CN87108308A

CN87108308A - 新的多肽及其生产

Info

Publication number: CN87108308A
Application number: CN198787108308A
Authority: CN
Inventors: 阪口雅郎; 本多; 西村纪
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-12-27
Filing date: 1987-12-24
Publication date: 1988-08-17
Also published as: JP2653061B2; EP0273373A2; US4980455A; EP0273373A3; JPS63264500A

Abstract

本发明提供一种新的多肽及其产生方法，这种多肽比定整IFN-r表现出更高的IFN-r活性。

这种多肽不但具有显著的抗病毒活性、抗肿瘤活性、免疫增强活性等，而且高度稳定，因此可有利地用作药物等。

Description

本发明涉及有很好的药理等作用的新的多肽及其生产。

γ-干扰素（以下也称为IFN-γ）由免疫活性细胞在一定条件下产生，而在同样条件下亦可促进淋巴细胞的胚细胞样转变和产生淋巴因子。因此IFN-γ又称为免疫干扰素。据报导IFN-γ比IFN-α和IFN-β具有更高的抑制细胞增殖活性和抗肿瘤活性，因此预料IFN-γ在临床上将得到很好的应用。然而，直至今天，由于IFN-γ生产方法中还存在某些问题，如需要供应新鲜的淋巴细胞，所以还没有有效的生产方法。

最近由于基因重组技术广泛应用，使IFN-γ互补DNA（cDNA）中的核苷酸顺序和氨基酸顺序（从前者推断）通过克隆cDNA而被阐明。同样也有可能利用各种宿主使cDNA和化学合成基因进行自身表达（Gray，P.W.et al.，Nature，295，503（1982）;Debos，R.et al.，Nucleic Acids Research，10，2487（1982）;Tanaka，S.et al.，Nucleic Acids Research，11，1707（1983）〕。

Gray et al〔Nature，295，503（1982）〕and Derynck et al.〔Nucleic Acids Research，10，3605（1982）〕提出一种由146个氨基酸分子组成的肽类的IFN-γ。本说明书中所指IFN-γ具有与上述参考文献中相同数目的氨基酸（参阅图4）。

同样也可能利用单克隆抗体大量制备通过基因重组获得的IFN-γ（以下也称为rIFN-γ）〔EP专利公告第0103898号〕。

许多试验都试图从IFN-γ的氨基酸顺序中去除部分氨基酸顺序，这些顺序不直接关系到IFN-γ的生物活性。

例如，日本专利公开第202899/1985号，它与EPC专利公告第146354号一致，公开了某些氨基酸顺序，这些顺序来自IFN-γ中N-末端肽链C¹ _ys-T² _yr-C³ _ys的缺失或一个由1至17个氨基酸分子组成的肽的氨基酸顺序（该顺序起始自IFN-γ的C-末端肽链¹³⁰ _Gly-…-¹⁴⁶ _Gln的C-末端）的缺失。

另外，日本专利公开第233，100/1985号，它与EP专利公告第161，504号一致，公开了IFN-γ的部分氨基酸顺序：5至127、1至127和5至146。但在这三种顺序中，氨基酸顺序5至127不能自身表达为多肽，尽管已构建了用于肽表达的DNA。

日本专利公开第5，096/1986号，它与EP专利公告第166，993号一致，所公开的氨基酸顺序来自IFN-γ中N-末端氨基酸顺序Cys-Tyr，Cys-Tyr-Cys或Cys-Tyr-Cys-Gln的缺失和由1至16氨基酸分子组成的一种氨基酸顺序或一种肽（起始自IFN-γ的C-末端肽链¹³¹ _Lys-…-¹⁴⁶ _Gln的C-末端）的缺失。

如上述，已对来源于IFN-γ中N-末端或C-末端氨基酸顺序（或肽）缺失的多肽进行了许多研究。本发明的目的是提供一种具有最高IFN-γ活性的多肽，其C-末端氨基酸顺序比上述任何一种多肽都要短。

在进行确定rIFN-γ活性部位的研究后，本发明者发现，某些IFN-γ的部分多肽比图4所示的完整IFN-γ表现出更高的活性，这些部分多肽比那种其C-末端氨基酸为第126位上的Ala、以及那种其C-末端氨基酸为从第122位上的Glu至第125位上的Pro的多肽要短。

