CN1019453B - 白细胞介素-2的稳定组合物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种白细胞介素-2的组合物，它包括人血清白蛋白，还原化合物或它们的结合物，并且溶液调至pH为3至6，本发明的组合物之特征在于，其白细胞介素-2的活性在储存，冷冻及冷冻干燥的过程中损失很小。

Description

本发明是一种用于药剂或其它方面的白细胞介素-2原组合物。

白细胞介素-2（以下简称为IL-2）是一种蛋白质，它具有作为T细胞和自然杀伤细胞生长因子的功能，并且认为这些细胞在体内免疫调节中起着重要的作用，直接或间接有助于消除癌或从免疫异常状态恢复正常及改善免疫低下状态（自然「Nature」302，305-310「1983」）。由于IL-2具有这样的生理活性，因此人们寄希望于能把它作为一种新型抗癌剂或对免疫缺陷的治疗剂来使用。

本发明的发明者们发现，IL-2是不稳定的，在对IL-2进行冷冻或冷冻干燥之后的储藏过程中，以及冷冻干燥之后的储藏过程中，它的活性很易损失，特别是在冷冻干燥的干燥这一步骤的，更是这样，并且把冷冻干燥的IL-2制剂重新溶解所得的液体一般都是混浊的。这些事实及其它一些事实，对把IL-2作为治疗的应用，是很不利的。

在这样的情况下，本发明的发明者们进行了广泛的深入研究，成功地制造出了一种稳定的IL-2的组合物，并且现已完成了本发明。

本发明提供了一种IL-2组合物，它含有血清白蛋白，一种还原化合物，或它们的一种结合物，并且是一种pH被调到3至6的溶液。

在实践本发明的过程中，所用的IL-2可以来源于任何哺乳动物但以来源于人类的为更好。所用的IL-2可以是天然的或是DNA技术重组的产物，尽管用后一种更好。常用的形式为溶液状的IL-2。

IL-2的最好的例子是用遗传工程生产出来的，非糖基化的人体IL-2，其通式为：

其中X是甲硫氨酸或是氢，其混合物也能用。

在上面的式中，每一个氨基酸残基是用（IUPAC-IUB）委员会生物化学命名法所规定的缩写符号代表的。

IL-2具有理想的比活性为20000～80000单位/毫克，具有优越性的液体形式的IL-2的活性为1～80000单位/毫升，以活性为10～50000单位/毫升为较好、以活性为50～5000单位/毫升为更好。上面这种液体形式的IL-2，在实践本发明的过程中是作为原料的，并以不含盐类，如氯化钠的为好。如果在提纯IL-2的过程中，所说的这种溶液被盐污染了，那么最好用超滤把盐除掉，如在使用之前就进行超滤。

人血清白蛋白（以下简写为HSA）可以是任意等级的。然而在本发明之用于医疗的组合物中，所说的HSA以用其质量适于肠胃外途径给药的为好。

例如，用健康人体血浆作为起始物，按照科恩（Cohn）的第6种乙醇分馏法来分离和提纯HSA（美国化学协会杂志「J.Am.chem.Soc.」68，459～475（1946）。

所述的HSA也还可以含有作为稳定剂的乙酰色氨酸钠或辛酸钠。

在上面所述的IL-2的浓度范围内，在每毫升液体IL-2中，所添加的HSA的水平以0.1～50毫克为好，以0.5～20毫克为更好。

还原化合物以生理上相容的还原化合物为好，包括含硫的还原化合物，例如谷胱甘肽（还原型：此后简称为谷胱甘肽），硫辛酸，N-乙酰半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸，硫二甘醇，硫乙醇胺，单硫甘油，二硫苏糖醇，含有1-7个碳原子的硫链烷酸类（如硫基乙酸，硫苹果酸），抗坏血酸及其上述成份的盐类、以用酸性化合物为好，如谷胱甘肽，硫辛酸，N-乙酰半胱氨酸和抗坏血酸，并且以用谷胱甘肽和抗坏血酸最为适宜。

