CN1217025A - 具有il－16活性的加工的多肽,其生产方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种核酸,它可用于在原核或真核宿主细胞中表达具有白细胞介素－16活性的多肽,其中所述的核酸编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2或在N末端延长了一个天冬氨酸残基的SEQ ID NO:2或在C末端缩短了多达8个氨基酸的形式的多肽,该核酸适合于生产具有活性的IL－16多肽。

Description

具有IL-16活性的加工的多肽，其 生产方法及其用途
本发明涉及具有IL-16活性的多肽，其生产方法及其用途。本发明描述了具有高活性的加工的IL-16。
IL-16(白细胞介素-16)是一种淋巴因子，它也称为淋巴细胞趋化因子(LCF)或免疫缺陷病毒抑制淋巴因子(ISL)。IL-16及其特性在WO94/28134和WO96/31607中及由Cruikshank,W.W.等，美国科学院学报91(1994)5109-5113和由Baier,M.，等，自然378(1995)563描述。IL-16的重组生产也在这些参考文献中进行了描述。根据这些文献，IL-16是分子量为13,385D的蛋白质。Cruikshank还发现ISL在分子筛层析中以分子量为50-60和55-60KD的多聚体形式洗脱。作为一种同型四聚体(产品信息AMS生物技术有限公司，欧洲，目录号11177186)的这种多聚体形式负责趋化活性。分子量为28KD的IL-16的同型二聚体形式由Baier进行了描述。然而，Cruikshank等在免疫学杂志146(1991)2928-2934中描述的趋化活性和Baier描述的重组人IL-16的活性非常小。
本发明的目的是提高IL-16的活性并提供具有低免疫原性及有优势地适宜于治疗应用的IL-16形式。
本发明的目的以可用于在原核或真核宿主细胞中表达具有白细胞介素-16活性的多肽的核酸来实现，其中所述的核酸
a)相应于SEQ ID NO:1的DNA序列或相应于在5’端延长了一个天冬氨酸密码子(GAC)的DNA，或相应于其互补链
b)在严格条件下与SEQ ID NO:1的DNA或与在5’端延长了一个天冬氨酸密码子的DNA杂交，
c)或是如果没有遗传密码简并性能在严格条件下与a)或b)限定的核酸序列杂交的核酸序列。
d)以及在5’端编码氨基酸序列SEQ ID NO:7至10之一或编码在N末端延长一个天冬氨酸的类似序列。
该核酸优选编码具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽或编码具有与SEQ ID NO:2相比在N末端延长了一个天冬氨酸密码的序列的多肽。在另一优选的实施方案中，该核酸编码在C末端缩短了多达8个氨基酸的具有IL-16活性的多肽。
该核酸编码具有IL-16活性的加工的多肽，特别是优选来自灵长类的天然IL-16，如人IL-16或猿种或诸如小鼠的另一哺乳动物的IL-16。
令人惊奇的是已证明WO94/28134的附图2没有描述正确加工的IL-16。该蛋白质前体形式的起始密码子“ATG”不是从核苷酸783而是从核苷酸54或174开始。当一个A插入到核苷酸156之后，一个C插入到核苷酸398之后且一个G插入到核苷酸780之后时产生该阅读框。该序列也显示与WO94/28134的附图2有其它区别。例如存在核苷酸取代(313位G变成A,717C变成A)。IL-16在真核细胞表达期间进行加工。以这种方式产生根据SEQ ID NO:2的多肽和/或具有与SEQ ID NO:2相比在N末端延长了一个天冬氨酸密码子的序列的多肽。对加工的IL-16的了解使之能够生产具有高活性和低免疫原性的IL-16及其衍生物。
IL-16的序列可与该DNA序列编码的蛋白质序列具有一定程度的区别。这种序列改变可以是氨基酸取代，缺失或添加。然而，IL-16的氨基酸序列优选与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少75％相同，且特别优选至少90％相同。部分氨基酸和核酸序列SEQ ID NO:1/SEQ ID NO:2的变异体在，例如，WO96/31607和国际专利申请PCT/EP96/05662和PCT/EP96/05661中描述。然而，多肽具有正确的N-末端是必需的。因此，优选的蛋白质其中N末端的前3个至10个氨基酸不变，从而在N末端以氨基酸序列SEQ ID NO:6至8或以在N端延伸一个天冬氨酸残基的类似序列开始。还优选在C末端缩短多达8个氨基酸的蛋白质。
在本发明意义内的核酸理解为，例如，DNA,RNA和核酸衍生物及类似物。优选的核酸类似物是那些其中糖磷酸骨架被诸如氨基酸的其它单位代替的化合物。这类化合物称为PNA且在WO92/20702中进行了描述。由于PNA-DNA键强于例如，DNA-DNA键，因此，下文所述的严格条件不能应用于PNA-DNA杂交。然而，合适的杂交条件在WO92/20703中进行了描述。
术语“IL-16”在本发明意义内理解为具有IL-16活性的多肽。IL-16优选在WO96/31607所述的试验方法中表现出所述作用或根据WO94/28134刺激细胞分裂。
