CN1382798A - 一种多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5以及具有这个二磷酸腺苷核糖二磷酸酶的药学化合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多肽－二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5,和具有这个二磷酸腺苷核糖二磷酸酶的药学化合物。本发明还公开了此多肽用于治疗多种疾病的方法,如原发性高血压、消化性溃疡、肾病综合征、支气管哮喘、震颤麻痹等。本发明还公开了编码这种新的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶－38.5的多核苷酸的用途。

Description

一种多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5以及具有这个二磷酸腺苷核糖二 磷酸酶的药学化合物

本发明属于生物领域，描述了一种纯的具有生物活性的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，和具有这个二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的药学化合物。

在所有的细胞中，二磷酸腺苷核糖(ADP-核糖)是NAD+和(ADP-核糖)蛋白单体的代谢产物，此外，在高等生物中它是多聚二磷酸腺苷核糖以及CADP-核糖的水解产物。如果在体内积聚，它会成为潜在的生物毒素。通过二磷酸腺苷核糖的非酶促糖化能力来调节蛋白质组胺酰基、赖胺酰基以及半胱氨酰基基团，并且还能通过这种能力来连接ATP激活的K+通道。

Nudix水解酶家族的一些成员对于二磷酸腺苷核糖具有高度的专一性，并且在它们底物特定的范围内包含有二磷酸腺苷核糖。这些水解酶是二磷酸化酶也可能是焦磷酸化酶，它们能够产生AMP以及5’-磷酸核糖作为产物。这些特异的酶包括NUDT5以及Nudt5等等，它们具有更大的底物专一性并且能以不同的效率对诸如ADP-糖、NADH以及Ap3A等底物进行降解。这些Nudix水解酶可能在保持细胞内的二磷酸腺苷核糖在亚毒素的水平具有重要作用，而Nudix水解酶家族的主要的功能是清理作用。

我们这里所研究的人类NUDT9基因编码了一个特殊的镁离子依赖的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶，它是以两种结合变体的形式存在的：NUDT9α以及NUDT9β。NUDT9α可能具有线粒体N-末端目标信号的作用。由于如上所述二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5蛋白在调节细胞分裂和胚胎发育等机体重要功能中起重要作用，这种蛋白可能构成开发疾病诊断和/或治疗药的基础。

本发明的另一个目的是提供生产二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的方法。

本发明的另一个目的是提供纯化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的方法。

本发明的另一个目的是提供了针对本发明多肽——二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的模拟化合物、拮抗剂、激动剂、抑制剂。

本发明的另一个目的是提供诊断治疗与二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5异常相关的疾病的方法。

本发明也涉及一种药物组合物，它含有本发明多肽或其模拟物、激活剂、拮抗剂或抑制剂以及药学上可接受的载体。

本发明还涉及本发明的多肽和/或多核苷酸在制备用于治疗原发性高血压、消化性溃疡、肾病综合征、支气管哮喘、震颤麻痹或其它由于二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5表达异常所引起疾病的药物的用途。

本发明涉及悬浮液的浓缩物，按照本发明在给药前不久将该浓缩物转变成浮悬制剂。

这些浓缩物可以具有各种组成。本发明也包括浓缩液和/或悬浮剂与稀释所需要的溶剂或溶液之间的进一步的组合，由此得到了本发明的悬浮剂。

本发明也涉及另外的表现形式或各种表现形式的结合，所有这些最终都导致了本发明的注射液。

本说明书和权利要求书中使用的下列术语除非特别说明具有如下的含义：

“生物活性”是指具有天然分子的结构、调控或生物化学功能的蛋白质。类似地，术语“免疫学活性”是指天然的、重组的或合成蛋白质及其片段在合适的动物或细胞中诱导特定免疫反应以及与特异性抗体结合的能力。

“拮抗剂”或“抑制物”是指当与二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5结合时，一种可封闭或调节二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的生物学活性或免疫学活性的分子。拮抗剂和抑制物可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的分子。

“激动剂”是指当与二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5结合时，一种可引起该蛋白质改变从而调节该蛋白质活性的分子。激动剂可以包括蛋白质、核酸、碳水化合物或任何其它可结合二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的分子。

本发明纯化步骤的顺序是：阳离子交换，亲和层析，超滤，凝胶渗透(加上回收组分的超滤)和阴离子交换。

在此纯化方法后，用的都是传统技术。为了储藏或处理的目的，产物就应该被冻干。其它对于影响产物浓缩、稳定或其它过程的合适的步骤已经成熟。可以将本发明的酶及其模拟物、激动剂、拮抗剂和抑制剂与合适的药物载体组合后用。这些载体可以是水、葡萄糖、乙醇、盐类、缓冲液、甘油以及它们的组合。组合物包含安全有效量的多肽或拮抗剂以及不影响药物效果的载体和赋形剂。这些组合物可以作为药物用于疾病治疗。

本发明还提供含有一种或多种容器的药盒或试剂盒，容器中装有一种或多种本发明的药用组合物成分。与这些容器一起，可以有由制造、使用或销售药品或生物制品的政府管理机构所给出的指示性提示，该提示反映出生产、使用或销售的政府管理机构许可其在人体上施用。此外，本发明的多肽可以与其它的治疗化合物结合使用。

药物组合物可以以方便的方式给药，如通过局部、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或皮内的给药途径。二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5以有效地治疗和/或预防具体的适应症的量来给药。施用于患者的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的量和剂量范围将取决于许多因素，如给药方式、待治疗者的健康条件和诊断医生的判断。

二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5可以以水和/或油注射剂加应用，或作为与某种酸或碱形成的盐来使用。以前药的形式，例如酯，加以应用也是可能的。

作为注射用时，除了水外，肌肉注射的水悬浮液也可以含有液体赋形剂，例如，乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、三甘醇。各种物质的缓冲溶液如磷酸盐、柠檬酸盐、三羟甲基氨基甲烷、抗坏血酸盐、乙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、葡糖酸和乳酸盐的缓冲液均可用于调节PH值使之尽量在生理范围之内(大约PH7.4)或作为缓冲之用。本发明水溶液制剂的PH为4.5-8.5，最好是6.5-7.5。水悬浮液的同渗重摩(osmolality)是200-900 m osmol/kg，最好是260-390mosmol/kg，而且可通过加入氯化钠、葡萄糖、果糖、甘油、山梨醇、甘露糖醇、蔗糖、木糖醇或这些物质的混合物，来调节到一个适当的等渗条件。