上述的还原化合物可以单独使用，也可以两个或两个以上结合使用。

这些还原化合物的再量，在每毫升含有上述IL-2浓度范围内的IL-2溶液中，以不少于0.01毫克为好，以0.05～20毫克为更好。

上述的HSA和还原化合物，在使用时，它们可以两者都在上述的范围内，或者其中一个在上述范围内，以HSA在上述范围内为好。

本发明之IL-2组合物还可进一步含有一种或更多的物质，这些物质是选自氨基酸中，特别是单氨基脂肪族氨基酸和环氨基酸，如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸和脯氨酸，单糖类，如葡萄糖，甘露糖，糖醇类，如山梨糖醇和甘露糖醇，生理上相容的盐类及其衍生物。在这些辅助添加剂中，以用甘氨酸为最好。

在每毫升上述IL-2溶液中，上述的辅助添加剂的用量，对单糖和糖醇类以10～100毫克为好，对氨基酸类以5～50毫克为好。

本发明之IL-2组合物还可进一步含有等渗剂，氯化钠，缓冲液，如琥珀酸，酒石酸或柠檬酸，和/或表面活性剂。然而，从冷冻干燥过程中的稳定化观点来看，IL-2组合物中最好不含有氯化钠。

为了使本发明的IL-2组合物的pH为3-6，较好的3-5.5，最好的3.5～4.5，要有以下的物质把组合物的pH调至这里所特定的范围之内，可以用酸性还原化合物或酸性氨基酸，如谷氨酸，或者是有进一步需要时而又不含有酸性化合物时，可用无机酸，如盐酸或磷酸，或可用有机酸缓冲液，如琥珀酸，酒石酸或柠檬酸。

上述IL-2的稳定性可以进一步地提高，即把放有IL-2组合物的容器中的空气抽干或在其中充满氮。

本发明之IL-2组合物以溶液，冰冻，冷冻干燥或类似的形式为好，尤其是冷冻干燥的形式为好。

本发明之组合物的制备，可按如下的方式进行：

在浓度为1～80000单位/毫升的IL-2溶液中，加入HSA和/或还原化合物至预定的浓度，接着用上述的方式调整pH值。

还可以加入上述相应浓度的单糖，糖醇和氨基酸。如有必要，还可以进一步加入等渗剂，表面活性剂等等。如果除了HSA以外，还添加了其它物质，就要依上述方法调整pH值，以使最终之溶液的pH保持在上述的范围内。这样获得的IL-2组 合物，还可以作为依下述方式制造冰冻材料或冷冻干燥物的原料。

例如，对上述溶液在-80℃至-20℃冷冻，一般可制成冰冻形式的IL-2组合物。所述的冰冻组合物最好储藏在-80℃～-10℃条件下。

例如，冷冻干燥形式的IL-2组合物可以这样制造，把上述的冰冻组合物在减压条件下以常规方式干燥，或对上述溶液、或对上述冰冻组合物解冻所得之溶液以上述之相同方式进行冷冻，接着依所需进行分布，最后在减压条件下，以常规方法对所得冰冻组合物进行干燥处理。

进而言之，本发明之液体形式的IL-2组合物还可以这样制备把含有IL-2，HSA或/和还原化合物，pH调节剂等等的用上述方法制得的冷冻干燥物重新溶解于一种溶剂中，该溶剂含有单糖，糖醇氨基酸等，以及需要时还含有pH调节剂，如盐酸。

在把本发明之冷冻干燥的IL-2组合物制成可注射的制剂时，最好是把一种含有IL-2的溶液和一种含有添加剂的溶液结合起来，各自分别进行消毒过滤，或对这两种液体之混合物用消毒过滤等方式提纯，然后把混合物以无菌操作分放入小玻璃瓶或类似物中，并对小玻璃瓶或其类似物中的混合物进行上述的冷冻干燥处理。

