JP2583770B2

JP2583770B2 - 遺伝子

Info

Publication number: JP2583770B2
Application number: JP62222696A
Authority: JP
Inventors: 真行高橋; 徹平戸; 哲中井; 英満洪; 尚美河野; 嘉勝平井
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1986-09-17
Filing date: 1987-09-04
Publication date: 1997-02-19
Anticipated expiration: 2012-02-19
Also published as: EP0261592B1; DK486587D0; ES2054638T3; EP0261592A1; KR880004089A; DK486587A; EP0547026A1; JPH01104176A; DE3750113D1; KR910000460B1; DE3750113T2

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、医薬として有用なヒトのコロニー刺激因子
（Colony-Stimulating Factor、CSF）をコードする新規
な遺伝子及び該遺伝子を含む組換えベクターに関する。

従来の技術一般に、造血細胞の増殖、分化には特定の増殖及び分
化因子が必要とされており、最終的に成熟した各種の血
球、例えば赤血球、顆粒球、マクロファージ、好酸球、
血小板、リンパ球等になるまでの間には、数多くの分
化、増殖因子が関与している〔三浦恭定著、血液幹細
胞、中外医学社、1983年〕。之等の中で顆粒球系前駆細
胞及びマクロファージ系前駆細胞の増殖、分化を刺激す
るものとしてCSFが知られており、かかるCSFには、顆粒
球の形成に特異性を有するＧ型（G-CSF）、マクロファ
ージの形成に特異的なＭ型（M-CSF）及び顆粒球とマク
ロファージの両方の形成を促進するGM型（GM-CSF）が知
られている。また更に多能性幹細胞に作用するCSFとし
て、マルチCSF（Multi-CSF:IL-3）も知られている。

上記CSFは、その生物活性に基づき、癌化学療法及び
放射線療法時の共通した欠点である白血球の減少を軽減
させるものと考えられ、この観点から臨床研究が行なわ
れている。

また、上記CSFは、白血球の機能を促進させる作用を
有することが知られており〔ロペッツら（Lopez,A.F.et
al.）,J.Immunol.,131,2983（1983）、ハンダムら（Ha
ndam,E.et al.），同122,1134（1979）及びバダスら（V
adas,M.A.et al.），同130,795（1983）〕、このことか
ら、種々の感染症の予防及び治療薬としての有効性が確
認されている。

更に、CSFの分化誘導作用〔メットカーフら（Metcal
f,D.et al.,Int.J.Cancer,30,773（1982）〕に基づき、
該CSFは骨髄性白血病の治療剤として有効性が認められ
ている。

しかして、CSFは例えば胎児細胞、脾細胞等の培養
液、人尿、種々の株化培養細胞の培養液等にその活性が
認められ、該活性画分として分離、利用されているが、
いずれの起源のものも該起源に由来する類似した多量の
夾雑物質等の混在及びCSF自体の濃度の低さが障害とな
り、その製造面で問題を残しており、均質性、収量、操
作等の面から、医薬品としてのCSFを産業的に継続して
得る手段は、未だ見出されていない。

本発明者らは、先にCSFを常時均質な状態で多量産生
することのできる、ヒト白血病Ｔ細胞由来の培養株化細
胞である「AGR-ON」を確立し、該細胞に係わる発明を特
許出願した（特開昭59-169489号公報）。また、本発明
者らは、上記AGR-ONの産生するCSFにつき、更にその精
製を重ねた結果、該CSFを純粋な形で簡単にしかも高収
率で収得する方法を開発し、またかくして得られるCSF
の構造的特徴及び生化学的特徴を解明し、かかる物質と
してのCSFに係わる発明を完成し、特許出願した（特願
昭61-12850号）。

上記先の発明に係わるCSFは、M-CSF、即ち、正常骨髄
細胞に作用してマクロファージの分化増殖を促進させる
活性を有する糖蛋白質であって、下記の理化学的性質を
有する点において特徴付けられるもので、「AGR-ON・CS
F」と呼ばれた。

ａ）分子量：非還元条件下でSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に
より、33000〜43000ダルトンであり、非還元条件且つSDS存在下でのゲル過で、23000〜4000
0ダルトンである、ｂ）蛋白質部分のＮ端アミノ酸配列：次の一次構造式で表わされる配列を有する。

Val-Ser-Glu-Tyr-Cys-Ser-His-Met-Ile-Gly-Ser-Gly-Hi
s-Leu-Gln-Ser-Leu-Gln-Arg-Leu-Ile-Asp-Ser-Gln-Met-
Glu-Thr 発明が解決しようとする問題点本発明の目的は、上記ヒトM-CSFを、遺伝子工学的手
法によって、より容易に且つ大量に製造、供給するため
の技術、殊に該技術に有用な遺伝子を提供することにあ
る。

本発明者らは、引続く研究において、上記AGR-ON・CS
Fの由来細胞であるAGR-ONからメッセンジャーRNA（mRN
A）を抽出そ、該mRNAからその相補DNA（cDNA）を調製
し、上記AGR-ON・CSFのアミノ酸配列情報に基づいて所
望のM-CSFをコードするcDNAを選択し、該cDNAを含むベ
クターを創製し、該ベクターを宿主細胞に導入して形質
転換体を製造し、これを培養して目的の生物活性を有す
るM-CSFの生成を確認するに至り、ここに本発明を完成
した。

問題点を解決するための手段即ち本発明は、下記式（１）のアミノ酸配列の34位Gl
uから37位GluのいずれかをＮ端アミノ酸とし、同185位T
hrをＣ端アミノ酸とする部分アミノ酸配列をコードする
核酸配列を有することを特徴とするヒトM-CSFの遺伝
子、及び該遺伝子を含む組換えベクターに係わる。

〔式中、ＸはTyr又はAspを示す。〕本明細書において、ペプチド及びアミノ酸の表示は、
IUPACにより採択されているアミノ酸命名法における略
号乃至当該分野で慣用されているそれに従うものとし、
DNA塩基配列及び核酸の表示も同様とする。

本発明の遺伝子は、その利用により、遺伝子工学的手
法によって、ヒトM-CSFを容易且つ大量に製造すること
ができ、かくして得られるM-CSFは、前記したごとく、
その生物活性に基づいて、例えば白血球減少を伴う疾病
もしくは病態の予防及び治療薬として、骨髄移植の補助
剤として、各種感染症の予防及び治療薬として、更に抗
癌剤等として、殊に医薬分野で有用である。

以下、本発明遺伝子につき詳述する。

本発明遺伝子は、例えばM-CSF産生能を有するヒト細
胞、より具体的且つ有利には前記AGR-ONより分離された
mRNAから調製される。以下、この調製の詳細をAGR-ONを
用いて説明するが、他の細胞でも同様である。起源細胞
として利用されるAGR-ONは、特開昭59-169489号公報に
記載された特性を有するヒト白血病Ｔ細胞由来のヒト培
養株化細胞であり、これはアメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクション（ATCC）に「ATCC受託No.CRL-819
9」として受託されている。

上記AGR-ONからのmRNAの分離は、基本的には通常の抽
出操作に従い実施される。より詳しくは、上記AGR-ON
を、まず例えばCEM培地、CMRL-1066培地、DM-160培地、
イーグルの最小必須培地（Eagle′s MEM）、フイッシャ
ーの培地（Fisher′s Medium）、F-10培地、F-12培地、
L-15培地、NCTC-109培地、RPMI-1640培地等又は必要に
応じて牛胎児血清（FCS）等の血清やアルブミン等の血
清成分を添加した上記培地で、約１×10⁴〜１×10⁷個/m
lの濃度範囲で、通常の培養法例えば炭酸ガス培養法等
に従い、約30〜40℃程度、好ましくは約37℃前後で１〜
５日間を要して培養する。次いで培養上清中にAGR-ON・
CSFが生産蓄積される時期に、上記培養細胞を、適当な
界面活性剤、例えばSDS、NP-40、トリトンX100、デオキ
シコール酸等を用いて、或いはホモゲナイザーを用いる
方法や凍結融解等の物理的方法によって、部分的又は完
全に破壊、可溶化した後、染色体DNAを、ポリトロン等
のミキサーもしくは注射筒を用い、ある程度せん断し、
その後、蛋白質と核酸分画とを分別して全RNAの抽出を
行なう。この操作には、特にフエノール・クロロホルム
抽出もしくは超遠心を用いるCsCl重層法〔チルグウィン
ら（Chirgwin,J.M.,et al.），バイオケミストリー（Bi
ochemistry），18,5294（1979）〕等が一般に用いられ
る。

また上記各方法においては、RNaseによるRNAの分解を
防ぐために、RNaseインヒビター、例えばヘパリン、ポ
リビニル硫酸、ジエチルピロカーボネート、バナジウム
複合体、ベントナイト、マカロイド等を添加使用するこ
ともできる。

