JPH04103599A

JPH04103599A - 融合ポリペプチド

Info

Publication number: JPH04103599A
Application number: JP2221826A
Authority: JP
Inventors: Ritsuko Sawada; 沢田　律子; Masanobu Naruto; 成戸　昌信
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1990-08-22
Filing date: 1990-08-22
Publication date: 1992-04-06

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は、医薬品として利用しうるコロニー刺激因子と
インターロイキン６との融合タンパク質に関する。

［従来の技術］血液中には、赤血球、リンパ球、顆粒球、マクロファー
ジ、血小板など各種の細胞が存在する。

これらの各種血液細胞には寿命があり、骨髄より絶えず
生産、供給されることにより恒常性を維持している。す
べての血液細胞は自己複製能を有する多能性幹細胞に由
来し、種々の前駆細胞を経て、成熟細胞へと増殖、分化
する。この過程には様々なタンパク性の分化、増殖因子
が関与している。

特に、顆粒球、マクロファージの増殖と分化を促進する
因子はコロニー刺激因子（以下Ｃ８Ｆと略す）と呼ばれ
ており、インターロイキン３、顆粒球・マクロファージ
Ｃ８Ｆ　（以下ＧＭ−Ｃ５Ｆと略す）、マクロファージ
Ｃ８Ｆ　（以下Ｍ−Ｃ８Ｆと略す）、顆粒球Ｃ３Ｆ　（
以下Ｇ−Ｃ３Ｆと略す）が知られている。

その中でＧ−Ｃ８Ｆは、好中球産生刺激、好中球機能（
遁走能、倉食能、殺菌能など）の亢進、造血幹細胞／前
駆細胞の増幅、骨髄性白血病細胞の増殖／分化の刺激な
どの生物作用を有する生体制御に重要な因子であり、細
菌・真菌感染症の予防・治療薬、癌治療や骨髄移植に基
づく顆粒球減少時の補助薬、さらに白血病自体の治療薬
となる可能性がある（浅野茂隆、高久史磨（１９８９）
　、実験医学、　　７．１９１−１９７）。Ｇ−Ｃ８Ｆ
のｃＤＮＡとその全遺伝子は、すでにクローニングされ
ており（Ｎａｇａｔａら、　Ｎａｔｕｒｅ、　３１．９
．４１５−４１８．１９８６ならびにＮａｇａｔａら、
　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、　　５．　５７５−５８１．
　１９８６）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）
細胞由来（Ｏｈｅｄａら、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｉ、、
　１０３．５４４−５４６．　１９８８）と大腸菌由来
（Ｓｏｕｚａら、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３２．６１−
６５．１９８６）の組換え型Ｇ−Ｃ５Ｆの産生が報告さ
れている。

一方、インターロイキン６は造血免疫系のみならず、神
経系、肝細胞など極めて多方面の組織、臓器に関与する
生体防御にとって重要な因子であることが明らかにされ
つつあり（平野俊夫、医学のあゆみ、　１４６．３０１
−３０４．１９８８）　、医薬品、特に癌治療や骨髄移
植に基づく血小板減少時の補助薬としての期待がもたれ
ている。このインターロイキン６を得る方法としては、
培養細胞を用いる方法＜Ｓｈｉｍｕｚｕら、　Ｊ、　　
ＪＩＢｍｕｎｏｌ、、　１３４．１７２８−１７３３．
１９８５）や、遺伝子組換え細胞あるいは微生物を利用
する方法がすでに報告されている（Ｈｉｒａｎｏら、　
Ｎａｔｕｒｅ、　３２４．７３−７６、１９８６）。

最近、遺伝子工学的技法の進歩により、タンパク質を暗
号化している遺伝子レベルの改変によって新規なタンパ
ク質を得ることが容易にできるようになってきた。この
ような技術の進歩は、異種のタンパク質を融合させてタ
ンパク質の取得をも可能にした。このような融合タンパ
ク質においては、発現量の増大、作用スペクトルの拡大
もしくは限定化、副作用の軽減などが期待できる。例え
ば、β−ガラクトシダーゼと融合させたタンパク質は大
腸菌内で効率良く発現するようになる（Ｂｒｅｓｓａｎ
　、　Ｇ　、ら、　Ｎｕｃ、　ａｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、
、　１５．１００５６．１９８７）。また、ヒトインタ
ーフェロンβとインターフェロンγを融合させたタンパ
ク質は、ヒトインターフェロンβあるいはヒトインター
フェロンγ感受性の両細胞に対して抗ウィルス作用を示
すことが報告されている（田中利明ら、特開昭６３−２
６７２７８号公報、特開昭６３−２６７２９６号公報）
。

