【発明の詳細な説明】
IL−16活性を有するプロセスされたポリペプチド、それらの製法、及びそれらの
使用
本発明は、IL−16活性を有するポリペプチド、それらの製法及びそれらの使用
に関する。本発明は、高い活性を有するプロセスされたIL−16について記載する
。
IL−16（インターロイキン−16）は、リンパ球化学誘引性因子（lymphocyte c
hemoattracting factor（LCF））ともいわれるリンホカイン又は免疫不善ウィル
ス抑制性リンホカイン（immunodeficiency virus suppressing lymphokine（ISL
））である。IL−16及びその特性は、WO 94/28134及びWO 96/31607 中に、そし
てCruikshank，W.W.，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91（1994）5109-51
13により、そしてBaier，M.，et al.，Nature 378（1995）563により記載されて
いる。IL−16の組換えによる製造も上記文献中に記載されている。これらによる
と、IL−16は、13,385Ｄの分子量を有するタンパク質である。Cruikshankは、IS
L が分子篩クロマトグラフィーにおいて分子量50〜60と55〜60KDをもつ多量体の
形態として溶出されるということも発見した。上記の化学誘引体の活性は、カチ
オン性ホモテトラマーであるこの多量体形態に帰されてきた(製品情報AMS Biote
chnology Ltd.，Europe，Cat．No．11177186)。28KDの分子量をもつIL−16のホ
モダイマー形態は、Baier により記載されている。しかしながら、Cruikshank e
t al．によりJ．Immunol．146（1991）2928-2934中に記載された化学誘引活性及
びBaier により記載された組換えヒトIL−16の活性は、ひじょうに小さなもので
ある。
本発明の目的は、IL−16の活性を改良すること、そして低免疫原性を有し、そ
して有利には治療用途に好適であるIL−16形態を提供することである。
本発明の目的は、原核又は真核宿主細胞内でインターロイキン−16活性を有す
るポリペプチドを発現するために使用されることができる核酸であって：
ａ）配列番号：１のDNA 配列に、アスパラギン酸のコドン(GAC)によりその５
’末端において延長されたDNA に、又はその相補鎖に一致し、
ｂ）ストリンジェント条件下、配列番号：１のDNA と、又はアスパラギン酸の
コドンによりその５’末端において延長されたDNA と、ハイブリダイズし、
ｃ）又は、遺伝子コードの縮重を伴わずにａ）又はｂ）により定義された核酸
配列とハイブリダイズするであろう核酸配列、
ｄ）そしてその５’末端において、アミノ酸配列番号：７〜10の中の１を、又
は１のアスパラギン酸によりＮ末端において延長されたアナログ配列をコードす
る、
前記核酸により達成される。
このような核酸は、好ましくは、アミノ酸配列番号：２をもつポリペプチドを
、又は配列番号：２に比較して、１のアスパラギン酸コドンによりＮ末端におい
て延長されている配列をもつポリペプチドを、コードする。さらに好ましい態様
においては、上記アミノ酸は、そのＣ末端において８以下のアミノ酸の分短縮さ
れているIL−16活性を有するポリペプチドをコードする。
このような核酸は、IL−16活性を有するプロセスされたポリペプチド、特に好
ましくは、霊長類由来の天然IL−16、例えば、ヒトIL−16、又はサル種の又は他
の哺乳類、例えばマウスのIL−16をコー
ドする。
驚ろくべきことに、WO 94/28134 の図２は、正しくプロセスされたIL−16につ
いて記載していないことが判明した。上記タンパク質の前駆体形態の開始コドン
“ATG”は、ヌクレオチド783 から開始せず、むしろヌクレオチド54又は174 か
ら開始する。この読み取り枠は、Ａがヌクレオチド156 の後に挿入されるとき、
Ｃがヌクレオチド398 の後に挿入されるとき、そしてＧがヌクレオチド78 0の後
に挿入されるときに生じる。また、この配列は、WO 94/28134 の図２に対するさ
らなる相違を示す。例えば、ヌクレオチド置換（313Ｇ into Ａ，717 Ｃ into
Ａ）が存在する。IL−16は、真核細胞内での発現の間にプロセスされる。この方
法で、配列番号：２に記載のポリペプチド及び／又は１アスパラギン酸コドンの
分配列番号：２に比較してＮ末端において延長された配列を有するポリペプチド
が得られる。このプロセスされたIL−16の知識は、高い活性及び低い免疫原性を
有するIL−16及び誘導体の製造を可能にする。
IL−16の配列は、上記DNA 配列によりコードされたタンパク質配列と一定の程
度、相違することができる。このような配列の変更は、アミノ酸置換、欠失又は
付加であることができる。しかしながら、上記IL−16のアミノ酸配列は、好まし
