CN107267551A - 玫瑰RrNUDX1 基因在增强植物花香中的应用 - Google Patents

玫瑰RrNUDX1 基因在增强植物花香中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107267551A
CN107267551A CN201710622899.4A CN201710622899A CN107267551A CN 107267551 A CN107267551 A CN 107267551A CN 201710622899 A CN201710622899 A CN 201710622899A CN 107267551 A CN107267551 A CN 107267551A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rrnudx1
genes
flower
fragrance
petunia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710622899.4A
Other languages
English (en)
Inventor
冯立国
臧姝
生利霞
魏恬恬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN201710622899.4A priority Critical patent/CN107267551A/zh
Publication of CN107267551A publication Critical patent/CN107267551A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8262—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield involving plant development
    • C12N15/827—Flower development or morphology, e.g. flowering promoting factor [FPF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Abstract

本发明属于植物生物技术领域，公开了玫瑰基因RrNUDX1在增强植物花香中的应用。并提供了玫瑰RrNUDX1基因在培育香气浓郁的花卉新品种中的用途。利用本发明可以构建RrNUDX1基因的过表达载体，采用农杆菌介导法将过表达载体导入待转化花卉，获得转基因花卉新品种。

Description

玫瑰RrNUDX1基因在增强植物花香中的应用
技术领域
本发明公开了玫瑰基因RrNUDX1在增强植物花香中的应用，属于植物生物技术领域。
背景技术
玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)是世界上重要的天然香料植物，也是我国传统的药食同源花卉，单萜类化合物中的香茅醇、香叶醇、橙花醇及其乙酸酯类衍生物是形成玫瑰特征香气的主要成分。
单萜作为萜类化合物主要种类，大多分布在植物的腺体油室等分泌组织中，通常具有较强的香气和生物活性，单萜对于植物生存和人类生活具有重要作用，除了它们在植物防御中的功能外，单萜还用作香料和药物，同时许多名贵植物精油的主要成分均由单萜类化合物组成，如薄荷精油主要由柠檬醛和香芹酮组成。近年来，研究人员通过分离单萜生物合成途径中的关键酶基因，借助基因工程手段，选择性地调控单萜代谢途径，从而提高萜类合成前体和下游单萜类化合物的产量，达到改良植物香气以及精油品质的目的。
NUDX1属于Nudix水解酶基因家族，在细菌、病毒、真核生物中均有发现，研究表明，NUDX1基因是NUDX家族中唯一一个马特型酶，其蛋白以8-oxo-(d)GTP(8-氧化脱氧鸟苷三磷酸酶)、dNTP、NADH、Dihydroneopterin(二氢新蝶呤)为底物，能够有效清除细胞中因ROS氧化所受损的核苷酸，减少细胞内氧化损伤的累积，降低细胞突变和程序性死亡，增强对不良环境的适应力。玫瑰RrNUDX1基因的cDNA全长序列全长777bp，具有起始密码子、完整的开放阅读框453bp，终止密码子、5'非编码区68bp，3′非编码区244bp与poly(A)尾巴12bp，共编码151个氨基酸。基因登陆号为KX096710.1。但是，RrNUDX1基因的应用尚未有报道。
发明内容
本发明的目的是提供玫瑰RrNUDX1基因的应用。
本发明公开了玫瑰RrNUDX1基因在增强植物花香中的应用。
本发明还公开了RrNUDX1基因在培育香气浓郁的花卉新品种中的用途。
一种增强香气的转基因花卉新品种的培育方法，是构建RrNUDX1基因的过表达载体，采用农杆菌介导法将过表达载体导入待转化花卉，获得转基因花卉新品种。