上記抽出操作に従い得られるRNAからのmRNAの分離、
精製は、例えばオリゴdT−セルロース［コラボレィティ
ブリサーチ社（Collaborative Research Inc.］、ポ
リＵ−セフアロース［フアルマシア（Pharmacia）社］
セフアロース2B［フアルマシア社］等を用いて吸着カラ
ム法又はバツチ法により実施できる。

かくして得られるmRNAからの、目的のM-CSFに対するm
RNAの精製濃縮及び同定は、例えば得られたmRNAを蔗糖
密度勾配遠心等によつて分画し、その分画につき、蛋白
質の翻訳系、例えばアフリカツメガエルの卵母細胞への
注入やウサギ網状赤血球ライゼート又は小麦胚芽等の無
細胞系で蛋白質に翻訳させ、その蛋白質のM-CSF活性を
調べることにより実施でき、かくして目的とするmRNAの
存在を確認できる。更に目的とするmRNAの確認は、上記
M-CSFの活性測定に代えて、M-CSFに対する抗体を用いる
免疫法によつても行ない得る。

上記により得られる精製mRNAは、通常不安定であるた
め、これを安定なcDNAに変換し、目的遺伝子の増幅を可
能とするために微生物由来のレプリコンに接続する。イ
ンビトロでの、上記mRNAのcDNAへの変換、即ち本発明の
目的遺伝子の合成は、一般に次のようにして行なうこと
ができる。

即ち、まずオリゴdTをプライマーとし（このプライマ
ーは遊離のオリゴdTもしくは既にベクタープライマーに
付加されたオリゴdTのいずれでもよい）、mRNAを鋳型と
してdNTP（dATP、dGTP、dCTP又はdTTP）の存在下で、逆
転写酵素を用いてmRNAからこれに相補的な一本鎖cDNAを
合成する。次のステツプは、上記において遊離のオリゴ
dTを用いたか、ベクタープライマーに付加されたオリゴ
dTを用いたかにより、各々以下の如く異なる。

前者の場合、鋳型としたmRNAをアルカリ処理等により
分解して除去し、その後一本鎖DNAを鋳型として逆転写
酵素又はDNAポリメラーゼを用いて二本鎖DNAを作成す
る。次に得られる二本鎖DNAの両端をエキソヌクレアー
ゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカーDNA又はア
ニーリング可能な組合せの塩基を複数付加し、これを適
当なベクター、例えばEK系プラスミドベクターやλgt系
ファージベクター等に組込む。

また、後者の場合、鋳型としたmRNAを残存させたま
ま、上記と同様のリンカーを付与した開環状プラスミド
と、リンカーDNA（しばしば動物細胞で自立複製できる
領域とmRNAの転写プロモーター領域を含むDNA断片が用
いられる）とを、アニーリングさせて閉環状とした後、
dTNP存在下で、RNaseとDNAポリメラーゼとを共存させ
て、mRNAをDNA鎖に置換し、完全なプラスミドDNAを作成
できる。

上記のごとくして得られるDNAは、これをベクターの
宿主、例えばエシェリヒアコリ（Esherichia col
i）、バチルスズブチリス（Bacillus subtilis）、サ
ッカロミセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisi
ae）等の適当な宿主内に導入して、これを形質転換する
ことができる。このDNAの宿主への導入及びこれによる
形質転換の方法としては、一般に用いられている方法、
例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、CaCl₂処
理して自然にDNAを取り込みやすい状態にして、プラス
ミドを取り込ませる方法等を採用できる。上記方法にお
いては、通常知られているように形質転換の効率を一層
向上させるためにMgCl₂やRbClを更に共存させることも
できる。また、宿主細胞をスフェロプラスト又はプロト
プラスト化してから形質転換させる方法も採用すること
ができる。

上記により得られる形質転換株から、目的のM-CSFのc
DNAを有する株を選出する方法としては、例えば以下に
示す各種方法を採用できる。

（１）合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリ
ーニング法目的蛋白質のアミノ酸配列の全部又は一部が解明され
ている（該配列は、複数個連続した特異的配列であれ
ば、目的蛋白のどの領域のものでもよい）場合、該アミ
ノ酸に対応するオリゴヌクレオチドを合成し（この場
合、コドン使用頻度を用いて導いた塩基配列又は考えら
れる塩基配列の組合せの複数個のどちらでもよく、また
後者の場合、イノシンを含ませてその種類を減らすこと
もできる）、これをプローブ（³²P又は³⁵Sでラベルす
る）として、形質転換株のDNAを変性固定したニトロセ
ルロースフィルターとハイブリダイゼーションし、得ら
れたポジティブ株を検索して、これを選出する。

（２）動物細胞でM-CSFを産生させてスクリーニングす
る方法形質転換株を培養し、遺伝子を増幅させ、その遺伝子
を動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製
可能でmRNA転写プロモーター領域を含むプラスミドもし
くは動物細胞染色体にインテグレートするようなプラス
ミドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされた蛋白質
を産生させ、その培養上清もしくは細胞抽出物のM-CSF
活性を測定するか、又はM-CSFに対する抗体を用いてM-C
SFを検出することにより、元の形質転換株より目的のM-
CSFをコードするcDNAを有する株を選出する。

（３）M-CSFに対する抗体を用いて選出する方法予め、cDNAを形質転換株内で蛋白質を発現し得るベク
ターに組込み、形質転換株内で蛋白質を産生させ、M-CS
Fに対する抗体及び該抗体に対する第二抗体を用いて、M
-CSF産生株を検出し、目的株を得る。

（４）セレクティブ・ハイブリダィゼーション・トラン
スレーションの系を用いる方法形質転換株から得られるcDNAを、ニトロセルロースフ
ィルター等にブロットし、M-CSF産生細胞からのmRNAの
ハイブリダイゼーションさせた後、cDNAに対応するmRNA
を回収する。回収されたmRNAを蛋白翻訳系、例えばアフ
リカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ網状赤血
球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質に翻訳さ
せ、その蛋白質のM-CSF活性を調べるか、又はM-CSFに対
する抗体を用いて検出して、目的の株を得る。

得られた目的の形質転換株よりM-CSFをコードするDNA
を採取する方法は、公知の方法に従い実施できる。例え
ば細胞よりプラスミドDNAに相当する画分を分離し、該
プラスミドDNAよりcDNA領域を切り出すことにより行な
い得る。

かくして得られるDNAは、本発明遺伝子の一具体例で
あり、第３図に示される372のアミノ酸配列又は第５図
に示される554のアミノ酸配列、で特定されるヒトM-CSF
前駆体をコードしている。

しかして、本発明遺伝子を利用して遺伝子工学的手法
により得られる物質が、ヒトM-CSFの生物活性を発現す
るためには、該遺伝子は必ずしも上記DNA、即ちヒトM-C
SF前駆体のアミノ酸配列のすべてをコードするDNA配列
を有するものである必要はなく、例えばその部分配列で
あって、それがヒトM-CSFの生物活性発現を可能とする
限り、それらのDNAもまた本発明遺伝子に包含される。

ヒトM-CSFの生物活性発現に、必ずしも前記式（１）
に示す全アミノ酸配列を必要としない事実は、例えば上
記前駆体の一方が、その372番目のアミノ酸（Pro）をＣ
末端アミノ酸としていること、又は前記AGR-ON・CSF
が、その35番目のアミノ酸（Val）を、Ｎ末端アミノ酸
としていること、AGR-ON・CSF製造の際に副産物（マイ
ナー成分）として、同33番目のアミノ酸（Glu）又は同3
7番目のアミノ酸（Glu）をそれぞれＮ末端アミノ酸とす
る生物活性のM-CSFが得られること等からも明白であ
る。更に他のヘモポエチン間の一次構造上の類似性の知
見から、同27番目のアミノ酸（Ala）をＮ末端アミノ酸
とするM-CSFも天然に存在すると考えられる〔J.W.Schra
der,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,Vol.83,pp.2458-
2462（1986）〕。

また、後述する実施例に示す通り、前記式（１）に示
すアミノ酸配列における178番目のアミノ酸（Cys）以降
のＣ末端側のアミノ酸配列は、ヒトM-CSFの生物活性発
現には必ずしも必要でないことも確認されている。

従って、本発明遺伝子は、式（１）に示されるアミノ
酸配列情報に基づいた、生物活性のヒトM-CSF分子をコ
ードする新規なDNA配列を有することにより特徴づけら
れる。これには、より具体的には、式（１）に示す全ア
ミノ酸配列をコードするDNAのほか、そのＮ末端側アミ
ノ酸配列の一部、例えばアミノ酸番号１〜26、１〜32、
１〜34及び１〜36の配列のいずれか、及び／又はそのＣ
末端側アミノ酸配列の一部、例えばアミノ酸番号178以
降の配列の全て又は一部、を欠失する各々のアミノ酸配
列をコードする各DNA及び之等と実質的に均等なDNAが包
含される。