くは、配列番号：２のアミノ酸配列と、少なくとも75％、そして特に好ましくは
、少なくとも90％同一である。核酸配列番号：１／配列番号：２のアミノ酸の部
分の変異体は、例えば、WO 96/31607 及び国際特許出願PCT/EP96/05662及びPCT/
EP96/05661中に記載されている。しかしながら、そのポリペプチドが正しいＮ−
末端をもつことが不可欠である。従って、そのＮ末端の最初の３〜10アミノ酸が
変更されておらず、そしてそれ故、Ｎ末端において、アミノ酸番号：６〜10から
、又は１のアスパラギン酸残基の分Ｎ末端において延長されたアナログ配列から
開始するようなタンパク質が好ましい。８以下のアミノ酸の分そのＣ末端におい
て短縮されたタンパク質も好ましい。
本発明の意味において核酸は、例えば、DNA，RNA及び核酸誘導体及びアナログ
として理解される。好ましい核酸アナログは、その糖リン酸塩骨格が他の単位、
例えばアミノ酸により置換されたような化合物である。このような化合物は、PN
A といわれ、そしてWO 92/20702 中に記載されている。PNA−DNA 結合は、例え
ば DNA−DNA 結合よりも強いので、以下に記載するストリント条件は、 PNA−DN
A ハイブリダイゼーションには適用できない。しかしながら、好適なハイブリダ
イゼーション条件がWO 92/20703 中に記載されている。
用語“IL−16”は、本発明の意味においてIL−16の活性を有するポリペプチド
と理解される。IL−16は、好ましくは、WO 96/31607に記載されたテスト手順に
おいてそこに言及された働きを示し、又はWO 94/28134 に従えば、細胞分裂を刺
激する。
IL−16は、CD４+リンパ球に結合し、そしてウィルス、例えば HIV−１，HIV-
２及びSIV の複製を抑制することができる。IL−16の働きは、そのMHC 複合体に
おけるその提示により限定されない。
特に、IL−16は、以下の特性の中の１又はいくつかを示す：
− そのCD４レセプターを介してのＴ細胞への結合、
− CD４+リンパ球上でのIL−16レセプター及び／又は HLA−DR抗原の発現の
刺激、
− IL-２の存在下でのＴヘルパー細胞の増殖の刺激、
− 抗−CD３抗体で刺激されたＴヘルパー細胞の増殖の抑制、
− ウィルス、好ましくは HIV−１，HIV−２又はSIV の複製の抑制。
ストリンジェント条件下、配列番号：１の核酸とハイブリダイズ
する核酸が好ましい。用語“ストリンジェント条件下ハイブリダイズする”とは
、２つの核酸断片が、例えば、Sambrook et al.，“Expression of cloned gene
s in E．coli”in Molecular Cloning：A laboratory manual(1989)，Cold Spri
ng Harbor Laboratory Press，New York，USA 中に記載されたような標準化され
たハイブリダイゼーション条件下で互いにハイブリダイズするということを意味
する。このような条件は、例えば、約45℃での 6.0×SSC 中でのハイブリダイゼ
ーション、その後の50℃での２×SSC での洗浄段階である。上記ストリンジェン
シーを選ぶために、上記洗浄工程における塩濃度は、例えば、低ストリンジェン
シーのための50℃で 2.0×SSC と、高ストリンジェンシーのための50℃での 0.2
×SSC の間に選ばれる。さらに、上記洗浄工程の温度は、低ストリンジェンシー
のための室温、約22℃と、高ストリンジェンシーのための65℃の間で変動するこ
とができる。
IL−16は、好ましくは、原核又は真核宿主細胞内で組換えにより製造される。
このような製造方法は、例えば、WO 94/28134 及びWO 96/31607 中に記載されて
おり、これらも、本目的のために、本発明の開示の主題である。しかしながら、
定義され、そして再現できるやり方で組換え製造によりIL−16の本発明に従う形
態を得るためには、当業者に馴染みのある組換え製造のための方法を超える追加
の手段がとられなければならない。
組換えIL−16は、（宿主生物のゲノム内へのIL−16核酸の相同的組換え後の）
異種発現又は同種発現として当業者に馴染みのある方法により製造されることが
できる。これを目的として、まず、IL−16の活性を有するタンパク質を製造する
ことができるDNA が製造される。このDNA は、宿主細胞内に移されることができ
、そしてそこで複製されることができるベクター内にクローン化される。このよ
うなベクターは、IL−16配列に加えて、そのDNA 配列の発現のために必要な調節
要素を含む。IL−16配列と調節要素を含む上記ベクターは、IL−16のDNA を発現
することができるベクター内に移される。宿主細胞は、ベクターの増幅のために
好適な条件下で培養され、そしてIL−16が単離される。この工程において、好適