在把冷冻干燥物溶解于一种含有氨基酸，单糖或糖醇的溶液中时，最好这种溶液经过消毒过滤，接着分装入安瓿瓶或其类似物中，并且在把它作为溶剂使用之前先进行高压消毒。

本发明之IL-2组合物具有比其它更为优越的特征，其特征在于在储存，冰冻，冷冻干燥的过程中，IL-2活性的降低为最小值，而当其为冷冻干燥物时，把它重新溶解所得到的液体为清澈透明的。

本发明之IL-2组合物，特别是冷冻干燥形式的，具有改善了外观，而且有效地防止了容器壁对其的吸收。

含有氨基酸的组合物，当冷冻干燥时也呈现改善的外观，在用于注射时也可有效地减轻病人的疼痛。

含有单糖的组合物，在用于注射时，还达到了减痛的效果。

在本发明所提供的IL-2组合物中，与其它形式相比，在作为非肠胃道制剂来说冷冻干燥形式优于其它，它可以制成稳定的IL-2的粉末。在作为注射剂使用时，冷冻干燥物被溶解于0.5～100毫升的注射用蒸馏水中，或溶于生理盐水中，或溶于为其特殊用途而制的0.5～100毫升溶剂中，该溶剂为这样一种溶液，含有氨基酸如甘氨酸，单糖，如葡萄糖，或糖醇如甘露糖醇，如果需要的话还有pH调节剂，而且这种溶液是用于肌肉或静脉注射的。所述的组合物还可以在配有合适的载体，赋形剂或稀释剂时，制成用于口服，用于鼻腔，用于耳朵或眼睛的制剂。

本发明之IL-2组合物的毒性低，并且可以与已知的IL-2制剂一样，以相同的方式用于相同的目的。

本发明说明书中所用的，以单位（Unit）所表示的有关IL-2活性的资料，是用下述方式得到的：

把含有IL-2的试验样品加入悬浮培养液中，其中含有小鼠细胞株，这种细胞株能以依靠IL-2浓度的方式生长。在对细胞株进行培养之后，以摄取的氚化胸苷为指数来测定该细胞株的生产。在进行分析时，总是用标准的IL-2（1单位/毫升）作为试验样品的平行对照并且用它与试验样品之间的活性比计算样品的活性（以单位表示）。

特别是，用传代的方法，在RPMI1640培养基中保持依赖IL-2的鼠细胞株「NRC3，黑纽玛等人、生物化学及生物物理研究通讯，109，363（1982）（Hinuma et al，Biochemical and Biophysical Research Communications）」在RPMI1640培养基中还含有人IL-2的经过处理的培养基加入20%的FCS「胎牛血清（fetal calf Serum）」，保持温度为37℃，并且使用了5%的二氧化碳（CO₂）。用不含血清的RPMI1640培养基冲洗细胞2次，并把细胞以6×10⁵细胞/毫升的浓度再次悬浮于加有FCS的RPMI1640培养基中。

全部含有IL-2的试验样品，以50微升为一份，分别放入96孔平底微量滴定板「Nune    Denmark」的第一排孔中，接着用一系列的倍比稀释直至第12排，每个孔中用50微升20%的加有FCS的RPMI1640培养基，接着每孔中加入50微升上述的NKC3细胞悬浮液。在通有5%二氧化碳的条件下，以37℃的温度培养24小时，在此期间，把1微居里（μCi）的氚化胸苷（Amersham Great    Britain）在培养20小时的时候分别加入每个孔中。用细胞收集器（Flow，U·S·A）在玻璃滤器上使细胞回收，并且用液闪计数仪器测定氚化胸苷的吸收。

