JP2747355B2 - ヒト血中単球増殖剤 - Google Patents
ヒト血中単球増殖剤Info
- Publication number
- JP2747355B2 JP2747355B2 JP2065639A JP6563990A JP2747355B2 JP 2747355 B2 JP2747355 B2 JP 2747355B2 JP 2065639 A JP2065639 A JP 2065639A JP 6563990 A JP6563990 A JP 6563990A JP 2747355 B2 JP2747355 B2 JP 2747355B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human
- csf
- monocytes
- human blood
- blood monocyte
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分解〕 本発明は、ヒト単球−マクロファージの増殖剤に関す
る。
る。
血液、組織に存在する抗感染、抗癌エフェクター細胞
である単球−マクロファージは骨髄に由来し、骨髄中の
単球−マクロファージ系幹細胞がコロニー刺激因子（CS
F）、特にマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−CSF）
の作用で、分化、増殖して単球−マクロファージになる
ことが知られている（Wong.et al;Science235 1504,（1
987））。
である単球−マクロファージは骨髄に由来し、骨髄中の
単球−マクロファージ系幹細胞がコロニー刺激因子（CS
F）、特にマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−CSF）
の作用で、分化、増殖して単球−マクロファージになる
ことが知られている（Wong.et al;Science235 1504,（1
987））。
単球−マクロファージは、種々の抗原物質やリンホカ
イン、免疫細胞等を受けて活性化マクロファージとな
り、癌細胞、細菌、原虫等を殺し、自然治癒力原動力に
なっていると考えられている（Higuchi.et al;Cell.Imm
unol.87,626（1984））。
イン、免疫細胞等を受けて活性化マクロファージとな
り、癌細胞、細菌、原虫等を殺し、自然治癒力原動力に
なっていると考えられている（Higuchi.et al;Cell.Imm
unol.87,626（1984））。
さらに、単球−マクロファージを生体外に於いて活性
化させ、再び患者に戻し、悪性腫瘍の治療に用いる事が
LAK療法（Rosenberg et.al;N.Engl.,J.Med.,313,1485
（1985））と関連して考えられているが、その絶対量
は、全白血球数中の約４％と低いため、ヒト単球−マク
ロファージのin vitroでの大量取得法の確立が望まれて
いた。
化させ、再び患者に戻し、悪性腫瘍の治療に用いる事が
LAK療法（Rosenberg et.al;N.Engl.,J.Med.,313,1485
（1985））と関連して考えられているが、その絶対量
は、全白血球数中の約４％と低いため、ヒト単球−マク
ロファージのin vitroでの大量取得法の確立が望まれて
いた。
従来、ヒト膵臓癌由来細胞株MIA・PaCaより得た1.6kb
のＭ−CSF遺伝子に基づいて作製された組換えＭ−CSFを
用いてヒト血中単球の増殖テストがなされた〔Gendelma
n他、J.Exp.Med.,167,1428（1988）〕が、その結果は、
10日間で単球が50％増加するのが限界であり、実用性に
乏しい問題があった。
のＭ−CSF遺伝子に基づいて作製された組換えＭ−CSFを
用いてヒト血中単球の増殖テストがなされた〔Gendelma
n他、J.Exp.Med.,167,1428（1988）〕が、その結果は、
10日間で単球が50％増加するのが限界であり、実用性に
乏しい問題があった。
本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、本発明者が先に
取得したヒト尿由来Ｍ−CSFとＭ−CSF遺伝子に基づいて
作製されたヒト組換え型Ｍ−CSFがin vitroに於いて著
明なヒト単球−マクロファージの増殖作用を示す事を見
い出し、本発明を完成した。
取得したヒト尿由来Ｍ−CSFとＭ−CSF遺伝子に基づいて
作製されたヒト組換え型Ｍ−CSFがin vitroに於いて著
明なヒト単球−マクロファージの増殖作用を示す事を見
い出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、ヒト尿由来マクロファージコロ
ニー刺激因子および、またはヒト組換え型マクロファー
ジコロニー刺激因子を有効成分として成るヒト血中単球
増殖剤。
ニー刺激因子および、またはヒト組換え型マクロファー
ジコロニー刺激因子を有効成分として成るヒト血中単球
増殖剤。
である。以下、さらに本発明について詳しく説明する。
本発明において、ヒトＭ−CSFは、細胞培養法、尿や
腹水などからの抽出法、および遺伝子組換え法によって
得ることができるが、好ましくは、特開昭64−34998号
公報記載のヒト尿より精製して取得したヒト尿由来Ｍ−
CSF及び、特願平１−192592の明細書に記載された方法
に従って約4kbのＭ−CSF遺伝子をCHO細胞等に例えばリ
ン酸カルシウム法（Okayama,H.et al.;Mol.Cell.Biol.