本发明者在这一发现的基础上进行了进一步研究，完成了本发明。

本发明包括：

（1）式（Ⅰ）的多肽（Ⅰ）：

（N）H-X-Y-⁵ _AspPro Tyr Val

Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys

Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His

Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly

Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu

Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser

Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser

Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe

Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys

Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys

Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu

Asp Met Asn Val Lys Phe Phe

Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg

Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr

Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu

Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile

His Glu Leu Ile Gln Val Met

¹²¹ _Ala-Z-OH（C）（Ⅰ）

〔其中，X代表Met或一个化学键;当X代表Met时，Y代表Gln或一个化学键，而当X代表一个化学键时，Y代表Gln，<Gln或一个化学键;Z代表由1至4个氨基酸分子组成的一个氨基酸或一个肽，起始自肽链（N）Glu Leu Ser Pro（C）的N-末端。〕

（2）一种含有编码多肽（Ⅰ）区域的DNA的转化体。

（3）一种携有段落（2）所限定的DNA的转化体。

（4）一种产生多肽（Ⅰ）的方法，它包括，在一种培养基中培养段落（3）所限定的转化体，以在一种培养物中产生并积累多肽（Ⅰ），然后收集多肽（Ⅰ）。

图1示实例1所公开的质粒pIGT-123的构建图（→代表IFN-γ基因;

代表突变位点）。

图2示实例1中所用的单链DNA mp¹⁹-IGP（-）和合成的寡核苷酸的部分碱基顺序（-代表缺失;^＊＊＊代表终止密码子）。

图3示得自实例3和参考实例3的SDS-PAGE图谱。

图4示本说明书所采用的IFN-γ的氨基酸顺序和氨基酸序号。

任何DNA，只要具有一个编码多肽（Ⅰ）的区域，就可用于本发明。

作为这类DNA的例子，可提出式（Ⅱ）的DNA：

（5′）Y′-GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA

GAA AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA

GGT CAT TCA GAT GTA GCG GAT AAT GGA

ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT

TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA

ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC TTT TAC

TTC AAA CTT TTT AAA AAC TTT AAA GAT

GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG

ACC ATC AAG GAA GAC ATG AAT GTC AAG

TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG AAA CGA

GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT

TCG GTA ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC

AAA GCA ATA CAT GAA CTC ATC CAA GTG

ATG GCT-Z′（3′）（Ⅱ）

〔其中Y′代表CAG或一个化学键;Z′代表由起始自碱基顺序（5′）GAA CTG TCG CCA（3′）的5′末端的1至4个密码子组成的碱基顺序。〕

本发明的DNA可以是含有编码多肽（Ⅰ）的区域的质粒，也可以是编码多肽（Ⅰ）的DNA本身。

对由化学合成或基因工程法获得的已发表的IFN-γ的cDNA进行加工，或对染色体来源的IFN-γDNA进行处理，可产生一种DNA，该DNA有一个位于5′-末端的ATG，在该密码子的下游有一个编码多肽（Ⅰ）的区域和一个终止密码子。

某些质粒可用作载体以产生能编码多肽（Ⅰ）的DNA，可以举出以下质粒作为例子：ColEI衍生的质粒pBR322〔Gene，2，95（1977）〕、pBR313〔Gene，2，75（1977）〕、pBR324、pBR325、〔Gene，4，121（1978）〕、pBR327、pBR328〔Gene，9，287 （1980）〕、pKY2289〔Gene，3，1（1978）〕、pKY2700〔Sei-kagaku，52，770（1980）〕、pACYC177、pACYC184〔Journal of Bacteriology，134，1141（1978）〕、pRK248、pRK646、pDF〔Methods in Enzymology，68，268（1979）〕、pUC18和pUC19〔Janisch-Peron et al.;Gene，33，103（1985）〕。也可使用噬菌体来源的质粒：使用噬菌体的载体如λgt·λc〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71，4579（1974）〕、λgt·λB〔Pro.Natl.Acad.Sci.USA，72，3416（1975）〕和λDam〔Gene，1，255（1977）〕;卡龙噬菌体载体〔Science，196，161（1977）;Journal of Virology，29，555（1979）〕;以及使用丝状噬菌体的载体如mp18和mp19〔Janisch-Peron et al.;Gene，33，103（1985）〕。

所述DNA最好在ATG密码子的上游有一个启动子;可使用任何启动子，只要它对于被用作宿主以产生转化体的物种是适合的。

这种启动子的实例，可以举出适用于大肠杆菌（Escherichiacoli）的trp启动子、lac启动子、recA启动子、λPL启动子和lpp启动子;适用于枯草杆菌（Bacillus subtilis）的SPO1启动子、SPO2启动子和penP启动子;适用于酵母（Saccharomyces cerevisiae）的PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子和ADH启动子;适用于动物细胞的SV40来源的启动子。

作为上述生产方法的应用实例，下文提出一种产生含特定DNA的质粒的方法，该DNA具有一个区域，该区域所编码的多肽（Ⅰ）中，Z为Gln-Leu肽，该方法所用的原料为质粒pLC2，它含有IFN-γ基因（cDNA）（参见EP专利公告154316号参考实例4）。