对活性以单位计的计算，是按免疫学杂志「Journal of lmmu-nology」120，2027，「1978」所述的方法计算的，在由标准IL-2样品经稀释而得到的一系列稀释液中（培养基上清液经48小时培养条件是温度为37℃，通入5%的二氧化碳，含有浓度为5×10⁶毫升/个淋巴细胞的人外周血液，10%的FCS加入到RPMI1640培养基中，该培养基中还含有40微克的刀豆素A和15毫微克/毫升12-邻位-四癸酰咐乙酸盐（12-0-tetra-decanoyl phorbel-13-acetate），并将此确定为每毫升具有一个单位的活性），最大有吸收值被计为100%，并计算每一个稀释液的吸收百分数1%）所得的各个值绘制在普通概率纸上，相应于吸收值为50%的稀释因子是由图上确定的。对每个含有IL-2的试验样品的，相应于吸收值为50%的稀释因子是以同样的方法确定的。

试验样品的IL-2浓度（单位/毫升）是用下式计算的：

试验样品吸收值为50%时的稀释因子

标准IL-2样品吸收值为50%时的稀释因子

在此后实施例中所述的转化型大肠肝菌DH1/pTF₄（Escherichia coli DH1/pTF₄）已经储存于大阪发酵所（Fermentation Institute，Osaka），储存号为IFO-14299储存日是1984年4月6日，并以储存号为FERMBP-628储存于国际贸易工业部，工业科技社的发酵研究所，（Fermentation，Research Institnte，Agency of Industrial Science and Technology，Ministy of International Trade and Industry）。于1985年4月1日储存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），储存号为CGMCC0001。

实施例

以下各工作实例以及参考实例更为详细地解释了本发明。然而，无论如何它们都不限制本发明。

在工作实例中所用的原液，是用在参考实例中给出的方法制得的非糖基化人IL-2蛋白溶液。

实施例1

在一种溶液（0.5毫升）中，该溶液含有2450单位的人IL-2，即用注射蒸馏水把原液稀释并经过消毒过滤而制成的，消毒过滤后再加入另一种含有10毫克谷胱甘肽或抗坏血酸并经消毒过滤的液体（0.5毫升）。这样所得的两种溶液（每份1毫升）（pH分别为3.4和3.5）分别放入一个小瓶中，在-40℃冰冻，并进行冷冻干燥。此外，小瓶中的空间要充满氮气并把小瓶盖严。

取相同量的不含谷胱甘肽或抗坏血酸的溶液和等量的含有25毫克甘露糖醇的溶液作为空白对照，并以同样的方式进行冷冻干燥，所用的甘露糖醇经常用在冷冻干燥制剂中代替谷胱甘肽或抗坏血酸。

这些冷冻干燥物分别重新溶解于1毫升的注射用蒸馏水中，并检测每个溶液的可溶性（清晰度）和其效力。就效力而言，以冷冻干燥前溶液的效力为100%，并依此计算出各溶液残留效力的百分数。结果在表1中给出了，并且显示出来本发明之IL-2组合物的可溶性和残留效力都极大地优于空白对照。（见表1）

实施例2

用一种含有7680单位人IL-2的溶液（0.5毫升），该溶液是用注射蒸馏水稀释原液并经消毒过滤制得，消毒过滤后加入一种含有2毫克谷胱甘肽或抗坏血酸的溶液。这样所得的两种溶液（每份1毫升）（pH分别为3.6和3.7）以同实施例1相同的方法冷冻干燥，将刚制得的冷冻干燥产物进行可溶性检查，以及在制造后以25℃条件储存1个月的产物，进行可溶性及残留效力的检验。

所得结果在表2中给出。（见表2）

实施例3

在含有7680单位人IL-2的溶液0.5毫升中，该溶液是用注射蒸馏水稀释原液并经消毒过滤制得，消毒过滤后加入含有5毫克HSA及2毫升谷胱甘肽或抗坏血酸的溶液（0.5毫升）。这样所得到的两种溶液（每种1毫升）（pH分别为4.1和4.2），用与实施例1相同的方法冷冻干燥，并以与实施例2相同的方法检验冷冻干燥产物的可溶性和残留效力。