かかる本発明遺伝子は、上記情報に基づいて、例えば
ホスファイトトリエステル法〔Nature,310,105（198
4）〕等の常法に従い、核酸の化学合成により製造する
こともでき、また第３図に示される372の、又は第５図
に示される554の、アミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするDNAを原料として、通常の方法に従い製造
することもでき、特に後者の方法は簡便であり好適であ
る。

この372又は554のアミノ酸配列からなるポリペプチド
をコードするDNAを原料とする方法において、一部DNAの
化学合成やDNA鎖の切断、削除、付加乃至は結合を目的
とする酵素処理やDNAの単離、精製乃至複製、選別等の
各種操作乃至手段は、いずれも常法に従うことができ、
本発明遺伝子以外の遺伝子もしくはDNA鎖について当該
分野でよく知られている各種方法をいずれも採用するこ
とができる。例えば上記DNAの単離精製は、アガロース
ゲル電気泳動法等に従うことができ、核酸配列のコドン
の一部の改変は、サイト−スペシフィックミュータジ
ェネシス（Site-Specific Mutagenesis）〔Proc.Natl.A
cad.Sci.,81,5662-5666（1984）〕等に従うことができ
る。尚、上記において所望のアミノ酸に対応する遺伝暗
号の選択は、特に限定されるものではなく、利用する宿
主細胞のコドン使用頻度等を考慮して常法に従い決定で
きる。

また、上記方法に従い得られる本発明遺伝子のDNA配
列の決定及び確認は、例えばマキサム−ギルバートの化
学修飾法〔Maxam-Gilbert,Meth.Enzym.,65,499-560（19
80）〕やM13ファージを用いるジデオキシヌクレオチド
鎖終結法〔Messing,J.and Vieira,J.,Gene,19,269-276
（1982）〕等により行うことができる。

かくして得られる本発明遺伝子の利用によれば、遺伝
子組換え技術により、ヒトM-CSFを容易に且つ大量に製
造、収得することができる。

このヒトM-CSFの製造方法は、上記特定の本発明遺伝
子（DNA）を利用することを除いて、従来公知の一般的
な遺伝子組換え技術に従うことができる〔Science,224,
1431（1984）;Biochem.Biophys.Res.Comm.,130,692（19
85）;Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,80,5990（1983）;EP特
許公開第187991号公報、Molecular Cloning,by T.Mania
tis et al.,Cold Spring Harbor Laboratory（1982）等
参照〕。

より詳細には、本発明遺伝子が宿主細胞中で発現でき
るような組換えDNAを作成し、これを宿主細胞に導入し
て形質転換し、該形質転換株を培養すればよい。

ここで宿主細胞としては、真核生物及び原核生物のい
ずれをも用いることができる。該真核生物の細胞には、
脊椎動物、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞として
は、例えばサルの細胞であるCOS細胞〔Y.Gluzman,Cell,
23,175-182（1981）〕やチヤイニーズ・ハムスター卵巣
細胞のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔G.Urlaub and
L.A.Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,77,4216-4220
（1980）〕等がよく用いられているが、之等に限定され
る訳ではない。脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、
通常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモー
ター、RNAのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び
転写終了配列等を保有するものを使用でき、これは更に
必要により複製起点を保有していてもよい。該発現ベク
ターの例としては、SV40の初期プロモーターを保有する
pSV2dhfr〔S.Sabramani,R.Mulligan and P.Berg,Mol.Ce
ll.Biol.,１,854-764〕等を例示できるが、これに限定
されない。

また真核微生物としては酵母が一般によく用いられて
おり、その中でもサッカロミセス属酵母が有利に利用で
きる。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、
例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーター
を持つpAM82〔A.Miyanohara et al,Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,80,1-5（1983）〕等を好ましく利用できる。

原核生物の宿主としては、大腸菌や枯草菌が一般によ
く用いられている。本発明では例えば該宿主菌中で複製
可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本
発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモ
ーター及びSD（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配
列、更に蛋白合成開始に必要なATGを付与した発現プラ
スミドが使用できる。上記宿主菌としての大腸菌として
は、エシエリヒア・コリ（Escherichia coli）K12株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にpBR322がよく
用いられるが、これに限定されず、公知の各種の菌株及
びベクターがいずれも利用できる。プロモーターとして
は、例えばトリプトフアン・プロモーター、P_Lプロモー
ター、lacプロモーター、lppプロモーター等を使用する
ことができ、いずれの場合にも本発明遺伝子を発現させ
ることができる。

宿主細胞として、COS細胞を用いる場合を例にあげる
と、発現ベクターとしては、SV40複製起点を保有し、CO
S細胞において自律増殖が可能であり、更に転写プロモ
ーター、転写終結シグナル及びRNAスプライス部位等を
備えたものを用いることができ、例えば後記実施例に示
すプラスミドpcDEを用いる場合、SV40初期遺伝子プロモ
ーター下流に位置する制限酵素EcoRI部位に、本発明遺
伝子を連結することにより、目的とする発現プラスミド
を得ることができる。

かくして得られる所望の組換えDNAの宿主細胞への導
入及びこれによる形質転換の方法としては、一般に用い
られている方法が採用でき、例えば上記プラスミドpcDE
に目的遺伝子が挿入された発現プラスミドは、DEAE−デ
キストラン法やリン酸カルシウム−DNA共沈澱法等によ
り、COS細胞に取込ませることができ、かくして所望の
形質転換細胞を容易に得ることができる。

かくして得られる所望の形質転換体は、常法に従い培
養することができ、該培養により生物活性のヒトM-CSF
が生産、蓄積される。該培養に用いられる培地として
は、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、例えば上記COS細胞であれば、RPMI-1640
培地、ダルベッコの修正イーグル最小必須培地（Dulbec
co′s modified Eagle′s MEM）等の培地に必要に応じ
牛胎児血清（FCS）等の血清成分を添加したものを使用
できる。

上記により、形質転換体の細胞内又は細胞外に生産さ
れるM-CSFは、該M-CSFの物理的性質、化学的性質等を利
用した各種の分離操作（「生化学データーブックII」、
1175〜1259頁、第１版第１刷、1980年６月23日、株式会
社東京化学同人発行参照）により、それらより分離、精
製することができる。該方法としては、具体的には例え
ば通常の蛋白沈澱剤による処理、限外過、分子ふるい
クロマトグラフィー（ゲル過）、吸着クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPL
C）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、之等の
組合せ等を例示できる。

特に好ましい分離方法においては、まず培養上清より
予め目的とする物質を部分精製する。この部分精製は、
例えば硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナト
リウム等の塩析剤を用いる処理及び／又は透析膜、平板
膜、中空繊維膜等を用いる限外過処理等により行なわ
れる。之等の各処理の操作及び条件は、通常のこの種方
法のそれらと同様のものとすればよい。

次いで上記で得られた粗精製物を、吸着クロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィー、ゲル過、
イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィ
ー等に付すことにより、又は之等各操作の組合せによ
り、目的物質の活性が認められる画分を収得し、かくし
て目的物質を均質な物質として単離することができる。

上記吸着クロマトグラフィーは、例えばフエニル−セ
ファロース、オクチル−セファロース等を担体として実
施できる。

アフィニティクロマトグラフィーは、場合により例え
ばConA−セファロース、レンチルレクチン−セファロー
ス（フアルマシア社製）等の担体を利用したクロマトグ
ラフィーにより実施することもできる。

ゲル過は、例えばデキストランゲル、ポリアクリル
アミドゲル、アガロースゲル、ポリアクリルアミド−ア
ガロースゲル、セルロースを素材としたゲル等を用いて
実施できる。上記ゲル過剤の具体例としては、セフア
デックスＧタイプ、セフアロースタイプ、セフアクリル
タイプ（以上、フアルマシア社製）、セルロファイン
（チッソ社製）、バイオゲルＰタイプ、同Ａタイプ（バ
イオラド社製）、ウルトロゲルAcA（LKB社製）、TSKゲ
ルSWタイプ（東洋曹達社製）等の市販品を例示できる。

イオン交換クロマトグラフィーは、例えばジエチルア
ミノエチル（DEAE）等を交換基とする陰イオン交換体を
利用したクロマトグラフィーにより実施できる。

逆相クロマトグラフィーは、例えばC₁、C₃、C₄等のア
ルキル基、シアノプロピル基、フエニル基等の官能基が
シリカゲル等の基体に結合された担体を用いて実施でき
る。より具体的には例えばC₄ハイポアー逆相HPLCカラム
（RP-304、バイオラド社製）を用いて、移動相としてア
セトニトリル、トリフルオロ酢酸（TFA）、水等及び之
等の混合溶媒を用いて実施できる。