IL-16结合CD4+淋巴细胞且可抑制诸如HIV-1,HIV-2和SIV的病毒复制。IL-16的功能不受其在MHC复合物中的存在的限制。
特别是IL-16表现出一种和几种下列特性：
-经CD4受体结合T细胞，
-刺激CD4+淋巴细胞上的IL-2受体和/或HLA-DR抗原的表达，
-在IL-2存在下刺激T辅助细胞的增生，
-抑制用抗-CD3抗体刺激的T辅助细胞的增生，
-抑制病毒，优选HIV-1,HIV-2或SIV的复制。
优选在严格条件下与序列SEQ ID NO:1的核酸杂交的核酸。术语“在严格条件下杂交”意思是两个核酸片断在例如Sambrook等，“克隆基因在大肠杆菌中的表达”，分子克隆：实验室手册(1989)，美国纽约冷泉港实验室出版，所述的标准杂交条件下互相杂交。该条件是例如在大约45℃下6.0×SSC中杂交，随后在50℃下2×SSC中洗涤。为了选择严格性，洗涤步骤中的盐浓度例如可选择为在50℃下2.0×SSC的低等严格和50℃下0.2×SSC的高度严格之间。另外，洗涤步骤的温度可在室温，大约22℃的低等严格和65℃的高度严格之间变化。
IL-16优选在原核或真核宿主细胞中经重组产生。该生产方法例如在WO 94/28134和WO 96/31607中进行了描述，它也是本发明说明书的主体目的。然而，为了以限定的和可重复的方式获得IL-16的根据本发明的形式，必须采取本领域的技术人员熟悉的重组生产方法以外的其它方法。
以本领域的技术人员熟悉的方法作为异源表达或作为同源表达(IL-16核酸同源重组进宿主生物基因组后)可生产重组IL-16。为此，首先生产能产生具有IL-16活性的蛋白质的DNA。将该DNA克隆进可转移进宿主细胞并能在那里复制的载体中。该载体除IL-16序列外还含有为DNA序列表达所必需的调节元件。将这种含有IL-16序列和调节元件的载体转移进能表达IL-16 DNA的载体中。在适合于扩增该载体的条件下培养宿主细胞并分离IL-16。在该方法中，合适的方法可保证该蛋白质形成表现出IL-16特性的有活性的三级结构。
也可修饰该蛋白质的核酸序列。该修饰是例如：
-修饰核酸以便导入限制性酶的各种识别序列以利于连结，克隆和诱变步骤
-修饰核酸以掺入优选的宿主细胞密码子
-在核酸上补充其它的操纵子元件以最优化在宿主细胞中的表达。
该蛋白质优选在微生物中，特别是在原核生物且在本例中是大肠杆菌中表达。在原核生物中的表达产生非糖基化的多肽。
表达载体必需含有允许在宿主生物中表达该蛋白质的启动子。这类启动子是本领域的技术人员已知的且是例如，lac启动子(Chang等，自然198(1977)1056),trp启动子(Goeddel等，核酸研究8(1980)4057),λPL启动子(Shimatake等，自然292(1981)128)和T5启动子(美国专利号4,689,406)。诸如tac启动子(美国专利号4,551,433)的合成启动子也是合适的。偶联的启动子系统同样是合适，例如T7-RNA聚合酶/启动子系统(Studier等，分子生物学杂志，189(1986)113)。由噬菌体启动子和微生物操纵子区组成的杂合启动子(EP-A 0 267 851)也是合适的。除了启动子外，有效的核糖体结合位点也是必需的。在大肠杆菌的例子中，核糖体结合位点称为Shine-Dalgarno(SD)序列(Sambrook等，“克隆基因在大肠杆菌中的表达”，分子克隆：实验室手册(1989)，美国纽约冷泉港实验室出版)。
为了提高表达，可作为融合蛋白质表达该蛋白质。在本例中编码内源性细菌蛋白质N端部分或另一稳定蛋白质的DNA序列通常融合到编码IL-16的序列的5’端。其例子是例如lacZ(Phillips和Silhavy，自然344(1990)882-884),trpE(Yansura，酶学方法185(1990)161-166)。
优选是有生物学功能的质粒或病毒载体的载体表达后，融合蛋白优选用酶(例如，因子Xa)裂解(Nagai等，自然309(1984)810)。裂解位点的其它例子是IgA蛋白酶裂解位点(WO 91/11520,EP-A 0 495 398)，遍在蛋白质裂解位点(Miller等，生物/技术7(1989)698)和肠激酶裂解位点。
以这种方式在细菌中表达的蛋白质经过破碎细菌并分离该蛋白质以常规方式获得。
在另一实施方案中可从微生物中作为活性蛋白质分泌该蛋白质。为此，优选使用融合产物，它由适合于在所用的宿主生物中分泌蛋白质的信号序列和编码该蛋白质的核酸组成。在本例中该蛋白质分泌进培养基(在革兰氏阳性细菌中)或分泌进壁膜间隙(在革兰氏阴性细菌中)。方便的是在信号序列和编码IL-16的序列之间插入一个裂解位点，它允许在加工期间或在其它的步骤中裂解该蛋白质。该信号序列来自例如ompA(Ghrayeb等，EMBO J.3(1984)2437),phoA(Oka等，美国科学院学报82(1985)7212)。
该载体另外还含有终止子。终止子是提供转录过程终止信号的DNA序列。它们通常以两个结构特征来鉴定：可形成分子内双螺旋的反向重复的G/C-富集区以及许多U(或T)残基。其例子有噬菌体fd(Beck和Zink，基因16(1981)35-38)和rrnB(Brosius等，分子生物学杂志148(1981)107-127)的主要终止子。