７ 2724（1987））やDEAE−デキストラン法（Arai,N.et
al.,実験医学５ 1019（1987））等を用いて導入し、無
血清条件下で産生させ、ヒト尿由来Ｍ−CSFと同様に精
製して取得したヒト組換え型Ｍ−CSFである。
腹水などからの抽出法、および遺伝子組換え法によって
得ることができるが、好ましくは、特開昭64−34998号
公報記載のヒト尿より精製して取得したヒト尿由来Ｍ−
CSF及び、特願平１−192592の明細書に記載された方法
に従って約4kbのＭ−CSF遺伝子をCHO細胞等に例えばリ
ン酸カルシウム法（Okayama,H.et al.;Mol.Cell.Biol.
７ 2724（1987））やDEAE−デキストラン法（Arai,N.et
al.,実験医学５ 1019（1987））等を用いて導入し、無
血清条件下で産生させ、ヒト尿由来Ｍ−CSFと同様に精
製して取得したヒト組換え型Ｍ−CSFである。
第１図に本遺伝子の全塩基配列を示す。また、この約
4kbの遺伝子を含むプラスミドpBS II CSFを保有するE,c
oli JM109株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている（微工研条寄第2526号〔FERM BP−252
6〕）。
4kbの遺伝子を含むプラスミドpBS II CSFを保有するE,c
oli JM109株は工業技術院微生物工業技術研究所に寄託
されている（微工研条寄第2526号〔FERM BP−252
6〕）。
尚、Ｍ−CSFを分離精製するには、例えば特開平１−1
35800記載の方法等により行うことができる。
35800記載の方法等により行うことができる。
具体的には酸処理、熱処理、限外濾過、塩析、イオン
クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の組合せに例示できる。
クロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラ
フィー等の組合せに例示できる。
より具体的には、まず培養上清を限外濾過方式で濃縮
し、それをリン酸等によりpH4.0〜5.0に調整、析出物を
除去する。次に陰イオン交換体、例えばDEAE−セルロー
スと接触させ、Ｍ−CSF活性が認められる画分を取得す
る。この活性画分を疎水性クロマトグラフィー、例えば
フェニルセファロースなどに接触させ、活性画分を取得
する。さらに分子ふるいクロマトグラフィー、例えばス
ーパーローズ12などを充填したカラムに通液して分画
し、脱塩、濃縮する。
し、それをリン酸等によりpH4.0〜5.0に調整、析出物を
除去する。次に陰イオン交換体、例えばDEAE−セルロー
スと接触させ、Ｍ−CSF活性が認められる画分を取得す
る。この活性画分を疎水性クロマトグラフィー、例えば
フェニルセファロースなどに接触させ、活性画分を取得
する。さらに分子ふるいクロマトグラフィー、例えばス
ーパーローズ12などを充填したカラムに通液して分画
し、脱塩、濃縮する。
上記の方法により高収率、高純度のＭ−CSFを取得で
きる。
きる。
本発明に用いるヒト単球は、パーコール法を用いた遠
心分離操作（Higuchi.et al;Microbiol.Immunol.31,469
（1978））すなわち、遠心によりパーコール溶液中に形
成された密度勾配に基づいて各血球がその密度に応じて
分離する方法により容易に取得することができる。
心分離操作（Higuchi.et al;Microbiol.Immunol.31,469
（1978））すなわち、遠心によりパーコール溶液中に形
成された密度勾配に基づいて各血球がその密度に応じて
分離する方法により容易に取得することができる。
ヒト単球の増殖条件としては、培地はいずれでも良い
が、好ましくは、RPMI1640培地を用い、ヒト又は牛胎児
血清（FCS）を５〜20％の範囲で添加し、ヒト単球濃度
を１×103〜１×105個/mlになるように調整し、これを
プラスチックシャーレに入れて培養する。培養条件は、
一般には、35〜37℃、飽和水蒸気下、３〜７％二酸化炭
素存在下に保つ。なお、ヒト単球培養の際、添加するＭ
−CSF濃度は好ましくは10ng/ml以上であり、過剰に添加
しても抑制現象は認めない。３〜５日おきにＭ−CSFが
添加されている新培地に交換し、約２〜４週間経過後、
増殖したヒト単球−マクロファージをラバーポリスマン
等を用いて剥離回収する。形態学的、また、細胞化学的
検討（エステレース染色）により増殖した細胞は100％
ヒト単球−マクロファージである事が確認された。
が、好ましくは、RPMI1640培地を用い、ヒト又は牛胎児