所得结果在表3中给出。（见表3）

实施例4

在含有7680单位人IL-2的溶液0.5毫升中，该溶液是用注射蒸馏水稀释原液并经消毒过滤 制得，消毒过滤后加入一种含HSA5毫克，氯化钠9毫克，2毫克谷胱甘肽或抗坏血酸的溶液（0.5毫升）这样所得的两种溶液（每种1毫升）（pH分别为4.1和4.2），以与实施例1相同的方法进行干燥处理，并以与实施例2相同的方法测定冷冻干燥产物的可溶性和残留效力。

所得结果在表4中给出。（见表4）

实施例5

在含有7680人IL-2的溶液（0.5毫升）中，该溶液是用注射蒸馏水稀释原液并经消毒过滤制得，消毒过滤后加入含有50毫克甘露糖醇、2毫克谷胱甘肽或抗血酸的溶液（0.5毫升）。这样所得的两种溶液（每种1毫升）（pH值分别为3.4和3.6）以与实施例1相同的方法进行冷冻干燥，并以与实施例2相同的方法测定冷冻干燥产物的可溶性和残留效力。

所得结果在表5中给出。（见表5）

实施例6

在含有23350单位人IL-2的溶液（0.5毫升）中，该溶液是用注射蒸馏水稀释原液并经消毒过滤制成，消毒过滤后加入含有5毫克谷胱甘肽和23毫克甘氨酸的溶液（0.5毫升）。这样所得的溶液（1毫升）（pH3.7）用与实施例1相同的方法进行冷冻干燥处理，并以与实施例1相同的方法对刚制得的及在40℃保存三星期的冷冻干燥产物进行可溶性和残留效力的测定。

所得结果在表6中给出。（见表6）

实施例7

在含有1790单位或130单位人IL-2的溶液（0.5毫升）中，该溶液是用注射蒸馏水稀释原液并经过消毒过滤制得，消毒过滤后加入含有2毫克谷胱甘肽，5毫克HSA，9毫克氯化钠的溶液（0.5毫升）。这样所得的两种溶液（每种1毫升）（pH均为3.9）。以与实施例1相同的方法进行冷冻干燥处理，并用与实施例1相同的方法，对刚制得的及在40℃保存1个星期的冷冻干燥产物进行可溶性和残留效力的测定。

所得结果在表7中给出。（见表7）

实施例8

在含有1860单位或116单位人IL-2的溶液（0.5毫升）中，该溶液是用注射蒸馏水稀释原液并经过消毒过滤制成的，消毒过滤后加入含有2毫克谷胱甘肽，1毫升HSA和23毫克甘氨酸的溶液（0.5毫升），这两种液体（每种1毫升，pH分别为3.8和3.9）。用与实施例1相同的方法进行冷冻干燥处理，并且以实施例1的方法对刚制成的及40℃保存1星期的冷冻干燥产物分别测定它们的可溶性和残留效力。

结果在表8中给出。（见表8）

实施例9

在含有17600单位人IL-2的溶液（0.5毫升）中，该溶液是以注射用蒸馏水稀释原液并经过消毒过滤制成，消毒过滤后加入含有5毫克HSA、9毫克氯化钠、并且pH为4（用盐酸调整）的溶液（0.5毫升）。这样所得的两种溶液（每种1毫升）被放入小瓶中，以-40℃冰冻，并且进行冷冻干燥，并且在小瓶的空间充满氮气，把小瓶盖严。

在刚制成的及在40℃保存了半个月的冷冻干燥产物重新溶解于1毫升的注射用蒸馏水中，并测定它们的可溶性（清晰度）和效力，就效力而言，以冷冻干燥前之液体的效力为100%，并在此基础上计算出残留百分数。如表9中的结果所指出的那样，本发明之IL-2组合物具有极为优越的可溶性和残留效力。（见表9）