用限制酶如EcoRI消化质粒pLC2，可获得编码IFN-γ全区的DNA片段。将该片段整合到M13噬菌体衍生的载体mp19中，获得含有IFN-γ基因的单链噬菌体DNA。

接着，将该单链DNA和用Phosphamidite方法合成的寡核苷酸ATG GCT GAA CTG TAA TGG TTG TCC结合使用，得到上述的编码IFN-γ的DNA，其中从第124位至第146位的密码子，通过常规的位点特异性致突变方法而被去除，使用了Amersham International plc，Buckinghamshire，England的药盒〔寡核苷酸指导的体外致突变系统〕。将产生的DNA连接到合适启动子的下游端，然后导入合适的宿主;如有必要，则在该启动子的下游插入一个SD（Shine-Dalgarno）顺序。

利用已有的常规方法，用如上获得的表达质粒转化宿主，可产生本发明的转化体〔Cohen，S.N.et al.：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69，2110（1972）〕。

埃希氏杆菌属（Escherichia）的细菌、芽孢杆菌属（Bacillus）的细菌、酵母等，可用作待转化的微生物的宿主。

可采用的各类埃希氏杆菌属细菌包括大肠杆菌，特别是大肠杆菌菌株K12DH1〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，60，160（1968）〕、JM-103〔Nucleic Acids Research，9，309（1981）〕、JA221〔Journal of Molecular Biology 120，517（1978）〕、HB101〔Journal of Molecular Biology，41，459（1969）〕、C600（Genetics，39，440（1954）〕、N4830〔Cell，25，713（1981）〕和K-12MM294〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，73，4174（1976）〕。

可采用的各类芽孢杆菌包括枯草杆菌，特别是枯草杆菌菌株MI114〔Gene，24，255（1983）〕和207-21〔Journal of Biochemistry，95，87（1984）〕。

可采用的酵母包括啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），特别是啤酒酵母菌株AH22〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75，1929（1978）〕、XSB52-23C〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77，2173（1980）〕、BH-641A（ATCC28339）、20B-12〔Genetics，85，23（1976）〕和GM3C-2〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78，2258（1981）〕。

可采用的动物细胞包括猿猴细胞COS-7〔Cell，23，175（1981）〕、Vero〔Nihon-Rinsho，21，1209（1963）〕、中国仓鼠细胞CHO〔J.Exp.Med.，108，945（1985）〕、鼠L-细胞〔J.Nat.Cancer Inst.，4，165（1943）〕、人类FL-细胞〔Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，94，532（1957）〕和仓鼠C-细胞。

培养上述转化体以在培养物中产生并积累多肽（Ⅰ），然后收集多肽（Ⅰ），即可生产多肽（Ⅰ）。

作为可采用的培养基的实例，可提出M9培养基（含有葡萄糖和酪蛋白氨基酸）〔Miller，J.;Experiments in Molecular Genetics，431-433，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1972〕和2×YT培养基〔Messing;Methods in Enzymology，101，20（1983）〕。在这种培养基中，如果需要，可加入某些试剂如3β-吲哚丙烯酸以增强启动子的功效。

培养应在15至43℃下进行3至24小时;如需要应同时通气和/或搅拌。

当培养具有一个λcIts阻遏物和一个含有PL-启动子的表达载体时，培养和阻遏物失活的温度最好分别为30至36℃和37至42℃。如果需要，可加入化学试剂如丝裂霉素C和萘啶酮酸，以增强recA启动子的功效，即降低recA基因表达抑制活性;亦可应用紫外线照射。

培养完成后，用常规方法收集细菌细胞，然后进行处理以获得上清。例如，在缓冲液中悬浮后，利用如蛋白质变性剂处理，超声和用溶菌酶等进行酶反应，使细菌细胞裂解，然后将悬浮液用常规方法如离心进行处理即获得上清。

也可以通过培养一种转化体来产生多肽（Ⅰ）（其中Z是由3个或更少的氨基酸分子组成的一个多肽或氨基酸残基），所述转化体具有一种DNA，该DNA含有一个编码多肽（Ⅰ）的区域，它所编码的多肽（Ⅰ）中，Z为一种多肽或氨基酸残基，它所包含的氨基酸分子数比前者要多（例如Z是具有所有上述4个氨基酸分子的多肽）。培养后，在有利于蛋白酶在转化体中作用的条件下，纯化得到的培养物。