血清（FCS）を５〜20％の範囲で添加し、ヒト単球濃度
を１×103〜１×105個/mlになるように調整し、これを
プラスチックシャーレに入れて培養する。培養条件は、
一般には、35〜37℃、飽和水蒸気下、３〜７％二酸化炭
素存在下に保つ。なお、ヒト単球培養の際、添加するＭ
−CSF濃度は好ましくは10ng/ml以上であり、過剰に添加
しても抑制現象は認めない。３〜５日おきにＭ−CSFが
添加されている新培地に交換し、約２〜４週間経過後、
増殖したヒト単球−マクロファージをラバーポリスマン
等を用いて剥離回収する。形態学的、また、細胞化学的
検討（エステレース染色）により増殖した細胞は100％
ヒト単球−マクロファージである事が確認された。
以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する
が本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ 正常人末梢血液50mlからHiguchiらの方法（前述）を
用いて１×107個のヒト単球を取得した。10％FCS1ml含
有するPRMI1640培地を底面積2cm2の円型プラスチックウ
ェルに入れ、ヒト単球１×105個を添加した。次いで、
特開昭64−34998号公報記載のヒト尿より精製して取得
したヒト尿由来Ｍ−CSF20ng及び50ngを添加し、37℃、
飽和水蒸気下、５％CO2存在下にて17日間培養した。
尚、増殖した単球は、ラバーポリスマンを用いて剥離回
収し、血球計算盤にて計数した。結果を第１表に示す。
用いて１×107個のヒト単球を取得した。10％FCS1ml含
有するPRMI1640培地を底面積2cm2の円型プラスチックウ
ェルに入れ、ヒト単球１×105個を添加した。次いで、
特開昭64−34998号公報記載のヒト尿より精製して取得
したヒト尿由来Ｍ−CSF20ng及び50ngを添加し、37℃、
飽和水蒸気下、５％CO2存在下にて17日間培養した。
尚、増殖した単球は、ラバーポリスマンを用いて剥離回
収し、血球計算盤にて計数した。結果を第１表に示す。
単球数はそれぞれ4.5倍、6.9倍増加した。尚、コント
ロールとして用いたPBS（0.9％の塩化ナトリウムを含む
5mMリン酸緩衝液pH7.3）添加では、単球は剥離消失し、
計測不能であった。
ロールとして用いたPBS（0.9％の塩化ナトリウムを含む
5mMリン酸緩衝液pH7.3）添加では、単球は剥離消失し、
計測不能であった。
実施例２ 正常人末梢血液30mlからHiguchiらの方法（前述）を
用いて５×106個のヒト単球を取得した。10％FCS1ml含
有するPRMI1640培地を底面積2cm2の円型プラスチックウ
ェルに入れ、ヒト単球５×104個を添加した。次いで、
ヒト組換え型Ｍ−CSFを50ng添加した。このヒト組換え
型Ｍ−CSFは特願平１−192592号の明細書に記載された
方法に従って約4kbのＭ−CSF遺伝子をCHO細胞に導入
し、そのCHO細胞１×106個を10cmのシャーレ上に10％FC
Sを含むMEMα培地10mlと供にまき込み４日間、37℃、５
％CO2下で培養し、MEMα培地で細胞を２回洗浄後、ERDF
培地（FCS不含）10mlを入れ、さらに４日間培養して取
得したものである。その後、37℃飽和水蒸気下、５％CO
2存在下にて17日間培養した後、単球数を計数した。結
果を第２表に示す。
用いて５×106個のヒト単球を取得した。10％FCS1ml含
有するPRMI1640培地を底面積2cm2の円型プラスチックウ
ェルに入れ、ヒト単球５×104個を添加した。次いで、
ヒト組換え型Ｍ−CSFを50ng添加した。このヒト組換え
型Ｍ−CSFは特願平１−192592号の明細書に記載された
方法に従って約4kbのＭ−CSF遺伝子をCHO細胞に導入
し、そのCHO細胞１×106個を10cmのシャーレ上に10％FC
Sを含むMEMα培地10mlと供にまき込み４日間、37℃、５
％CO2下で培養し、MEMα培地で細胞を２回洗浄後、ERDF
培地（FCS不含）10mlを入れ、さらに４日間培養して取
得したものである。その後、37℃飽和水蒸気下、５％CO
2存在下にて17日間培養した後、単球数を計数した。結
果を第２表に示す。
単球数は約13倍増加した。尚、コントロールとして用
いたPBS添加では、実施例１と同様単球は剥離消失し、
計測不能であった。
いたPBS添加では、実施例１と同様単球は剥離消失し、
計測不能であった。
〔発明の効果〕 本発明に基づく特定のＭ−CSFを用いて、末梢血中の
ヒト単球−マクロファージを生体外で増殖せしめること
は、感染症の治療及び癌の免疫療法に際して、エファク
ター細胞であるヒト単球−マクロファージを臨床に応用