な手段が、上記タンパク質が、それがIL−16特性を示すところの活性な３次構造
を採用することができることを保証する。
上記タンパク質の核酸配列は修飾されることができる。このような修飾は、例
えば：
− ライゲーション、クローニング及び突然変異誘発の工程を容易にするため
の制限酵素の各種認識配列を導入するための上記核酸の修飾、
− 宿主細胞のために好ましいコドンを取り込むための上記核酸の修飾、
− 宿主細胞内での発現を最適化するための追加のオペレーター要素による上
記核酸の伸長。
上記タンパク質は、好ましくは、微生物、特に原核細胞内で、そしてこの場合
、大腸菌（E.coli）内で発現される。原核細胞内での発現は、グリコシル化され
ていないポリペプチドを産生する。
上記発現ベクターは、その宿主生物内でのタンパク質の発現を許容するプロモ
ーターを含まなければならない。このようなプロモーターは、当業者に知られて
おり、そして例えば、lac プロモーター（Chang et al.，Nature 198（1977）10
56）、trp プロモーター（Goeddel et al.，Nuc．Acids Res．8（1980）4057）
、λPLプロモーター(Shimatake et al.，Nature 292（1981）128)及びＴ５プロ
モーター（米国特許第 4,689,406号）である。合成プロモーター、例えば、tac
プロモーター（米国特許第 4,551,433号）も好適である
。結合プロモーター系、例えば、Ｔ７−RNA ポリメラーゼ／プロモーター系（St
udier et al.，J．Mol．Biol．189（1986）113）も等しく好適である。バクテリ
オファージのプロモーターと微生物のオペレーター領域から成るハイブリッド・
プロモーター（EP-A 0 267 851）も好適である。有効なリボソーム結合部位が上
記プロモーターに加えて必要である。E.coliの場合、このリボソーム結合部位は
、シャイン−ダルガルノ（Shine-Dalgarno（SD））配列といわれる（Sambrook e
t al.，“Expression of cloned genes in E．coli”in Molecular Cloning：A
laboratory manual（1989）Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，
USA）。
発現を改善するために、上記タンパク質を融合タンパク質として発現させるこ
ともできる。この場合、内因的なバクテリア・タンパク質又は他の好適な安定性
タンパク質のＮ末端部分をコードするDNA 配列が、通常、IL−16をコードする配
列の５’末端に融合される。この例は、例えば、lacZ（Phillips and Silhavy，
Nature 344（1990）882-884），trpE（Yansura，Meth，Enzymol．185（1990）16
1-166）である。
好ましくは生物学的に機能するプラスミド又はウィルス・ベクターであるベク
ターの発現後、融合タンパク質は、好ましくは、酵素（例えば、Xa因子）により
解裂される（Nagai et al.，Nature 309（1984）810）。解裂部位のさらなる例
は、IgA プロテアーゼ解裂部位(WO 91/11520，EP-A 0 495 398)、ユビキチン(ub
iquitin)解裂部位（Miller et al.，Bio/Technology 7（1989）698）及びエンテ
ロキナーゼ（enterokinase）解裂部位である。
バクテリアにおいてこのやり方で発現されたタンパク質は、そのバクテリアを
破壊し、そして上記タンパク質を単離することにより普通のやり方で得られる。
さらなる態様においては、活性タンパク質として上記微生物からタンパク質を
分泌させることができる。この目的のためには、使用される宿主生物内でのタン
パク質の分泌のために好適であるシグナル配列と、そのタンパク質をコードする
核酸から作られた融合生成物が、好ましくは使用される。この場合、上記タンパ
ク質は、（グラム陽性菌においては）その培地中に、又は（グラム陰性菌におい
ては）その細胞周辺腔内に分泌される。プロセッシングの間に又は追加の工程の
間に上記タンパク質の解裂を許容する解裂部位を、上記シグナル配列とIL−16を
コードする配列の間に、挿入することが好都合である。このようなシグナル配列
は、例えば、ompA（Ghrayeb et al.，EMBO J．3（1984）2437），phoA（Oka et
al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82（1985）7212）に由来する。
上記ベクターは、さらにターミネーターを含む。ターミネーターは、転写プロ
セスの終結をシグナルするDNA 配列である。それらは、通常、２つの構造的特徴
：分子内にダブル・ヘリックスを形成することができる逆方向に繰り返されるＧ