本发明通过构建RrNUDX1基因的过表达载体，采用农杆菌介导法将pCAMBIA1304-RrNUDX过表达载体导入矮牵牛，待植株开花后，采用GC-MS技术检测盛开期矮牵牛花朵芳香成分，结果发现，与野生型相比，转RrNUDX1基因植株花中苯甲酸甲酯等主要香气成分的含量明显提高，且感官上能闻到浓郁的香气，说明过表达RrNUDX1基因具有增强植物花香的功能。
本发明利用现代分子生物学手段，挖掘出调控植物花香形成的关键基因，并培育出香气浓郁的花卉新品种，不仅可以提高切花和盆栽植物的商品价值，还可以提高花卉产品的质量及其经济价值，甚至可以提高植物精油的含量，改良精油的品质，具有重要的经济价值和巨大的潜在应用价值。
附图说明
图1矮牵牛植株转化过程；A:叶片预处理，B:侵染，C:生根，D:壮苗，E:移植。
图2PCR产物凝胶检测，M：Marker DL 2000 N：RrNUDX1的PCR产物。
图3重组质粒pCAMBIA1304-RrNUDX1的单酶切电泳图，
M1：Marker DL 15000 M2:Marker DL 2000 A1-A2:重组质粒单酶切 N:阴性对照。
图4RrNUDX1-1和RrNUDX1-2序列比较，
RrNUDX1-1：克隆的目的基因 RrNUDX1-2：重组质粒。
图5pCAMBIA1304-RrNUDX1农杆菌转化子菌液PCR电泳图
M：Marker DL 2000 P1-P3：pCAMBIA1304为模板 N1：ddH2O为模板 N2：农杆菌EHA菌液为模板 N3：YEB液体培养基为模板 A1-A7：pCAMBIA1304-RrNUDX1农杆菌转化子菌液为模板。
图6矮牵牛愈伤GUS染色结果
A:WT；B-D:转RrNUDX1基因愈伤。
图7转基因矮牵牛植株DNA验证
M:Marker DL2000；A1-A6:过表达抗性植株；P:pCAMBIA1304-RrNUDX1质粒；WT1-2:野生型。
图8野生型与转基因矮牵牛植株的表型观察
A:野生型与转RrNUDX1基因植株的生长状态；B:野生型植株开花状态；C:转RrNUDX1基因植株的开花状态。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
生物材料：pCAMBIA1304表达载体(Biovector公司，北京)、EHA105农杆菌(华越洋生物科技有限公司，北京)
实施例：
1玫瑰RrNUDX1基因转化矮牵牛与功能验证
1.1载体质粒与菌株
pCAMBIA1304表达载体和EHA105农杆菌均为本实验室保存。
1.2主要试剂的配制
(1)YEB液体培养基：0.05g MgSO4·7H2O、1g酵母提取物、5g蛋白胨、5g牛肉浸膏、5g蔗糖，用ddH2O溶解并定容至1000mL，调pH值至7.0，灭菌后4℃保存。YEB固体培养基：在YEB液体培养基的基础上加20g/L琼脂，灭菌后分装保存。
(2)Kan：母液50mg/mL。0.5g kan，溶于10mL灭菌ddH2O中，0.22μm滤膜过滤，用1.5mL离心管分装，-20℃保存。
(3)Rif：母液5mg/mL。0.05g Rif，溶于少量无水乙醇后用灭菌ddH2O定容到10mL，0.22μm滤膜过滤，用1.5mL离心管分装，-20℃保存。
(4)6-BA：母液0.1mg/mL。10mg 6-BA，用少量0.1moI/L的NaOH溶液溶解，最后用灭菌ddH2O定容至100mL，-20℃避光保存。
(5)IAA：母液0.1mg/mL。10mg IAA，用少量1mol/L的NaOH溶液溶解，定容至100mL，0.22μm滤膜过滤，-20℃避光保存。
(6)As：母液50μmol/L。0.1962g As，溶于DMSO定容至20ml，0.22μm滤膜过滤，-20℃避光保存。
(7)MES：母液10mg/mL。0.1g MES，溶于10mL灭菌ddH2O中溶解，0.22μm滤膜过滤，用1.5mL离心管分装，4℃保存。
(8)Cb：母液50mg/mL。0.5g Cb，溶于10mL灭菌ddH2O中溶解，0.22μm滤膜过滤，用1.5mL离心管分装，-20℃保存。
1.3矮牵牛遗传转化基本培养基
MS1：蔗糖30g/L+MS基本成分，pH5.8
MS2(愈伤分化)：MS1+6-BA 3.0mg/L+IAA 0.2mg/L，pH5.8
MS3(生根)：蔗糖30g/L+1/2MS，pH5.8
MS4(侵染液)：MS+MES 1mg/L+As 20mol/L，pH5.8
MS5(共培养)：MS2+As 20mol/L，pH5.8
1.4RrNUDX1基因过表达载体构建
1.4.1目的基因的初步获取
1.4.4.1引物的合成与设计
根据RrNUDX1基因(KX096710.1)cDNA全长序列分别设计上下游引物(引物所跨区域包含完整的CDs序列)，用于体外分离目的基因，引物信息如下：
表1扩增RrNUDX1基因开放阅读框的引物