癌治療時や骨髄移植時では、化学療法剤の投与や放射線
照射により骨髄抑制が起こり、種々の血球系の細胞が減
少する。好中球を特異的に増加させる因子として、Ｇ−
Ｃ３ＦなどのＣ８Ｆが知られている。しかしながら、骨
髄抑制は同時に血小板の減少も伴なうので、インターロ
イキン６のような血小板増加作用のある医薬も必要とさ
れている。Ｃ８Ｆは増血系の細胞だけに作用するのに対
して、インターロイキン６は造血系の細胞のほかにも広
範囲な細胞に作用すること（前述）が知られている。

［発明が解決しようとする課題］本発明は、作用スペクトルの改良された、望ましくは副
作用の少ない体内動態（体内分布）や安定性の改良され
た、またある場合には、標的細胞選択性の優れた造血活
性を有するＣ３Ｆとインターロイキン６との融合ポリペ
プチドを提供することを目的とする。

［課題を解決するための手段］本発明者らは融合ポリペプチドの作製にあたり、両タン
パク質の立体構造になるべく変化を与えない方法を鋭意
検討し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、ヒトＣ８Ｆのポリペプチドとヒトイ
ンターロイキン６のポリペプチドからなる機能的な融合
ポリペプチドを提供する。

本発明におけるＣ８Ｆとは、インターロイキン３、ＧＭ
−Ｃ８Ｆ、Ｍ−Ｃ８Ｆ、、Ｇ−Ｃ５Ｆを指し、このいず
れを用いてもかまわない。例えば、ヒｈＧ−Ｃ３Ｆは好
中球の分化、増殖に深く関与していることが知られてい
る。ヒトＧ−Ｃ８Ｆの具体的なアミノ酸配列は、長円ら
の報告に記載されている（Ｎａｔｕｒｅ、　３１９．４
１５−４１８．１９８６）　、ヒトＧ−Ｃ８Ｆを暗号化
するＤＮＡを取得する方法は、動物細胞からメツセンジ
ャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を調製しｃＤＮＡを合成する
方法、あるいは化学的に合成する方法があるが、いずれ
の方法でもよい。

また、本発明におけるインターロイキン６とは、従来Ｂ
ＳＦ−２、ＩＦＮ−β２．２６にタンパク、ハイブリド
ーマ／プラズマサイトーマ増殖因子、肝細胞増殖因子な
どの名称で呼ばれていたタンパク質を指す。ヒトインタ
ーロイキン６の具体的なアミノ酸配列は、平野らの報告
に記載されている（Ｎａｔｕｒｅ、　３２４．７３−７
Ｌ　１９８Ｂ）　、ヒトインターロイキン６を暗号化す
るＤＮＡを取得する方法には、動物細胞からｍＲＮＡを
調製しｃＤＮＡを合成する方法、あるいは化学的に合成
する方法があるが、いずれの方法でもよい。

ヒトＣ８Ｆとヒトインターロイキン６との融合ポリペプ
チドとしては、両者のフルレングスを単につなぎ合わせ
たもの、両者の途中から切断したものをつなぎ合わせた
ものなどが考えられるが、いずれのポリペプチドでもか
まわない。しかしながら、ヒトＣ３Ｆとヒトインターロ
イキン６との融合ポリペプチドの設計においては、両タ
ンパク質の立体構造になるべく変化を与えないことが望
ましい。何故なら、ヒトインターロイキン６の場合には
、その活性部位はＣ末端側にあるにもかかわらず、Ｎ末
端側の欠失により失活することが報告されており（Ｋｒ
ｉｉｔｔｇｅｎ、Ａ、ら、　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ８
，２６２、３２３−３２６，１９９０）　、これは、そ
の立体構造がインターロイキン６の活性発現に深く関与
していることを示しているからである。