する道が開かれる。
ヒト単球−マクロファージを生体外で増殖せしめること
は、感染症の治療及び癌の免疫療法に際して、エファク
ター細胞であるヒト単球−マクロファージを臨床に応用
する道が開かれる。
第１図は、本発明実施例２のヒトＭ−CSF遺伝子（cDN
A）の全塩基配列およびコードするアミノ酸配列を示
す。尚、図中のポリペプチドおよび塩基配列の符号は以
下の略号である。 Ala:Alanine、Arg:Arginine Asn:Asparagine、Asp:Asparatic acid Cys:Cysteine、Glu:Glutamic acid Gln:Glutamine、Gly:Glycine His:Histidine、Ile:Isoleucine Leu:Leucine、Lys:Lysine Met:Methionine、Phe:Phenylalanine Pro:Proline、Ser:Serine Thr:Threonine、Trp:Tryptophane Tyr:Tyrosine、Val:Valine A:Adenine、C:Cytosine G:Guanine、T:Thymine
A）の全塩基配列およびコードするアミノ酸配列を示
す。尚、図中のポリペプチドおよび塩基配列の符号は以
下の略号である。 Ala:Alanine、Arg:Arginine Asn:Asparagine、Asp:Asparatic acid Cys:Cysteine、Glu:Glutamic acid Gln:Glutamine、Gly:Glycine His:Histidine、Ile:Isoleucine Leu:Leucine、Lys:Lysine Met:Methionine、Phe:Phenylalanine Pro:Proline、Ser:Serine Thr:Threonine、Trp:Tryptophane Tyr:Tyrosine、Val:Valine A:Adenine、C:Cytosine G:Guanine、T:Thymine
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭64−34998（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−104176（ＪＰ，Ａ) 基礎と臨床，Ｖｏｌ．22，Ｎｏ．９ （1988）Ｐ．2523−2529 Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ. 17，Ｎｏ．１（1989）Ｐ．68−71 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ. 222，Ｎｏ．２（1987）Ｐ．341−344
Claims (1)
- 【請求項１】ヒト尿由来マクロファージコロニー刺激因
子および、またはヒト組換え型マクロファージコロニー
刺激因子を有効成分として成るヒト血中単球増殖剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2065639A JP2747355B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | ヒト血中単球増殖剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2065639A JP2747355B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | ヒト血中単球増殖剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03266982A JPH03266982A (ja) | 1991-11-27 |
| JP2747355B2 true JP2747355B2 (ja) | 1998-05-06 |
Family
ID=13292796
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2065639A Expired - Lifetime JP2747355B2 (ja) | 1990-03-16 | 1990-03-16 | ヒト血中単球増殖剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2747355B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2583770B2 (ja) * | 1986-09-17 | 1997-02-19 | 大塚製薬株式会社 | 遺伝子 |
