JPS60222424A - インタ−ロイキン−２組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は医薬品などとして有用なインターロイキン−２
組成物に関する。

従来の技術 インターロイキン−２（以下ＩＬ−２と略称することが
ある月ま生体内で免疫調節に中心的な役割をはたしてお
り直接的あるいは間接的に癌の排除や免疫失調からの回
復やその改善に働くと考えられているＴ細胞やナチュラ
ルキラー細胞の増殖因子としての機能を有する蛋白質で
ある〔ネイチャー、第３０２巻、８０５−８１０頁（１
９８８月。

かかる生理作用を有するためＩＬ−２は新しい制癌剤あ
るいは免疫失調治療剤としての応用が強く期待されてい
る。

発明が解決しようとする問題点 本発明者らは、ＩＬ−２が不安定であって水溶液の保存
、凍結あるいは凍結乾燥の操作および凍結乾燥後の保存
において、とりわけ凍結乾燥を行う際の乾燥操作におい
て容易に活性が減じ、また凍結乾燥品の再溶解した液に
濁りを認める等の問題点を有し、医療用等に用いる上で
はなはだ不都合であることを見い出した。

かかる事実に鑑み、本発明者らは鋭意研究を進めた結果
、安定なＩＬ−２組成物の製造に成功し、本発明を完成
した。

問題点を解決するための手段 本発明は、ヒト血清アルブミンを配合し、溶液状態でｐ
Ｈｓ〜６を示すように調整したＩＬ〜２組成物を提供す
るものである。

本発明のＩＬ−２は、哺乳動物のものであればいかなる
ものでもよいが、ヒトのものが好ましい。

またＩＬ−２は、天然の、あるいは遺伝子組み換え技術
で得られるいずれのものでもよく、遺伝子組み換え技術
で得られるものが有利に用いられ、通常ＩＬ−２水溶液
として用いる。

好ましいＩＬ−２の例として式 ％式％ （１） 〔式中、ＸはＭｅｔまたは水素を示す〕で表わされる遺
伝子組み換え技術で製造される非グリコジル化ヒトＩＬ
−２ｆａ：挙げることができ、これらの混合物でもよい
。

なお式（１）においてアミノ酸残基は、ＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢ　コミッション　オン　バイオケミカル　ノメンク
レイチャによる略号で示した。

またＩＬ−２の比活性は２０，０００〜ｇｏ、ｏｏ。

単位／”９であることが望ましく、ＩＬ−２水溶液とし
て１〜８０，０００単位／ｌｕｇ、とりわけ１０〜５０
．０００単位／ｍｌの活性を有するものが有利に用いら
れる。上記本発明の原料としてのＩＬ−２水溶液は食塩
等の塩を含まないものが好ましく、ＩＬ−２の精製工程
等で塩が混在した場合は、限外沢過等によりこれを除去
して用いることが好ましい。

ヒト血清アルブミン（以下１１８　Ａと略記する〕とし
ては、いかなるものでもよいが、本組成物を臨床応用す
るためには、非経口投与に用いる程度の品質のものが好
ましい。

例えば、健康人血漿を原料としてＣｏｈｎのエタノール
分画第６法によって、分画精製したものが用いられる。

また安定剤としてアセチルトリプトファンナトリウムや
、カプリル酸ナトリウムを含有するものであってもよい Ｈ８Ａは上記濃度ＩＬ−２水溶液に対し水溶液１ｍ／当
り０．１”ｉ’　〜５０ｍ？、とりわけ０．５η〜２０
〜含有させることが好ましい。

本発明のＩＬ−２組成物には前記Ｈ８Ａに加えグリシン
、グルタミン酸、アスパラギン酸、アラニン、プロリン
などのアミノ酸とりわけモノアミノ脂肪族アミノ酸、も
しくは環状アミノ酸、ブドウ糖、マンノースなどの単糖
類、ソルビット、マンニット等の糖アルコール類、およ
びこれらの生理学的に許容できる塩もしくは誘導体の１
種または２種以上を配合してもよい。これら配合剤のう
ちでも、とりわけグリシンが好ましい。

上記配合剤は、上記ＩＬ−２水溶液水溶液１リＪ当糖類
または糖アルコール類に関しては１０〜１００■、アミ
ノ酸に関しては５〜５０ｍ９７ｍ１配合することが好ま
しい。