／Ｃに富む領域、並びに多数のＵ（又はＴ）残基を特徴とする。例は、ファージ
fd(Beck and Zink，Gene 16（1981）35-38)とrrnB（Brosius et al.，J．Mol．B
iol．148（1981）107-127）のDNA内の主要なターミネーターである。
さらに、上記発現ベクターは、通常、形質転換された細胞を選択するための選
択マーカーを含む。このような選択マーカーは、例えば、アンピシリン、クロラ
ムフェニコール、エリスロマイシン、カナマイシン、ネオマイシン及びテトラサ
イクリンのための耐性遺伝子である（Davies et al.，Ann．Rev．Microbiol．32
（1978）469）。等しく好適である選択マーカーは、その細胞に必要な物質、例
えば、ヒスチジン、トリプトファン及びロイシンの生合成のために不
可欠な物質のための遺伝子である。
多くの好適なバクテリアのベクターが知られている。ベクターは、例えば、以
下のバクテリアについて記載されている：バチルス・サブチリス（Bacillus sub
tilis）(Palva et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 79（1982）5582)、大腸菌
（E.coli）（Aman et al.，Gene 40（1985）183；Studier et al.，J．Mol．Bio
l．189（1986）113）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremo
ris）(Powell et al.，Appl．Environ：Microbiol．54（1988）655)、ストレプ
トコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）及びストレプトミセス・リ
ビダンス（Streptomyces lividans）（米国特許第 4,747,056号）。
さらに、好適なベクターの製造及び発現のための遺伝子操作方法は、J．Sambr
ook et al.，Molecular cloning：a laboratory manual（1989），Cold Spring
Harbor Laboratory Press，New York，N.Y中に記載されている。
原核微生物に加えて、真核細胞（例えば、CHO 細胞、酵母又は昆虫細胞）内で
組換えIL−16を発現させることもできる。上記酵母系又は昆虫細胞は、真核発現
系として好ましい。酵母内での発現は、３つのタイプの酵母ベクター：（組込み
YIp(酵母組込みプラスミド)ベクター）、複製YRp(酵母レプリコン・プラスミド)
ベクター）及びエピソームYEp(酵母エピソーマル・プラスミド)ベクター、によ
り達成されることができる。これについてのさらなる詳細は、例えば、S.M．Kin
gsman et al.，Tibtech 5（1987）53-57中に記載されている。
さらに本発明は：宿主細胞が本発明に係るIL−16ポリペプチドを発現するよう
な方法で当該ポリペプチドをコードする核酸により形質転換され又はトランスフ
ェクトされた原核又は真核宿主細胞に関
する。このような宿主細胞は、通常、生物学的に機能する核酸ベクター、好まし
くはDNA ベクター、プラスミドDNA であって上記核酸を含むものを、含む。
モノマーIL−16ポリペプチドであって、さらにサブユニットに解裂されること
ができないものが、さらに好ましい。
驚ろくべきことに、WO 94/28134 中に記載されたIL−16の核酸及びタンパク質
配列が天然のヒト配列に一致しないということが判明していた。それは、単に非
天然のIL−16アナログである。しかしながら、タンパク質であってその天然のタ
ンパク質に同一であるか又はその天然のタンパク質と僅かに相異するかのいずれ
かであり、そして少なくとも匹敵する活性及び免疫原性を示すタンパク質が、治
療用途のために好ましくは使用される。上記タンパク質の配列は、配列番号：２
（場合により、１のアスパラギン酸残基によるＮ末端伸長及び／又は８以下のア
ミノ酸程Ｃ末端において短縮される）中に記載されている。
IL−16の核酸配列は、本発明の範囲内で、欠失、突然変異及び付加を含む。IL
−16のモノマー形態は、好ましい態様においては多量体化されることができる。
IL−16の活性は、このやり方で高められることができる。このようなマルチマー
形態は、好ましくは、ダイマー、テトラマー又はオクタマー形態である。
さらなる態様においては、本発明に係るポリペプチドは、さらに、規定量の金
属イオンを含み、サブユニット当りの金属イオンの数は、好ましくは 0.5〜２で
ある。
多くの金属イオンが、本発明の意味における金属イオンとして好適である。ア
ルカリ金属イオン並びにその側の族の元素が好適である。アルカリ土類金属、コ
バルト、亜鉛、セレン、マンガン、ニッケル、銅、鉄、マグネシウム、カルシウ
ム、モリブデン及び銀が特
