于28℃，250转/分钟的振荡培养箱中扩大培养10小时。

（3）扩摇的菌液于离心机中在5000 转/分钟的速度下离心15分钟，去除上清液。

（4）将沉淀以悬浮液悬浮，置于28℃、250转/分钟振荡培养箱中。培养菌液至600nm波长下光密度值达到0.6。将含有重组质粒的GV3101菌液与经过同等情况处理（将p19菌株经过如上述农杆菌菌株同样的操作）的P19菌液等体积混匀后，置于28℃摇床轻摇20分钟备用。农杆菌的悬浮液配方为：10mM MES（pH 5.6），10mM MgCl2，2％(w/v)蔗糖，150 μM 乙酰丁香酮。

3、农杆菌对葡萄组培苗组织的侵染：

从培养5周龄的葡萄组培苗中选择处于第3、4叶位的叶片。除叶片外的其他组织（如根和茎）用此种技术则难以实现菌液的浸入，如图2、图3和表1所示。将叶片表面扎若干小孔后，置入装有30ml混合菌液的50ml注射器中，如图4所示。封注射器口，迅速拉至最大刻度处。反复3-5次，直至菌液完全进入。当菌液完全浸入叶片后，侵染后的叶子呈半透明状态。在这个过程中，除了注射器法还可以用真空泵法如图5和图6所示，但用注射器法达到的效果要远优于真空泵法，如图7和表2所示。

表1 相同浓度的菌液对不同葡萄组织处理后的效果对比

不同器官	叶片	茎	根
				阳性率	80%	0	0

表2 采用真空泵法和注射器法处理葡萄组培叶片的效果对比

抽真空方式	真空泵	注射器
			阳性率	0	80%

4、农杆菌侵染后的培养：

（1）如图8所示，用灭过菌的滤纸拭去植物组织上残留的菌液，并置于湿润的双层脱脂棉中，用保鲜膜封住瓷盘，以保持湿度，并扎小孔透气。

（2）将瓷盘置于26℃恒温培养箱中黑暗培养12 h之后，转移至光照培养箱培养4-5 d，光照培养箱条件设置为：26℃，2000 Lux 光照14 h/黑暗10 h。

（3）培养4-5天后将转基因材料用液氮冷冻后，提取RNA，反转录为cDNA。采用重组质粒中带有的GFP为标签进行PCR验证，不同培养天数叶片的转基因效果分别如图9和图10所示。

实施例2

本发明所述基因快速高效地在葡萄中瞬时转化的方法具体包括如下步骤：

1、葡萄组培苗的培养：

将市售葡萄品“赤霞珠”的幼嫩组织从大田取回，消毒水处理后，在超净工作台上剥取茎尖生长点，进行组织培养。葡萄组培苗培养基为MS固体培养基，配方为：NH₄NO₃ 33000 mg/L、KNO₃ 38000 mg/L、CaCl₂•2H₂O 8800 mg/L、MgSO₄•7H₂O 7400 mg/L、KH₂PO₄ 3400 mg/L、KI166 mg/L、H₃BO₃ 1240 mg/L、MnSO₄•4H₂O 4460 mg/L、ZnSO₄•7H₂O 1720 mg/L、Na₂MoO₄•2H₂O50 mg/L、CuSO₄•5H₂O 5 mg/L、CoCl₂•6H₂O 5 mg/L、FeSO₄•7H₂O 5560 mg/L、Na₂-EDTA•2H₂O7460 mg/L、肌醇20000 mg/L、烟酸100 mg/L、盐酸吡哆醇（维生素B6）100 mg/L、盐酸硫胺素（维生素B1）20 mg/L、甘氨酸400 mg/L。培养5周后，待用。五周龄的葡萄“赤霞珠”组培苗如图11所示。