さらに本発明のＩＬ−２組成物は食塩などの等張化剤、
コハク酸、酒石酸、クエン酸等の緩衝剤、界面活性剤な
どを含有していてもよい。しかし、凍結乾燥時の安定化
の観点からは、本発明の■Ｌ−２組成物は食塩を含まな
いものが好ましい。

本発明のＩＬ−２組成物を溶液状態でｐＩ−１８〜６、
好ましくはｐｎａ〜５．５、とりわけｐＨ３，５〜４．
５を示すように調整するために、グルタミン酸など酸性
アミノ酸を配合する場合は該物質で、または塩酸、リン
酸等の鉱酸、もしくはコハク酸。

酒石酸、クエン酸等の緩衝剤で所定のｐＨに調製する。

本発明のＩＬ−２組成物は、水溶液、凍結晶。

凍結乾燥品の形態が好ましく、とりわけ凍結乾燥品が好
ましい。

本発明の組成物は、たとえば以下の方法により製造する
ことができる。

Ｉ　Ｌ−２７ｒ　１〜８０，０００単位／ｌｕｌ含有す
る水溶液に、Ｈ８’Ａｙ前記所定の濃度になるように加
え、前記した方法でｐＨ調整を行なう。

単糖類、糖アルコール類、アミノ酸などもそこに記載し
た濃度として加えることもできる。また所望により等張
化剤、界面活性剤なども加えることができる。なお、Ｈ
８Ａ以外の物質を添加する場合には、最終水溶液のｐＨ
が前記ｐＨを示すように、前記した方法でｐＨ調節を行
う。かくして得られる水溶液としてのＩＬ−２組成物は
、下記の凍結および凍結乾燥品の原料としても用いるこ
とができる。

凍結晶としてのＩＬ−２組成物は、たとえば上記水溶液
を通常−８０〜−２０°Ｃで凍結することにより製造で
きる。該凍結組成物は一８０°〜−１０°Ｃで保管する
ことが好ましい。

凍結乾燥品としてのＩＬ−２組成物は、例えは上記凍結
組成物を常法により減圧乾燥するか上記水溶液または上
記凍結組成物の融解により得られろ水溶液を、所望によ
り小分けし、上記同様凍結した後、常法により減圧乾燥
することにより製造することができる。

また前記の方法により製造し、ＩＬ−２，１−１８Ａ及
びｐＨ調節剤等を含有する凍結乾燥品を、例えば前記し
た単糖類、糖アルコール類、アミノ酸等を含有し、所望
により塩酸等でｐＨ調整された溶解液によって再溶解す
ることによって溶液状態としての本発明のＩＬ−２組成
物を製造することができる。

注射用製剤としての本発明の凍結乾燥したＩＬ−２組成
物を製造する場合は、１１，２を含有する水溶液および
配合剤含有水溶液をそれぞれ除菌濾過して混合するか、
これらの混合液を小分けする前に除菌濾過等により精製
し、無菌操作によりバイアル瓶等に分注小分けした後上
記凍結乾燥処理に付すことが好ましい。

また、アミノ酸や単糖類あるいは糖アルコール類を含有
する水溶液で、凍結乾燥品を溶解する場合には、その水
溶液は除菌濾過し、無菌操作によリアンブル等に分注小
分後、常法により蒸気滅菌したものを用いることが好ま
しい。

作　用 本発明のＩＬ−２組成物は、保存中および凍結や凍結乾
燥操作におけるＩＬ−２活性の低下が少なく、また凍結
乾燥品においてはその再溶解時の溶状が澄明である点等
に優れた特徴を有するものである。

本発明のＩＬ−２組成物、とりわけその凍結乾燥品は、
その外観が向上し、その器壁への吸着が防止される効果
をも奏するものである。

さらにアミノ酸を配合した組成物は凍結乾燥品とした場
合にその外観が向上し、注射剤として投与する場合の疼
痛を軽減する効果をも奏する。

また単糖類を配合した組成物は注射剤として投与する場
合の疼痛を軽減する効果をも奏する。

本発明のＩＬ−２組成物の中で、とりわけ凍結乾燥品は
、安定化されたＬＬ−２の粉末として得られ、とりわけ
非経口投与製剤として有利に用いることができる。注射
用製剤として用いる場合には通常用時、凍結乾燥組成物
Ｙ０．５〜１００ｍＪの注射用蒸留水、生理食塩液等に
溶解するか、グリシン等のアミノ酸、ブドウ糖等の単糖
類、またはマンニット等の糖アルコール類の必要であれ
ばｐＨ調整された水溶液を凍結乾燥組成物の専用の溶解
液として添付する場合にはその溶解液０．５〜１００ｍ
Ａ’で溶解し、筋肉内あるいは静脈内に投与する。