上記方法により、容易に高収率、高純度で所望のM-CS
Fを工業的規模で製造できる。

上記で得られるM-CSFは、これを医薬として用いるに
当り、その有効量を、薬理的に許容される通常の無毒性
担体と共に含有する薬理組成物の形態に調製され該形態
に応じた各種投与経路で投与される。その製剤形態とし
ては、液状形態例えば溶液、懸濁液、乳濁液等が通常採
用され、之等は一般に経口、静脈内、皮下、皮内、筋肉
内投与されるが、特に之等の形態及び投与経路に限定さ
れず、上記M-CSFは、他の通常採用される経口、非経口
投与等に適した各種の製剤形態に調製することもでき、
また使用前に適当な担体の添加により液状となし得る乾
燥品とすることもできる。各種形態の製剤の投与量は、
所望の薬理効果、疾病の種類、患者の年齢、性別、疾患
の程度等に応じて適宜決定され、特に限定はないが、通
常有効成分とするM-CSFを蛋白量として約0.001〜1mg/kg
/日となる量で１日に１回乃至数回に分けて投与すれば
よい。

実施例以下、本発明遺伝子の製造及びその利用によるM-CSF
の製造、その特徴等を、実施例として挙げて、更に詳述
する。

尚、各例で得られる試料のCSF活性は以下の方法によ
り測定されるものとする。

〈CSFの活性測定法〉牛胎児血清（FCS）20ml、α−培地30ml及び２倍濃度
α−培地20mlを混和して得られる溶液を37℃にて保温
し、その23.3mlを予め50℃に保温した１％寒天（ディフ
コ社製）溶液10mlと混合して37℃に保温する。

一方BALB/C系マウス大腿骨より採取した骨髄細胞（BM
C）を、ハンクス液で２回洗浄後、α−培地にて細胞濃
度が10⁷個/mlとなるように調製し、その1mlを上記37℃
に保温してある寒天培地に加え、よく混和した後、37℃
に保温し、次いでその0.5mlを、予め50μｌの供試試料
を入れたウェル（ティッシュカルチャークラスター12、
コスター社製）に加えて手早く混和して室温に放置す
る。各ウェルの寒天が固化するのを待って炭酸ガスイン
キュベーターに移し、更に37℃で７日間培養する。

かくして生じたコロニー数を実体顕微鏡を用いて計測
し、CSF活性の指標とする。尚上記で生じるコロニー
は、形態学的及び酵素化学的観察の結果、いずれもマク
ロファージコロニーであつた。

実施例１本発明遺伝子の製造 AGR-ON細胞の培養ヒトＴ細胞培養株化細胞AGR-ON（ATCC受託No.CRL-819
9）を、10％新生子牛血清（NCS）、20mM Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸
（HEPES）、100μg/mlストレプトマイシン、100単位/ml
ペニシリンＧ、50μg/mlゲンタマイシン、５×10^-5M 2
−メルカプトエタノール及び1mMグルタミンを含むRPMI-
1640培地［フローラボラトリー社製］にて、約10⁵細胞/
mlの細胞濃度に調製した。その１を、200ml容ティッ
シューカルチャーフラスコ［コーニング社製］５本に
て、37℃で72時間培養した。

mRNAの抽出上記で得たAGR-ON細胞約５×10⁸細胞を、4M−グア
ニジンチオシアネート溶液［4M−グアニジンイソチオシ
アネート、50mMトリス・HCl（pH7.6）、10mM EDTA、２
％ザルコシル（Sarkosyl）、140mM 2−メルカプトエタ
ノール］50mlに溶解後、60℃に加温しながら、G18G注射
針をつけた50ml注射筒を用いてDNAをせん断した。

この溶液に60℃に加温した等量のフェノール、1/2容
量の100mM酢酸ナトリウム（pH5.2）‐10mMトリス・HCl
（pH7.4）‐1mM EDTA溶液及び等量のクロロホルム−イ
ソアミルアルコール（24:1）混合液を加え、60℃の水溶
中で10分間振盪した後、４℃にて3000rpmで15分間遠心
分離した。水層を取り、フェノール−クロロホルム抽出
を２回、更にクロロホルム抽出を２回行なった後、２容
の冷エタノールを加えて、−20℃で60分間保持した。４
℃にて3000rpmで20分間遠心し、沈澱したRNAペレット
を、100mMトリス・HCl（pH7.4）‐50mM NaCl-10mM EDTA
-0.2％SDS溶液50mlに溶解後、プロティナーゼＫ［prote
inaseK、メルク社製］を200μg/mlの濃度で加え、37℃
にて60分間反応させた。60℃にて、フェノール−クロロ
ホルム抽出を２回、更にクロロホルム抽出を２回行なっ
た後、1/10容の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び２容の
冷エタノールを加えて、−70℃にて60分間放置した。４
℃にて3000rpmで20分間遠心し、沈澱したRNAペレットを
冷70％エタノールで洗浄後、TE溶液［10mMトリス・HCl
（pH7.5）及び1mM EDTA］に溶解させた。

かくしてAGR-ON細胞５×10⁸細胞から全RNA約5mgを得
た。

次いで、上記で得られた全RNAからmRNAを取得するた
めに、オリゴ（dT）−セルロース［コラボレイティブリ
サーチ社製］を用いて、カラムクロマトグラフィーを行
なった。mRNAの吸着は、10mMトリス・HCl（pH7.5）‐1m
M EDTA-0.5M NaCl溶液を用いて行ない、カラムを同溶液
及び10mMトリス・HCl（pH7.5）‐1mM EDTA-0.1M NaCl溶
液にて洗浄後、10mMトリス・HCl（pH7.5）‐1mM EDTAを
用いてRNAを溶出させた。

上記により、mRNA約110μｇを得た。

cDNAライブラリーの作製上記で得たmRNA5μｇから、cDNAを、cDNA合成シス
テム［アマシャム社製］を利用して合成した。

得られたcDNA約0.6μｇを、減圧乾燥した後、50mMト
リス・HCl（pH7.5）‐10mM EDTA-50mM DTT-40μM S−ア
デノシル−Ｌ−メチオニン溶液20μｌに溶解し、EcoRI
メチラーゼ［ニューイングランドバイオラブ社製］16単
位を加え、37℃にて15分間反応させた。

この反応液を70℃で10分間加熱し、反応を停止させた
後、フェノール−クロロホルム抽出を行ない、抽出液に
1/10容の3M酢酸ナトリウム（pH5.2）及び2.5容のエタノ
ールを加え、−70℃にて15分間放置した。４℃にて1500
0rpmで15分間遠心し、沈澱させたDNAペレットを、50mM
トリス・HCl（pH7.5）‐10mM MgCl₂‐10mM DTT-1mM ATP
-100μg/ml EcoRIリンカー［宝酒造社製、５′−GGAATT
CC−３′］溶液10μｌに溶解後、これにT4DNAリガーゼ
［宝酒造社製］350単位を加え、14℃にて16時間反応さ
せた。

得られた反応液を70℃で10分間加熱して反応を停止さ
せた後、100mM NaCl-50mMトリス・HCl（pH7.5）‐7mM M
gCl₂‐10mM DTT溶液16μｌと、制限酵素EcoRI［宝酒造
社製］40単位とを加え、37℃にて３時間消化させた。

反応液に0.5M EDTA（pH8.0）0.8μｌを加え、反応を
停止させた後、バイオゲルA50m［バイオ−ラド社製］カ
ラムクロマトグラフィーにて、余剰のEcoRIリンカーを
除去した。cDNA画分に、制限酵素EcoRIで消化後、アル
カリフォスファターゼにて、５′−リン酸基を除去した
λgt11DNA［プロトクローンGT（Protoclone GT）、プロ
メガバイオテク社製］１μｇ、1/10容積の3M酢酸ナトリ
ウム（pH5.2）及び2.5容積のエタノールを加え、−70℃
にて30分間放置した。４℃にて15000rpmで15分間遠心
し、沈澱させたDNAペレットを70％エタノールで洗浄
後、減圧乾燥し、水７μｌに溶解させた。

次に、500mMトリス・HCl（pH7.5）‐100mM MgCl₂溶液
２μｌを加え、42℃にて15分間保温した後、室温に戻
し、100mM DTT1μｌ、10mM ATP 1μｌ及びT4DNAリガー
ゼ175単位を加え、14℃で16時間保温した。