Ｇ−Ｃ３Ｆとインターロイキン６は、そのアミノ酸配列
における類似性は高くなく、またその生理作用は異なる
ものの、その遺伝子構造（エキソンーイントロン構成）
は第１図（ａ）に示すように酷似している（Ｙａｓｕｋ
ａｗａら、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪ、、　６　。

２９３９−２９４５．１９８７）。さらに、タンパク質
の立体構造の形成に重要なシスティンの数と位置が保存
されている（松田正ら、実験医学、　　７　、１３−２
０．１９８９〉。従って、本発明者らは両者をエクソン
部分ごとに遺伝子をつなぎ合わせれば、その遺伝子配列
より転写、翻訳される融合ポリペプチドの立体構造は保
持されることが期待できると考えた。例えば、Ｇ−Ｃ８
Ｆとインターロイキン６は第１図（ａ）に示すように、
それぞれ５つのエクソンからなるので、エクソンごとに
つなぎ合わせた場合、計３０個の融合ポリペプチドが考
えられる。

実際上は、Ｇ−Ｃ３Ｆとインターロイキン６の両者とも
、成熟タンパク質は第２エクソンの途中からはじまるの
で、成熟タンパク質に注目して、エクソン部の組み合わ
せによるＧ−Ｃ８Ｆとインターロイキン６の融合テンバ
ク質の種類は１４通りになる。例えば、第１図（ｂ）の
ような融合ポリペプチドが一例として考えられる。

従って、本発明の特徴の一つは、Ｇ−Ｃ５Ｆとインター
ロイキン６の両者の分子量や基本的な構造を大きく変え
ることな（両者の融合ポリペプチド（場合によりキメラ
蛋白質とも言われる）を規定するものであり、方法論と
して遺伝子のエクソン部分をブロックとしてつなぎ変え
ることを一つの特徴とする。

しかしながら、本発明はエクソン部同士のつなぎ換えに
よるＧ−ＣＳＦとインターロイキン６の融合ポリペプチ
ド（場合によりキメラ蛋白質とも言われる）に限定され
るものではなく、基本的にはＣ８Ｆとインターロイキン
６の組み合わせによる融合ポリペプチド全体を含むもの
である。

ヒトＣ８Ｆとヒトインターロイキン６との融合ポリペプ
チドを作製する方法は、各々のタンパク質を精製した後
、化学的に結合させる方法あるいは融合ポリペプチドを
暗号化するＤＮＡを作製し、これを発現させることによ
り目的物を得る方法があるが、いずれの方法でもよい。

融合ポリペプチドを暗号化するＤＮＡを作製する方法と
しては、化学的に全合成する方法、制限酵素を利用する
方法、ポリメラーゼ鎖伸長反応（ＰＣＲ）を利用した方
法（Ｒ，Ｍ、Ｈｏｒｔｏｎら、　ＧＥＮＥ、　７７、６
１−６８．１９８９）などがあるが、いずれの方法を用
いてもよい。例えば、目的物の分子量が大きくて全合成
が困難な場合、あるいは適当な制限酵素認識部位が存在
しない場合では、ＰＣＲ法を利用することができる。こ
の方法は、例えばヒトＧ−Ｃ８Ｆとヒトインターロイキ
ン６の融合ポリペプチドを暗号化するＤＮＡを取得する
場合、第２図に示す操作により目的物を得ることができ
る。

まず、４種類（１〜４）の１５〜３０塩基のプライマー
を作製する。太線はＧ−Ｃ８Ｆと相補的な配列、細線は
インターロイキン６と相補的な配列を示す。すなわち、
２のプライマーはＧ−Ｃ３Ｆに相補的な配列（１６塩基
）と３のプライマーのインターロイキン６部分に相補的
な配列（９塩基）を有し、３のプライマーはインターロ
イキン６に相補的な配列（１６塩基）と２のプライマー
のＧ−Ｃ８Ｆ部分に相補的な配列（９塩基）を有するよ
うに設計する。点線はＥｃｏＲＩ酵素認識部位を含む配
列を示すが、各々のポリペプチドを暗号化するＤＮＡ配
列中に存在しない制限酵素認識配列を含むものならば、
いずれの配列でもかまわない。