また適当な担体、賦型剤、希釈剤を用いて口腔内。

眼、耳、鼻内投与用の剤形として用いることができる。

本発明のＩＬ−２組成物は、低毒性で、公知のＩＬ−２
と同様の目的に同様の用法により使用することができる
。

本願明細書中ＩＬ−２の活性としての単位（Ｕ）の算出
方法は以下のようにして行った。

すなわち、ＩＬ−２９度に依存して増殖するマウス細胞
株を浮遊した培地にＩＬ−２を含む検体を加えて培養し
、該細胞株の増殖をトリチウムチミジンの取込を指標と
してめた。目的とする検体中ツユニット（Ｕ）算出のた
めには、常に標準Ｉ　Ｌ　−２（Ｉ　Ｕ／ｍｌ）を並べ
てアッセイを実施して、その比率からユニツ１を算出し
た。

具体的には、ヒトＩＬ−２・を含有するコンディション
ドメジウムを含む２０％Ｆ　ＣＳ　７Ｊ［］　ＲＰ　Ｍ
　１１６４０培地中で、３７℃で５％Ｃ０２の存在下に
継代維持されたＩＬ−２依存性マウス細胞株〔（ＮＫＣ
８）、Ｈｉｎｕｍａら、バイオケミカル・バイオフィジ
カル・リサーチ・コミュニケイションズ、第１０９巻、
３６３頁（１９８２年）〕を無血清ＲＰＭＩ　１６４０
培地を用いて２回洗浄し、２０％ＦＣ８７ＪＤＲＰＭＩ
’　１６４０培地に６×１０５個／ｒｕｇになるように
再浮遊する。

ＩＬ−２を含む資料５０μｌを９６穴平底マイクロタイ
タープレート（ヌンク社、デンマーク）の第１列目の穴
に入れ、５０μｌずつの２０％ＦＣ８加ＲＰＭＩ　１６
４０培地を用いて第１２列目まで順次２倍段階希釈系列
を作成後、上記ＮＫＣ３細胞浮遊液を５０μｌずつ各穴
に分注し、３７℃で５％ＣＯ２の存在下に２４時間培養
する。培養２０時間目に、各穴に１μＣｉ　ずつトリチ
ウムチミジン（アマルシャム社、イギリス）を添加して
さらに４時間培養を継続後、セルハーベスタ＝（フロー
社、アメリカ）を使用して細胞をガラスフィルター上に
回収し、液体シンチレーションカウンターを用いてトリ
チウムチミジンの取込を測定する。測定に際しては標準
ＩＬ−２標品について資料と同一の操作を行い、トリチ
ウムチミジンの取込を測定する。

ユニット（Ｕ）の計算はジャーナル・オブ・イムノロジ
ー、第１２０巻、２０２７頁（１９７８年月二準じニブ
ロビット変換法により行う。すなわち、標準ＩＬ−２標
品（ヒト末梢血リンパ球を５×１０６個／ｒｕｌとなる
ように１０％ＦＣ８加ＲＰＭＩ　１６４０培地に浮遊し
、コンカナバリン−Ａ４０μｙおよび１２−０−テｒラ
デカノイルホルボール−１３−アセテート１５ｎｇ／ｍ
ｅを添加して、３７°Ｃで５％ＣＯ□の存在下に４８時
間培養した培養液の遠心上清’ｌ　Ｉ　Ｕ　／ｍｌと定
める）の希釈系列のうち最大値の取込を１００％として
、各希釈段階の取込値の割合（％）を計算する。得られ
た数値を正規確率紙にプロットし、５０％の取込を示す
希釈倍数を作図からめる。同様にしてＩＬ−２を含む各
資料についても５０％の取込を示す希釈倍数をめる。

資料の■Ｌ−２ａ度（Ｕ／ＩＩＬｌ）は次式に従って計
算される： 標準ＩＬ−２標品が５０％の取込２示す希釈倍数下記参
考例（Ｔ）に開示した形質転換体エシェリヒア　コリ（
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　ＤＨ１／　ｐ
　ＴＦ４は財団法人発酵研究所にＩＦＯ−１４２９９と
して、また昭和５９年４月６日から通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所（ＦＢＩ月二受託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−６２８として寄託されている。