2、侵染菌液的制备：

（1）将保存于-80℃的含35S::GFP质粒的GV3101农杆菌菌株和p19菌株于3毫升含抗生素的YEB液体培养基中，在28℃，250转/分钟下的振荡培养箱中恢复培养10-12个小时。实验中p19菌株对葡萄组培苗叶片转化效果的影响如表3所示。培养农杆菌所用的YEB液体培养基配方为：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物1 g/L，蔗糖5 g/L，MgSO₄•7H₂O 0.5 g/L，pH 7.0。分装后121℃高压灭菌20 min，待冷却至室温后加入50 mg/L过滤灭菌的卡那霉素和利福平。

表3 实验中p19菌株对葡萄组培苗叶片转化效果的影响

是否加p19菌株	否	是
			阳性率	0	80%

（2）恢复培养后，将他们转移至50毫升含抗生素的YEB液体培养基中，置于28℃，250转/分钟的振荡培养箱中扩大培养10小时。

（3）扩摇的菌液于离心机中在5000转/分钟的速度下离心15分钟，去除上清液。

（4）将沉淀以悬浮液悬浮，置于28℃、250转/分钟振荡培养箱中。培养菌液至600nm波长下光密度值达到0.6。不同菌液浓度处理葡萄组培叶片后的效果对比如表4所示。将含有重组质粒的GV3101菌液与经过同等情况处理的P19菌液等体积混匀后，置于28℃摇床轻摇20分钟备用。农杆菌的悬浮液配方为：10mM MES（pH 5.6），10mM MgCl₂，2％(w/v)蔗糖，150μM乙酰丁香酮。

表4 不同菌液浓度处理葡萄组培叶片后的效果对比

菌液浓度（OD₆₀₀）	0.5	0.6
			阳性率	40%	80%

3、农杆菌对葡萄组培苗组织的侵染：

（1）从培养5周龄的葡萄组培苗中选择处于第3、4叶位的叶片，将叶片表面扎若干小孔后，置入装有30ml混合菌液的50ml注射器中。

（2）封注射器口，迅速拉至最大刻度处。反复3-5次，直至菌液完全进入。当菌液完全进入后，叶子呈半透明状态。

4、农杆菌侵染后的培养：

（1）用灭过菌的滤纸拭去植物组织上残留的菌液，并置于湿润的双层脱脂棉中，用保鲜膜封住瓷盘，以保持湿度，并扎小孔透气。

（2）如图12所示，将瓷盘置于26℃恒温培养箱中黑暗培养12小时之后，转移至光照培养箱培养3-5天，光照培养箱条件设置为：26℃，2000 Lux 光照14小时/黑暗10小时。

（3）培养3-5天后将转基因材料用液氮冷冻后，提取RNA，反转录为cDNA。不同培养天数对瞬时转化效果的影响如表5所示。采用重组质粒中带有的GFP为标签进行PCR验证。如图13所示，进行PCR验证时以含35S::GFP的空质粒作为阳性；用H₂O代替DNA的扩增样品作为阴性对照。

表5 不同培养天数对瞬时转化效果的影响

培养时间（d）	3	4	5
				阳性率	14%	80%	60%

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述转化方法包括以下步骤：

2.根据权利要求 1 所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中农杆菌菌株为含35S::GFP质粒的GV3101菌株。

3.根据权利要求 1 所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中恢复培养和扩大培养的条件为在28℃，250转/分钟的振荡培养箱中培养。

4.根据权利要求 1 所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中农杆菌的悬浮液配方为：pH 5.6的10mM MES，10mM MgCl₂，质量体积比为2％的蔗糖，150μM乙酰丁香酮。

5.根据权利要求 1 所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（2）中将以悬浮液悬浮后获得的菌液培养至600nm波长下光密度值达到0.6。

6.根据权利要求 1 所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（3）中选择处于第3、4叶位的叶片。

7.根据权利要求 1 所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（3）中注射器的容量为50ml。

8.根据权利要求 1 所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（4）中经过黑暗培养12 h和光照培养4-5 d获得转基因材料。

9.根据权利要求 8所述的快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法，其特征在于：所述步骤（4）中光照培养的条件为：26℃，2000 Lux 光照14 h/黑暗10 h。