1.4.4.2目的基因的PCR扩增
(1)反应体系为：
(2)反应条件：
X：退火温度
(3)将PCR反应液在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测。
1.4.4.3PCR产物的回收与纯化
参照TaKaRa公司的TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer.4.0试剂盒进行。
1.4.4.4PCR产物的连接、转化、扩大培养
目的片段的连接、转化参照Trans公司的pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit试剂盒说明书进行。
1.4.4.5质粒DNA的提取及检测
参照AXYGEN公司的AxyPrepTM Plasmid Minniprep Kit 50-prep试剂盒说明书提取，委托上海生工进行目的基因序列测序,将测序结果与已登录的RrNUDX1基因序列进行同源比对。
1.4.4.6RrNUDX1基因的克隆与序列分析
采用玫瑰品种‘唐红’花瓣提取的RNA，反转录成cDNA为模板，通过PCR扩增后产物电泳图如图2，可以看出，扩增片段介于500-750bp，与预期值相近。回收纯化扩增片段，插入pEASYTM-T5 Zero Cloning Vector，转入大肠杆菌在附加1‰Km的LB平板上筛选阳性克隆。测序结果显示，所克隆的目的基因序列为540bp左右，含起始密码子、终止密码子，编码151个氨基酸，经比对与已克隆的RrNUDX1基因相似性达100％，推测氨基酸序列相似性达100％。
1.4.2目的基因(含有酶切位点)的获取
1.4.2.1引物的设计与合成
根据In-Fusion试剂盒说明书要求，结合目的基因及双元表达载体pCAMBIA1304上的限制性酶切位点，设计用于过表达载体构建的PCR引物，引物名称及其寡核苷酸序列如下：
RrNUDX1单酶切引物：
RrNUDX1-F:5’-GGACTCTTGACCATGGTTATGGGAAACGAGACAGTTGTAG-3’(Nco I)(SEQIDNO.3)
RrNUDX1-R:5’-GTCAGATCTACCATGGTCATGTTGGAAAAGGGTTAAATC-3’(Nco I)(SEQIDNO.4)
1.4.2.2含有酶切位点目的基因的PCR扩增
以获取的含有RrNUDX1基因编码区序列的克隆载体质粒为模板，采用高保真酶进行PCR扩增反应，将NcoI酶切位点引入RrNUDX1基因编码区两端。
(1)反应体系为：
(2)反应条件：
(3)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物，切下含有目的片段的胶块并回收。
1.4.2.3双元表达载体pCAMBIA1304酶切及产物回收
(1)连接RrNUDX1基因的过表达载体pCAMBIA1304酶切反应体系为：
(2)反应条件：37℃3h；
(3)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。
1.4.2.4目的片段与表达载体的连接
将获取的目的基因与获取的过表达载体以1:3混合连接。
(1)连接反应体系为：
(2)PCR反应条件：50℃15min
1.4.3连接转化
目的片段的连接、转化参照Trans公司的pEASYTM-T5 Zero Cloning Kit试剂盒说明书进行。
1.5重组质粒的鉴定及检测
1.5.1酶切鉴定及检测
挑选LB固体培养皿上的单菌落，分别置于含3mL液体LB(含1‰Kan)的灭菌10mL离心管中，37℃200rpm振荡过夜培养后，提取pCAMBIA1304-RrNUDX1重组质粒的DNA。
对pCAMBIA1304-RrNUDX1进行单酶切鉴定，反应条件均为37℃3h，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。同时酶切pCAMBIA1304作为阴性对照，电泳检测结果如图3所示。可以看出，阴性对照N显示一条长约12000bp的条带，单酶切A1-A2切出一条约为500bp的条带，与RrNUDX1开放阅读框大小一致。因此，表明目的基因已初步插入表达载体pCAMBIA1304中。
将经酶切验证后的阳性重组质粒送测序，测序结果用DNAMAN分析(图4)，与已克隆结果进行比对，发现相似性为100％，无碱基突变，推测氨基酸序列完全相同，证明目的基因RrNUDX1已成功连入表达载体pCAMBIA1304，过表达载体pCAMBIA1304-RrNUDX1构建成功。并将测序正确的重组质粒于-20℃保存。
1.5.2重组质粒导入农杆菌EHA105及筛选鉴定
1.5.2.1农杆菌EHA105感受态制备
试验方法参照本实验室的方法进行农杆菌EHA105感受态制备
1.5.2.2液氮冻融法转化农杆菌