第２図に示すように、１と２のプライマーを用いてＧ−
Ｃ３ＦのｃＤＮＡを、３と４のプライマーを用いてイン
ターロイキン６のｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＨにより
断片を増幅する。次に、各々の増幅されたＤＮＡ断片を
混合したものを鋳型としてＰＣＲを行なう。Ｇ−Ｃ３Ｆ
由来の断片とインターロイキン６由来の断片は、第２図
に示すごとく１８塩基の相補的な配列を有しているので
アニーリングし、各々の断片がプライマーとなり、Ｇ−
Ｃ８Ｆとインターロイキン６との融合ポリペプチドを暗
号化する２本鎖ＤＮＡ　（融合遺伝子）が生じる。この
反応に１と４のプライマーを加えることにより、目的と
する融合遺伝子を増幅させることができる。この増幅さ
れた融合遺伝子は両端にＥｃｏＲＩ酵素切断部位を有し
ているので、切断後、適当なプラスミドベクターに挿入
することができる。

このようにして作製した融合遺伝子発現用のプロモータ
ー、あるいは発現をコントロールする領域としては、遺
伝子工学の分野で用いられている各種のプロモーターや
エンハンサ−が利用できる。

例えば、真該細胞での発現用としては、シミアンウィル
スのＳＶ４０のプロモータ−９エンハンサ、亜鉛により
発現誘導可能なメタルチオネイン遺伝子のプロモーター
、ラウス肉腫ウィルスのＬＴＲ領域、ヒトＴ細胞白血病
ウィルスのＬＴＲ領域などが挙げられる。組換えＤＮＡ
の構築に用いるベクターとしては、遺伝子工学の分野で
用いられているプラスミド由来の各種ベクターが利用で
き、用いる宿主中での複製のための複製開始領域を有す
るものを適宜選択して用いる。例えば、ｐＳ　Ｒａ　２
９６　（Ｔａｋｅｂｅ、Ｙ、ら、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１
．　Ｂｉｏｌ、。

４　、４６６−４７２．１９８８）が挙げられるが、こ
れに限定されるものではない。

融合遺伝子を組み込んだ発現ベクターを真該細胞に導入
し、適当な条件下で培養することにより該融合遺伝子に
規定された融合ポリペプチドを得ることができる。この
融合ポリペプチド生産用宿主としては、酵母、昆虫、両
性類および哺乳類の細胞が利用できるが、いずれを用い
てもかまわない。本発明においては、哺乳類由来の細胞
、例えばハムスターＣＨＯ細胞、マウスＣ１２７細胞、
サルＣＯ８細胞などを用いることが望ましい。

哺乳類由来の細胞を宿主とした場合には、融合ポリペプ
チドは細胞の培養上清中から回収することができる。さ
らに、各種クロマトグラフィーにより融合ポリペプチド
を精製することが可能である。

［実　施　例］以下に、実施例によって本発明をさらに詳しく説明する
。

一般的な実験方法は、実装置［５ａＩＩｌｂｒｏｏｋ、
Ｊ、　Ｆｒｊｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、
Ｔ、　（１９８９）　”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ。

ｎｉｎｇ　：　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａ
ｌ″Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　］に従った。

実施例１ヒトインターロイキン６遺伝子のクローニング：インタ
ーロイキン６、Ｇ−Ｃ５ＦおよびＧＭ−Ｃ８Ｆを産生ず
るヒト甲状腺由来細胞株ＮＩＭ−１（微工研菌寄第１１
１０３号）から、グアニジウムチオシアネートを用いる
公知の方法により全ＲＮＡを調製し、さらにオリゴｃｌ
Ｔセルロースカラムクロマトグラフィーを用い、公知の
方法に従ってｍＲＮＡを精製した。このｍ　ＲＮ　Ａ　
１μｇを材料に、公知の方法を利用したｃＤＮＡ合成キ
ット（ベーリンガー社製）を用いて２本鎖のｃＤＮＡを
合成した。次に、以下に示すようなＥｃｏＲ■切断部位
を含む、インターロイキン６のＮ末端およびＣ末端に相
当する部分を暗号化する合成オリゴマーを作製した。