実施例 以下の実施例および参考例によって本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

なお実施例において用いたＩＬ−２原液は、参考例に記
載の方法で得られた非グリコリル化ヒトＩＬ−２蛋白質
溶液である。

実施例Ｉ ＩＬ−２原液を注射用蒸留水で希釈し除菌沢過して得た
ヒトＩＬ〜２　１７６００単位を含有する水溶液それぞ
れ０．５　ｍｌに、Ｈ８Ａ３■を含有し、塩酸でｐＨ４
に調整し除菌沢過した水溶液またはＨ８に５ｍ９および
食塩９ｒｌｙｉヲ含有し塩酸でＩ）Ｈ４に調整し除菌沢
過した水溶液０．５　ｒｕｇを加え、得られた２種の水
溶液おのおの１ｍＡをバイアルに分注して一４０℃で凍
結し、乾燥後バイアル空間部をＮ２ガスで置換し施栓巻
締した。

これらの凍結乾燥品を製造直後および４０℃で０．５力
月保存後に注射用蒸留水１ｍｌで再溶解し、これらの溶
液の溶状（澄明度］及び力価を調べた。力価については
凍結乾燥前の水溶液力価を１００％とした時の残存率を
計算した。その結果は、第１表に示されるとおり、本発
明のＩＬ−２組成物は溶状、力価残存率共に有意に優れ
ていた。

第１表 実施例２゜ ＩＬ−２原液を注射用蒸留水で希釈し、除菌沢過して得
たヒトＩＬ−２４１１５単位を含有する水溶液０．５　
ａｔ！に、Ｈ８Ａ３■、Ｈ８Ａ３〜と食塩９〜．Ｈ８Ａ
３”ｌｌｉ’トゲリシン２８ｍｙまタハＨ８Ａ５ｍＶと
マンニット５０キを含有し、且つ塩酸でｐＨ４，０に調
整し、除菌沢過した各種添加剤水溶液おのおの０．５　
ｍｌを加え、得られた４種の水溶液おのおの１ｍ１ｆバ
イアルに分注して一４０°Ｃで凍結し乾燥後、バイアル
空間部をＮ２ガスで置換し、施栓巻締した。対照として
ヒ１ＩＬ−２のみの水溶液及びｐＨ調節剤を含有しない
同量の各種ＩＬ−２水溶液を同様に凍結乾燥した。

これらの凍結乾燥品の外観を調べた後、注射用蒸留水０
．９％、生理食塩液、５％ブドウ糖水溶液、５％ソルビ
ット水溶液、または５％マンニット水溶液のいずれか１
ｒｕｌで再溶解し、これらの溶液のｐＨ及び溶状（澄明
度〕を調べた。

その結果は第２表に示される通り、本発明の工Ｌ−２組
成物は対照と比較し溶状面で有意に優れており、特にＨ
８Ａとグリシンが配合されｐＨが約４の凍結乾燥品の溶
状が優れていた。

（以下＃−ｆ：Ｊ） 実施例８゜ 実施例１と同様にして得たヒトＩＬ−２として１６２０
単位または１２８単位、Ｈ８Ａを５■、グリシンを２３
ｍ９含有し、塩酸でｐＨを４，０に調節した除菌沢過さ
れた２種の水溶液おのおの１ｍｌ！を実施例１と同様に
凍結乾燥し、実施例１と同様の方法で製造直後、及び４
０°Ｃ１週間、２週間及び４週間保存後に溶状及び力価
残存率を調べた。

その結果は第３表に示す通りであった。

（玖下余負） 参考例　非グリコジル化ヒトＩＬ−２蛋白質溶液の製造 （１）特願昭５８−２２５０７９号（昭和５８年１１月
２８日出願）明細書の実施例３で得たヒトＩＬ−２遺伝
子を含有する形質転換体エシェリヒア　コリ（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）ＤＨＩ／ｐＴＥ４を２５０ｄ容三角フラスコ内の
バク計・トリプトン（ディフコ・ラボラトリーズ、アメ
リカ）１％、バク計・イーストエキス（ディフコ・ラボ
ラトリーズ。