此外，还可以应用一些其他的配方试剂，例如增调剂(如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯吡咯烷酮、明胶等)，吸附剂，光的遮蔽剂，吸附抑制剂，结晶阻滞剂，络合剂(如，NaEDTA、磷酸盐、硝酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐以及其他盐)抗氧化剂(抗坏血酸、亚硫酸盐化含物、L-半胱氨酸、亚硫基二丙酸、硫羟乳酸、单疏代甘油、酸丙酯(propyl gall-ate)等)，防腐剂(PHB酯、酚及其衍生物、有机汞化合物、氯丁醇、苯甲醇、乙醇、1，3-丁二醇、benzalkonium chlorideChlorhexidline salts、苯甲酸及其盐、山梨酸及其他)。如果合适的话，局部麻醉剂，比如像普鲁卡因盐酸盐、利多卡因盐酸盐诸如此类，可以加进水悬浮液中。

在制备水悬浮液时，必须保颗粒的大小在0.5-150μm。特别为4-40μm。可以通过控制混合活性物质的不同大小颗粒来实现活性物质自肌内悬浮库的控制释放。

对于水悬浮液的情形，90％颗粒的大小最好在10-20μm。水悬浮液的粘励5-500mPa·s，最好是10-130mPa·s。

二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的水悬浮液可以采用不同的方法制备。一种方法是将某种促旋酶抑制剂活性化合物以微粒形式加进水赋形介质中，当然包括已经提及的辅助剂；采用这种工艺时，应该严格保证不能使结晶的生长超出上述界限。在某些情况下，活性化合物必须先制作成它的一种稳定的水合物的形式，然后再进一步加工成一种悬浮液。如果最后灭菌不宜用加热法的话，那么好必须在无菌条件下进行，使用的活性化合物和辅料要经过预处理。最后，采用辐射灭菌方式是可行的。

二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的水悬浮液还可以通过控制从溶液中沉淀的方法加以制备。例如，将活性化合物溶解某种生理上可耐受的酸中是可行的。这些酸包括盐酸、甲磺酸、丙酸、琥珀酸、戊二酸、柠檬酸、富马酸、马来酸、酒石酸、谷氨酸、葡糖酸、葡糖醛酸、半乳糖醛酸、抗坏血酸、磷酸、己二酸、羟乙酸、硫酸、硝酸、乙酸、苹果酸、L-天冬氨酸、乳酸、羟乙磺酸、乳糖酸和草酸或者各种氨基酸，如L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨、L-谷氨酸、甘氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸和L-丝氨酸，如果需要可以缓慢温热至20-80℃

通常使用的酸是过量的，例如，根据欧洲专利申请86114131.5和84110474.8的规定。然后，加入一种生理上可以耐受的碱溶液来调节PH至7(生理PH)，碱溶液有如氢氧化钠、氢氧化钾或麦格鲁明(meglumine)，最后活性化合物从溶液中沉淀出来。另一方面，也可以将二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5活性化合物溶解在前述一种碱的碱性介质，然后前述的一种酸将其沉淀出来。

然而，酸和碱溶液可以在不加压情况合并，也可以加压，压力范围为2到100巴。通过限定条件来控制悬浮液中形成颗粒大小是可能的。实际的沉淀操作也可以使用高速搅拌器，旋转-固定均化器，高压均化器(100-1000巴)和其他类似方法以助于均化作用。如果因为可能使颗粒长大而不能在最后灭菌，可以在无菌条件下制备悬浮液，即将预先灭菌并在另一种严格灭菌条件下进行无菌过滤的酸和碱的组分在无菌条件下混合。有时可以应用前述的防腐剂或其结合物，加入一适当的剂量以保无菌制作。最后的灭菌也可以应用了γ-射线灭菌的方式。

另外，还有一种形式可以提供，即这种制剂含有的活性化合物是干的，没有液体赋形剂。分装的液体赋形剂只是在给药前临时与处方中的固体组分相混合，在这种情况下必须充分振摇以保证固体颗粒在液相中的均匀分布。

在上述和下面讨论的各种肌肉汪射制剂中，油性基质含有水溶性、结晶或无定形的活性化合物，例如以盐酸盐乳酸盐、菜酸盐、对一甲苯磺酸盐或其他与生理耐受性好的酸所形成的盐，基于油性基质的肌肉注射液还可含有表面活性物质，例如呈大豆卵磷脂、鸡蛋卵磷脂、脑卵磷脂或油菜卵磷脂形式的各种卵磷脂或其他生理耐受性好的表面活性剂，其浓度为0.1-30％，特别是0.2-10％，尤其是5.5-5.5％W/V，油性基质的肌内注射剂除了含有活性化合物的水溶性盐以外，还含有过量的生理上可耐受的酸，如乳酸或柠檬酸，其范围为1-300mmol/L，特别是5-50mmol/L，最好是10-30mmol/L。这种油性基质的肌内注射剂是本发明最特别的目的。

二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的油质悬浮液所含活性化合物是以内盐的形式或水溶性盐的形式存在。

油质悬浮液可以含有非水赋形剂，诸如杏仁油、花生油、橄榄油、罂粟子油、芝麻油、棉子油、豆油、玉米油、蓖麻油、油酸乙酯、油酸油酯、十四烷酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、中等链长的三甘油酯等。

可以与所提及的物质合并使用的其它赋形剂还有乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、1，3-丁二醇、苯甲醇、各种来源的二乙二醇和三乙二。醇、Pluronic类型的聚氧乙烯和聚氧丙烯的共聚体、聚氧脱  水山梨醇脂肪酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、甘油-油酸酯、Cremophor EL、imwitor742以及不同种类的卵磷脂诸如大豆卵磷脂、鸡蛋卵磷脂、脑卵磷脂和油菜卵磷脂等。