(1)在碎冰上将农杆菌EHA105感受态细胞慢慢融化，加入5μL重组质粒并混匀，置于冰上30min，1min液氮速冻，37℃热激5min，冰浴2min；
(2)加入800μL左右的不含抗生素液体YEB，120-160rpm，28℃，4-5h，在含有40mg/L的Rif和50mg/L的Kan的固体YEB上涂布300μL，28℃暗培养2d左右。
1.5.2.3农杆菌转化子的筛选鉴定
(1)挑取YEB平板上的单菌落，接种于含有3mL(含有40mg/L的Rif和50mg/L的Kan)液体YEB的灭菌10mL离心管中，28℃200rpm暗培养；
(2)菌液PCR检测阳性转化子；
(3)用1％的琼脂糖凝胶电泳检测产物。
1.5.2.4农杆菌转化子保存
将经菌液PCR鉴定为阳性转化子的农杆菌菌液中加入25％灭菌甘油，混匀后用1.5mL灭菌离心管分装，-70℃保存。
1.5.2.5结果
将检测正确的重组质粒(pCAMBIA1304-RrNUDX1)采用液氮冻融法导入农杆菌EHA105感受态，在附加有1‰Km和1‰Rif的YEB固体培养基上筛选阳性转化子，制成菌液后以其为模板进行菌液PCR验证，同时针对模板设置一组阳性对照(P)，三组阴性对照(N1、N2、N3)，以保证结果的准确性。产物经电泳检测显示(图5)，A1-A7均扩增出了长度为500bp左右的目的片段。
1.6矮牵牛遗传转化体系优化
1.6.1植物材料的获得
1.6.1.1无菌苗的获得
将矮牵牛种子置于75％的酒精中浸泡5min，无菌水冲洗3次，再用12.5％的次氯酸钠溶液中浸泡10min，无菌水冲洗3次，接种于1/2MS培养基上培养。
1.6.1.2组培苗移栽
当组培苗长到五叶一心时进行移栽，将瓶盖打开在常温中炼苗一周左右，然后移栽于人工温室气候箱，光/暗周期为16h/8h，光照强度为200umol.m-2s-1，温度为25℃/23℃，相对湿度为70％。
1.6.2矮牵牛遗传转化体系选择压和抑菌剂浓度的确定
1.6.2.1潮霉素选择压的确定
本试验构建的过表达载体pCAMBIA1304-RrNUDX1携带潮霉素(Hyg)抗性基因，因此确定Hgy为农杆菌介导的矮牵牛遗传转化的选择抗生素。在超净工作台上，选取生长旺盛的矮牵牛无菌苗，将叶片切为1cm2的叶盘，分别置于Hyg浓度为1、3、5、6、7、9、10、15mg/L的培养基MS1上，每个梯度处理30块叶片组织，培养30天，每15天更换1次培养基，重复3次。
从表2可以看出，Hyg的浓度越高，对外植体的分化影响越大，愈伤诱导和芽分化的临界值均为7mg/L，生根的临界浓度6mg/L，因此在选择培养时，分别使用相应浓度的Hyg进行筛选，确保阳性率的提高。
表2不同Hyg浓度对矮牵牛各时期分化的影响
1.6.2.2羧苄浓度的确定
本试验采用羧苄作为遗传转化的抑菌剂，在超净工作台上，选取生长旺盛的矮牵牛无菌苗，将叶片切为1cm2的叶盘，分别置于Cb浓度为100、200、300、400、500、600、700mg/L的培养基MS1上，每个梯度处理30块叶片组织，培养30天，每15天更换1次培养基，重复3次。
从表3可以看出，羧苄对外植体的生长没有明显的抑制作用，浓度为500mg/L时，对愈伤和芽分化有小幅度影响，浓度为500mg/L时，对生根有小幅度影响，故三种选择培养基的抑菌剂浓度均选择500mg/L。
表3不同Cb浓度对矮牵牛各时期分化的影响
1.6.2.3农杆菌侵染液的培养
(1)取出-70℃中含有目的基因的农杆菌菌株，在含有Km和Rif的YEB筛选培养基上划板，28℃暗培养2-3天；
(2)在YEB+Kan+Rif液体培养基中接种单菌落，培养OD为0.8-1.3；
(3)菌液PCR验证，确定菌液中目的基因的正确性；
(4)经过鉴定的菌液，加入50mL不含抗生素液体YEB在28℃200rpm震荡1-2天；
(5)将二次活化的菌液在4℃5000rpm离心12-15min后，收集菌体，再用事先准备好的侵染液(MS4)重悬稀释菌液OD为0.3-0.6备用。
1.7矮牵牛的遗传转化
1.7.1叶片的预处理
选取生长旺盛的矮牵牛叶片，在超净工作台上，切成1cm2的小方块，叶片腹面向下，置于MS固体培养基上暗培养2天。
1.7.2侵染
首先在共培养表面平铺无菌滤纸片；第二步将预先培养2天的材料放入已准备好的侵染液中侵染5-8min；第三步取出侵染后的叶片，用无菌滤纸吸干表面的菌液，置于共培养基(MS5)上培养3天。
1.7.3分化筛选培养
将共培养3天后的叶盘取出，用无菌滤纸吸干材料表面的菌液；转移至筛选培养基中诱导培养愈伤组织，置于植物组培室培养，每15d换一次培养基，直至长出再生苗。
1.7.4生根筛选培养
当筛选培养的愈伤组织分化出的再生苗长至2-3cm左右时，切下更换至生根筛选培养基中，没有分化出芽的愈伤组织需要切除褐化变黄的部分，转移到新的分化筛选培养基上，阳性植株2-3周即可生根(图1)。
1.8转基因矮牵牛的检测
采用GUS染色法和PCR法检测抗性植株。
1.8.1矮牵牛愈伤组织GUS染色