应用常规的蛋白纯化方法，可将多肽（Ⅰ）从获得的上清液中分离出来。将能与IFN-γ或多肽（Ⅰ）结合的抗体用于此目的是很有效的。采用使用这种抗体的柱子是特别好的。这种抗体柱子的例子，可提出用于肽<Glu-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-OH的单克隆抗体柱〔日本专利公开第107，569/1985号实例11和Hybridoma6（2），173（1987）（使用单克隆抗体WNγ2-76.53的抗体柱）〕。

应用这种抗体柱进行纯化时，可用下述方法。将含有多肽（Ⅰ）的培养物溶解在接近中性的缓冲液如磷酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液中，然后将其吸附到抗体柱上。用上述相同缓冲液洗柱后，洗脱多肽（Ⅰ）。

可用作洗脱剂的溶液包括弱酸溶液和醋酸溶液、含有聚乙二醇的溶液、含有一种比多肽（Ⅰ）更易结合到抗体上的肽的溶液、以及高浓度的盐溶液。这些溶液可单个使用，也可结合使用;建议用一种不能很快加速多肽（Ⅰ）分解的溶液。

获得的洗脱液应利用常规方法，用一种缓冲液将其中和;如需要，可重复上述步骤。

多肽（Ⅰ）可以两种多肽的混合物形式获得，两种多肽中，X分别是一个化学键和Met。

N-末端氨基酸为Gln的多肽（Ⅰ）也可以以一种混合物的形式获得，混合物中另一多肽中N-末端氨基酸为<Glu。此混合物甚至可不经任何预处理就用于后继的目的;但这种混合物应在上述步骤后，经过加热或弱酸（如稀醋酸）处理而将其转化为其N-末端氨基酸为<Glu的多肽（Ⅰ）。

在如此获得的多肽（Ⅰ）中，优选的是X为Met、Y为Gln的多肽（Ⅰ）。

作为如上获得的更为优选的各型多肽（Ⅰ）的实例，可提出利用下面的实例获得的多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁴ _Ser-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（以下也称作IFN-γ4-123）、多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁵ _Pro-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（以下也称作IFN-γ4-124）及多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁶ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（以下也称作IFN-γ4-125）。

接着，将得到的多肽（Ⅰ）的溶液进行透析;如有必要，应将其冷冻干燥成粉末。冷冻干燥时，可加入山梨醇、甘露醇、右旋糖、麦芽糖和甘油等物质作为稳定剂。

如上述获得的多肽（Ⅰ）型不仅具有IFN-γ活性，而且也较稳定（二聚或多聚的可能性较小），这是因为缺少Cys;它可有效地用作药物等。

本发明的多肽（Ⅰ）型可纯化至比活高于10⁶U/mg，这个比活是在病毒活性测定试验中测定的，在该试验中测定多肽（Ⅰ）对疱疹性口炎病毒（VSV）造成的人羊膜来源的WISH细胞的细胞退化的抑制活性;可以某种方式将该多肽用于某种目的，这种方式和目的与使用已发表的rIFN-γ型〔Gray，P.W.et al.;见上〕和天然型IFN-γ（＝2型IFN）〔Salvin et al.;J.National Cancer Institute，55，1233（1975）〕时是相同的。

本发明的多肽（Ⅰ）型表现有抗病毒、抗肿瘤、细胞增殖抑制及免疫增强作用，此外，毒性低、无抗原性。

因此，本发明多肽（Ⅰ）型可作为抗病毒剂、抗肿瘤剂、细胞增殖抑制剂、免疫增强剂等，用于预防或治疗温血动物（小鼠、大鼠、猫、狗、绵羊、山羊、牛、人等）的病毒性疾病、肿瘤和免疫抑制疾病。

本发明的多肽（Ⅰ）型可与生理上可接受的常规载体（如无菌水、人血清清蛋白（HSA）和生理盐水）结合使用，可经非口服途径如静脉或肌肉注射给药。其一日量应为2，000-2，000，000单位/kg，最好为80，000-800，000单位/kg。

含有本发明多肽（Ⅰ）型的药物可含有其他活性成份（只要是生理上可接受的），如盐、稀释剂、佐剂、其他载体、缓冲剂、粘合剂、表面活性剂和防腐剂。本发明的多肽（Ⅰ）型用作非口服药时，应制成安瓿，此安瓿装有悬浮在无菌水或某种生理上可接受的溶剂中的多肽（Ⅰ），或者装有无菌的多肽（Ⅰ）粉末，使用前用某种生理上可接受的稀释液稀释（此种粉剂通常是将多肽（Ⅰ）溶液冷冻干燥而得到的）。