另外表达载体通常含有一个选择标记以便选择转化的细胞。该选择标记是例如氨苄青霉素，氯霉素，红霉素，卡那霉素，新霉素和四环素的抗性基因(Davies等，微生物学年鉴32(1978)469)。同样合适的选择标记是用于细胞所必需的物质，例如组氨酸，色氨酸和亮氨酸的生物合成的必需物质的基因。
许多合适的细菌载体是已知的。例如已描述了用于下列细菌的载体：枯草芽孢杆菌(Palva等，美国科学院学报79(1982)5582)，大肠杆菌(Aman等，基因40(1985)183；Studier等，分子生物学杂志189(1986)113)，奶油色链球菌(streptococcus cremoris)(Powell等，应用环境微生物学54(1988)655)，变青链球菌(streptococcuslividans)和变青链霉菌(streptomyces lividans)(美国专利号4,747,056)。
生产和表达合适的载体的其它遗传工程方法在Sambrook等，分子克隆：实验室手册(1989)，纽约州纽约冷泉港实验室出版中描述。
除了原核生物外，也可在真核生物(例如CHO细胞，酵母或昆虫细胞)中表达重组IL-16。优选酵母系统或昆虫细胞作为真核表达系统。可借助于三类酵母载体：整合型YIP(酵母整合质粒)载体，复制型YRP(酵母复制子质粒)载体和附加型YEP(酵母附加体质粒)载体实现在酵母中的表达。其更详细的情况在例如S.M.Kingsman等，Tibtech 5(1987)53-57中描述。
另外本发明涉及用编码根据本发明的IL-16多肽的核酸以宿主细胞表达所述多肽的方式转化或转染的原核或真核宿主细胞。该宿主细胞通常含有一个有生物学功能的核酸载体，优选含有该核酸的DNA载体，质粒DNA。
另外优选不能进一步裂解为亚基的单体IL-16多肽。
令人惊奇的是证明了WO94/28134中所述的IL-16的核酸和蛋白质序列并不与天然的人序列相对应。它仅仅是非天然的IL-16类似物。然而，优选用于治疗应用的蛋白质与天然蛋白质相同或者与天然蛋白质仅有微小的差别且至少表现出相当的活性和免疫原性。该蛋白质的序列在SEQ ID NO:2中描述(任选在N端延长一个天冬氨酸残基和/或在C末端缩短多达8个氨基酸)。
在本发明范围内的IL-16核酸序列可含有缺失，突变和添加。在优选的实施方案中IL-16的单体形式可多聚体化。可以这种方式增强IL-16的活性。该多聚体形式优选二聚体，四聚体或八聚体形式。
在另一实施方案中，本发明的多肽可另外含有限量的金属离子，每亚基的金属离子数优选0.5到2个。
许多金属离子适合于作为本发明意义内的金属离子。已证明碱土金属以及副族的元素是合适的。碱土金属，钴，锌，硒，锰，镍，铜，铁，镁，钙，钼和银特别合适。该离子可以是单价，二价，三价或四价的。特别优选二价离子。该离子优选作为MgCl2,CaCl2,MnCl2,BaCl2,LiCl2,Sr(NO3)2,Na2MoO4,AgCl2的溶液加入。
这种含有金属离子的IL-16的多聚体形式在国际专利申请PCT/EP96/05661中描述。
经过在合适的营养条件下培养用权利要求1或2所要求的核酸序列转化或转染的原核或真核宿主细胞并任选分离所需的多肽可生产根据本发明的多肽。如果试图在基因治疗处理的情况中体内生产该多肽，则当然不必从细胞中分离该多肽。
本发明的另一主体是含有根据本发明的多肽以及任选药用上合适的稀释剂，佐剂和/或载体的药用组合物，其中该多肽的量和/或特异性活性足以用于治疗应用。
根据本发明的多肽特别适合于治疗由病毒复制，特别是逆转录病毒复制所引起的病理状态以及适合于免疫调节。该治疗应用也在WO96/31607中描述。它还描述了诊断试验方法。
根据本发明的多肽也可优选用于免疫抑制。优选经过抑制TH0和/或TH1和/或TH2细胞的辅助功能实现该免疫抑制。因此根据本发明的多肽在病理上假定为免疫调节异常成分的所有疾病且特别是在超免疫中具有治疗价值。在心脏病学/血管学中可用IL-16治疗的疾病有例如，诸如心肌炎，心内膜炎和心包炎的疾病，在肺脏学中有例如支气管炎，哮喘，在血液学中有自身免疫神经缺乏病和移植排斥，在胃肠病学中有慢性胃炎，在内分泌学中有糖尿病I型，在肾病学中有肾小球肾炎，风湿病，在眼科学中的疾病，在神经学中例如多发性硬化和在皮肤病学中的湿疹。根据本发明的多肽特别是可用于自身免疫疾病，过敏性并避免移植排斥。
本发明还涉及根据本发明的核酸分子在基因治疗上的应用。例如逆转录病毒或非病毒性载体系统是用于该目的的合适的载体系统。
另外本发明还涉及多克隆或单克隆抗IL-16抗体或其与SEQ IDNO:2的前3-20个氨基酸或与N端延长一个天冬氨酸残基的SEQ ID NO:2结合的免疫活性片断，还涉及生产该抗体的方法及其在IL-16的测定和在真核细胞且特别是在哺乳动物细胞材料中测定病毒感染的用途。经过用根据本发明的多肽免疫实现该抗体的生产。根据本领域的技术人员熟悉的方法用含有SEQ ID NO:2的前3-20个氨基酸或N端延长一个天冬氨酸残基的SEQ ID NO:2的免疫原作为半抗原进行免疫接种可实现该抗体的生产。随后可用常规方式从免疫动物中分离该抗体并任选可生产单克隆抗体。
下面的实施例和公开以及序列方案进一步解释本发明从本专利的权利要求书产生的保护范围。所述的方法应作为实施例来理解，即使修改后它仍是描述了本发明的目的。