５−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡ
ＣＴＣ−３５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴ
ＡＣＡＴＴＴＧＣＣ−３゜合成オリゴマーは、自動ＤＮ
Ａ合成装置（アプライドバイオシステム社製）を用いて
合成した後、逆相ＨＰＬＣにより精製したものを用いた
。これらをプライマーとし、合成したｃＤＮＡの１／３
量を用いて、ＰＣＲ法によりＥｃｏＲＩ切断部位を両端
に保持するインターロイキン６ｃＤＮＡを増幅した。Ｐ
ＣＲ反応液の組成は既報（Ｓａｉｋｉ、Ｒ。

Ｋ、ら、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．４８７−４９１　
（１９８８）　）に従った。

反応は、ＤＮＡサーマルサイクラ−ＤＪｌｏｏＯ（パー
キンエルマーシータス社製）を用い、熱変性９４℃１分
間、アニーリング５０℃２分間、伸長反応７２℃３分間
の条件で、４０サイクル反応を繰り返した。得られた反
応混合物をフェノール／クロロホルム抽出２回、クロロ
ホルム抽出丁目した後、ＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮ
Ａを低融点アガロースゲル電気泳動を用いて分離し、目
的の約５７０ｂｐのＤＮＡ断片を分取した。

実施例２動物細胞発現ベクターへの導入：ｐ　Ｓ　Ｒａ　２９６　（Ｔａｋｅｂｅ、Ｙ、ら、　Ｍ
ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｌｏｌ、、　　４．４６６−４
７２．１９８８）をＥＣ０ＲＩ消化後、Ｂ　Ａ　Ｐ　（
Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈ
ａｔａｓｅ）処理により５°末端を脱燐酸化し、これと
実施例１で得られたインターロイキン６ｃＤＮＡを混合
、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した後、Ｅ、ｃ。

１ｉ　　ＨＢＩＯＩを形質転換した。得られたアンピシ
リン耐性を示す形質転換株を培養、アルカリ抽出法によ
りプラスミドＤＮＡを調製した。インターロイキン６ｃ
ＤＮＡがベクターに正しい向きで挿入されたクローンを
選ぶため、調製したＤＮＡをＰｓｔｌで消化、アガロー
スゲル電気泳動によりＤＮＡを分離した。インターロイ
キン６ｃＤＮＡはその３′側に、ベクターはｃＤＮＡ挿
入位置の５′側にＰｓｔ１部位があり、インターロイキ
ン６ｃＤＮＡが正しい向きに入っている場合、約５００
ｂｐのバンドが検出されることとなる。このような方法
により、インターロイキン６ｃＤＮＡを正しい方向に挿
入した発現プラスミドｐＳＲαＩＬ６を選び出した。

実施例３Ｇ−Ｃ８Ｆ／インタ一ロイキン６融合遺伝子の作製：Ｇ−Ｃ５Ｆ／インタ一ロイキン６融合遺伝子を、ＰＣＲ
法（前述文献）を利用して第２図に示すような手順で作
製した。まず、以下に示すようなＧ−Ｃ８Ｆあるいはイ
ンターロイキン６の一部を暗号化する合成オリゴマーを
作製した。

Ｇ−１０１、５’−ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＧＡＣＣＣＡＴ
ＧＧＣＴＧＧＡＣＣ−３Ｇ−１０２；　５°−ＧＴＴＡ
ＣＡＴＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＣＴＧＧＡＧＣ−３’６
−１０１　；　５　”ＧＡＧＡＡＧＣＴＧＡＣＡＴＧＴ
ＡＡＣＡＡＧＡＧＴＡ−８’６−１０２　、５−ＣＣＧ
ＡＡＴＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＡＣＡＴＴＴＧＣＣ−３
上記４種のオリゴマーは各々第３図に示す部分のプライ
マーを示し、下線はＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を示す
。