本发明的多肽（Ⅰ）型不但比图4所示的完整IFN-γ具有更高的IFN-γ活性（抗病毒活性、抗肿瘤活性、免疫增强活性等），而且高度稳定，因此可有效地用作药物。

用于本发明说明书和附图中的有关氨基酸、肽、保护基团、活性基团等的缩写，是根据IUPAC-IUB生化命名委员会规定的缩写或有关领域中常用的缩写，如表1所示。值得注意的是，在氨基酸等化合物中可能存在旋光异构体时，除非有其他说明，该异构体为L-型。

表 1

DNA：脱氧核糖核酸

A：腺嘌呤

T：胸腺嘧啶

G：鸟嘌呤

C：胞嘧啶

RNA：核糖核酸

dATP：三磷酸脱氧腺苷

dTTP：三磷酸脱氧胸腺嘧啶核苷

dGTP：三磷酸脱氧鸟苷

dCTP：三磷酸脱氧胞苷

ATP：三磷酸腺苷

EDTA：乙二胺四乙酸

SDS：十二烷基硫酸钠

Gly：甘氨酸

Ala：丙氨酸

Val：缬氨酸

Leu：亮氨酸

Ile：异亮氨酸

Ser：丝氨酸

Thr：苏氨酸

Met：蛋氨酸

Glu：谷氨酸

Asp：天冬氨酸

Lys：赖氨酸

Arg：精氨酸

His：组氨酸

Phe：苯丙氨酸

Tyr：酪氨酸

Trp：色氨酸

Pro：脯氨酸

Asn：天冬酰胺

Gln：谷氨酰胺

<Glu：焦谷氨酸

本说明书中，多肽（Ⅰ）单位用JRU（日本参考单位）表示，用下列方法测定。此测定根据Sindbis病毒对人羊膜来源的FL-细胞的细胞退化作用，测定试验样品和已知单位的标准样品（日本标准）的细胞退化抑制活性。然后从如上获得的相对值计算试验样品的抗病毒活性（U/ml）。根据其蛋白浓度计算试验样品的比活性（U/mg）。

应该注意，一个JRU单位等于日本专利公开第186995/1985号（相应于EP专利公告第110044号）中所定义的1/6.4单位。

公开在下述实例中的转化体，即大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-123、大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-124和大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-125，已自1987年9月1日起保藏在日本大阪发酵研究所（IFO），登记号分别为IFO 14647、IFO 14648和IFO 14649。这些转化体也已从1987年9月9日起保藏在Fermentation Research Institute，Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry（FRI），Japan，登记号分别为FERM BP-1474、FERM BP-1475和FERM BP-1476。

另一方面，在下面参考实例中公开的转化体大肠杆菌N4830/pIGT-126自1986年12月19日起保藏在IFO，登记号是IFO 14557。它也已自1986年12月25日起保藏在FRI，登记号是FERM P-9113。

实例

下文用本发明优选实施方案的一些实例更具体地描述本发明。但应当指出本发明不限于这些实例。

实例1（转化体的产生）

用限制酶EcoRI消化IFN-γ表达质粒pLC2（参阅EP专利公告第154316号参考实例4），分离含有IFN-γ基因位点的DNA片段。利用T4-DNA连接酶将此片段整合到EcoRI消化的M-13噬菌体来源的DNA mp19中，然后将其转导到大肠杆菌JM103菌株中〔Messing et al.;Nucleic Acids Resaarch，9，309（1981）〕。从获得的M-13噬菌体噬菌斑中，选出含有IFN-γ基因负链的噬菌体颗粒，然后从噬菌体颗粒提取DNA并纯化，获得单链DNA mp19-IGT（-）。

接着，将这个单链DNA与用amidite phosphate方法合成的寡核苷酸（a）-（c）〔（a）ATGGCTGAACTGTAATGGTTGTCC，（b）GCTGAACTGTCGTAATGGTTGTCC，（c）GAACTGTCGCCATAATGGTTGTTC〕结合使用，利用Amersham International plc，Buckinghamshire，England的药盒〔寡核苷酸指导的体外致突变系统〕，通过常规方法诱导位点特异性突变。分别设计上述寡核苷酸（a）-（c），以去除IFN-γ基因中非必需的密码子，并得到编码IFN-γ至第123位〔（a）〕、第124位〔（b）〕和第125位〔（c）〕的DNA（见图2）。

按照上述药盒的说明进行DNA操作后，从用所得到的DNA转化的大肠杆菌JM-103中得到噬菌斑，用大肠杆菌JM-103作宿主培养从噬菌斑中取出的噬菌体。从培养物上清中的噬菌体颗粒中获得单链DNA，而从宿主细胞中获得双链DNA。用这个单链DNA分别确定突变位点的碱基顺序，以证实该突变。