对潮霉素筛选下生长形态正常的矮牵牛愈伤组织进行GUS染色，结果显示，野生型呈黄白色，无GUS底物活性，转RrNUDX1基因的愈伤中染出了不同程度的蓝色(图6)，表明筛选标记基因GUS正常表达。
1.8.2转RrNUDX1基因的矮牵牛植株DNA验证
在获得的转RrNUDX1基因的矮牵牛植株中随机挑选6个单株，提取叶片DNA进行PCR扩增，结果显示6株中5株能扩增出单一的条带且大小为500bp左右，与转入的对照质粒产物大小相似，而野生型不能扩增出条带(图7)，由此可见RrNUDX1基因已经整合到矮牵牛基因组中。
1.9矮牵牛转基因植株表型观察
将野生型和转RrNUDX1基因的矮牵牛植株移栽于人工温室气候箱，相同培养条件下进行培养，观测记录转基因和野生型植株叶片的形态、开花时间、花朵大小、花色和花期等表型方面的变化，发现转基因植株长势变快。如图8
1.10矮牵牛花香成分分析
1.10.1HS-SPME取样
试验在扬州大学测试中心进行。取样前先将固相微萃取头在气相色谱进样口老化20min，老化温度250℃。分别盛开期的矮牵牛花朵3朵，用剪刀轻轻剪碎，混匀后称取1g，迅速置于l0mL样品瓶中，并在样品瓶底部加入内标物3-壬酮，然后迅速用聚四氟乙稀丁基合成橡胶隔片密封，将老化好的萃取头插入样品瓶顶空部分，于40℃(水浴)条件下吸附40min。
1.10.2GC-MS分析
吸附完成后将固相微萃取头抽回，插入气相色谱-质谱联用仪(Trace DSQ，美国Thermo公司)，于250℃解析2min，启动仪器采集数据。色谱条件：FFAP弹性石英毛细管色谱柱，长60m，内径0.32mm，液膜厚1.0μm；载气为He(99.99％)，不分流；程序升温，进样口250℃，柱温起始温度50℃保持1min，以5℃/min升温至120℃，再以8℃/min升温至200℃，最后以12℃/min升温至250℃，保持7min。质谱条件：GC-MS接口温度250℃，离子源温度200℃，电离方式EI，电子能量70eV，发射电流200μA；扫描质量范围29～600amu。
1.10.3花香成分的定性和定量分析
定性方法：未知化合物质谱图经计算机检索同时与NIST library和Wileylibrary2个质谱库相匹配，并结合人工图谱解析及资料分析。仅报道正反匹配度均大于800(最大值1000)的鉴定结果。
定量方法：选择3-壬酮为内标，其浓度为0.8μg/μl，加入体积为2μL。采用SIM(选择离子检测)方式定量。计算公式如下：香气成分含量(μg/g)＝[该组分的峰面积/内标的峰面积×内标浓度(μg/μL)×内标体积]/样品重量(g)。
1.10.4结果
结果如表4和表5，从表4可以看出，矮牵牛叶片挥发性成分主要以酯类化合物为主，野生型和转基因植株主要挥发性物质为亚油酸甲酯、叔十六硫醇、棕榈酸甲酯、顺式-十八烷酸甲酯、亚麻酸甲酯等。转RrNUDX1基因的矮牵牛中亚油酸甲酯的含量有所提高，其他成分的含量变化不明显，说明RrNUDX1基因转化后对矮牵牛叶片挥发性成分影响甚微。
表4野生型和转基因矮牵牛叶片主要挥发性成分及含量比较(μg/μl)
从表5可以看出，矮牵牛花香主要成分为酯类和醇类化合物，含量最高的为苯甲酸甲酯。与野生型相比，转基因矮牵牛花中未发现新的挥发性物质，即过表达RrNUDX1基因未改变矮牵牛MD的花香组分。我们选择了10种主要香气成分进行统计分析(这10种香气成分之和占矮牵牛花中香气成分总量的80.10％)，发现转基因矮牵牛酯类花香成分中，除苯甲酸苄酯外含量均有所提高，苯甲酸甲酯含量增加最明显，在转基因植株RrNUDX1-1花中，苯甲酸甲酯含量是野生型植株的1.69倍；醇类物质以苯甲醇、苯乙醇为主，转基因植株RrNUDX1-1和RrNUDX1-2中苯甲醇含量比野生型提高了25.58％、53.49％；另外，两种主要酚类物质含量也有所增加，转基因植株中异丁香酚的含量分别是野生型植株的3.2、4.3和4.9倍。
表5野生型与转RrNUDX1基因矮牵牛花香成分及含量比较(μg/μl)
2、结论
综合上述结果，我们发现，与野生型相比，转RrNUDX1基因矮牵牛植株花中苯甲酸甲酯等主要香气成分的含量明显提高，且感官上能闻到浓郁的香气，说明过表达RrNUDX1基因具有增强矮牵牛花香的功能，这为我们接下来利用RrNUDX1基因提高其它植物花香奠定了突破性基础。
SEQUENCE LISTING
<110> 扬州大学
<120> 玫瑰RrNUDX1基因在增强植物花香中的应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggaaacg agacagttgt ag 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcatgttgga aaagggttaa atc 23