に好適である。上記のイオンは、１価、２価、３価又は４価である。２価イオン
が特に好ましい。上記イオンは、好ましくは、MgCl2，CaCl2，MuCl2，BaCl2，Li
Cl2，Sr(NO3)2，Na2MoO4，AgCl2の溶液として添加される。
このような多量体形態及び金属イオンを含むIL−16の形態は、国際特許出願PC
T/EP96/05661号中に記載されている。
本発明に係るポリペプチドは、好適な栄養条件下、請求項１又は２に記載の核
酸配列により形質転換され又はトランスフェクトされた原核又は真核宿主細胞を
培養し、そして場合により所望のポリペプチドを単離することにより製造される
ことができる。遺伝子治療の処置の意味でインビボにおいて上記ポリペプチドを
製造することが意図される場合、そのポリペプチドは、もちろん上記細胞から単
離されない。
本発明のさらなる主題は、治療用途のために十分である量及び／又は比活性に
おいて本発明に係るポリペプチドを、そして場合により医薬として好適な希釈剤
、補助剤及び／又は担体を含有する医薬組成物である。
本発明に係るポリペプチドは、特に、ウィルスの複製、特にレトロウィルスの
複製により引き起こされる病理学的症状の治療のために及び免疫調節のために好
適である。このような治療用途は、WO 96/31607 中にも記載されている。これは
、診断テスト手順をも記載している。
本発明に係るポリペプチドは、好ましくは、免疫抑制のために使用されること
もできる。この免疫抑制は、好ましくは、TH0及び／又はTH1及び／又はTH2細胞
のヘルパーの働きの阻害により達成される。これ故、本発明に係るポリペプチド
は、免疫異常調節性(immunodysregulatory)成分が病因論において、そして特に
免疫過敏(h
yperimmunity)において仮定されているところの全ての疾患において治療的価値
を有する。心臓病学（cardiology）／脈管学(angiology)においてIL−16により
処置されることができる疾患は、例えば、心筋炎(myocarditis)、心内膜炎（end
ocarditis）及び心膜炎（pericarditis）の如き疾患であり、肺病学(pulmonolog
y)においては、例えば、気管支炎（bronchitis）、ぜん息（asthma）、血液学(h
aematology)においては、自己免疫性ニューロペニア（autoimmune neuropenias
）及び移植拒絶、胃腸病学においては、慢性胃炎、内分泌学においては、真性糖
尿病Ｉ型、腎臓病学（nephrologｙ）においては、糸球体腎炎（glomerulonephri
tis）、リウマチ性疾患、眼科学(ophthalmology)における疾患、神経学において
は、多発性硬化症ならびに皮膚科学(dermatology)におては、湿疹(eczemas)であ
る。本発明に係るポリペプチドは、特に、自己免疫疾患、アレルギーのためにそ
して移植拒絶を回避するために使用されることができる。
本発明は、さらに、遺伝子治療の意味における本発明に係る核酸の使用に関す
る。レトロウィルス又は非ウィルス性ベクター系が、例えば、このために好適な
ベクター系である。
さらに、本発明は、配列番号：２の最初の３〜20アミノ酸に、又は１アスパラ
ギン酸残基程Ｎ末端において伸長された配列番号：２に結合するポリクローナル
又はモノクローナル抗体IL−16抗体又はその免疫活性断片に、並びにこのような
抗体の製法IL−16の測定のための及び真核細胞内及び特に哺乳類細胞材料中での
ウィルス感染の測定のためのそれらの使用に関する。ウィルス活性化哺乳類細胞
及び特にＴ細胞も、IL−16を用いて測定されることができる。このような抗体の
製造は、本発明に係るポリペプチドによる免疫化により行われることができる。
このような抗体の製造は、ハプテンとし
て配列番号：２の最初の３〜20アミノ酸又は１アスパラギン酸残基分Ｎ末端にお
いて伸長された配列番号：２を含む免疫原で免疫感作させることにより当業者に
馴染みのある方法に従って行われる。その後、上記抗体は、免疫感作された哺乳
類から普通のやり方で単離されることができ、そして場合により、モノクローナ
ル抗体が製造されることができる。
以下の実施例及び刊行物並びに配列プロトコールは、その保護範囲が特許請求
の範囲から生じるところの本発明をさらに明らかにする。記載するプロセスは、
修飾後でさえも本発明の目的をさらに説明する実施例として理解されなければな
らない。実施例１
IL−16のクローニング、発現及び精製
１．１ RNA 単離
（ヒト又はサルからの）５×107 PBMCを、10μｇ／mlのコンカナバリンＡ及び
180Ｕ／mlのIL−２と共に48時間培養した。そのRNA を調製するために、上記細
胞を１回 PBSで洗浄し、そしてその後、５mlの変性溶液で溶解した（RNA 単離キ
ット、Stratagene）。この溶解物を、１mlの酢酸Na，５mlのフェノール及び１ml
のクロロホルム／イソアミル・アルコール（24：１）の添加後15分間氷上に保っ