实施例1
IL-16的克隆，表达和纯化
1.1 RNA分离
5×107 PBMC(来自人或猴)用10μg/ml伴刀豆凝集素A和180U/mlIL-2培养48小时。为了制备RNA，细胞用PBS洗涤一次并随后用5ml变性溶液(RNA分离试剂盒，Stratagene)裂解。加入1ml乙酸钠，5ml酚和1ml氯仿/异戊醇(24∶1)后将裂解产物在冰上保持15分钟。随后将水相与6ml异丙醇混合以沉淀RNA并在-20℃储存2小时。沉淀最后用纯乙醇洗涤一次并溶于150μl H2O中。以分光光度法测定产量为120μg。
1.2 cDNA合成
用于cDNA合成的混合物含有10μg RNA,0.2μg寡聚dT,13mM DTT和5μl混合第一链混合物(第一链cDNA合成试剂盒，Pharmacia)，总量为15μl。混合物在37℃培养1小时随后储存在-20℃备用。
按WO94/28134或WO96/31607所述并考虑修饰的序列实现IL-16cDNA的扩增，克隆及表达克隆的生产。
1.3 IL-16的大肠杆菌表达克隆的10 l发酵和高压破碎
从种子培养物(储存于-20℃的平板涂布物或安瓿)在37℃下摇动培养建立预培养物。接种进下一更高规模的体积在每例中是1-10体积％。在预培养物和主要培养物中使用氨苄青霉素(50-100mg/l)选择质粒丢失。
作为N和C源的酶消化的蛋白质和/或酵母提取物以及作为额外C源的甘油和/或葡萄糖用作营养物。培养基缓冲至pH7并以生理学可耐受的浓度加入金属盐以稳定发酵过程。用具有混合的酵母提取物/C源剂量的饲养批次进行发酵。发酵温度是25-37℃。溶氧分压(pO2)借助于通氧率r.p.m.调节和剂量速率保持在大约20％以下。经过在528nm下测定光密度(OD)来测定生长。借助于IPTG诱导IL-16的表达。经过10-20小时的发酵时期后，在OD值不变时离心收获生物量。
将生物量置于50mM磷酸钠，5mM EDTA,100mM NaCl,pH7中并借助于连续高压挤压在1000巴下破碎。再次离心以这种方式获得的悬液并进一步处理含有溶解的IL-16的上清。
1.4重组人IL-16的纯化
在50mM磷酸钠，5mM EDTA,100mM NaCl,pH7.2中的550ml裂解上清与55ml 5M NaCl,60mM MgCl2,pH8.0混合，搅拌30分钟并随后在20,000g下离心30分钟。将400ml上清上样到预先装有30μMolNiCl2/ml凝胶并用50mM磷酸钠，0.2M NaCl,pH8.0平衡的镍螯合的琼脂糖柱(V=60ml；Pharmacia)上。随后用300ml 50mM磷酸钠，0.5MNaCl,pH7.0洗涤柱，然后用在50mM磷酸钠，0.1M NaCl,pH7.0中的OM至300mM咪唑梯度(2×0.5 l梯度体积)洗脱IL-16融合蛋白质。含有IL-16的馏份借助于SDS-PAGE鉴定，合并且在20mM磷酸钠，pH7.0中透析。
以这种方式获得的300mg融合蛋白质在4℃下用20 l 20mM咪唑，pH5.5透析，随后在20,000g下离心30分钟以去掉浑浊物。接着用NaOH将离心上清调至pH8.5，与0.3mg凝血酶(Boehringer Mannheim GmbH)混合并在37℃培养4小时。随后用HCl将裂解混合物调至pH6.5，经过用水稀释将导电性调至1.7mS。将样品上样到预先用20mM咪唑平衡的Q-琼脂糖FF柱(45ml；Pharmacia)上。使用在20mM咪唑，pH6.5中的0至0.3M NaCl梯度洗脱IL-16。含有IL-16的馏份借助于SDS-PAGE鉴定并合并。借助于分子量分析(分子量13,566+3D)和自动N端序列分析证实IL-16的相同性。IL-16在280nm下的紫外吸收率和在此波长下计算的摩尔消光系数5540M-1cm-1(Mack等(1992)分析化学200,74-80)用于测定浓度。
为了获得所需N末端，任选用氨基肽酶(例如，α氨酰基肽水解酶)或二肽基肽酶(例如，组织蛋白酶CCATH)再裂解。
以这种方式获得的IL-16在还原条件下在SDS-PAGE中纯度超过95％。
Vydac，蛋白质和肽C18,4×180mm柱用于借助于RP-HPLC分析纯度。用0％至80％B(溶剂B：在0.1％TFA中的90％乙晴；溶剂A：在H2O中的0.1％TFA)的线性梯度在30分钟内以1ml/分钟的流速洗脱。在220nm下检测。
实施例2
使用肠激酶裂解位点生产缩短的IL-16
2.1表达克隆
按WO94/28134或WO96/31607所述并考虑修饰的序列实现IL-16cDNA的扩增和克隆及表达克隆的制备。
具有序列SEQ ID NO:3的寡聚核苷酸用作正向引物，它含有EcoRⅠ位点，6个组氨酸和肠激酶裂解位点(D4K)：cccgaattc tatg cat cac cac cac cac cac gatgacgacgacaaa-tctgcagcctcagcctctgcEcoRⅠ              H6                D4K