次に、この反応液10μｌにλファージパッケージング
エクストラクト［Packagene system、プロメガバイオテ
ク社製］を加え、22℃にて２時間保温することにより、
インビトロでリコンビナントファージDNAのパッケージ
ングを行なった。この溶液にファージ希釈緩衝液［100m
M NaCl-10mMトリス・HCl（pH7.9）‐10mM MgSO₄・7H
₂O］0.5ml及びクロロホルム25μｌを加え４℃で保存し
た。

cDNAライブラリーのスクリーニング −1.合成プローブの作製 AGR-ON培養上清から抽出単離されたAGR-ON・CSFのア
ミノ酸配列（Ｎ末端より27残基）の情報に基づいて、合
成プローブとして、下記塩基配列を用いた。

上記式に示した塩基配列に対する相補的な塩基配列
（最下段に示す）を、M-CSFをコードするcDNAを有する
リコンビナントファージの選出のためのプローブとして
利用するため、以下の方法により合成した。

即ち、N,N−ジアルキルメチルホスホロアミダイド誘
導体を、縮合ユニツトとして用いた固相ホスフアイトト
リエステル法〔ネーチヤー（Nature），310,105（198
4）〕にて、自動合成機［380A DNAシンセサイザー，ア
プライドバイオシステムズ社製］を用いて、目的とする
完全保護DNAを合成した。続いて該完全保護DNAを28％ア
ンモニア水で55℃で10時間処理することにより５′末端
のOH基に結合している保護基としてのDMTr（ジメトキシ
トリチル）基以外の保護基（Ａ、Ｇ、Ｃのアミノ基のア
シル基をさす）を脱保護させ、部分保護DNA（DMTr体と
よぶ）を得た。次いでこのDMTr体をODS（山村化学研究
所社製）を担体とする逆相高速液体クロマトグラフィー
（HPLC）により精製後、80％酢酸を用いて室温で20分間
処理して、粗オリゴヌクレオチドを得た。これをODSを
担体とする逆相HPLCにより更に精製して、目的とするオ
リゴヌクレオチドを得た。

上記で得たDNA0.8μｇを、100μｌの反応液［50mMト
リス・HCl（pH7.6）、10mM MgCl₂、10mM 2−メルカプト
エタノール、200μCi〔γ−³²P〕‐ATP）中で、T4ポリ
ヌクレオチドキナーゼ［宝酒造］18単位と、37℃にて１
時間反応させ、DNAの５′末端を³²Pで標識した。標識さ
れたDNAと未反応の〔γ−³²P〕ATPを分別するために、
バイオゲルP-30［バイオ−ラド社製］によるゲル過を
行なつた。標識DNA画分をプールし−20℃で保存した。

得られたプローブの比放射活性は、10⁸cpm/μgDNA以
上であつた。

−2.プラークハイブリダイゼーションエシェリヒア・コリY1090株を、50μg/mlアンピシリ
ン及び0.2％マルトースを含むLB培地［バクトトリプト
ン10g、バクトイースト抽出物5g及びNaCl5g/l］40mlに
植菌し、300mlフラスコにて37℃で一夜振盪培養した。
４℃にて3000rpmで15分間遠心して菌体を回収し、菌体
のペレットを20mlのSM培地［100mM NaCl-50mMトリス・H
Cl（pH7.5）‐10mM MgSO₄・7H₂O‐0.01％ゼラチン］に
懸濁させ、４℃で保存した。

次に、上記菌液0.3mlに、前記で得られたリコンビ
ナントファージ粒子液をSM培地にて3.5×10⁵pfu（プラ
ークフォーミングユニット）/mlに希釈したもの0.1mlを
加え、37℃にて15分間保温した。続いて、予め47℃に保
温しておいたLB軟寒天培地［バクトトリプトン10g、バ
クトイースト抽出物5g、NaCl5g、アガロース7g/l］7.5m
lを加えて混和した後、直径15cmのシャーレに作ったLB
寒天プレート［バクトトリプトン10g、バクトイースト
抽出物5g、NaCl5g、バクト寒天15g/l］に重層し、42℃
にて一夜培養した。尚、同様の操作を合計20枚のシャー
レで実施した。

プラークの出現した寒天プレート上に、直径132mmの
ナイロンフィルター［BNRG132、ポール社製］を載せる
ことによって、レプリカフィルターを作製した。寒天プ
レートはこれをマスタープレートとして４℃に保存し
た。

フィルターを、0.5M NaOH-1.5M NaCl、0.5Mトリス・H
Cl（pH7.5）‐1.5M NaCl及び0.3M NaCl-0.02M NaH₂PO₄
（pH7.4）‐0.002M EDTA（pH7.4）にて順次処理し、風
乾後、真空下に80℃で１時間ベーキングを行なった。

ベーキング済みのフィルターを、0.75M NaCl-0.075M
クエン酸ナトリウム−1mg/mlフィコール−1mg/mlポリビ
ニルピロリドン−1mg/mlBSA-10mMリン酸ナトリウム（pH
6.5）‐0.2％SDS-0.1mg/mlサーモンスパーム（Salmon S
perm）DNA溶液50ml中で軽く振盪しながら、42℃にて６
時間保温した。次にフィルターを10⁶cpm/mlの濃度にプ
ローブを加えた同液に移し、42℃にて20時間軽く振盪し
ながら、ハイブリダイゼーシヨンを行なつた。

ハイブリダイゼーシヨンの終わつたフィルターを取り
出し、0.9M NaCl-0.09Mクエン酸ナトリウムにて室温で
３回洗浄し、その後、56℃で同溶液にて５分間洗浄し
た。

フィルターを風乾後、増感紙を用いてＸ線フイルム
［XR5、コダック社製］に、−70℃にて２日間オートラ
ジオグラフィーを行なつた。

フイルムを現像後、シグナル領域に符号するプラーク
をマスタープレートよりかき取り、上記の方法を繰返し
てポジティブシグナルを有するプラークの純化を行な
い、最終的に、代表的なポジティブクローンλcM5及び
λcM11を単離した。

クローンの構造解析 λcM5のcDNAの制限酵素地図を作製した。

その結果を第１図に示す。

第１図より、cDNAは全長約2.5キロベース（kb）であ
り、その中にはBstEII［ニューイングランドバイオラブ
社］、NcoI［宝酒造社］、SmaI［宝酒造社］、KpnI［宝
酒造社］、EcoRI［宝酒造社］及びNdeI［ニューイング
ランドバイオラブ社］により切断される個所がそれぞれ
１個所、またScaI［宝酒造社］、StuI［宝酒造社］及び
BamHI［宝酒造社］により切断される個所がそれぞれ２
個所ずつ存在することが確認された。

次に、上記cDNAの塩基配列をマキサム−ギルバートの
化学修飾法及びM13フアージを用いるジデオキシヌクレ
オチド鎖終結法にて決定した。

その結果を、第２図（第２図−１〜第２図−４）に示
す。

第２図より、合成プローブと相補的な領域が、５′末
端より227番目〜247番目に存在（図に下線を付して示
す）した。

また、λcM5のcDNA中の最長のリーデイングフレーム
（reading frame）を検索したところ、これは５′末端
より125番目から1240番目の領域にあり、そのコドンの
フレームによる227番目〜307番目の塩基配列に対応する
アミノ酸配列は、AGR-ON・CSFのＮ末端27アミノ酸と完
全に同一であつた。このことは、λcM5のcDNAがM-CSF前
駆体蛋白質をコードするcDNAであることを示している。

以上の結果より、決定されたλcM5のコードするM-CSF
前駆体蛋白質の蛋白一次構造を第３図（第３図−１〜第
３図−２）に示す。

また上記と同様にして決定されたλcM11cDNAの塩基配
列を第４図（第４図−１〜第４図−４）に、そのコード
するM-CSF前駆体蛋白質の蛋白一次構造を第５図（第５
図−１〜第５図−３）にそれぞれ示す。

実施例２ COS細胞における組換えM-CSF（r-MCSF）の製造この例に利用したCOS-1細胞とは、増殖開始点（Ori）
欠損のSV40DNAで、サルの腎細胞CV1をトランスフォーム
させることによって、SV40初期遺伝子を発現し、Ｔ抗原
陽性となった細胞である〔セル（Cell），23,175-182
（1981）参照〕。

COS細胞発現ベクターpcDEの作製まず、プラスミドpcDV1〔オカヤマら（H,Okayama,P.B
erg,Mol.Cell.Biol.,３,280-289（1983）〕を、制限酵
素KpnIで切断し、次いで５′末端及び３′末端の突出部
分をT4DNAポリメラーゼ［BRL社］で削り平滑末端とし
た。