用限制酶EcoRI分别消化所得的双链DNA，以分离变异型IFN-γ基因的DNA片段，然后将其插入预先用限制酶EcoRI消化的质粒pLC2的λPL启动子的下游（见图1）。此外，按照Maniatis等人的方案〔Molecular Cloning，pp250-251，Cold Spring Harbor Laboratory（1982）〕，用质粒pRK248cIts〔Hans-urich et al.;Methods in Enzymology，68，482（1979）〕（该质粒有一个温度敏感的PL启动子阻遏物基因）转化大肠杆菌DH1菌株，以建立大肠杆菌DH1/pRK248cIts菌株。用上述 DNA以与上面相同的方法将此菌株进一步转化，分别得到：具有表达质粒pIGT-123，编码多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁴ _Ser-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（IFN-γ4-123）的转化体大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-123（IFO 14647，FERM BP-1474）;具有表达质粒pIGT-124，编码多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁵ _Pro-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（IFN-γ4-124）的转化体大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-124（IFO 14648，FERM BP-1475）;具有表达质粒pIGT-125，编码多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁶ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（IFN-γ4-125）的转化体大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-125（IFO 14649，FERM BP-1476）。

实例2（转化体的培养）

将实例1中得到的转化体，即大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-123（IFO 14647，FERM BP-1474）、大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-124（IFO 14648，FERM BP-1475）和大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-125（IFO 14649，FERM BP-1476），在含有50μg/ml氨苄青霉素、1.6%Bacto-Tripton、1%酵母提取物和0.5%NaCl的2×TY培养基中于30℃培养一夜，得到饱和培养液，再用2×TY培养基将其稀释至三倍体积，并于42℃培养5小时，然后离心分离细菌细胞。这些细胞在冰冻条件下于-80℃贮存备用。

实例3（多肽的纯化）

将50g用实例2所示方法得到的冰冻细菌细胞悬浮于48ml含7M盐酸胍的硼酸钠缓冲液（pH7.2）中，并于4℃搅拌1小时;然后将悬浮液分别以22，000×G离心30分钟，得到57ml上清液。用一种缓冲液将这些上清液稀释至14倍体积，此缓冲液由137mM氯化钠、2.7mM氯化钾、8.1mM磷酸氢二钠和1.5mM磷酸二氢钾组成（pH7.4;以下缩写为PBS）并补充了1M尿素。稀释后以40ml/hr的流速通过一个抗体柱（日本专利公开第107596/1985号）〔所用单克隆抗体是WNγ2-76.53（Hybridoma，6（2），173（1987）），容量为14ml〕。然后该柱用补充了1M尿素的50ml PBS洗涤，再用含2M盐酸胍的20mM磷酸钠缓冲液（pH7.0）洗脱，分别得到含有IFN-γ4-123、IFN-γ4-124和IFN-γ4-125的组分，每个组分的体积为37ml。

将这些组分再通过一个用Sephacryl S-200（Pharmacia）装填的柱（5.0×51cm，容量为1，000ml），该柱预先用补充了2M盐酸胍的25mM醋酸铵缓冲液（pH6.0）平衡。用相同的缓冲液洗脱，分别得到含有IFN-γ4-123、IFN-γ4-124和IFN-γ4-125的组分，每个组分的体积为37mM。

接着，将这些组分用2125mM醋酸铵缓冲液（pH6.0）于4℃透析一天，然后更换外部透析液再透析一天。将得到的透析液用一个YM-5膜和Diaflo（Amicon，Inc.）浓缩，并通过Acrodisc滤器，得到5.3ml滤液，用作试验样品。用牛血清清蛋白作标准液，按照Lowry法〔Lowry et al.;J.Biol.Chem.，193，265（1951）〕测定这些样品的蛋白浓度和总蛋白含量;所获总蛋白含量的数值分别为7.9mg IFN-γ4-123、16.7mg IFN-γ4-124和15.6mgIFN-γ4-125。

按照Laemmli法〔Nature，227，680（1970）〕，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析这些样品。结果，分别在相当于分子量约14，000的位置出现单一的一条带（见图3）。在图3中，图型1、2、3、4、5和6分别表明以下样品的SDS-PAGE结果：磷酸化酶B（分子量92，500）/牛血清清蛋白（66，200）/卵清蛋白（45，000）/碳酸酐酶（31，000）/大豆胰酶抑制剂（21，500）/溶菌酶（14，400）;由下述参考实例得到的多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁸ _Lys-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（以下也称为IFN-γ4-127）;由下述参考实例得到的多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁷ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（以下也称为IFN-γ4-126）;IFN-γ4-125;IFN-γ4-124和IFN-γ4-123。