用来作为抗氧剂的有a-、p-、Y-和6-维生素E、棕榈酸抗坏血酸脂、硬脂酸抗坏血酸酯、L-半胱氨酸、亚硫基二丙酸、硫羟乳酸、巯基乙酸、甲硫代甘油、酸丙酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯及其他。

有时，某种要求粘度可以加人像乙醇或苯甲醇稀释剂和象硬脂酸铝增稠剂来获得。由于吸附的增加，所以可以加入某些酸。油悬浮剂的粘度值为5-500mPa·S，最好是10-15Pa·s

油悬浮剂的制备是通过将油性赋性剂同其中所包含的辅料和活性化合物相混合来进行，活性化合物已事先用适当的仪器粉碎成所希望顺粒大小(参见前面)并将混合物匀化。90％的颗粒大小为0.5-150μm。最好时4-12μm。如果因为活性化合物的颗粒大小可能发生变化而不能在释放容器中进行最后灭菌的话，那么悬浮剂必须在无菌条件下制作。同时也指明了含有适当的溶解的辅料的油相的无菌过滤方法，例如通过加热处理对活性化合物进行灭菌预处理。最后的灭菌也可以应用Y-射线灭菌除了作好的悬浮剂以外，还可以提供一种在给药前不久进行制作的新鲜的制剂。在这种情况下，活性化合物必须在一个短时间内在振摇装有制剂的容器时，能够均匀的悬浮在液体赋性剂中。

用于装载悬浮液、活性化合物、溶剂和其他的表现形式如悬浮液浓缩物的容器可以用玻璃或塑料制作。此处容器的材质可以含有某些物质，这些物质对于内容物可以起着特殊的保护作用，比如避光或与氧隔绝。对小体积容器，其中的悬浮液在给药之前必须被抽进注射器之中，在此，也可以把这些容器做成注射系统。

本发明的各种注射剂均被应用于人体或动物体的治疗。

下面给出一些疾病的例子，能够用本发明的化合物预防、缓解或治愈的各种疾病(包括但不限于)：

二磷酸腺苷核糖(ADP-核糖)是NAD+和(ADP-核糖)蛋白单体的代谢产物，此外，在高等生物中它是多聚二磷酸腺苷核糖以及CADP-核糖的水解产物。如果在体内积聚，它会成为潜在的生物毒素。这些Nudix水解酶包括NUDT5以及Nudt5等等可能在保持细胞内的二磷酸腺苷核糖在亚毒素的水平具有重要作用，而Nudix水解酶家族的主要的功能是清理作用。

我们这里所研究的人类NUDT9基因编码了一个特殊的镁离子依赖的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶，在体内，其表达的异常将导致机体代谢产物的堆积，引起一系列疾病，这些疾病包括但不限于：一.心血管疾病

  心力衰竭，原发性高血压，动脉粥样硬化，冠状动脉粥样硬化性心脏病，心肌病，病毒性心肌炎等；二.消化系统疾病

  胃炎，消化性溃疡，胃癌，溃疡性结肠炎，Crohn病，肝硬化，原发性肝癌，急性胰腺炎，胆石病等；三.泌尿系统疾病

  原发性肾小球疾病，慢性肾小球肾炎，肾病综合征，阵发性睡眠性血红蛋白尿，溶血尿毒综合征，肾盂肾炎，急慢性肾功能不全，肾移植，慢性前列腺炎等；四.呼吸系统疾病

  上呼吸道感染，支气管哮喘，呼吸衰竭，成人呼吸窘迫综合征(ARDS)，阻塞性肺气肿，慢性肺源性心脏病，肺水肿，肺炎等；五.代谢内分泌疾病

   糖尿病，肝豆状核变性，慢性淋巴细胞性甲状腺炎，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮(SLE)等；六.血液系统疾病

   缺铁性贫血，巨幼细胞性贫血，再生障碍性贫血，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺陷症，海洋性贫血，骨髓增生异常综合征，急性白血病，淋巴瘤，多发性骨髓瘤，弥散性血管内凝血(DIC)等；七.神经系统疾病

   脑水肿，颅脑损伤，高血压性脑出血，蛛网膜下腔出血，脑梗死，震颤麻痹，癫痫，病毒性脑炎等；八.新生儿疾病

  新生儿窒息，新生儿吸入综合征，新生儿缺血缺氧性脑病，新生儿上呼吸道感染，新生儿肺炎，新生儿透明膜病，支气管肺发育不良，新生儿败血症，新生儿硬肿症，地中海贫血等；九.外科疾病

  肺癌，食管癌，胃癌，胸部创伤等；十.妇产科疾病

  流产，胎膜早破，子宫内膜异位症，妊娠高血压综合症，子宫颈癌，外阴恶性肿瘤，子宫内膜癌等；十一.五官科疾病复发性口腔溃疡，牙髓炎，口腔鳞癌，喉癌，突发性耳聋，老年性白内障等；十二.其他，如多脏器功能失调综合征、休克等；综合上述，本发明的多肽以及该多肽的拮抗剂，激动剂和抑制剂可直接用于多种疾病的诊治，例如原发性高血压、消化性溃疡、肾病综合征、支气管哮喘、震颤麻痹等。下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由 所界定的本发明范围。

图1为分离的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的聚丙烯酰胺凝胶电泳图(SDS-PAGE)。39kDa为蛋白质的分子量。箭头所指为分离出的蛋白条带。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的克隆

用异硫氰酸胍/酚/氯仿一步法提取人胎脑总RNA。用Quik mRNA Isolation Kit(Qiegene公司产品)从总RNA中分离poly(A)mRNA。2ug poly(A)mRNA经逆转录形成cDNA。用Smart cDNA克隆试剂盒(购自Clontech)将cDNA片段定向插入到pBSK(+)载体(Clontech公司产品)的多克隆位点上，转化DH5α，细菌形成cDNA文库。用Dyeterminate cycle reaction sequencing kit(Perkin-Elmer公司产品)和ABI 377自动测序仪(Perkin-Elmer公司)测定所有克隆的5′和3′末端的序列。将测定的cDNA序列与已有的公共DNA序列数据库(Genebank)进行比较，结果发现其中一个克隆Nudt的cDNA序列为新的DNA。通过合成一系列引物对该克隆所含的插入cDNA片段进行双向测定。结果表明，Nudt克隆所含的全长cDNA为1666bp(如Seq ID NO：1所示)，从第295bp至1347bp有一个1053bp的开放阅读框架(ORF)，编码一个新的蛋白质(如Seq ID NO：2所示)。我们将此克隆命名为pBS-Nudt，编码的蛋白质命名为二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。实施例2：用RT-PCR方法克隆编码二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的基因