一方、EcoRIリンカー（５′−GGAATTCC−３′）［宝
酒造社］の５′末端を、T4ポリヌクレオチドキナーゼに
よりリン酸化し、これを先の平滑末端としたDNA断片
に、T4DNAリガーゼを用いて連結した。連結物を制限酵
素EcoRIで切断し、更に制限酵素Hind IIIで切断し、得
られた反応物をアガロースゲル電気泳動に付して、2590
ベースペアー（bp）のEcoRI-Hind IIIDNA断片を単離精
製した。

また他方、プラスミドpL1〔オカヤマら（H.Okayama,
P.Berg,Mol.Cell.Biol.,３,280-289（1983）〕を、制限
酵素PstI［宝酒造社］で切断後、５′末端及び３′末端
をT4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端とし、このDNA断
片に、上記と同様にしてEcoRIリンカーを連結させ、得
られるDNA断片を制限酵素Hind IIIにて切断し、反応物
をアガロースゲル電気泳動に付して、580bpのEcoRI-Hin
d IIIDNA断片を単離精製した。

得られたDNA断片と先に調製したEcoRI-Hind IIIDNA断
片とを、T4DNAリガーゼを用いて連結させて、所望のプ
ラスミドpcDEを得た。

以上の概略を第６図に示す。

M-CSF発現プラスミドpcDM・CSFの作製 λcM5DNAを、制限酵素EcoRIで部分消化させ、得られ
る反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、cDNA部分
（約2.5kb）をEcoRI部分消化断片として単離精製した。

上記で得られたCOS細胞発現ベクターpcDEを制限酵
素EcoRIで切断し、これを上記で調製したcDNA断片にT4D
NAリガーゼを用いて連結させて、所望のプラスミドpcDM
・CSFを得た。

かくして得られたプラスミドを、エシェリヒア・コリ
HB101株にトランスフォームさせて、目的のトランスフ
ォーマントを、アルカリ溶菌法〔マニアティスら（T.Ma
niatis et al.Molecular Cloning,pp90,Cold Spring Ha
rvor Laboratory（1982）〕によって、得られるプラス
ミドDNAの制限酵素分析により選択した。

以上の概略を第７図に示す。

r-MCSFの製造上記で得たpcDM・CSFを、COS-1細胞に、DEAE−デキ
ストラン法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,Vol.81,p 1070
（1984）〕にてトランスフェクトし、該細胞におけるr-
MCSFの生産を以下の通り試験した。

即ち、まずCOS-1細胞を、10％牛胎児血清（FCS）を含
むRPMI-1640培地で、約2.5×10⁵細胞/mlの細胞濃度に調
製し、これをティッシュカルチャークラスター６［コー
スター社製］に、１ウェル当り2mlとなる量で入れて、3
7℃で一夜、炭酸ガスインキュベーターにて培養した。

次いで培地を除去し、RPMI-1640にて細胞を２回洗浄
後、上記で調製したpcDM・CSF10μｇを含むRPMI-1640
培地1ml［50mMトリス・HCl（pH7.4）及び400μg/ml DEA
E・デキストラン（ファルマシァ社製）を含む］を加
え、炭酸ガスインキュベーター内に４時間放置した。更
に培地を除去した後、RPMI-1640にて細胞を２回洗浄
し、これに150μＭクロロキン［シグマ社製］を含むRPM
I-1640培地3mlを加え、３時間培養した。次に培地を除
去し、細胞をRPMI-1640にて洗浄後、10％FCSを含むRPMI
-1640培地にて、37℃で72時間、炭酸ガスインキュベー
ター内で培養した。

かくして得られた細胞培養物より培養上清及びその抽
出物を回収して、之等につき、それぞれの希釈倍率での
CSF活性を測定した。

得られた結果を下記第１表に示す。尚、第１表には、
コントロールとしてpcDM・CSFに代えて、pcDEを用いて
上記と同一操作を行なった結果を併記する。また各活性
測定試験は、同一試料につき各２回行なった。

尚、第１表における数値は、プレート当りのコロニー
数（平均値）を示す。以降のCSF活性を示す表において
も同様とする。

M-CSF発現プラスミドpcDM・CSF-185の作製上記で得たプラスミドpcDM・CSFを利用して、サイ
ト−スペシフィックミュータジェネシス（Site-Speci
fic Mutagenesis）〔Proc.Nat.Acad.Sci.,81,5662-5666
（1984）〕の方法に従って、第３図におけるアミノ酸番
号186のアミノ酸（Lys）をコードするコドン（AAG）
を、終止コドン（TAG）に置換して、第３図におけるア
ミノ酸番号185のアミノ酸（Thr）をＣ末端アミノ酸とす
る所望のM-CSF発現プラスミドpcDM・CSF-185を得た。

その詳細は次の通りである。

即ち、まずプラスミドpcDM・CSFよりEcoRI-EcoRIDNA
断片（大きさ1.8kb）を切り出し、これをM13mp11ファー
ジ（RF）のEcoRIとEcoRIの制限酵素サイトにクローニン
グし、これから一本鎖（ss）DNA（M13-CSF）を得、これ
をミュータジェネシスの鋳型とした。

一方、合成オリゴヌクレオチド［５′‐GTGGTGACCTAG
CCTGATT-3′（プライマー）］を、T4ポリヌクレオチド
キナーゼでリン酸化した後、上記ssDNA（M13-CSF）とハ
イブリダイズし、アニーリング後、dNTPsの存在下に、D
NAポリメラーゼＩ（クレノー断片）及びT4DNAリガーゼ
で各々処理して、15℃で18時間インキュベートした。

得られたDNAをJM105コンピテント細胞にトランスフォ
ームし、生じたコロニーの内50コロニーを、寒天プレー
ト上に植菌し、37℃で18時間培養した。生育したコロニ
ーを含むフィルターを通常の方法によりアルカリ変性
し、乾燥後、80℃で２時間ベーキング処理した。このフ
ィルターをプレハイブリダイズした後、このものと、上
記プライマーの５′末端を³²P‐r-ATPでラベルした³²P
−プローベとを、室温でハイブリダイズさせた。ハイブ
リダイズさせたフィルターを、６×ssc（saline sodium
citrate）で、室温で10分間、次いで56℃で４分間各々
洗浄し、乾燥させた後、−70℃で18時間オートラジオグ
ラフィーを行なった。

変異したクローンの内から、M13-CSF-185を選び、こ
れをJM105に感染させて培養して、ssDNA及びRF DNAを調
製した。

上記で得られたssDNAのM13ジデオキシヌクレオチド鎖
終結法により、目的とする遺伝子の変異を確認した。

また上記JM105で増殖させたRF DNAよりEcoRI-EcoRI断
片を調製し、これを上記と同様にして発現プラスミド
に組込んで、所望のプラスミドpcDM・CSF-185を得た。

このプラスミドを用いて、上記と同様にして、COS-
1細胞でr-MCSFを発現させた。その結果を下記第２表に
示す。

M-CSF発現プラスミドpcDM・CSF-177の作製プライマーとして５′‐GCTGAATGATCCAGCCAA-3′を用
いて、上記と同様にして、第３図におけるアミノ酸番
号178のアミノ酸（Cys）をコードするコドン（TGC）を
終止コドン（TGA）に置換して、第３図におけるアミノ
酸番号177のアミノ酸（Glu）をＣ末端アミノ酸とする所
望のM-CSF発現プラスミドpcDM・CSF-177を得た。

このプラスミドを用いて、上記と同様にして、COS-
1細胞でr-MCSFを発現させた結果を同様にして下記第３
表に示す。

上記第２表及び第３表に示す結果より、本発明遺伝子
を保有するプラスミドpcDM・CSF-185及び同pcDM・CSF-1
77の利用によれば、それぞれM-CSFの生物活性を示す所
望のr-MCSFを発現できることが判る。

このことから、少なくとも第３図に示すアミノ酸配列
におけるアミノ酸番号178以降のＣ端側のアミノ酸配列
は、目的とする生物活性を有するM-CSF分子の発現に
は、実質的に影響を及ぼさないことが明らかである。

上記において、λcM5cDNAの代わりにλcM11cDNA
を用いて、プラスミドpcDM・CSF11を得た。該プラスミ
ドを用いて、上記に従ってr-MCSFを製造し、略同様の
結果を得た。

即ち、λcM11DNAを、制限酵素EcoRIで部分消化させ、
得られる反応物をアガロースゲル電気泳動に付し、cDNA
部分（約2.5kb）をEcoRI部分消化断片として単離精製し
た。

前記で得られたCOS細胞発現ベクターpcDEを制限酵
素EcoRIで切断し、これを上記で調製したcDNA断片にT4D
NAリガーゼを用いて連結させて、所望のプラスミドpcDM
・CSF11を得た。