具有序列SEQ ID NO:6的也含有EcoRⅠ位点，6个组氨酸和肠激酶裂解位点(D4K)的寡聚核苷酸用作正向引物用于在5’端延长一个天冬氨酸密码子的序列：cccgaattc tatg cat cac cac cac cac cac gatgacgacgacaaa-gactctgcagcctcagcctcEcoRⅠ              H6                 D4K
寡聚核苷酸IL-16-R1(SEQ ID NO:4):IL-16-R1:gcg gat cca agctta gga gtc tcc agc agc tgt g或寡聚核苷酸IL-16-R2(SEQ IDNO:5):IL-16-R2:gcg gat cca agc tta ttc ctt gga ctg gag gct ttttc用作反向引物。
两个反向引物含有用于克隆的BamHⅠ和HindⅢ裂解位点。
用IL-16-R1获得了编码根据SEQ ID NO:2的蛋白质的一个序列。
用IL-16-R2获得了编码C末端缩短8个氨基酸的IL-16的一个序列。该C末端IL-16也具有活性。
根据标准条件进行PCR反应，克隆和表达克隆(具有用于纯化的N端poly-His部分的融合蛋白质)的制备：
0.2mM dNTP混合物，正向和反向引物各1pmol/μl,1x高保真缓冲液(Boehringer Mannheim,D),1.5mM MgCl2,2.6U高保真酶混合物(Boehringer Mannheim,D)。
20μl终体积。
仪器：Perkin Elmer GeneAmp 9600
反应过程：
94℃3分钟，56℃1分钟，72℃2分钟，然后25个循环(94℃20秒，56℃20秒，72℃1分钟)。
2.2发酵
与实施例1.3类似地进行发酵。
2.3纯化和裂解
在50mM磷酸钠，5mM EDTA,100mM NaCl,pH7.2中的700ml裂解上清与70ml 5M NaCl,60mM MgCl2,pH8.0混合，搅拌30分钟，随后在20,000g下离心30分钟。将离心上清上样到预先装有NiSO4溶液(c=10mg/ml)并用50mM磷酸钠，0.5M NaCl,pH8.0平衡的镍螯合柱(V=200ml；Pharmacia)上。随后用平衡缓冲液洗涤柱直至几乎达到基线(在280nm下紫外检测)。之后用1l 50mM磷酸钠，0.5M NaCl,pH7.0和用1l 50mM磷酸钠，0.1M NaCl,pH7.0洗涤柱。用在50mM磷酸钠，0.1M NaCl,pH7.0中的0-300mM咪唑，pH 7.0梯度(2×1.6l)洗脱融合蛋白质。含有IL-16的馏份借助于SDS-PAGE鉴定并合并。将该IL-16合并物在Provario(Filtron，膜ω5K)中浓缩至5mg蛋白质/ml的浓度并在50mM Tris,pH8.0中透析。
相当于含有100mg融合蛋白质的合并物用50mM Tris,pH8.0稀释至蛋白质浓度为c=1mg/ml用于肠激酶裂解。加入33μg肠激酶(Boehringer Mannheim；1:3000w/w)后，裂解混合物在37℃培养过夜(14小时)。随后用HCl将pH值调至pH6.5。
经过在20ml镍螯合琼脂糖(其制备见上文)中搅拌并随后离心(10,000g)或经过在玻璃滤器上抽吸过滤上清去掉未裂解的IL-16。经过N端测序和分子量分析证实上清中所含的裂解的IL-16的相同性。经过SDS-PAGE和RP-HPLC(Vydac，二肽基，4.6×150mm，在45分钟内20％至95％B的线性梯度；溶剂A：在H2O中的20mM磷酸钾，pH7.5；溶剂B:100％乙腈)检测纯度。
实施例3
用细胞裂解物(Zellysat)裂解重组IL-16
3.1经MACS分离CD8+和CD4+淋巴细胞
借助于Ficoll梯度从淡黄色覆盖层分离的淋巴细胞重悬于500μlPBS-叠氮化物/1×108个细胞(无Ca2+和Mg2+的磷酸缓冲盐水，0.01％叠氮化钠，5mM EDTA,pH7.2)。加入20ml CD8微珠/1×107个预期细胞(与磁颗粒连结的小鼠抗人CD8抗体，Miltenyi Biotec GmbH)后，将它们在4℃培养15分钟。加入2mg DTAF/1×107个预期细胞(FITC连结的抗小鼠IgG,Dianova公司)在4℃下再处理5分钟。用25ml BPS-叠氮化物/1％BSA稀释后，再次离心(10分钟，1200rpm,4℃)。弃去上清，细胞重悬于2ml PBS/1％BSA中，将细胞悬液上样到位于磁分离器(Miltenyi Biotec GmbH)中的柱上。偶联CD8微珠的CD8+细胞留在柱中，因此流过的部分含有除CD8+细胞外的所有淋巴细胞(大约80％CD4+细胞)。从支架上取出洗涤柱后，用PBS-叠氮化物/1％BSA洗脱CD8+细胞部分。离心流出部分和CD8+细胞部分，重悬于细胞培养基(RPMI 1640,20％FCS,2mM谷氨酰胺，180U/ml IL-2)中，调节细胞数至3×106个细胞/ml并用PHA(9mg/ml)刺激细胞。借助于FACS检查淋巴细胞亚群体分离的质量。
3.2制备细胞裂解物并消化IL-16