用胎脑细胞总RNA为模板，以oligo-dT为引物进行逆转录反应合成cDNA，用Qiagene的试剂盒纯化后，用下列引物进行PCR扩增：

Primer1：5’-GGCAGAGAGAAAGTTACGAGGTTC-3’(SEQ ID NO：3)

Primer2：5’-TGATCAAGAATTTATCTTTATTCT-3’(SEQ ID NO：4)

Primer1为位于SEQ ID NO：1的5’端的第1bp开始的正向序列；

Primer2为SEQ ID NO：1的中的3’端反向序列。

扩增反应的条件：在50μl的反应体积中含有50mmol/L KCl，10mmol/LTris-Cl，(pH8.5)，1.5mmol/L MgCl₂，200μmol/L dNTP，10pmol引物，1U的Taq DNA聚合酶(Clontech公司产品)。在PE9600型DNA热循环仪(Perkin-Elmer公司)上按下列条件反应25个周期：94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 2min。在RT-PCR时同时设β-actin为阳性对照和模板空白为阴性对照。扩增产物用QIAGEN公司的试剂盒纯化，用TA克隆试剂盒连接到pCR载体上(Invitrogen公司产品)。DNA序列分析结果表明PCR产物的DNA序列与SEQ ID NO：1所示的1-1666bp完全相同。实施例3：重组二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的体外表达、分离和纯化

根据SEQ ID NO：1，设计出一对特异性扩增引物，序列如下：

Primer3：5’-CCCCATATGATGGCGGGACGCCTCCTGGGAAAG-3’(Seq ID No：5)

Primer4：5’-CCCGAATTCCTACAACGCATGGCAGTCAGCTTC-3’(Seq ID No：6)

此两段引物的5’端分别含有NdeI和BamHI酶切位点，其后分别为目的基因5’端和3’端的编码序列，NdeI和BamHI酶切位点相应于表达载体质粒pET-28b(+)(Novagen公司产品，Cat.No.69865.3)上的选择性内切酶位点。以含有全长目的基因的pBS-Nudt质粒为模板，进行PCR反应。PCR反应条件为：总体积50μl中含pBS-Nudt质粒10pg、引物Primer-3和Primer-4分别为10pmol、Advantage polymerase Mix(Clontech公司产品)1μl。循环参数：94℃ 20s，60℃ 30s，68℃ 2min，共25个循环。用NdeI和BamHI分别对扩增产物和质粒pET-28(+)进行双酶切，分别回收大片段，并用T4连接酶连接。连接产物转化用氯化钙法大肠杆细菌DH5α，在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB平板培养过夜后，用菌落PCR方法筛选阳性克隆，并进行测序。挑选序列正确的阳性克隆(pET-Nudt)用氯化钙法将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plySs(Novagen公司产品)。在含卡那霉素(终浓度30μg/ml)的LB液体培养基中，宿主菌BL21(pET-Nudt)在37℃培养至对数生长期，加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续培养5小时。离心收集菌体，经超声波破菌，离心收集上清，用能与6个组氨酸(6His-Tag)结合的亲和层析柱His.Bind Quick Cartridge(Novagen公司产品)进行层析，得到了纯化的目的蛋白二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。经SDS-PAGE电泳，在39kDa处得到一单一的条带(图1)。将该条带转移至PVDF膜上用Edams水解法进行N-端氨基酸序列分析，结果N-端1 5个氨基酸与SEQ ID NO：2所示的N-端15个氨基酸残基完全相同。

实施例4：根据本发明纯化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5

准备或调整发酵物的浓缩液(centrat)，或其它任何来源(如血清)的不纯的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5溶液以便用阳离子交换基质进行层析，同时防止二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的多聚化(通过加入正率酸)和蛋白酶活性(通过加热或选择不含损害水平的蛋白酶的酵母)。优选地是加入辛酸钠(色谱溶液13(CS13)-表2)至终浓度1-10mM，例如约5mM以稳定二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。用乙酸(CS09)调pH至4.3-4.8，优选地为4.5±0.1最优选地为±0.05)，电导率检测应小于5.5smScm^-1。

来源于某些宿主菌株或种的培养物上清含有在后续过程中能降解重组人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的蛋白酶。这种情况下；这种蛋白酶的活性可通过对含有重组人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的培养物上清加热处理以破坏。通常1-10mM辛酸钠足以防止重组人的蛋白的热变性，在60-80℃的温度下30秒至10分钟足以使蛋白酶失活。随后；上清可进一步如前所述地调节。如果不存在蛋白酶的降解作用，优选地省略热处理。

层析

    所有的操作均可在室温下(20±0℃)进行。层析柱中二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的上样量(g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基质)取决于用SDS-PAGE(在SP-FF柱的情况下)或GP-HPLC(对所有其它柱)确定的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5滴度(g/L)。每一步骤的过程可用连机的紫外吸收，如在254或280nm测定来监测。

第一步纯化步骤中阳离子基质的使用使大部分从酵母发酵中得到低分子量有色物质直接通过柱子，而那些与基质结合的也是弱的结合且能用诸如1M氯化钠的高离子强度的盐洗涤液去除。因此；不象阴离子基质，其不可逆地吸附那类物质；阳离子基质可再生并用于纯化中第一步的层析的多次循环。因而，这一步骤形成了耐用的商品化的层析方法的基础。

在本实施例中应用Cibacron蓝型柱作为第一步纯化对于特异地用于去除一种由于其物理化学特征；如大小和等电点而难以从二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5中去除的45KDa的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5片段是新颖的。该片段令人吃惊地比全长的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5能更强地与染料结合，因而可将它们分离。