また、上記λcM11DNAのcDNA（EcoRI部分消化断片）
を、クローニングベクターpUC19DNA（宝酒造）のEcoRI
クローニング部位に挿入して、プラスミドpUCMCSF・11
を得た。該プラスミドをエシェリヒア・コリHB101株に
トランスフォームさせた形質転換体は、Escherichia co
li HB 101/pUCMCSF・11なる名称で、1987年７月16日に
工業技術院微生物工業研究所に微工研条寄第1409号（FE
RM BP-1409）として寄託されている。

プラスミドpcDM・CSF11を制限酵素EcoRI及びBstEII
で消化し、約670bpのEcoRI-BstEIIDNA断片を単離精製し
た。

このDNA断片のBstEII切断側に、５′末端をT4ポリヌ
クレオチドキナーゼにてリン酸化した合成DNAリンカ
ー；５′‐GTGACCTGATAAGGATCCG-3′ ３′‐GACTATTCCTAGGCTTAA-5′ を連結して得られたDNA断片と、前記したプラスミドpcD
EのEcoRI消化物とをT4DNAリガーゼにより連結して、所
望のプラスミドpcDM・CSF11-185を得た。該プラスミド
は、上記合成リンカー部位に翻訳終止コドンTGATAAをも
ち、従ってプラスミドpcDM・CSF11がコードする第５図
に示されるポリペプチドにおいて、その185番目のアミ
ノ酸（Thr）をＣ末端アミノ酸とするM-CSFをコードす
る。

以上の概略を第８図に示す。

該プラスミドを用いて、上記と同様にして発現させ
た結果を下記第４表に示す。

上記で得たプラスミドpcDM・CSF11-185を用い、
上記に従って第５図におけるアミノ酸番号178のアミ
ノ酸（Cys）をコードするコドン（TGC）を終止コドン
（TGA）に置換して、第５図における177番目のアミノ酸
（Glu）をＣ末端アミノ酸とする所望のM-CSF発現プラス
ミドpcDM・CSF11-177を得た。該プラスミドを用いて上
記と同様にして発現させた結果を下記第５表に示す。

プラスミドpcDM・CSF11-185DNAを、EcoRI及びBamHI
で消化してEcoRI-BamHI DNA断片（約680bp）を単離精製
し、これを分泌型発現ベクターpIN-III-OmpA3〔EMBO
J.,３,2437〜2442（1984）〕のEcoRI、BamHIクローニン
グサイトに挿入して、プラスミドpIN-III-OmpA3-MCSF11
-185を得た。

該プラスミドDNAをXbaI及びBamHIで消化してXbaI-Bam
HI DNA断片（約770bp）を単離精製し、これを一本鎖DNA
調製用のクローニングベクターpUC118DNA［宝酒造］のX
baI、BamHIクローニングサイトに挿入して、プラスミド
pUC118-OmpA3-MCSF11-185を得た。

該プラスミドを用い、前記サイトスペシフィック
ミュータジェネシスの方法に従い、OmpAシグナルペプチ
ドのＣ末端アミノ酸（Ala）をコードするコドン（GCC）
に、第５図に示すポリペプチドの35番目のアミノ酸（Va
l）をコードするコドン（GTG）が連結して位置するよう
に改変して、プラスミドpUC118-OmpA-MCSF11-NV151を得
た。

即ち、プラスミドpUC118-OmpA3-MCSF11-185 DNAにて
トランスフォームした大腸菌JM105に、ヘルパーファー
ジK07［宝酒造］を感染させ、37℃で14時間振盪培養
し、一本鎖（ss）pUC118-OmpA3-MCSF11-185DNAを得、こ
れをミュータジェネシスの鋳型として用い、またプライ
マーとして５′‐TACCGTAGCGCAGGCCGTGTCGGAGTACTGTAGC
-3′を用いて、上記と同様にして所望のプラスミドpU
C118-OmpA-MCSF11-NV151を得た。

該プラスミドDNAをXbaI及びBamHIで消化してXbaI-Bam
HI DNA断片（約540bp）を単離精製し、これを発現ベク
ターpIN-III（lpp^P‐５）‐A3のXbaI-BamHIサイトに挿
入して、第５図における35番目のアミノ酸（Val）から1
85番目のアミノ酸（Thr）までからなるポリペプチド発
現用の、所望の分泌型発現プラスミドpIN-III（lpp^P‐
５）‐OmpA-MCSF11-NV151を得た。

以上の概略を第９図−１、２及び３に示す。

また、上記分泌型発現プラスミドにコードされるアミ
ノ酸配列を第10図に示す。第10図中、下線を付した配列
はOmpAシグナルペプチドを、▼はプロセッシング部位を
それぞれ示す。

上記で得たpIN-III（lpp^P‐５）‐OmpA-MCSF11-N
V151を大腸菌HB101及びJM109にトランスフォームして分
泌生産を行ない、ペリプラズム画分としてCSF活性を示
す上清を回収した。

即ち、上記のM-CSF分泌型発現ベクターを保有する菌
株を2l容フラスコにて、50μg/mlアンピシリンを含有す
るLB培地500mlにて37℃で14時間振盪培養した後、遠心
（5000rpm、５分間、室温）して菌体をペレットとし
た。

この菌体ペレットを、50mMトリス・HCl（pH8.0）−25
％シュークロース溶液50mlに再浮遊させ、更に250mM ED
TA（pH8.0）を1.25ml加えた後、ゆっくりと振盪しなが
ら室温に30分間置いた。同様に遠心して得られた菌体ペ
レットを、氷冷した蒸留水25mlに再浮遊させ、ゆっくり
と振盪しながら、30分間氷冷し、４℃にて、10000rpm 5
分間遠心して、ペリプラズム画分として上清を回収し
た。

上記において、pcDM・CSF11-185の代りにpcDM-CS
F11-177を用いることにより、第５図における35番目の
アミノ酸（Val）から同177番目のアミノ酸（Glu）まで
からなるポリペプチド発現用の所望のM-CSF分泌型発現
プラスミド、pIN-III（lpp^P‐５）‐OmpA-MCSF11-NV143
を得た。

該プラスミドにコードされるアミノ酸配列を第11図に
示す。第11図中、下線を付した配列はOmpAシグナルペプ
チドを、▼はプロセッシング部位をそれぞれ示す。該プ
ラスミドを上記と同様にして大腸菌にトランスフォー
ムさせて、該大腸菌よりペリプラズム画分としてCSF活
性を示す上清を得た。

上記，、及びで得た各上清を、下記条件の
HPLCに付した。

カラム:TSKゲルG3000SW（60cm×7.5mm直径、東洋曹達工
業）溶離液:0.005％ポリエチレングリコール及び0.15M NaCl
含有PBS 流速:0.8ml/分フラクション容積:0.8ml/チューブ／分分子量マーカー（グルタミン酸脱水素酵素:29万、乳酸
脱水素酵素:14.2万、エノラーゼ:6.7万、アデニル酸キ
ナーゼ:3.2万、チトクロムC:1.24万）を基準として、各
サンプルにつき、以下の結果を得た。

サンプル：前記で得た培養上清の4mlをセントリコ
ン−10（アミコン社製）にて約150μに濃縮したもの。

分子量32〜70万（平均48万）に相当する範囲の溶出画分
に、CSF活性を認めた。

サンプル：前記で得た培養上清4mlを上記と同様に
処理したもの。

分子量6.6万から8.6万（平均7.6万）に相当する範囲の
溶出画分に、CSF活性を認めた。

分子量5.2万から8.6万（平均6.7万）に相当する範囲の
溶出画分に、CSF活性を認めた。

サンプル：前記で得たペリプラズム画分の上清2ml
を上記と同様にして約110μｌに濃縮したもの。

分子量３〜４万（平均3.5万）に相当する位置に、CSF活
性を認めた。

前記，又はで得た培養上清の10mlを、1mlのC
onA−セファロースを充填したカラムに供した後、PBS^-
（5ml）にて洗浄後、0.5Mメチル−α−Ｄ−マンノシド
含有PBS^-（10ml）にて溶出した。得られた溶出液の4ml
をセントリコン−10にて濃縮し、これを下記SDS-PAGE用
サンプルとした。

また、前記で得たペリプラズム画分の上清は、これ
をそのまま、同サンプルとした。

M-CSFの検出は、SDS-PAGE後のゲルをウエスタンブロ
ッティングに供し、常法に従って製造したM-CSFに対す
る家兎抗血清を使用することにより行なった。

即ち、SDS-PAGEはレムリの方法〔Laemmli,U.K.,Natur
e,277,680（1970）〕に従い、ミニスラブ（ゲル濃度15
％）を用い、またウエスタンブロッティングは、バイオ
ラッド社のトランスブロットセルを用いて行なった。ト
ランスファーされたニトロセルロース膜を１％牛血清ア
ルブミン含有PBS^-にてブロッキング後、M-CSFに対する
上記家兎抗血清と反応させ、更にパーオキシダーゼ標識
ヤギ抗ウサギ抗体（バイオラッド社製）を作用させた。
M-CSFバンドの検出は、かくして得られたニトロセルロ
ース膜と発色基質である４−クロロ−１−ナフトール液
を反応させることにより行なった。