已用PHA刺激3天的1×108 CD8+淋巴细胞在与1％Triton X100混合的2mlPBS中在冰上裂解10分钟。然后经离心取出细胞碎片和细胞核。以这种方式获得的45μl细胞裂解物在室温下与10μg以在氨基末端或羧基末端与组氨酸标记(HIS标记，例如，具有裂解位点的6个组氨酸，参见WO 94/28134)融合的形式表达的重组IL-16保温16小时。然后借助于镍琼脂糖基质纯化携带该HIS标记的片段。进一步纯化在HPLC中形成的片段后，以质谱法测定该片段的质量，从而测定N末端片段的大小。以这种方式鉴定了天然加工的IL-16片段，它以SEQID NO:1/2所述的N末端或以延长了一个天冬氨酸密码子的N末端开始。
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WO 94/28134
WO 96/31607
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序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：
(A)名称：由卫生部代表的联邦德国
(B)街道：-
(C)城市：Bonn
(E)国家：德国
(F)邮政编码(邮编)：D-53108
(A)名称：BOEHRINGER MANNHEIM GMBH
(B)街道：Sandhofer Str.116
(C)城市：Mannheim
(E)国家：德国
(F)由政编码(由编)：D-68305
(G)电话：08856/60-3446
(H)电传：08856/60-3451(ⅱ)发明名称：具有IL-16活性的加工的多肽，其生产方
法及其用途(ⅲ)序列数：10个(ⅳ)计算机可读形式：
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30B
         (EPO)(ⅵ)优先申请数据：
  (A)申请号：DE 196 17 202.0
  (B)申请日：1996年4月30日(ⅵ)优先申请数据：
  (A)申请号：DE 196 17 203.9
  (B)申请日：1996年4月30日(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：366个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链型：双链
  (D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：cDNA(ⅸ)特征：
  (A)名称/关键词：CDS
  (B)位置：1..366(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述：TCT GCA GCC TCA GCC TCT GCA GCC AGT GAT GTT TCT GTA GAA TCT ACA    48Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr1               5                  10                  15GCA GAG GCC ACA GTC TGC ACG GTG ACA CTG GAG AAG ATG TCG GCA GGG    96Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly
         20                  25                  30CTG GGC TTC AGC CTG GAA GGA GGG AAG GGC TCC CTA CAC GGA GAC AAG   144Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys
     35                  40                  45CCT CTC ACC ATT AAC AGG ATT TTC AAA GGA GCA GCC TCA GAA CAA AGT   192Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser
 50                  55                  60GAG ACA GTC CAG CCT GGA GAT GAA ATC TTG CAG CTG GGT GGC ACT GCC   240Glu Thr Val Gln Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala65                  70                  75                  80ATG CAG GGC CTC ACA CGG TTT GAA GCC TGG AAC ATC ATC AAG GCA CTG   288Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Asn Ile Ile Lys Ala Leu
             85                  90                  95CCT GAT GGA CCT GTC ACG ATT GTC ATC AGG AGA AAA AGC CTC CAG TCC   336Pro Asp Gly Pro Val Thr  Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser