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggactcttga ccatggttat gggaaacgag acagttgtag 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtcagatcta ccatggtcat gttggaaaag ggttaaatc 39

Claims (3)

1.玫瑰RrNUDX1基因在增强植物花香中的应用。
2.RrNUDX1基因在培育香气浓郁的花卉新品种中的用途。
3.一种增强香气的转基因花卉新品种的培育方法，其特征在于，是构建RrNUDX1基因的过表达载体，采用农杆菌介导法将过表达载体导入待转化花卉，获得转基因花卉新品种。
CN201710622899.4A 2017-07-27 2017-07-27 玫瑰RrNUDX1 基因在增强植物花香中的应用 Pending CN107267551A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710622899.4A CN107267551A (zh) 2017-07-27 2017-07-27 玫瑰RrNUDX1 基因在增强植物花香中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710622899.4A CN107267551A (zh) 2017-07-27 2017-07-27 玫瑰RrNUDX1 基因在增强植物花香中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107267551A true CN107267551A (zh) 2017-10-20

Family

ID=60078697

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710622899.4A Pending CN107267551A (zh) 2017-07-27 2017-07-27 玫瑰RrNUDX1 基因在增强植物花香中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107267551A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107312794A (zh) * 2017-07-27 2017-11-03 扬州大学 玫瑰RrNUDX1基因在改变植物花期中的应用
CN111500625A (zh) * 2020-05-18 2020-08-07 扬州大学 一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法
CN111548400A (zh) * 2020-05-18 2020-08-18 扬州大学 一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1382798A (zh) * 2001-04-26 2002-12-04 上海博德基因开发有限公司 一种多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5以及具有这个二磷酸腺苷核糖二磷酸酶的药学化合物
CN101466259A (zh) * 2005-05-10 2009-06-24 孟山都技术有限公司 用于植物改良的基因及其用途
CN104694491A (zh) * 2015-01-19 2015-06-10 华中农业大学 玫瑰的花青素还原酶RrANR基因及其编码蛋白和应用
CN107312794A (zh) * 2017-07-27 2017-11-03 扬州大学 玫瑰RrNUDX1基因在改变植物花期中的应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1382798A (zh) * 2001-04-26 2002-12-04 上海博德基因开发有限公司 一种多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5以及具有这个二磷酸腺苷核糖二磷酸酶的药学化合物
CN101466259A (zh) * 2005-05-10 2009-06-24 孟山都技术有限公司 用于植物改良的基因及其用途
CN104694491A (zh) * 2015-01-19 2015-06-10 华中农业大学 玫瑰的花青素还原酶RrANR基因及其编码蛋白和应用