た。この水相を、その後、そのRNA を沈澱させるために６mlイソプロパノールと
混合し、そして−20℃で２時間保存した。この沈澱物を最終的に１回純粋なエタ
ノールで洗浄し、そして 150μｌのH2O中で溶解した。この収量を光度測定法に
より測定し、そしてそれは 120μｇであった。
１．２ cDNA合成
cDNA合成のための混合物は、15μｌの量において、10μｇのRNA，
0.2μｇオリゴ−dT，13mM DTT及び５μｌバルク第１ストランド反応ミックス(第
１ストランドcDNA合成キット、Pharmacia)を含んでいた。この混合物を37℃で１
時間インキュベートし、そしてその後、その後の使用のために−20℃で保存した
。
IL−16 cDNA の増幅、クローニング及びその発現クローンの製造を、その修飾
された配列を考慮しながら、WO 94/28134 又はWO 96/31607 中に記載したように
行った。
１．３ IL−16のためのE.coli発現クローンの発酵及び高圧破壊
プレカルチャーを、振とうしながら37℃でインキュベートされた保存カルチャ
ー（−20℃で保存されたプレート・スミア又はアンプル）から用意する。次の高
い次元への接種容量は、各ケースにおいて１〜10 vol％である。アンピシリン（
50〜100 mg／ｌ）を上記プレカルチャー中で使用し、そしてプラスミドの損失に
対して選択するための主培養中で使用する。
Ｎ−及びＣ−源として、酵素により消化されたタンパク質及び／又は酵母エキ
ス並びに追加のＣ−源として、グリセロール及び／又はグルコースを栄養として
使用する。この培地をpH７に緩衝液化し、そして金属塩を、その発酵プロセスを
安定化させるために生理学的に許容される濃度で添加する。この発酵を、混合酵
母エキス／Ｃ源投与によりフィード・バッチ（feed batch）として行う。発酵温
度は、25〜37℃である。溶存酸素分圧(pO2)は、通気速度、r.p.m.調節及び投与
速度により約20％未満に維持される。成長は、 528nmの吸光度（OD）を測定する
ことにより測定される。IL−16の発現は、IPTGにより誘導される。10〜20時間の
発酵期間の後、そのバイオマスをOD停止遠心分離により収穫する。
上記バイオマスを、５mM EDTA，100mM塩化ナトリウム、pH７中にとり、そして
連続高圧プレスにより1000bar において破砕する。こ
のやり方で得られた懸濁液を再び遠心分離にかけ、そして溶解したIL−16を含む
上清をさらに処理する。
１．４ 組換えヒトIL−16の精製
50mMのリン酸ナトリウム、５mM EDTA，100mM NaCl，pH7.2中の 550mlの溶解上
清を、55mlの５Ｍ NaCl，60mM MgCl2，pH8.0と混合し、30分間撹拌し、そしてそ
の後、20,000ｇで30分間遠心分離した。 400mlの上清を、ニッケル・キレート・
セファロース・カラム(Ｖ＝60ml；Pharmacia)上にとった。これは事前に、30μM
ol NiCl2/mlゲルを充填されており、そして50mMリン酸ナトリウム、0.2Ｍ NaCl
，pH8.0で平衡化されていた。このカラムを、その後、 300mlの50mMリン酸ナト
リウム、0.5Ｍ NaCl，pH7.0で洗浄し、そしてIL−16融合タンパク質を、その後
、50mMリン酸ナトリウム、0.１Ｍ NaCl，pH7.0中の０Ｍ〜300mM イミダゾール、
pH7.0 のグラジエント（２×0.5 ｌグラジエント容量）で溶出した。IL−16を含
有する画分を、SDS−PAGEにより同定し、プールし、そして20mMリン酸ナトリウ
ム、pH7.0 に対して透析した。
この方法で得られた融合タンパク質 300mgを、20ｌの20mMイミダゾール、pH5.
5 に対して４℃で透析し、そしてその後、濁りを除去するために20,000ｇで30分
間遠心分離した。この遠心分離の上清を、その後、NaOHでpH8.5 に調整し、0.3m
g トロンビン（Boehringer Mannheim GmbH）と混合し、そして37℃で４時間イン
キュベートした。その後、この解裂混合物をHCl でpH6.5 に調整し、そしてその
誘電率を、H2Oで希釈することにより1.7mS に設定した。このサンプルを、20mM
イミダゾール、pH6.5 で事前に平衡化されたＱ−Sepharose FFカラム(45ml；Pha
rmacia)に適用した。IL−16を、20mMイミダゾール、pH6.5 中の０〜0.3 Ｍ NaCl
のグラジエントを使用して溶出した。IL−16を含有する画分を SDS−PAGEによ
り同定し、そ
してプールした。IL−16の同定を、質量分析（分子量13,566±３Ｄ）と自動Ｎ末
端配列分析により確認した。280nm におけるIL−16のUV吸収及びこの波長におけ
る5540Ｍ-1cm-1の計算されたモル吸光係数（Mack et al．（1992）Analyt．Bioc