二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5纯化中所用的层析液详细列于表1中。因为在二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5纯化中大量使用，并且相对廉价，这种缓冲盐溶液因其工业上可提供高纯度的形式和与其它通常用于缓冲液的如TriS、HEPES或MOPS相比廉价而最适于本方法。其它的缓冲液可代替表2中所列，如相近pKa值的缓冲液(如苹果酸对乙酸)，但在大多数情况下，价钱如在大范围的适用性排除了他们的应用。其它的盐形式的使用取决于其可溶性，可工业上提供及低价格。然而，在CS06和CS10柱中包含四硼酸盐离子有特殊的益处因为其在与大分子的碳水化合物部分复合和使其与基质中的阴离子基团紧密结合起特别的作用。这一结果可以增加洗脱液中二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的纯度。

层析可使用轴流式柱(axial flow columns)，如由Pharmacia提供的那种，或辐流式柱(radial flow columns)，如由Sepragen提供的那种。在本实施例中，所用的柱子都是轴流式。

缓冲溶液可按下述浓度扼配制；或者配制浓缩的贮存液，使用时即时混和或稀释。

表1  用于纯化实施例中的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的层析溶液

溶液		成分	浓度(g/L-1)	PH	电导率(mSm-1)
						CS01	SP-EF平稳液	CH3COONa.3H2OCH3COOH(冰)	3.690.220	5.45-5.65	1.9-2.2
CS02	SP-EF洗脱液	CH3COONa.3H2OCH3COOH(冰)	13.60.750	5.45-5.65	6.5-7.5
						CS03	DBA洗脱液	NaClCH3COONH4NaOH	1173.840.680	9.0-9.4	125-165
CS04	0.5MnaOH	NaOH	20.0	＞12	80-120
						CS05	凝胶渗透	CH3COONa.3H2OCH3COOH(冰)辛酸NaOH	4.940.3800.7210.190	5.4-5.6	2.9-3.3
CS-06	DE-EF洗脱液	Na2B4O7.10H2ONACl	7.625.84	8.9-9.3	11.7-13.5
						CS07	20mMNaOH	NaOH	0.800	＞12	3.5-5.5
CS08	DE-FF平衡液	CH3COONa.3H2OCH3COOH(冰)辛酸NaOH	4.940.380.7210.190	5.4-5.6	2.9-3.3
						CS09	乙酸	CH3COOH	Clacial
CS10	DE-FF洗涤液	Na2B4O7.10H2O	7.62	9.0-9.4	2.3-2.9
						CS11	DE-FF预平衡液	CH3COONa.3H2OCH3COOH(冰)	61.82.98	5.5-5.7	24-28
CS12	DBS平衡液/洗涤液	NaClCH3COONH4NaOH	11.70.9600.150	8.8-9.2	18-22
						CS13	2M辛酸钠	辛酸NaOH	28876.0	7.7-8.2
CS14	1.73M磷酸	H3PO4(85％(w/w))	200	＜1.2
						CS15	2M氨	NH4OH(30％NH3(w/w))	113ml

阳离子交换层析：二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是用阳离子交换层析，从至少是酵母蛋白(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是来源于酵母发酵的重组人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5和其它抗原，低分子量杂质和色素化合物中纯化和浓缩。本方法采用的是商品化的阳离子交换基质，如SP-琼脂糖FF，SP-多孔微球硅胶(Spenerosil)，CM-琼脂糖FF，CM-纤维素，SE-纤维素或S-葡聚糖凝胶。优选的基质是SP-琼脂糖FF(Pharmacia)床高5-25cm，优选地为10-15cm，本实施例为12.scm，柱的上样量为10至50g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基质；优选地为40±10g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基质。基质以缓冲液平衡以去除碱性贮存液，缓冲液优选地应具足够的缓冲能力以降低ph至约pH6.0、如CS01的缓冲液用于去除柱中的CS07贮存液；然而，任何PH小10于6.0的缓冲液都可使用。当柱流出液的PH值约6对时，即可判断为平衡完成。

调整的浓缩液(centrate)以一定的流率加入层析柱，例如以1.0-8.0cm/min；优选地为4.0-7.0cm/min，本实施例为6.36cm/min，然后以一种溶液洗涤柱子以去除残留的杂质。这种洗涤溶液应为PH＜6.0并且电导率15低于5mScm^-1’；优选地低于3mScm^-1以防二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5被洗脱。合适的溶液是CS01。前面的步骤都以6.36cm/min的流率进行；对于洗脱和所有随后的步骤流率降至0.5-5cm/min，优选地为2.0-4.0c./min。本实施例为3.18cm/min，以减少洗脱的体积、增加离子强度将有效地洗脱二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5；使用电导率范围在5-10mscm^-1的溶液，优选地为6-8mscm^-1，本实施例使用CS02。当紫外吸收信号上升至1.0A₂₈₀/cm以上时开始收集二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，直至紫外吸收信号降至0.6A₂₈₀/Cm或收集的最大体积达65倍柱体积时为止。层析柱然后用CS03和04清洗，贮藏于CS07。

亲和层析：这一步进一步纯化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，以去除45KDa二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5N-末端片段，酵母抗原(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是来源于酵母发酵的重组人{多肽名称})和色素。亲和基质可包括任何型的结合二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5Cibacron0蓝染料，如活性蓝2，Procion蓝HB，蓝琼脂糖，蓝丙烯酰基和其它蒽醌型化合物。该基质优选地是下述的“Delta蓝琼脂糖”基质。这可降低基质产生蓝浸出液的程度和增强基质的碱稳定性以有助于洗涤和去热原。和商品化的基质相比，进一步改进的基质是在染料(活性蓝2)和基质之间引入一间隔基团，1，4—二氨基丁烷。这对于二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5纯品的洗脱而言；间隔基团的长度是合适的。