分别得到IFN-γ4-123、IFN-γ4-124和IFN-γ4-125的均一标准样品。这些标准样品用于研究下述项目：

（a）氨基酸组成

上面得到的标准样品每个取70μg置于玻璃试管中，加入恒沸点盐酸进行水解。减压封管后，于110℃水解24小时。完全水解后，将试管打开，减压除去盐酸。将残留物溶于0.02N盐酸，用日立835型氨基酸分析仪进行氨基酸分析。结果示于表2。

表2

氨基酸每个分子中的残基数^＊

IFN-γ IFN-γ IFN-γ

4-123 4-124 4-125

Asp/Asn 20 20 20

Thr 3.9 3.8 3.7

Ser 6.6 7.2 6.8

Glu/Gln 17.3 17.2 17.3

Pro 1.0 1.0 2.1

Gly 3.2 3.2 3.2

^＊根据Asp/Asn残基数（＝20）计算。

表2（续）

氨基酸每个分子中的残基数

IFN-γ IFN-γ IFN-γ

4-123 4-124 4-125

Ala 5.2 5.2 5.3

Val 7.3 7.5 7.6

Met 3.8 3.8 3.9

Ile 6.5 6.5 6.6

Leu 9.4 9.5 9.5

Tyr 4.0 4.1 4.1

Phe 9.2 9.3 9.2

Lys 16.6 17.0 17.1

His 1.8 1.8 1.9

Arg 3.1 3.1 3.2

Trp -^＊＊- -

^＊＊未测出

（b）N-末端氨基酸顺序

按照Edman法，每个标准样品取12μg，用气相蛋白顺序仪（470-A型，Applied Biosystems，USA）分析N-末端氨基酸顺序。用Micropack SP-ODS柱（Varian，Inc.，USA）通过高效液相色谱法进行乙内酰苯硫脲氨基酸（PTH 氨基酸）的鉴定。表3列出每步所测得的PTH氨基酸。

表3

（c）C-末端氨基酸

每个标准样品取220μg置于玻璃试管内，并加入0.05ml无水肼以进行肼分解。减压密封后，将试管于100℃加热6小时。将得到的肼分解产物进行冷冻干燥，再溶解于蒸馏水中。加入苯甲醛后，在室温下将此溶液搅拌1小时，然后离心得到上清液。将得到的上清液冷冻干燥，用日立835型氨基酸分析仪进行氨基酸分析。结果，在IFN-γ4-123、IFN-γ4-124和IFN-γ4-125中分别只测得亮氨酸、丝氨酸和脯氨酸。

（d）抗病毒活性

IFN-γ4-123、IFN-γ4-124和IFN-γ4-125所具有的抗病毒活性分别为14.5×10⁶U/mg蛋白、9.87×10⁶U/mg蛋白和12.1×10⁶U/mg蛋白。

为了比较本发明的IFN-γ4-123、IFN-γ4-124、IFN-γ4-125和得自下述参考实例的多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des- ¹²² _Glu-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（以下也称为IFN-γ4-121）、IFN-γ4-126、IFN-γ4-127，表4列出它们的抗病毒活性。

表4

^＊未测出

从表4可清楚地看到，本发明的IFN-γ4-123、IFN-γ4-124和IFN-γ4-125具有显著的抗病毒活性。

参考实例1（转化体的产生）

将得自实例1的单链DNA mp19-IGTC（-）与用amidite phosphate方法合成的寡核苷酸（d）（GTCGCCAGCATAGAAAACAGG）结合使用，在下述步骤中诱导位点特异性突变（Zoller et al.;Methods in Enzymology，100，468（1983）〕。

单链DNA和合成的寡核苷酸（d）相互反应形成双链。然后将所得双链用DNA连接酶连接到DNA聚合酶Klenow片段上，制备双链闭环DNA。用限制酶EcoRI消化得到的DNA以分离含IFN-γ基因变异体正链的DNA片段，然后将其插入质粒pLC2的λPL启动子的下游，此质粒预先用限制酶EcoRI消化。此外，按照Maniatis等人的方案〔Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory（1982）〕，用具有一个温度敏感的PL启动子阻遏物基因的质粒pRK248cIts〔Hansurich et al.;Methods in Enzymology，68，482（1979）〕转化大肠杆菌DH1菌株，以建立大肠杆菌DH1/pRK248cIts菌株。此菌株以与上述相同的方法用上述DNA进一步转化。

从所得到的转化体菌落中，选出表达多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁷ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ的菌株。

包含在此菌株中的质粒的IFN-γ编码位点所具有的碱基顺序，可用式（Ⅱ）表示，其中Y′和Z′分别代表CAG和（5′）GCT GAA CTG TCG CCA GCA（3′），就是说，构建了所要的编码多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁷ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ的表达质粒pIGT-126。

