UA54379C2

UA54379C2 - Інгібітор проліферації стовбурових клітин,фармацевтична композиція (варіанти) та спосіб їх використання (варіанти)

Info

Publication number: UA54379C2
Application number: UA97042028A
Authority: UA
Inventors: Владімір Козлов; Айрен Цирлова; Стівен Д. Уолп; Стивен Д. Уолп
Original assignee: Про-Нейрон, Інк.; ПРО-НЕЙРОН, Инк.
Priority date: 1994-09-30
Filing date: 1995-09-29
Publication date: 2003-03-17
Also published as: EP1362596A2; EP1897553A1; AU712204C; EP1362596A3; AU3725795A; AU712204B2

Abstract

Винахід стосується інгібіторів проліферації стовбурових клітин та способів їхнього застосування для регулювання аномального циклу стовбурових клітин та для прискорення відновлення клітин периферичної крові після хіміотерапії.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к использованию ингибиторов пролиферации стволовьїх клеток для 2 регулирования их митотической активности при лечений людей либо животньх от аутоиммунньх болезней, старения, рака, миєлодисплазии, предлейкоза, лейкоза, псориаза и других заболеваний, включающих состояние гиперпролиферации. Настоящее изобретение относится также к способу лечения людей либо животньїх, которьім назначеньі либо бьіли введень! химиотерапевтические препарать! или другие препарать,, повреждающие циклирующие стволовье клетки, либо лучевая терапия. И, наконец, настоящее изобретение 70 относятся к усовершенствованию способов сохранения или размножения стволовьх клеток для ауто- и, аллотрансплантации либо для переноса генов.

Большинство клеток на терминальной стадий дифференцировки в возобновляющихся системах являются короткоживущими и должнь! постоянно заменяться в течение всего срока жизни. Например, клетки крови берут начало в самообновляющейся популяции мультипотентньх гемопозтических стволовьх клеток. 79 Гемопозтическиє стволовье клетки являются субпопуляцией гемопозтических клеток. Гемопозтические клетки могут бьіть полученьї, например, из костного мозга, крови пупочного канатика либо периферической крови (как неактивированной, так и активированной с помощью такого фактора, как (-С5Е (гранул оцитарньй колониестимулирующий фактор)); Гемопозтические клетки включают популяцию стволовьїх клеток, клетки-предшественники, дифференцированньюе клетки, А-клетки, клетки стромь! и другие, способствующие созданию средь, необходимой для продуцирования зрельх клеток крови. Поскольку гемопозтическиє стволовьіе клетки необходимь! для развития всех зрельїх клеток гемопозтической и иммунной систем, их вьживание является необходимьїм условием полного функционального восстановления системь! защить! у людей, подвергающихся химиотерапии либо воздействию других препаратов (факторов).

Продуцирование гемопозтических клеток регулируется рядом факторов, стимулирующих их рост и с дифференциацию. Некоторье из зтих факторов, например, зритропозтин и О-С5Е в настоящее время Ге) используются в клинической практике. Одной частью сети управления, которая, однако, зкстенсивному исследованию не подвергалась, является механизм обратной связи, образующий отрицательную ветвь процесса регулирования (Ивз (Еамез) и др.; Віоса 78: 110-117, 1991). исследования, ранее проведеннье Лордом (І ога) и сотр., показали существование растворимого белкового о фактора в зкстрактах нормального костного мозга мьішей и свиней, обладавшего способностью обратимого ингибирования митотической активности гемопозтических стволовьїх клеток (НЗС) (Лорд и др., Вг. у). Нает. 34: 441-446, 1976). Зтот ингибирующий фактор (молекулярная масса 50 - 100килоДальтон) бьіл назван ингибитором о стволовьїх клеток (СІ). «І

Работа по вьіделению зтого фактора из первоисточников не бьла завершена вследствие трудностей, присущих постановке реакции іп мімо, требующей большого количества облученньх мьшей. Пьтаясь о преодолеть зти проблемьі, Прагнелл (Ргадпеїї) и сотр. разработали реакцию іп міго для гемопозтических стволовьіх клеток (СРО-А) и отобрали клеточнье линии, подходящие для получения ингибитора стволовьх клеток (см. Грехем (Сгтапат) и др., Майшге 344: 442-444, 1990). «

Ранее проведеннье исследования позволили идентифицировать макрофаги, как возможньй источник ЗСІ З (Лорд и др., Віоса СеїЇз 6: 581-593, 1980). С зтой целью бьіла отобрана линия клеток макрофагов мьішей .)774.2 с (Грехем и др., Майшге 344: 442-444, 1990). Для очистки Грехем и др. использовали кондиционированную среду з» зтой линии клеток; бьл вьіделен ингибирующий пептид, оказавшийся идентичньм ранее описанному цитокину-макрофагальному медиатору аллергического воспаления 1-о,(МІР-15). Таким образом, МІР-19, бьіл вьіделен из линии клеток, а не из первичного материала. В то время, как Грехем и др. установили, что антитела 79 кМІР-14 нейтрализовали активность неочищенного зкстракта костного мозга, другие исследователи показали, і-й что важную роль играют и другие ингибирующие факторьі. Например, Грехем и др. (У. Ехр. Мед. 178: 925-32,