活性蓝结构中邻位，间位或对位异构体或任何其混合物都可使用。优选的异构体是邻位SO₃型，但难以制备理想的纯度，故使用间位异构体。氨丁酞一活性蓝2的制备达到用分析型高效液相色谱测定至少整个峰区占98％的纯度。还可通过使用粗的商品化的染料，其必须纯化氨丁酰衍生的染料，或使用纯的合成的染料。在后一种方法中，开始用的染料物质应在分析型高效液相色谱280nm测定纯度至少为98％。这种材料由ACL，Isle of Man提供。通过加热混和物至60℃，使活性蓝2与1，4-二氨基丁烷在水中反应，然后以混合物中纯化修饰的染料，如通过沉淀。然后氨丁酰-活性蓝2与基质偶合，例如与3-氯-1-2-环氧丙烷活化的琼脂糖CL-6B(Pharmacia，瑞典)偶合。见Porath等(1971)色谱杂志(J.Chromatog)60，167-177。这种Delta蓝琼脂糖(DBA)基质的染料的含量优选地是50±5mmol/g干重。

蓝基质的使用：本方法使用DBA；床高10-30cm，优选地为20-30cm(本实施例为25Cm，柱的上样量为7.14g重组人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基质；优选地为8-12g/L(本实施例为10±1g二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5/L基质)。所有步骤以0.3-2.cm/min的流率进行，优选地为1.-2.0Cm/min。本实施例中为153cm/min。DBA在来源自CS07的CS01中平衡；当柱中流出液的ph约为9.5时，平衡完成。层析之前；SP-FF的洗脱液用氨调节…约为8.5-9.5，优选地PH9.0，然后上样至层析柱。上样完毕后；层析柱以1-5倍体积的电导率10-30mScm^-1；优选地是15-25mSm^-1的缓冲液洗涤以去除杂质，例如用CS12，优选地以5倍体积。二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5用电导率大于100mScm^-1，优选地为125-165mScm^-1的高离子强度的缓冲液洗脱，例如用CS03。当紫外信号(A₂₈₀/cm)升至高于0.4对时开始收集洗脱液，在信号再次低于0.4时停止。层析柱再用CS04洗涤并贮存于CS07。

中间体超滤：这一步为进行凝胶渗透层析而浓缩二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。超滤装置中的纤维素型滤膜(最小分子量截留低于或相当于30,000，例如10,000)用于浓缩DBA洗脱液以保持二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5浓度20-120g/L，优选地为80-100g/L。使用后，滤膜以水或表3中的CS03或CS05冲洗去残留的蛋白质，并以0.1M的氢氧化钠清洗。滤膜可贮存于20mM的氢氧化钠中。凝胶渗透层析。这一步纯化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是针对酵母蛋白(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是来源于酵母发醇的重组人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，色素和二聚化的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5并进行缓冲液交换的步骤。本方法使用商品化的凝胶渗透基质，如交联葡聚糖凝胶G100；G150，G250，Sephacryl S-100，S-200或S-300，Toyopearl HW50S或琼脂糖凝胶6或12。优选地，基质为SePhacryl-200HR(Pharmacia)凝胶床高度大于60cm，最好在90cm(3×30cm)。层折柱在CS05中平衡并以0.1-1.5cm/min，优选地为0.5-1.0cm/min的流率进行层析，在本实施倒流率为0.75cm/min；然后当层析柱的ph达到9.5时，将中间体超滤所得的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5上样至层析柱。上样体积约相当2-9％细层析柱体积，优选地为5-8％，本实施例为柱体积的7.5％。二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5组分分三部分收集：弃去最初小量的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5二聚体直至A₂₈₀/Cm上升至指针满偏(FSD)的10％；这时开始连续收集回收的组分直至达满偏的90％；然后所收集的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5作为初级产品组分。这一连续收集直至A280降至5％满偏值之下，之后的流出液再直接弃去。回收初级产品组分分开收集。重复这一步骤直至所有原料上样至层析柱。

S-200HR回收超滤：一种标称截流分子量等于或小于30,000，或如本实施例所用的10,000的纤维素型滤膜置于超滤装置中，用以浓缩汇集的回收组分至保留浓度为20-120g/L二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5；优选地为80-110g/L。使用后的滤膜按中间体超滤中所述方法处理。

另一种选择是，在本方法的任何超滤步骤中，标称截流分子量30.000的聚醚枫或PVDF膜可代替纤维素型的滤膜。这种膜由Amicon和Millipore提供。最好选用适宜NaOH贮存和清洗的滤膜。

S-200HR回收超滤保留物的纯化。从回收超滤所得的保留物上样至和初级S-200纯化同样的层析柱，从每个峰收集产物组分；然后与前面收集的大量的初级产物组分混和。重复这一步骤直至所有的原料上样至层析柱。

阴离子交换层析：这一步的目的是纯化二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5以去除至少酵母抗原(如果二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是来源自酵母发酵的重组人二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5和含色素的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。本方法使用的阴离子交换基质，如QMA-多孔微球硅胶(SPherosil)，DEAE-SPherodex，Q-Hvper D，DEAE-纤维素，QAE-纤维素或W-DMAE或DEAE分级凝胶(Fractogel优选地。基质用商品化的阴离子交换基质二乙氨基乙基琼脂糖凝胶-FF(DEAE Sepharose-FF)(Phannacia)，床高在5-25cm范围内根据方便选择，优选地为10-15cm，如12.scm，柱的上样量为每升基质10-60g，优选地为35±15g/L基质。层析柱首先以强的缓冲液平衡将pH迅速降至工作范围，如pH4.5-6.0，优选地为约出5.5的乙酸钠，以CS11为例。使用浓的缓冲液之后，在加S200洗脱液于柱子之前，用一种低电导率，即范围在1-4mSm^-1。优选地为2.5-3.5mSm^-1。例如CS08的溶液平衡层析柱。所用的线性流率为1.0-8.0cm/min，优选地为3.0-7.0cm/min，本实施例为4.4cm/min。上样完毕后，层析柱以5-30mM范围，优选地是15-25mM的四硼酸钠溶液洗涤，例如用CS10。这导致洗脱二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5组分之前，任何含碳水化合物的杂质更强地粘附在层析柱上。用任何范围在10-20mScm^-1的高离子强度的溶液可有效地洗脱，优选地用CS06。当A₂₈₀/cm达到0.4时开始连续收集洗脱液直至吸收峰降至0.8以下。