实施例10

在含有4115单位/毫升人IL-2的溶液（0.5毫升）中，该溶液是以注射用蒸馏水稀释原液并经过消毒过滤制成，消毒过滤后再加入含有5毫克HSA，5毫克HSA加9毫克氯化钠，5毫克HSA加23毫克甘氨酸，或5毫克HSA加50毫克甘露糖醇的pH为4.0（用盐酸调整）的溶液（0.5毫升）。这样所得的4种溶液（每种1毫升）分别放入小瓶中，以-40℃冷冻并进行冷冻干燥处理，小瓶的空间充满氮气并把小瓶盖严。用作对照的是等量的只含人IL-2的液体，不同IL-2的溶液其中不含pH调节剂，并以上述的方法进行冷冻干燥。

测定这些冷冻干燥物的外观，并把它们分别重新溶于1毫升的注射用蒸馏水，0.9%的生理盐水，5%的葡萄糖溶液，5%的山梨糖醇溶液，或5%的甘露糖醇溶液中，并测定它们的pH值和可溶性（清晰度）。

正如表10中结果所示，本发明之IL-2组合物在可溶性方面比对照具有极大的优越性。特别是掺合HSA和甘氨酸所得的冷冻干燥产物，其pH 为4，在可溶性方面更为优越。（见表10）

实施例11

由实施例9的方法得到的两种溶液（各1毫升），并用过滤除去细菌，其中含有1620或128单位的人IL-2，5毫克HSA和23毫克甘氨酸，pH为4.0（用盐酸调整），以实施例9的方法进行冷冻干燥，对刚制成的及在40℃保存了1.2和4周的产物，以实施例9之方法测定它们的可溶性及残留效力。

所得结果在表11中给出。（见表11）

实施例12

在含有2450单位人IL-2的溶液（0.5毫升）中，该溶液是以注射用蒸馏水稀释原液并经过消毒过滤制成，加入（5毫升）注射用蒸馏水，消毒滤液（0.5毫升），该溶液中含有10毫克谷胱甘肽，谷胱甘肽二钠盐，抗坏血酸或抗坏血酸钠盐，或是被用盐酸调至酸性的消毒滤液（0.5毫升）。该滤液含有10毫克的谷胱甘肽二钠盐或抗坏血酸钠盐。把这样制得的7种溶液分别放入小瓶中，以-40℃冷冻并进行干燥处理，小瓶的空间充满氮气，并把小瓶盖严。把它们的冷冻干燥产物分别再溶于1毫升的注射用溜水中，并测试这些溶液的pH值和可溶性（清晰度）。正如表12中的结果所指出的那样，本发明之IL-2组合物，在可溶性方面极明显地优于对照组。（见表12）

参考例

制备非糖基化人IL-2蛋白质溶液

1.带有人IL-2基因的大肠杆菌转化体DH1/pTF₄被接种到50毫升液体培养基（pH7.0）中培养，其中含有1%细菌用胰化胨（Bacto-tryptone Difco Labratories，U·SA）0.5%酵母菌提取物（Bacto yeast extract·Difco Laboratories，U·S·A）0.5%氯化钠及7微克/毫升的四环素，把它们放在一个250毫升的锥形烧瓶中，接着用摇动法进行过夜培养，温度为37℃。然后把培养液转移到一个5升的发酵罐中，其中装有2.5升的M9培养基，该培养基中含有0.5%酪蛋白氨基酸，0.5%葡萄糖以及7微毫/毫升的四环素，接着在37℃通风搅拌培养24小时，然后加入3-β-吲哚-丙烯酸（25微克/毫升）。并在同样条件下继续培养4小时。把这样所得到的培养液（25升）进行离心，所收集到的细胞以-80℃冷冻并储存。

2、在步骤1所得的冷冻状态的细胞（37.5克）均匀地悬溶于500毫升的提取剂（pH7.0）中，该提取液含有浓度为7摩尔的盐酸胍及0.1摩尔三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，把此悬液以4℃条件搅拌1小时。将所生成的溶胞液以28000×g离心20分钟。得到453毫升上清液。