        100                  105                 110AAG GAA ACC ACA GCT  GCT GGA GAC TCC  TAG                         366Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser    *
    115                 120(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：122个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述:Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala Ala Ser Asp Val Ser Val Glu Ser Thr1               5                  10                  15Ala Glu Ala Thr Val Cys Thr Val Thr Leu Glu Lys Met Ser Ala Gly
         20                  25                  30Leu Gly Phe Ser Leu Glu Gly Gly Lys Gly Ser Leu His Gly Asp Lys
     35                  40                  45Pro Leu Thr Ile Asn Arg Ile Phe Lys Gly Ala Ala Ser Glu Gln Ser
 50                  55                  60Glu Thr Val Gln Pro Gly Asp Glu Ile Leu Gln Leu Gly Gly Thr Ala65                  70                  75                  80Met Gln Gly Leu Thr Arg Phe Glu Ala Trp Ash Ile Ile Lys Ala Leu
             85                  90                  95Pro Asp Gly Pro Val Thr Ile Val Ile Arg Arg Lys Ser Leu Gln Ser
        100                 105                 110Lys Glu Thr Thr Ala Ala Gly Asp Ser   *
    115                 120(2)SEQ ID NO:3的信息：(ⅰ)序列特征：
(A)长度：66个碱基对
(B)类型：核苷酸
(C)链型：单链
(D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：其它核酸
(A)描述：/desc=“正向引物’(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述：CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAATCTG CAGCCTCAGC     60CTCTGC                                                                66(2)SEQ ID NO:4的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：34个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线型
(ⅱ)分子类型：其它核酸
  (A)描述：/desc=“反向引物IL-16-R1’
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述：GCGGATCCAA GCTTAGGAGT CTCCAGCAGC TGTG                         34(2)SEQ ID NO:5的信息：
(ⅰ)序列特征：
  (A)长度：38个碱基对
  (B)类型：核苷酸
  (C)链型：单链
  (D)拓扑学：线型
(ⅱ)分子类型：其它核酸
  (A)描述：/desc=“反向引物IL-16-R2”
(ⅹⅰ)SEQED NO:5的序列描述：GCGGATCCAA GCTTATTCCT TGGACTGGAG GCTTTTTC                      38(2)SEQ ID NO:6的信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：66个碱基对