因此，在本实施例中；纯化步骤的顺序是：阳离子交换，亲和层析，超滤，凝胶渗透(加上回收组分的超滤)和阴离子交换。

实施例6  药剂的配制

本发明获得含有二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的制剂后。既然该物质在冻干后仍具有活性，可适合制成注射剂。

用生理盐水和/或其他合适的稀释液配制含有二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5冻干粉的注射液。

一些赋形剂可作为药物的组成部分，诸如甘露醇、乳糖、糖胶、葡萄糖、蔗糖及其他混合物。其他的一些载体、填充物及诸如此类可以使用。混合物亦可。

根据本发明，实验中乳糖被作为注射药的赋形剂。

在制备注射剂中，PH值通过常规酸或碱调定。酸包括醋酸等。碱包括氢氧化钠等。混合物亦可。

还需要一种或多种稳定剂比如白蛋白等。

制备每20000安瓿含75国际单位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，制法如下：

适量的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5冻干粉末溶于700ml冷水中，如必须，可用醋酸或氢氧化钠(视情况而定)，将PH值调至6.2-6.8。然后通过0.2微米的小孔过滤器过滤消毒。200克乳糖溶于2立升冷水中，注射用，如上法过滤消毒后加入二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5溶液中。将冷水加至15立升，然后将溶液等分至0.75ml/安瓿，并在消毒冻干器冻干。这样所得的安瓿含有75国际单位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5和10ml乳糖。

每安瓿含有150国际单位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5是首选剂量。

根据进一步的配制实例，每安瓿还需含有1mg人白蛋白作为赋形剂乳糖的稳定剂。

这些特例对本发明进行了描述，但可以理解此外在本发明的所及范围内还有许多可变性。

                            序列表

(1)一般信息：

  (ii)发明名称：二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5及其编码序列，以及含有其成分的药学化合物

  (iii)序列数目：6

(2)SEQ ID NO：1的信息：

  (i)序列特征：

   (A)长度：1666bp

   (B)类型：核酸

   (C)链性：双链

   (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：1  GGCAGAGAGAAAGTTACGAGGTTCGTGGCCGCGGTTTCCCCAGGCAGCTGGCGCTGGAGG61 CTTCGGCGTCACGTGCTGGTCTGGATTTTTCTCGATGCACTGGGGAAAGCGGTGGACTCT121 TATCGTGGGAGGGCTCTTGATCTGTGATTTATAGATAGGCACAGGGAACCCAACGGCAGA181 CAGGTCCTAGTGCCCATCAGATACCCGCGGCCGGGACTCGGAGCTGTGGGGTGTGGGGAG241 GCGGAGGCACCAACTAAGAGCGACCTAGCATCGCAAAGCCGCCTCGGGGCGCTCATGGCG301 GGACGCCTCCTGGGAAAGGCTTTAGCCGCGGTGTCTCTCTCTCTGGCCTTGGCCTCTGTG361 ACTATCAGGTCCTCGCGCTGCCGCGGCATCCAAGCGTTCAGAAACTCGTTTTCATCTTCT421 TGGTTTCATCTTAATACCAACGTCATGTCTGGTTCTAATGGTTCCAAAGAAAATTCTCAC481 AATAAGGCTCGGACGTCTCCTTACCCAGGTTCAAAAGTTGAACGAAGCCAGGTTCCTAAT541 GAGAAAGTGGGCTGGCTTGTTGAGTGGCAAGACTATAAGCCTGTGGAATACACTGCAGTC601 TCTGTCTTGGCTGGACCCAGGTGGGCAGATCCTCAGATCAGTGAAGGTAATTTTTCTCCC661 AAGTTTAACGAAAAGGATGGGCATGTTGAGAGAAAGAGCAAGAATGGCCTGTATGAGATT721 GAAAATGGAAGACCGAGAAATCCTGCAGGACGGACTGGACTGGTGGGCCGGGGGCTTTTG781 GGGCGATGGGGCCCAAATCACGCTGCAGATCCCATTATAACCAGATGGAAAAGGGATAGC 841   AGTGGAAATAAAATCATGCATCCTGTTTCTGGGAAGCATATCTTACAATTTGTTGCAATA901   AAAAGGAAAGACTGTGGAGAATGGGCAATCCCAGGGGGGATGGTGGATCCAGGAGAGAAG961   ATTAGTGCCACACTGAAAAGAGAATTTGGTGAGGAAGCTCTCAACTCCTTACAGAAAACC1021   AGTGCTGAGAAGAGAGAAATAGAGGAAAAGTTGCACAAACTCTTCAGCCAAGACCACCTA1081   GTGATATATAAGGGATATGTTGATGATCCTCGAAACACTGATAATGCATGGATGGAGACA1141   GAAGCTGTGAACTACCATGACGAAACAGGTGAGATAATGGATAATCTTATGCTAGAAGCT1201   GGAGATGATGCTGGAAAAGTGAAATGGGTGGACATCAATGATAAACTGAAGCTTTATGCC1261   AGTCACTCTCAATTCATCAAACTTGTGGCTGAGAAACGAGATGCACACTGGAGCGAGGAC1321   TCTGAAGCTGACTGCCATGCGTTGTAGCTGATGGTCTCCGTGTAAGCCAAAGGCCCACAG1381   AGGAGCATATACTGAAAAGAAGGCAGTATCACAGAATTTATACTATAAAAAGGGCAGGGT1441   AGGCCACTTGGCCTATTTACTTTCAAAACAATTTGCATTTAGAGTGTTTCGCATCAGAAT1501   AACATGAGTAAGATGAACTGGAACACAAAATTTTCAGCTCTTTGGTCAAAAGGAATATAA1561   GTAATCATATTTTGTATGTATTCGATTTAAGCATGGCTTAAATTAAATTTAAACAACTAA1621   TGCTCTTTGAAGAATCATAATCAGAATAAAGATAAATTCTTGATCA