合成オリゴマーは、自動ＤＮＡ合成装置（アプライドバ
イオシステム社製）を用いて合成した後、逆相ＨＰＬＣ
により精製した。

ヒト甲状腺由来細胞株ＮＩＭ−１（前述）から公知の方
法によりクローニングしたＧ−Ｃ８ＦｃＤＮＡを大腸菌
の発現ベクターｐＵｃ１９に挿入したベクターｐＵｃ１
９Ｇ−Ｃ８Ｆ５０ｎｇを鋳型とし、上記Ｇ−１０１とＧ
−１０２をプライマーとし、ＰＣＲ法（前述文献）によ
りヒトＧ−Ｃ８Ｆの第１エクソンと第２エクソン（Ｎａ
ｇａｔａ、Ｓ。

ら、　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、　　５　、５
７５−５８１．１９８６）部分と、そのＮ末端側にＥｃ
ｏＲＩ切断部位、Ｃ末端側にヒトインターロイキン６の
第３エクソンの３アミノ酸（Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ）
をコードする遺伝子配列（Ｙａｓｕｋａｗａ、に、ら、
　Ｔｈｅ　ＥＭＢＯＪｏｕｒｕａｌ、　　６　、２９３
９−２９４５、１９８７）を有する約２００ｂｐのＤＮ
Ａを増幅した。一方、ヒトインターロイキン６を挿入し
たベクターｐｓＲα１Ｌ６（実施例２）５０ｎｇを鋳型
とし、上記６−１０１と６−１０２をプライマーとし、
ＰＣＲ法（前述文献）によりヒトインターロイキン６の
第３、第４、第５エクソン（前述文献）部分と、そのＮ
末端側にＧ−Ｃ８Ｆの第２エクソンの３アミノ酸（Ｇｌ
ｕ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ）をコードする遺伝子配列（前述文
献）と、Ｃ末端側にＥｃｏＲＩ切断部位を有する約４３
０ｂｐのＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応液（１００μα
）の組成は既報（前述文献）に従った。反応は、ＤＮＡ
サーマルサイクラ−ＤＪｌｏｏＯ（前述）を用い、熱変
性９４℃１分間、アニーリング５２℃２分間、伸長反応
７２℃３分間の条件で、４０サイクル反応を繰り返した
。それぞれの反応生成物について低融点アガロースゲル
電気泳動を行ない、目的の長さのＤＮＡが得られたこと
を確認した。

次に、これらの反応生成物各２μαを混合したものを鋳
型とし、上記Ｇ−１０１と６−１０２をプライマーとし
、ＰＣＲ法（前述文献）によりヒトＧ−Ｃ８Ｆ／インタ
ーロイキン６の融合タンパク質をコードする約６３０ｂ
ｐのＤＮＡを増幅した。

反応は、熱変性９４℃１分間、アニーリング５５℃２分
間、伸長反応７２℃３分間の条件で、４０サイクル反応
を繰り返した。得られた反応混合物をフェノール／クロ
ロホルム抽出２回、クロロホルム抽出１回した後、Ｅｃ
ｏＲＩ消化した。このＤＮＡを低融点アガロースゲル電
気泳動を用いて分離し、目的の約６３０ｂｐのＤＮＡ断
片であるＧ−６Ａ（第１図（ｂ））を得た。

実施例４融合遺伝子の動物細胞発現ベクターへの導入：実験例２
で使用した、ＥｃｏＲＩ消化後５′末端を脱燐酸化した
ｐｓＲα２９６と、実験例３で得られたＧ−Ｃ８Ｆ／イ
ンタ一ロイキン６融合遺伝子断片を混合、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて連結した後、Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＭＣ１０
６１株を形質転換した。得られたアンピシリン耐性を示
す形質転換株を培養、アルカリ抽出法によりプラスミド
ＤＮＡを調製した。Ｇ−Ｃ８Ｆ／インタ一ロイキン６融
合遺伝子がベクターに正しい向きで挿入されたクローン
を選ぶため、調製したプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄｕと
ＸｂａＩの二重消化あるいはＰｓｔＩで消化し、低融点
アガロースゲル電気泳動により解析を行なった。このよ
うな方法により、Ｇ−Ｃ８Ｆ／インタ一ロイキン６融合
遺伝子を正しい方向に挿入した動物細胞発現ベクターｐ
ｓＲαＧ−６Ａを選び出した。