CN107312794A (zh) * 2017-07-27 2017-11-03 扬州大学 玫瑰RrNUDX1基因在改变植物花期中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEAN-LOUIS MAGNARD等: "Biosynthesis of monoterpene scent compounds in roses", 《SCIENCE》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107312794A (zh) * 2017-07-27 2017-11-03 扬州大学 玫瑰RrNUDX1基因在改变植物花期中的应用
CN107312794B (zh) * 2017-07-27 2019-12-03 扬州大学 玫瑰RrNUDX1基因在改变植物花期中的应用
CN111500625A (zh) * 2020-05-18 2020-08-07 扬州大学 一种利用发根农杆菌诱导产生玫瑰毛状根的方法
CN111548400A (zh) * 2020-05-18 2020-08-18 扬州大学 一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用
CN111548400B (zh) * 2020-05-18 2022-03-08 扬州大学 一种玫瑰花香调控基因RrMYB114及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109153988A (zh) 植物的基因组编辑方法
CN107936104A (zh) 牡丹PsMYB12转录因子及其编码基因与应用
CN103882054B (zh) 一种将外源基因转入菊花或近缘种进行瞬时表达的方法
CN106916848A (zh) 一种在桃果实中实现基因瞬时表达的方法
CN108070594A (zh) 烟草腺毛ttr1启动子、其表达载体及其应用
CN102599052A (zh) 一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用
CN107267551A (zh) 玫瑰RrNUDX1 基因在增强植物花香中的应用
Maliga et al. Plastid transformation in Nicotiana tabacum and Nicotiana sylvestris by biolistic DNA delivery to leaves
CN115466749A (zh) 一种银杏bZIP类转录因子GbbZIP08在促进植物类黄酮合成中的应用方法
CN106755080A (zh) 一种快速高效地在葡萄中瞬时转化基因的转化方法
CN107312794B (zh) 玫瑰RrNUDX1基因在改变植物花期中的应用
KR20210011394A (ko) Crispr/cas9 시스템을 이용하여 플라보노이드 생합성 유전체를 편집하기 위한 조성물 및 이의 이용
CN103525816B (zh) 一种姜花花部特异和伤害、虫害诱导的tps2启动子及其应用
JP2007312635A (ja) クエン酸分泌能が強化された樹木およびその作出方法
CN103233039A (zh) 一种农杆菌介导的水稻幼苗转基因方法
CN103146748A (zh) 农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法
Hassanein et al. Direct gene transfer study and transgenic plant regeneration after electroporation into mesophyll protoplasts of Pelargonium× hortorum,‘Panaché Sud’
CN104988176B (zh) 一种提高杜仲含胶量的方法
Wang et al. Overexpression of ß-1, 4-Glucanase Gene EuEG1 Improves Micrografting of Eucommia ulmoides.
CN106811448B (zh) 棉花酪氨酸蛋白磷酸酶GhPTP1及其编码基因和应用
RU2519652C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИОННОЙ КУЛЬТУРЫ ТРАНСГЕННОГО ТАБАКА Nicotiana tabacum L., СОДЕРЖАЩЕГО ГЕН UIDA
CN117187294B (zh) BnaC5.ACBP4基因在提高植物耐水淹性中的应用
CN108660143A (zh) 一种甘蓝型油菜BnKCS1-2基因及其构建的载体和应用
CN116375835B (zh) 一种燕子花MYB4b蛋白在调控植物叶片形态中的应用
CN116286863B (zh) 多核苷酸在促进兰科植物芽体生长中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20171020