hem．200，74-80）を、上記濃度を測定するために使用した。
所望のＮ末端を得るために、それは、場合により、アミノ・ペプチダーゼ（例
えば、αアミノアシル・ペプチド・ヒドロラーゼ）又はジペプチジル・ペプチダ
ーゼ（例えば、カテプシン（cathepsin）CCATH）で再解裂される。
このやり方で得られたIL−16は、還元条件下、 SDS−PAGEにおいて95％超の純
度をもっていた。
Vydac，Protein & Peptide C18，４×１80mm カラムを、RP-HPLCにより純度を
分析するために使用した。それを、１ml／分の流速で30分間、０％〜80％Ｂの線
形グラジエント（溶媒Ｂ：0.1％ TFA中90％アセトニトリル；溶媒Ａ：H2O中 0.1
％ TFA）を用いて溶出した。検出は 220nmであった。実施例２
エンテロキナーゼ解裂部位を使用した短縮IL−16の製造
２．１ 発現クローン
IL−16 cDNA の増幅及びクローニング並びに発現クローンの製造を、その修飾
配列を考慮しながらWO 94/28134 又はWO 96/31607 中に記載したように行う。
配列、配列番号：３をもつオリゴヌクレオチドを、EcoRＩ部位、６His 及びエ
ンテロキナーゼ解裂部位(D4K)を含む前進プライマーとして使用する：
同じく、EcoRＩ部位、６His 及びエンテロキナーゼ解裂部位(D4K)を含む配列
、配列番号：６をもつオリゴヌクレオチドを、１のアスパラギン酸コドンの分５
’末端において伸長された配列のための前進プライマーとして使用する：
オリゴヌクレオチドIL−16−Ｒ1（配列番号：４）：IL−16−Ｒ1：gcg gat cc a agc tt
a gga gtc tcc agc agc tgt g 又はオリゴヌクレオチドIL−16−Ｒ2（
配列番号：５）：IL−16−Ｒ2 ：gcggat cca agc tta ttc ctt gga ctg gag gct
ttt tcのいずれかを、後退(reverse)プライマーとして使用する。
上記２つの後退プライマーは、クローニングのためのBamHＩとHindIII解裂部
位を含む。
配列が、配列番号：２に記載のタンパク質をコードするIL−16−Ｒ1を用いて
得られる。
配列が、そのＣ末端において８アミノ酸程短縮されたIL−16をコードするIL−
16−Ｒ2を用いて得られる。このＣ末端IL−16も活性である。
PCR 反応、クローニング及び発現クローンの調製（精製のためにＮ末端におい
てポリ−His 部分をもつ融合タンパク質）を、以下の標準条件に従って実施する
：
0.2mM dNTPミックス、１pmol／μｌの各前進及び後退プライマー、１×高フィ
デリティー（fidelity）バッファー（Boehringer Mannheim，D）、1.5mM MgCl2
，2.6Ｕ高フィデリティー酵素ミックス（Boehringer Mannheim，D）。
20μｌ 最終容量
装置：Perkin Elmer Gene Amp 9600
反応コース：
３分間94℃，１分間56℃，２分間72℃、その後25サイクル（20秒間94℃，20秒
後56℃、１分間72℃）。
２．２ 発酵
発酵を、実施例１．３にならって実施する。
２．３ 精製及び解裂
50mMリン酸ナトリウム、５mM EDTA，100mM NaCl，pH7.2中の 700ml溶解上清を
、70mlの５Ｍ NaCl，60mM MgCl2，pH8.0と混合し、30分間撹拌し、そしてその後
、20,000ｇで30分間遠心分離した。この遠心分離された上清を、事前に、NiSO4
溶液（Ｃ＝10mg／ml）で充填され、そして50mMリン酸ナトリウム、0.5Ｍ NaCl，
pH8.0で平衡化されたニッケル−キレート・カラム（Ｖ＝200ml，Pharmacia）に
適用した。このカラムを、その後、ベース・ライン（280nm におけるUV検出）が
ほぼ達成されるまで、平衡バッファーで洗浄した。その後、このカラムを、１ｌ
の50mMリン酸ナトリウム、0.5ＭのNaCl，pH7.0 で、そして１ｌの50mMリン酸ナ
トリウム、0.1Ｍ NaCl，pH7.0で濯ぐ。上記融合タンパク質を、50mMリン酸ナト
リウム、0.1 NaCl，pH7.0（２×1.6ｌ）中、０〜300mイミダゾール、pH7.0 で溶
出した。IL−16を含む画分を、SDS−PAGEにより同定し、そしてプールした。こ
のIL−16プールを、５mgタンパク質／mlの濃度まで、Provario（Filtron、膜オ
メガ５Ｋ）中で濃縮し、そして50mM Tris，pH8.0に対して透析した。
100mg 融合タンパク質を含む上記プールの当量を、エンテロキナーゼ解裂のた
めにＣ＝１mg／mlのタンパク質濃度まで、50mM Tris, pH8.0で希釈した。33μｇ
のエンテロキナーゼ（Boehringer Mannheim；１：3000ｗ／ｗ）の添加後、この
解裂混合物を、37℃で一夜（14時間）インキュベートした。その後、上記pH値を
、HCl でpH6.