実験例５実施例４で作製したｐＳＲαＧ−６ＡをサルＣ０８−１
細胞に導入し、一過性の発現を調べた。

１０％牛脂児血清（Ｆ　ＣＳ）を含むダルベツコ変法イ
ーグル培地（Ｄ、ＭＥＭ）に懸濁させたＣ０８−１細胞
（ＣＲＬ−１６５０）を、３．５×１０５個１５ｍ１ず
つ６穴プレート（コーニング社製、２５８１０−６）に
シーディングし、３７℃、５％ＣＯ２存在下、−晩培養
を行なった。このＣ０８−１細胞の培地を抜き取り、１
０％二ニー・セーラム（コラボレイティブ社製）２μｇ
プラスミドＤＮＡ、１００μＭクロロギン、ＤＥＡＥ−
デキストラン４００μｇ／ｍｌの溶液１ｍｌを加え、３
７℃、５％ＣＯ２条件下で４時間トランスフェクション
した後、液を抜き取り、１０％ジメチルスフレホキシト
を含むＰＢ８１ｍｌを加え、２分間静置した。細胞をり
、ＭＥＭで２回洗った後、１０％ＦＣ８を含むり、ＭＥ
Ｍを加え、２日間培養し、培地を交換した後、さらに３
日間培養して得られた上清をＧ−Ｃ８Ｆ／インタ一ロイ
キン６融合タンパク質標品とし、活性を測定した。

実施例６バイオアッセイ法によるインターロイキン６活性の検出
：１０％ＦＣ８，５Ｘ１０’Ｍ　　２−メルカプトエタノ
ールを含むＲＰＭ１１６４０培地に、数段階希釈した実
施例５で得られた試料溶液を加え５０μαとし、９６穴
プレート（細胞培養用）に入れる。各ウェルに２×１０
３個１５０μＵの７ＴＤ１細胞（インターロイキン６依
存性細胞株、Ｖａｎ　Ｄａｍｍｅら、　（１９８７）　
Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｎｅｄ、　１６５．９１４−９１９）
を加え、３７℃、５％ＣＯ２存在下で３日間培養する。

５　ｍｇ／　ｍ１Ｍ　Ｔ　Ｔ　１０μ０を各ウェルに加
え５時間培養後、１５０μｆｆの０．０４Ｎ塩酸−イツ
ブロバノールを加えて細胞を溶解後、５７０ｎｍの吸収
を測定した。標準インターロイキン６としては天然型イ
ンターロイキン６を用いた。この結果、培養上清中に約
３．７μｇ／ｍｌのインターロイキン６活性を認めた。

［発明の効果］本発明により得られたＣ３Ｆ／インタ一ロイキン６融合
ポリペプチドは、各々の持つ生理作用およびスペクトル
の改良されたものが期待される。

その結果、癌治療時や骨髄移植時の好中球およびもしく
は血小板減少の回復が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はＧ−Ｃ８Ｆとインターロイキン６の遺伝子構造
を示すものであり、（ａ）は各々のエクソン構成を示し
、（ｂ）は融合ポリペプチドの一例のエクソン構成を示
す。第２図は本発明の融合ポリペプチドを暗号化する遺伝子
の作製方法の一例を示し、第３図は実施例３の融合遺伝
子の作製方法を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒトコロニー刺激因子のポリペプチドとヒトイン
ターロイキン６のポリペプチドからなる融合ポリペプチ
ド。
（２）ヒトコロニー刺激因子が顆粒球コロニー刺激因子
である請求項（１）記載の融合ポリペプチド。
（３）請求項（１）もしくは（２）記載の融合ポリペプ
チドを暗号化する遺伝子。
（４）ヒトコロニー刺激因子を暗号化する遺伝子とヒト
インターロイキン６を暗号化する遺伝子をエクソン部分
ごとに連結してなる請求項（３）記載の遺伝子。
（５）請求項（３）もしくは（４）記載の遺伝子を有す
る発現ベクターにより真核細胞を形質転換させ、該形質
転換体を培養させて得られる融合ポリペプチド。