結果を下記第６表に示す。

プラスミドpSV2-dhfr〔Mol.Cell.Biol.,１,854（19
81）〕を、制限酵素HindIIIとBamHIにより２つの断片に
切断して、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子を含む
断片を単離精製した。

次に、プラスミドpRSV-CAT〔Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A,79,6777（1981）〕を、同じくHindIIIとBamHIとで切
断してラウス肉腫ウイルス（RSV）のLTR（long termina
l repeat）部分を含む断片を単離精製した。

上記で精製された２種の断片を、T4DNAリガーゼを反
応させることにより連結させた。

この反応物を大腸菌HB101コンピテントセル（宝酒
造）にトランスフォームし、得られたアンピシリン耐性
を示すコロニーからプラスミドDNAを調製し、制限酵素
地図を作成して、目的のプラスミドpRSV-dhfrを得た。

該プラスミドはRSVのLTR部分、DHFR遺伝子、SV40由来
の介在配列とpolyA付加シグナル、更に大腸菌プラスミ
ドpBR322由来の複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子を
含有し、上記LTR部分に含有されるプロモーターのコン
トロール下にDHFRを発現するものである。

このプラスミドpRSV-dhfrをNdeIとBamHIとで２つの断
片に切断して、DHFR遺伝子を含む断片を単離精製した。
得られたDNA断片を、DNAポリメラーゼＩ（クレノウフ
ラグメント）で処理して両末端を平滑末端とした。

一方、前記で得たプラスミドpcDM・CSF11を、SalI
で切断後、この切断部位を同様にDNAポリメラーゼＩで
処理して平滑末端とした。

以上により得られた両断片を、T4DNAリガーゼを用い
て連結させ、この反応物を大腸菌JM109コンピテントセ
ルにトランスフォームした。得られたアンピシリン耐性
を示すコロニーからプラスミドDNAを調製し、制限酵素
地図を作成して、目的のM-CSFとDHFRの両遺伝子の発現
プラスミドpcDM・CSF11-dhfrを得た。

該プラスミドは、M-CSF発現に係わるSV40由来の初期
プロモーター部分、介在配列、M-CSF遺伝子、polyA付加
シグナル、DHFR発現に係わるRSVのLTR部分、DHFR遺伝
子、SV40由来の介在配列、polyA付加シグナルを含有
し、更に大腸菌プラスミドpBR322由来の複製開始点及び
アンピシリン耐性遺伝子を含有する。

以上の概略を第12図−１及び−２に示す。

上記で得たプラスミドpcDM・CSF11-dhfrを用いて、
前記に従って、r-MCSFを製造した。

その結果、培養上清のCSF活性は、プレート当たりの
コロニー数（平均値）として68（プラスミドpcDEを用い
た対照は０）であった。

75cm²培養フラスコ（コスター社製）で培養された
チャイニーズハムスター卵巣dhfr欠損細胞〔CHO-Dukdhf
r^-細胞:Proc.Natl.Acad.Sci.,USA.,77,4216（1980）〕
を、常法に従ってトリプシン（フローラボラトリー社
製）処理し、10％透析牛胎児血清（GIBCO社製）を含む
ダルベッコ改良最小必須培地（DMEM培地、GIBCO社製）
に懸濁させ、同培地にて細胞を洗浄した後、培地を除い
た。

この細胞を、DNA注入溶液（0.25Mマンニトール−0.1m
M CaCl₂・2H₂O‐0.1mM MgSO₄・7H₂O‐0.2mMトリスHCl、
pH7.2、和光純薬工業社製）に懸濁させた。

前記で得たM-CSF発現プラスミドpcDM・CSF11-dhfr
を、ClaIにより切断し、線状化した後、DNA注入溶液に
溶解させた。

上記の細胞懸濁液200μｌ（２×10⁶細胞）とDNA溶液2
00μｌ（30μgDNA）を混合し、融合チャンバーCH-2（島
津製作所社製）に入れ、電気融合装置SSH-1（島津製作
所社製）に接続して、4.2KV/cm²パルスを１秒間隔で２
回繰返し、電気的に、細胞内にDNAを導入した。

DNAを導入した細胞を10％透析牛胎児血清−１％非必
須アミノ酸溶液（フローラボラトリーズ社製）−２％HT
溶液（同上社製）−DMEM培地に懸濁させ、24穴プレート
（コスター社製）にて培地した。

48時間培養後、培地を選択培地（10％透析牛胎児血清
及び１％非必須アミノ酸溶液を含むDMEM培地）に交換
し、その後、３〜４日毎に培地を新鮮なものと交換し
た。

10〜14日間培養して得られた約200クローンの形質転
換細胞より50クローンを選んで、常法通りトリプシン処
理後、新しい24穴プレートに移した。

DHFR遺伝子の増幅は、高濃度のメトトレキセート（MT
X）に対する耐性を与え〔J.B.C.,253,1357（1978）〕、
同時に形質転換された近接の遺伝子はMTXにより増幅を
示す。

上記50クローンの形質転換細胞を、20nM MTXを含む選
択培地で培養し続け、増殖のみられた耐性クローンをト
リプシン処理後、50nM MTXを含む選択培地に懸濁させて
培養を行なった。同様に増殖のみられた耐性クローン
を、100nM MTXを含む選択培地で培養し続け、最終的に4
00nM MTXに耐性を示すクローンを得た。

これらの耐性クローンの培養上清のCSF活性を下記第
７表に示す。

上記で得たCHO細胞培養上清を、そのまま、SDS-PAGE
のサンプルとして、前記と同様にして、SDS-PAGEによ
る分子量の検討を行なった。

その結果、非還元条件下で９万、還元条件下で4.4万
に相当する位置にM-CSFのバンドが検出された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、λcM5のcDNAの制限酵素地図を示す。第２図（第２図−１〜第２図−４）は、マキサム−ギル
バートの化学修飾法及びM13フアージを用いるジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法にて決定された上記cDNAの塩基
配列を示す。第３図（第３図−１〜第３図−２）は、上記cDNAにより
コードされているM-CSF前駆体蛋白質の蛋白一次構造を
示す。第４図（第４図−１〜第４図−４）は、λcM11のcDNAの
塩基配列を示す。第５図（第５図−１〜第５図−３）は、λcM11cDNAによ
りコードされているM-CSF前駆体蛋白質の蛋白一次構造
を示す。第６図は、COS細胞発現ベクターpcDEの作製の概略図を
示す。第７図は、M-CSF発現プラスミドpcDM・CSFの作製の概略
図を示す。第８図は、M-CSF発現プラスミドpcDM・CSF11-185の作製
の概略図を示す。第９図（第９図−１〜第９図−３）は、M-CSF発現プラ
スミドpIN-III（lpp^P‐５）‐OmpA-MCSF11-NV151の作製
の概略図を示す。第10図は、M-CSF発現プラスミドpIN-III（lpp^P‐５）‐
OmpA-MCSF11-NV151によりコードされるアミノ酸配列を
示す。第11図は、M-CSF発現プラスミドpIN-III（lpp^P‐５）‐
OmpA-MCSF11-NV143によりコードされるアミノ酸配列を
示す。第12図（第12図−１及び第12図−２）は、M-CSF発現プ
ラスミドpcDM・CSF11-dhfrの作製の概略図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者河野尚美徳島県徳島市佐古八番町８―17 八番町リバーハイツ404号 (72)発明者平井嘉勝徳島県板野郡北島町新喜来字江古川５― 49 (56)参考文献特開平１−501283（ＪＰ，Ａ) 特開平１−502397（ＪＰ，Ａ) 特開昭62−501607（ＪＰ，Ａ) 国際公開86／4607（ＷＯ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，230（1985）Ｐ，291 −296 Ｓｃｉｅｎｃｅ，235（1987，３．20) Ｐ，1504−1508

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下式（１）のアミノ酸配列の34位Gluから3
7位GluのいずれかをＮ端アミノ酸とし、同185位ThrをＣ
端アミノ酸とする部分アミノ酸配列をコードする核酸配
列を有することを特徴とするヒトM-CSFの遺伝子。〔式中、ＸはTyr又はAspを示す。〕
【請求項２】下式（１）のアミノ酸配列の34位Gluから3
7位GluのいずれかをＮ端アミノ酸とし、同185位ThrをＣ
端アミノ酸とする部分アミノ酸配列をコードする核酸配
列を有するヒトM-CSF遺伝子を含有する組換えベクタ
ー。〔式中、ＸはTyr又はAspを示す。〕