3、在上述步骤2所得到的上清液，以0.01摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液pH8.5进行透析，然后以19000×g离心10分钟。这样得到的上清液（458毫升）通过一个DE52本（即二乙氨基乙基纤维素52柱，柱的容积为50毫升），并预先用0.01摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液（pH8.5）平衡以获得有效的蛋白质吸附。用一个氯化钠的线性浓度梯度（0～0.15摩尔氯化钠，1升）对IL-2进行洗脱。把有活性的组分合在一起（105毫升），用YM-5膜（Amicon    U·S·A）浓缩至10.2毫升，再用葡萄糖丙烯酰胺凝胶（Sephacryys200）（Pharmacia·Sweden）进行凝胶过滤（柱的容积为500毫升），该柱是0.1摩尔的三羟甲基氨基甲烷-盐酸（pH8.0）-1摩尔氯化钠缓冲溶液平衡的。活性组分（56毫升）用YM-5膜浓缩至4.9毫升。所得之浓缩物通过高效液相层析，所用的是超孔（Ultrapore）RPSC柱和三-氟乙酸-乙腈洗脱系统。

Ultrapore    RPSC柱的大小为4.6×75cm;柱的温度为30℃;洗脱液A为：0.1%三氟乙酸-99.9%水;洗脱液B为：0.1%三氟乙酸-99.9%乙腈;洗脱程序为：第0分钟，用68%A+32%B;第25分钟，用55%A+45%B;第35分钟，用45%A+55%B;第45分钟用30%A+70%B;第48分钟用100%B;洗脱流速为0.8毫升/每分钟，测定波长为230nm。在上述条件下，在39分钟左右出现停滞的活性组分被收集起来，从而得到了15毫升溶液。其中含有7.5毫克的非糖基化人IL-2蛋白质比活性为30000单位/毫克;自起始物的活性回收率为48.2%;蛋白质纯度为99%（由光密度测定法所测定）。