| JPH0694479B2 (ja) * | 1986-10-31 | 1994-11-24 | 電気化学工業株式会社 | ヒト尿由来ｃｓｆ及びその製法 |
-
1990
- 1990-03-16 JP JP2065639A patent/JP2747355B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１（１９８９）Ｐ．６８−７１ |
| ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．２２２，Ｎｏ．２（１９８７）Ｐ．３４１−３４４ |
| 基礎と臨床，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．９（１９８８）Ｐ．２５２３−２５２９ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03266982A (ja) | 1991-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2064558C (en) | Method for inhibiting growth of stem cells | |
| FI105045B (fi) | Menetelmä sytolyyttisten T-lymfosyyttien muodostamiseksi | |
| CA1296667C (en) | Process for preparing lymphokine activated killer cells | |
| JPH01502397A (ja) | Ｍ―ｃｓｆの生産方法 | |
| JPH10510147A (ja) | 二次性免疫不全症の治療用薬剤の製造方法 | |
| JP4445268B2 (ja) | γδＴ細胞を製造するための方法 | |
| CA2186423C (en) | Protein which induces interferon-gamma production by immunocompetent cell | |
| CA2274469C (en) | Serum-derived factor inducing cell differentiation and medical uses thereof | |
| JP3439490B2 (ja) | 蛋白質とその蛋白質をコードするｄｎａ並びにその蛋白質の製造方法 | |
| JP2747355B2 (ja) | ヒト血中単球増殖剤 | |
| WO1996016987A1 (fr) | Facteur thrombocytotique | |
| WO1992012177A1 (fr) | Nouvel amplificateur de megakaryocyte et sa production | |
| Wolf et al. | A soluble inhibitor of B and T cell proliferation and antibody synthesis produced by dividing human T cells | |
| JPH07102131B2 (ja) | ヒトリンパ球の癌細胞に対する傷害活性を高める方法 | |
| JPS63126897A (ja) | 免疫抑制因子 | |
| WO1991018925A1 (fr) | Nouveau facteur de stimulation de colonies megacaryocytaires et production de ce facteur | |
| JP2589094B2 (ja) | 抗悪性腫瘍剤 | |
| WO1993016106A1 (en) | Novel megakaryocyte amplifier and production thereof | |
| JPH02149527A (ja) | 抗血栓剤 | |
| KR950008569B1 (ko) | 신규 림포카인(lymphokine) 및 그 제조방법과 사용방법 | |
| JP2697725B2 (ja) | 悪性腫瘍治療用キット | |
| JPH03505732A (ja) | 移動刺激因子 | |
| WO1989010133A1 (en) | Stem cell inhibitors | |
| JPS6335600A (ja) | Ｔ細胞活性化因子 | |
| UA54379C2 (uk) | Інгібітор проліферації стовбурових клітин,фармацевтична композиція (варіанти) та спосіб їх використання (варіанти) |