5 に調整した。
非解裂のIL−16を、20mlのニッケル・キレート・セファロース中で撹拌し（調
製については上記参照；結合時間２時間）、そしてその後、遠心分離することに
より（10,000ｇ）又はフィルター・フリット（filter frit）上での上記上清の
吸引濾過により、除去した。上記上清中に含まれる解裂されたIL−16の同定を、
Ｎ末端配列決定及び質量分析により確認した。この純度を、 SDS−PAGE及びRP−
HPLCによりチェックした（Vydac、ジフェニル、4.6×150mm、45分間の20％〜95
％Ｂの線形グラジエント；溶液Ａ：H2O中の20mMリン酸カリウム、pH7.5；溶液Ｂ
：100％アセトニトリル）。実施例３
細胞溶解物による組換えIL−16の解裂
３．１ MACSを介するCD８+リンパ球とCD４+リンパ球の分離
Ficollグラジエントにより軟膜（buffy coat）から単離されたリンパ球を、50
0μｌ PBS−アジド／１×108細胞中に再懸濁させる（Ca2+とMg2+を含まないリン
酸塩緩衝液化生理食塩水、0.01％アジ化ナトリウム、５mM EDTA，pH7.2）。予想
される20mlのCD８マイクロビーズ（１×107細胞の添加後（磁気粒子と結合され
た、マウス抗−ヒトCD８抗体、Miltenyi Biotec GmbH）、それらを４℃で15分間
インキュベートする。２mgのDTAF／１×107予想細胞(抗−マウスIgG 結合FITC，
Dianova Company)を、さらに、４℃で５分間添加する。25mlの PBS−アジド／１
％ BSAでの希釈の後、それを再び遠心分離する（10分間、1200rpm，４℃）。こ
の上清を捨て、上記細胞を、２ml PBS／１％ BSA中に再懸濁させ、そしてその細
胞懸濁液を、マグネチップ・セパレーター（Miltenyi Biotec GmbH）内に置かれ
たカラムに適用する。CD８マイクロビーズがそれに結合されたところのCD８+細
胞をカラム内に保持される。従って、フロー画分
は、CD８+細胞以外の全てのリンパ球（約80％のCD４+細胞）を含む。洗浄後、上
記カラムを上記ホルダーから取り外し、そして上記CD８+細胞画分を、PBS−アジ
ド／１％ BSAで溶出させる。上記フロー画分とCD８+細胞画分を遠心分離し、細
胞培養基(RPMI 1640，20％ FCS，２mMグルタミン、180Ｕ／ml IL−２)中に再懸
濁させ、その細胞数を３×106細胞／mlに調製し、そして上記細胞を、PHA(９mg
／ml)で刺激する。上記リンパ球のサブ集団の分離の品質を、FACSによりチェッ
クする。
３．２ 細胞溶解物の調製及びIL−16の消化
PHA で３日間刺激された１×108CD８+リンパ球を、１％ Triton×100 と混合
された２ml PBS中で氷上で10分間溶解させた。次にその細胞死骸と細胞核を、遠
心分離により除去する。このやり方で得られた細胞溶解物45μｌを、室温で16時
間、そのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかにおいてヒスチジン・タグ（
HIS タグ、例えば、解裂部位を有する６つのヒスチジン、WO 94/28134 参照）と
融合されて発現された組換えIL−16の10μｇと、インキュベートする。次に、こ
のHIS タグを担持する断片を、ニッケル・アガロース・マトリックスの助けを借
りて精製する。HPLCにおいて形成された断片をさらに精製した後、これらの断片
の質量を、質量分析により測定し、そしてこのように、そのＮ末端断片のサイズ
を測定する。このやり方で、配列番号：１／２中に示すＮ末端又は１のアスパラ
ギン酸コドン分伸長されたＮ末端から開始する天然にプロセスされたIL−16断片
を同定した。
【手続補正書】
【提出日】１９９８年１０月２６日
【補正内容】
請求の範囲
１．原核又は真核宿主細胞内でインターロイキン−16活性を有するポリペプチ
ドを発現させるために使用されることができる核酸であって、その５’末端にお
いて配列番号：７〜10のアミノ酸配列の中のいずれか１をコードし、
ａ）配列番号：１のDNA 配列又はその５’末端において１のアスパラギン酸コ
ドンの分、伸長された上記DNA 、あるいはその相補鎖に一致し、
ｂ）配列番号：１のDNA と、又は１のアスパラギン酸コドンの分、その５’末
端において伸長された上記DNA とストリンジェント条件下、ハイブリダイズし、
ｃ）又は、その遺伝子コードの縮重を伴わずにａ）及びｂ）により定義した核
酸配列とストリンジェント条件下、ハイブリダイズするであろう核酸配列である
、
前記核酸。
２．請求項１に記載の核酸によりコードされたインターロイキン−16活性を有
するポリペプチド。
３．請求項１に記載の核酸配列により形質転換され又はトランスフェクトされ
た原核又は真核宿主細胞が、好適な栄養条件下で培養され、そして所望のポリペ
プチドが場合により単離される、請求項２に記載のポリペプチドの製法。
４．請求項２に記載のポリペプチド並びに医薬として好適な希釈剤、補助剤及
び／又は担体を含む、医薬組成物。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＤＹ Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ０７Ｋ 14/54 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｋ
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＧ
Ｃ１２Ｐ 21/02 37/02 ＡＤＹ
// Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＢＧ ＡＢＡ
(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ
，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ
，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，
ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ
Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ
，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，
ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ
，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 バイエル，ミヒャエル
ドイツ連邦共和国，デー―60318 フラン
クフルト，エッケンハイマー ランドシュ
トラーセ 57アー
(72)発明者 バンナート，ノルベルト
ドイツ連邦共和国，デー―60322 フラン
クフルト，アディッケザレー 13
(72)発明者 バーナー，アルブレッヘト
ドイツ連邦共和国，デー―69469 バイン
ハイム，プランケルシュトラーセ 30
(72)発明者 ランク，クルト
ドイツ連邦共和国，デー―82377 ペンツ
ベルク，ランゴーナー シュトラーセ 10