X-A

a Pro Thr Ser Ser Ser

Thr    Lys    Lys    Thr    Gln    Leu    Gln

20

Leu    Glu    His    Leu    Leu    Leu    Asp

Leu    Gln    Met    Ile    Leu    Asn    Gly

Ile    Asn    Asn    Tyr    Lys    Asn    Pro

40

Lys    Leu    Thr    Arg    Met    Leu    Thr

Phe    Lys    Phe    Try    Met    Pro    Lys

Lys    Ala    Thr    Glu    Leu    Lys    His

60

Leu    Gln    Cys    Leu    Glu    Glu    Glu

Leu    Lys    Pro    Leu    Glu    Glu    Val

Leu    Asn    Leu    Ala    Gln    Ser    Lys    Asn

80

Phe    His    Leu    Arg    Pro    Arg    Asp

Leu    Ile    Ser    Asn    Ile    Asn    Val

Ile    Val    Leu    Glu    Leu    Lys    Gly

100

Ser    Glu    Thr    Thr    Phe    Met    Cys

Glu    Tyr    Ala    Asp    Glu    Thr    Ala

Thr    Ile    Val    Glu    Phe    Leu    Asn

120

Arg    Trp    ILe    Thr    Phe    Cys    Gln

133

Ser    Ile    Ile    Ser    Thr    Leu    Thr（Ⅰ）

表1

添加剂（mg）    可溶性    残留效力

无    混浊    47%

甘露糖醇25    混浊    58%

谷胱甘肽10    清晰    97%

抗坏血酸10    清晰    100%

表2

添加剂    （mg）    刚制得产物    25℃保存1个月后

溶解性    效力

谷胱甘肽    （2）    清晰    清晰    99%

抗坏血酸    （2）    清晰    清晰    90%

续表2

添加剂    （mg）    刚制得产物    25℃保存1个月后

溶解性    可溶性    残留效力

谷胱甘    （2）    清晰    清晰    104%

+HSA    （5）

抗坏血酸    （2）    清晰    清晰    101%

+HSA    （5）

表4

添加剂    （mg）    刚制得产物    25℃保存1个月后

可溶性    可溶性    残留效力

谷胱甘肽    （2）    清晰    清晰    85%

+HSA    （5）

+氯化钠    （9）

抗坏血酸    （2）    清晰    清晰    93%

+HSA    （5）

+氯化钠    （9）

表5

添加剂    （mg）    刚制得产物    25℃保存1个月后

可溶性    可溶性    效力

谷胱甘肽 （2） 清晰 清晰^＊114%

+甘露糖醇    （50）

抗坏血酸    （2）    清晰    清晰    95%

+甘露糖醇    （50）

＊此数据是在25℃保存6天之产物的。

表6

添加剂    （mg）    刚制得产物    40℃保存1个月后

可溶性    效力    可溶性    效力

谷胱甘肽    （2）    清晰    95.1%    清晰    107.1%

+甘氨酸    （23）

表7

人IL-2    添加剂（mg）    刚制成产物    40℃保存1星期后

谷胱甘肽（2）    可溶性    效力    可溶性    效力

1790    +HSA（5）    清晰    90%    清晰    94%

+氯化钠（9）

130    同上    清晰    94%    清晰    89%

表8

人IL-2    添加剂（mg）    刚制成产物    40℃保存1周后

（单位）    可溶性    效力    可溶性    效力

1860    谷胱甘肽（2）    清晰    90%    清晰    98%

+HSA（1）

+甘氨酸（23）

116    同上    同上    清晰    110%    清晰    108%

表9

添加剂（mg）    刚制成产物    40℃保存半个月后

可溶性    效力    可溶性    效力

HSA（5）

用盐酸调节pH    清晰    102.3%    清晰    100.6%

HSA（5）

+氯化钠（9）    清晰    113.6%    清晰    110.2%

用盐酸调节pH

表12

pH

添加剂    （mg）    调节剂    pH    可溶性    注

无    无    5.4    混浊    对照

谷胱甘肽    （10）    无    3.4    清晰

谷胱甘肽二钠盐    （10）    无    9.2    混浊    对照

谷胱甘肽二钠盐 （10） HCl^＊4.2 清晰

抗坏血酸    （10）    无    3.5    清晰

抗坏血酸钠盐    （10）    无    6.5    微混    对照

抗坏血酸钠盐 （10） HCl^＊4.3 清晰

＊盐酸

Claims (17)

1、一种制备白细胞介素-2组合物的方法，其特征在于该组合物含有人血清白蛋白，并且作为溶液其pH值被调节为3～6，该方法包括将人血清白蛋白加进浓度为1-50000单位/毫升的白细胞介素-2的水溶液中，使人血清白蛋白的最终浓度为0.1-50毫克/毫升，并将该溶液的pH值调至上述范围。

2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的白细胞介素-2是人白细胞介素-2。

3、根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的白细胞介素-2是重组白细胞介素-2。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的人白细胞介素-2是非糖基化的人白细胞介素-2。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，人白细胞介素-2的比活性为20000～80000单位/毫克。

6、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组合物包括人血清白蛋白和一种还原化合物的混合物。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的还原化合物是酸性还原化合物。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的酸性化合物是谷胱甘肽，硫辛酸，N-乙酰半胱氨酸，具有1至7个碳原子的硫代链烷酸或抗坏血酸。

9、根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的还原化合物是浓度为0.05～20毫克/毫升的水溶液。

10、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组合物还进一步包括单氨基脂肪族氨基酸，环氨基酸，单糖，糖醇或它们的结合物。

11、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组合物还进一步含有单氨基脂肪族氨基酸。

12、根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的单氨基脂肪族氨基酸是浓度为5至50毫克/毫升的水溶液。

13、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，组合物的pH值为3至5.5。

14、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组合物是水溶液形式，冰冻形式或冷冻干燥形式。

15、根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的组合物水溶液是用酸性还原化合物，酸性氨基酸，无机酸或有机酸缓冲液调节。

16、根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的组合物水溶液是用无机酸调节的。

17、根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的组合物水溶液是用酸性还原化合物调节的。