用这种质粒转化大肠杆菌N4830菌株〔Reed;Cell，25，713（1981）〕，得到转化体大肠杆菌N4830/pIGT-126（IFO14557，FERMP-9113）。

参考实例2（转化体的产生）

利用与实例1所述相同的方法，将得自实例1的单链DNA mp19-IGT（-）与用amidite phosphate方法合成的寡核苷酸（e）-（f）〔（e）CAAGTGATGGCTTAATGGTTGTCC或（f）TCGCCAGCAGCTTAATGGTTGTCC〕结合使用，分别得到具有表达质粒pIGT-121、编码多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²² _Glu-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ的转化体大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-121和具有表达质粒pIGT-127、编码多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁸ _Lys-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ的转化体大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT

-127。

参考实例3（转化体的培养和多肽的纯化）

利用与实例2所述相同的方法，分别培养得自参考实例1-2的转化体大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-122、大肠杆菌DH1/pRK248cIts/pIGT-127和大肠杆菌N4830/pIGT-126（IFO14557，FERM P-9113），并分别离心分离细菌细胞。利用与实例3所述相同的纯化方法，从这些细胞中得到以下各样品：多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²² _Glu-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ、多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁸ _Cys-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ和多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁷ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ。

按照实例3的描述，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分别分析这些样品。结果，多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁷ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ和多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁸ _Lys-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ各在相当于分子量约14，000的位置出现单一条带（见图3）。

关于多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²² _Glu-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ，得到了一个单一条带，但未测出抗病毒活性。

分别得到多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁷ _Ala-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（IFN-γ4-126）和多肽〔des-¹ _Cys-² _Tyr-³ _Cys，des-¹²⁸ _Lys-…-¹⁴⁶ _Gln〕IFN-γ（IFN-γ4-127）的均一标准样品。这些样品用于研究下列项目：

（a）氨基酸组成

利用与实例3所述相同的方法进行氨基酸分析。结果示于表5。

表5

氨基酸每分子中的残基数^＊

IFN-γ IFN-γ

4-126 4-127

Asp/Asn 20 20

Thr 3.9 3.8

Ser 8.2 7.6

Glu/Gln 17.2 16.9

Pro 2.0 2.0

Gly 3.1 3.5

Ala 6.3 7.3

Val 7.5 7.8

Met 4.0 3.7

Ile 6.6 6.0

Leu 9.3 8.8

Tyr 4.1 3.9

Phe 9.4 9.1

Lys 16.1 16.3

His 1.8 1.8

Arg 3.1 3.0

Trp 0.6 -^＊＊

^＊根据Asp/Asn残基数（＝20）计算。

^＊＊未测出。

（b）N-末端氨基酸顺序

利用与实例3所述相同的方法分析N-末端氨基酸顺序。结果示于表6。

表6

（c）C-末端氨基酸

利用与实例3所述相同的方法鉴定C-末端氨基酸。结果，在IFN-γ4-126和IFN-γ4-127中都只测得丙氨酸。

（d）抗病毒活性

IFN-γ4-126和IFN-γ4-127所具有的抗病毒活性分别为3.3×10⁶U/mg蛋白和2.6×10⁶U/mg蛋白。

Claims

1、一种产生式(Ⅰ)多肽的方法，该方法包括：在一种培养基中培养一种转化体，该转化体携有含一个编码所述式(Ⅰ)多肽的区域的DNA；在一种培养物中产生并积累所述式(Ⅰ)多肽；收集所述式(Ⅰ)多肽。

(N)H-X-Y-Asp Pro Tyr Val

Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys

Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His

Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly

Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu

Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser

Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser

Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe

Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys

Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys

Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu

Asp Met Asn Val Lys Phe Phe

Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg

Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr

Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu

Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile

His Glu Leu Ile Gln Val Met

Ala-Z-OH(C) (Ⅰ)

其中，X是Met或一个化学键；当X是Met时，Y是Gln或一个化学键，当X是一个化学键时，Y是Gln、＜Glu或一个化学键；Z是一个由起始自肽链(N)Glu Leu Ser Pro(C)N-末端的1至4个氨基酸组成的氨基酸或肽。

2、根据权利要求1的方法，其中X为一个化学键。

3、根据权利要求1的方法，其中X为Met。

4、根据权利要求1的方法，其中X为Met，Y为Gln。

5、根据权利要求1的方法，其中X为Met，Y为Gln，Z为Glu-Leu。

6、根据权利要求1的方法，其中X为Met，Y为Gln，Z为Glu-Leu-Ser。

7、根据权利要求1的方法，其中X为Met，Y为Gln，Z为Glu-Leu-Ser-Pro。

8、根据权利要求1的方法，其中Y为一个化学键。

9、根据权利要求1的方法，其中转化体属于大肠杆菌。