アメリカ）０．５％２食塩０．５％およびテトラサイク
リｙ　７　ｐ　ｌ／　／ｒｕｌを含む液体培地（ｐＨ７
，０）５０１１ｔ／に接種して８７°Ｃで１晩回転振盪
培養した。この培養液をカザミノ酸０．５％、グルニア
”ス０，５％およびテトラサイクリン７μＬ楡ｌを含む
Ｍ９培地２．５１！の入った５Ｊ容ジャーファーメンタ
−に移し３７℃で４時間、ついで３−β−インドリルア
クリル酸（２５μ！／ｄ）を添加して、さらに４時間通
気攪拌培養して培養液２．５１を得た。この培養液を遠
心分離し、菌体を集め、−８０°Ｃで凍結保存した。

（１υ　上記（１）で得た凍結保存菌体３７．５ノを７
Ｍ項酸グアニジ７　、０．１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　
ｙ含む抽出液（ｐＨ７，０）　５００ｍｌに均一に懸濁
し、４℃で１時間攪拌した。この溶菌液を２８．ＯＯ’
Ｏｘグで２０分間遠心分離して上清４５８ｍ１ｆ得た。

（ＩＩＩ）　上記（１１）で得た上清７ａ１０．ＯＬＭ
　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５月二対して透析
後１９，０ＯＯＸ）で１０分間遠心分離して透析上清４
５８ｍＡ’ｉ得た。この透析上清を０．０１Ｍ　Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，５）で平衡化したＤｇｆｉ
２（ＤＥＡＥ−セルロース、ワットマン社製、イギリス
ツカラム（５０ｍｌ容〕に通して蛋白を吸着させ、Ｎａ
Ｃ１濃度直線勾配（（１〜０．１５Ｍ　ＮａＣ１，ｌｊ
’　）’、を作成してＩＬ−２を溶出させた。活性画分
１０５ｔｎｌ’ｆｌＹＭ−５メンプラン（アミコン社製
、アメリカ〕を用いて１０．２ｔｕｌに濃縮し、０．１
　Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ８，０）　−１Ｍ　Ｎ
ａ１ｌ緩＃液で平衡化した七フアクリルＳ−２００（フ
ァルマシア社製、スエーデンノカラム（５００ｍ／容）
を用いてゲル濾過を行った。活性画分５６ｔｕｌをＹＭ
−５メンプランで４．９１１Ｌｌに濃縮した。得られた
濃縮液乞ウルトラボアＲＰＳＣ（アルテックス社製、ア
メリカ）カラムに吸着させ、トリフルオロ酢酸−アセト
ニ［リル系を溶出溶媒とする高速液体クロマトグラフィ
ーを行った。

カラム、ウルトラポアＲＰ８Ｃ（４，６Ｘ７５Ｍ）１力
ラム温度、８０℃；溶出溶媒Ａ、０．１％トリフルオロ
酢酸−９９，９％水；溶出溶媒Ｂ、０．１％トリフルオ
ロ酢酸−９９，９％アセトニトリル；溶出プログラム、
０分（６８％Ａ＋３２％Ｂ）−２５分（５５％Ａ＋４５
％Ｂンー３５分（４５％Ａ＋５５％Ｂ）−４５分（３０
％Ａ＋７０％Ｂ）−４８分（１００％に溶出速度、　０
．８ｍＪ／ｍｉｎ；検出波長、２８０ｎｍ０本条件下で
保持時間約３９分の活性画分を集め、非グリコジル化ヒ
トＩＬ−２蛋白質７．５’Ｗ［比活性、８０，０ＯＯＵ
膚。

出発材料からの活性回収率、４８．２％；蛋白質の純度
、　９９％（デンシトメトリーにょろり〕を含む溶液１
５ｍ１を得た。

発明の効果 本発明のＩＬ−２組成物は、保存中および凍結や凍結乾
燥操作におけるＩＬ−２活性の低下が少なく、また凍結
乾燥品においてはその外観が向上し、その器壁への吸着
が少なく、さらにその再溶解時の溶状が澄明である点等
の優れた特徴を有し、医薬品製剤等とりわけ非経口投与
製剤として有利に用いることができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）　ヒト血清アルブミンを配合し、溶液状態でｐＨ
   ３〜６を示すように調整したインターロイキン−２組成
   物。
2. （２）さらにモノアミノ脂肪族アミノ酸を配合した特許
   請求の範囲第１項記載の組成物。
3. （３）凍結乾燥品である特許請求の範囲第１項または第
   ２項記載の組成物。