(3)SEQ ID NO：2的信息：

  (i)序列特征：

   (A)长度：350个氨基酸

   (B)类型：氨基酸

   (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：多肽

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：1 Met  Ala  Gly  Arg  Leu  Leu  Gly  Lys  Ala  Leu  Ala  Ala  Val  Ser  Leu16 Ser  Leu  Ala  Leu  Ala  Ser  Val  Thr  Ile  Arg  Ser  Ser  Arg  Cys  Arg31 Gly  Ile  Gln  Ala  Phe  Arg  Asn  Ser  Phe  Ser  Ser  Ser  Trp  Phe  His46 Leu  Asn  Thr  Asn  Val  Met  Ser  Gly  Ser  Asn  Gly  Ser  Lys  Glu  Asn61 Ser  His  Asn  Lys  Ala  Arg  Thr  Ser  Pro  Tyr  Pro  Gly  Ser  Lys  Val76 Glu  Arg  Ser  Gln  Val  Pro  Asn  Glu  Lys  Val  Gly  Trp  Leu  Val  Glu91 Trp  Gln  Asp  Tyr  Lys  Pro  Val  Glu  Tyr  Thr  Ala  Val  Ser  Val  Leu106 Ala  Gly  Pro  Arg  Trp  Ala  Asp  Pro  Gln  Ile  Ser  Glu  Gly  Asn  Phe121 Ser  Pro  Lys  Phe  Asn  Glu  Lys  Asp  Gly  His  Val  Glu  Arg  Lys  Ser136 Lys  Asn  Gly  Leu  Tyr  Glu  Ile  Glu  Asn  Gly  Arg  Pro  Arg  Asn  Pro151 Ala  Gly  Arg  Thr  Gly  Leu  Val  Gly  Arg  Gly  Leu  Leu  Gly  Arg  Trp166 Gly  Pro  Asn  His  Ala  Ala  Asp  Pro  Ile  Ile  Thr  Arg  Trp  Lys  Arg181 Asp  Ser  Ser  Gly  Asn  Lys  Ile  Met  His  Pro  Val  Ser  Gly  Lys  His196 Ile  Leu  Gln  Phe  Val  Ala  Ile  Lys  Arg  Lys  Asp  Cys  Gly  Glu  Trp211 Ala  Ile  Pro  Gly  Gly  Met  Val  Asp  Pro  Gly  Glu  Lys  Ile  Ser  Ala226 Thr  Leu  Lys  Arg  Glu  Phe  Gly  Glu  Glu  Ala  Leu  Asn  Ser  Leu  Gln241 Lys  Thr  Ser  Ala  Glu  Lys  Arg  Glu  Ile  Glu  Glu  Lys  Leu  His  Lys256 Leu  Phe  Ser  Gln  Asp  His  Leu  Val  Ile  Tyr  Lys  Gly  Tyr  Val  Asp271 Asp  Pro  Arg  Asn  Thr  Asp  Asn  Ala  Trp  Met  Glu  Thr  Glu  Ala  Val286 Asn  Tyr  His  Asp  Glu  Thr  Gly  Glu  Ile  Met  Asp  Asn  Leu  Met  Leu301 Glu  Ala  Gly  Asp  Asp  Ala  Gly  Lys  Val  Lys  Trp  Val  Asp  Ile  Asn316 Asp  Lys  Leu  Lys  Leu  Tyr  Ala  Ser  His  Ser  Gln  Phe  Ile  Lys  Leu331 Val  Ala  Glu  Lys  Arg  Asp  Ala  His  Trp  Ser  Glu  Asp  Ser  Glu  Ala346 Asp  Cys  His  Ala  Leu

(4)SEQ ID NO：3的信息

  (i)序列特征

   (A)长度：24碱基

   (B)类型：核酸

   (C)链性：单链

   (D)拓扑结构：线性

 (ii)分子类型：寡核苷酸

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GGCAGAGAGAAAGTTACGAGGTTC

(5)SEQ ID NO：4的信息

  (i)序列特征

   (A)长度：24碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TGATCAAGAATTTATCTTTATTCT(6)SEQ ID NO：5的信息

(i)序列特征

 (A)长度：33碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CCCCATATGATGGCGGGACGCCTCCTGGGAAAG(7)SEQ ID NO：6的信息

(i)序列特征

 (A)长度：33碱基

 (B)类型：核酸

 (C)链性：单链

 (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：寡核苷酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CCCGAATTCCTACAACGCATGGCAGTCAGCTTC

Claims (13)

1、一种分离的多肽-二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，其特征在于它包含有：SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽、或其多肽的活性片段、类似物或衍生物。

2、如权利要求1所述的多肽，其特征在于所述多肽、类似物或衍生物的氨基酸序列具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列至少95％的相同性。

3、如权利要求2所述的多肽，其特征在于它包含具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽。

4.如权利要求1所述的多肽，在每毫克冻干粉末中含有大概6200国际单位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的这样规格下，具有特有的活性。

5.与权利要求1所述的多肽相关的能够进行治疗的药学化合物，和药学上的赋形体。

6.如权利要求5所述的药学化合物，它的赋形体是乳糖。

7.如权利要求5所述的药学化合物，它的一个计量单位中含有75个国际单位的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。(如另有一个计量单位，可作为权利要求8)

8.如权利要求1所述的多肽，在每毫克冻干粉末中含有6200国际单位二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的这样规格下，具有特有的活性。

9.二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5的肌内注射剂，其中含有0.05-70％的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5，适当时，可作为与酸和碱形成的盐或作为前药，制剂形式为水性或油性悬浮液。

10.根据权利要求9的肌内注射剂在于{多肽名称}颗粒的大小为0.5-150μm，最好为4-40μm。

11.根据权利要求9的肌内注射剂的其特征在于：它们的同渗重摩(osmolality)是200-900 m osmol/kg，最好是260-390 m osmol/kg。

12.根据权利要求9、10、11的肌内注射剂，其特征是它们含有2.5-50％(重量)的二磷酸腺苷核糖二磷酸酶-38.5。

13.根据权利要求9的肌内注射剂在治疗人体和动物体方法的应用。

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