   (B)类型：核苷酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：线型
(ⅱ)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc=“正向引物”
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述：CCCGAATTCT ATGCATCACC ACCACCACCA CGATGACGAC GACAAAGACT CTGCAGCCTC    60AGCCTC                                                               66(2)SEQ ID NO:7的信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：7个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：线型
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述：
Ser Ala Ala Ser Ala Ser Ala
1               5(2)SEQ ID NO:8的信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：6个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：线型
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述：Ser Ala Ala Ser Ala Ser1               5(2)SEQ ID NO:9的信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：5个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：线型
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述：Ser Ala Ala Ser Ala1               5(2)SEQ ID NO:10的信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：4个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑学：线型
(ⅱ)分子类型：肽
(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述：Ser A1a Ala Ser1

Claims (14)

1．可用于在原核或真核宿主细胞中表达具有白细胞介素-16活性的多肽的核酸，其中所述的核酸
a)相应于DNA序列SEQ ID NO:1或相应于在其5’端延长了一个天冬氨酸密码子的DNA，或相应于其互补链
b)在严格条件下与序列SEQ ID NO:1的DNA或与其在5’端延长了一个天冬氨酸密码子的DNA杂交，
c)或是能在严格条件下与无遗传密码简并性的a)或b)限定的核酸序列杂交的核酸序列
d)以及在5’端编码氨基酸序列SEQ ID NO:7至10之一或编码在其N末端延长一个天冬氨酸的类似序列。
2．权利要求1所要求的核酸，它编码来自灵长类的白细胞介素-16。
3．用权利要求1或2所要求的核酸转化或转染的原核或真核宿主细胞，宿主细胞表达所述多肽。
4．具有生物学功能的核酸载体，它含有权利要求1或2所要求的核酸。
5．可作为权利要求1或2所要求的核酸的真核表达产物获得的来自灵长类的白细胞介素-16，它基本上不含其它人类蛋白质。
6．可作为权利要求1或2所要求的核酸的真核表达产物加工后获得的人类白细胞介素-16，它基本上不含其它人类蛋白质。
7．由权利要求1或2所要求的核酸编码的具有白细胞介素-16活性的多肽。
8．权利要求7所要求的具有白细胞介素-16活性的多肽，其特征在于，它是由一定数目的亚基组成的多聚体，而权利要求7的多肽是其一个亚基。
9．权利要求8所要求的多肽，其特征在于，它由4至32个亚基组成。
10．权利要求7-9所要求的多肽，其特征在于，它含有一定数目的金属离子，每亚基的金属离子数是0.5-2个。
11．生产权利要求7-10所要求的多肽的方法，其特征在于，在合适的营养条件下培养用权利要求1或2所要求的核酸序列转化或转染的原核或真核宿主细胞并任选分离所需的多肽。
12．含有权利要求5-10所要求的多肽以及药用的稀释剂，佐剂和/或载体的药用组合物。
13．含有用于治疗应用足够量的权利要求5-10所要求的多肽的药用组合物。
14．生产抗具有白细胞介素-16活性的多肽的抗体的方法，其中用含有SEQ ID NO:2的前3-20个氨基酸或N端延长一个天冬氨酸残基的SEQ ID NO:2的免疫原作为半抗原免疫接种一种哺乳动物并随后从该哺乳动物中分离该抗体。
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