ЧК» 1993) предположили, что основньім ингибитором гемопозтических стволовьїх клеток является не МІР-1о, а ТОЕД сю (фактор роста Т-клеток). Далее, Ивз и др. (РМАЗ 90: 12015-19, 1993) предположили, что как МІР-1у, таки ТОЕрД 5р присутствуют в нормальном костном мозге в субоптимальньїх количествах и что для ингибирования требуется - синергизм двух зтих факторов.

Ге Другие исследователи описали дополнительнье факторьі ингибирования стволовьїх клеток. Фриндел (Егіпдеї) и сотрудники из костного мозга плода КРОС и зкстрактов печени вьіделили тетрапептид, обладавший ингибирующей активностью по отношению к стволовьім клеткам (Ленфант (І епіапі) и др., РМАЗ 86: 779-782, 1989), Пуковиц (Рашйкоміїв) и др. (Сапсег Кез., 50: 328-332, 1990) идентифицировали пентапептид, которьй, в виде мономера, является ингибитором, а в виде димера - стимулятором циклирования стволовьїх клеток. (Ф) Сообщали также о ингибирующих свойствах других факторов в различньїх системах іп міїго (см. Райт (Му/гіднЮО и

ГІ Прагнелл, Вайегз СіїтісаІ! Наетайіоду, т. 5, стр. 723-39, 1992 (Вайіеге Тіпадаї, Рагів)).

В авторском свидетельстве СССР Мо1561261 А1 (Цьірлова (Твзугпома) и др.) раскрьт процесс очистки во ингибитора пролиферации стволовьїх клеток.

До настоящего времени ни один из зтих факторов не бьіл рекомендован для применения в клинической практике. Существует, однако, необходимость в зффективньх ингибиторах стволовьїх клеток. Основной опасностью, связанной с химиотерапией либо лучевой терапией, является уничтожение нормально пролиферирующих клеток, что может привести к угнетению костного мозга либо оказаться токсичньмМ для де / Жепудочно-кишечного тракта. Зффективньій ингибитор стволовьїх клеток обеспечил бьі защиту зтих клеток и позволил оптимизировать вьішеупомянутье лечебнье схемьі. Вероятнее всего, что, в такой же степени, как необходимь! различнье стимулирующие цитокинь! (т.е. такие цитокиньї, как ИЛ-1 (интерлейкин-1), ИЛ-2, ИЛ-3, иИлЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, 5-С5Е, ОМ-С5Е (гранулоцитарно-макрофагальньй колониестимулирующий фактор), зритропозтин, тромбопозтин, фактор роста стволовьїх клеток, лиганд ЯК2ЛІЇЗ и

Т.Д. которне стимулируют циклирование гемопозтических клеток) в зависимости от клинической ситуации, для удовлетворения различньїх клинических потребностей необходимь! будут и различньіе ингибирующие факторь!.

Гемоглобин является весьма упорядоченньім белком-тетрамером, молекулярная масса которого составляет около 64000 Дальтон. Он состоит из двух о- и двух р-цепей. Каждая цепь связьшваєт одну молекулу гема (ферропротопорфирин ІХ), железосодержащую простетическую группу, о- и Д-цепи позвоночньїх произошли, 70 вероятно, от одного предкового гена, которьій, в последующем, дуплицировался и дивергировал; две цепи сохраняют значительное сходство последовательности как между собой, так и у различньїх позвоночньх (см. фиг.16А). У людей кластер о-цепи на 16 хромосоме содержит два о-гена (05 и 025), которне кодируют идентичнье полипептидь, а также сгеньі, кодирующиє другиє о-подобнье цепи: 5, 9 и несколько нетранскрибированньїх псевдогенов (см. фиг.16В8 - кКДНК и аминокислотная последовательность о-цепи 75 человека). Кластер р-цепи на 11 хромосоме состоит из одного гена р-цепи и нескольких р-подобньх генов: 5, є, бС-у и А-у, а также из, как минимум, двух незкспрессированньїх псевдогенов (см. фиг.16С - кКДНК и аминокислотная последовательность р-цепи человека).

Зкспрессия зтих генов изменяется в процессе развития. В гемопоззе человека, которьй бьіл подвергнут зкстенсивному изучению, зритробластьі плода последовательно синтезируют тетрамерь двух --цепей и двух є-цепей (Гувер І), двух о-цепей и двух є-цепей (Гувер ІЇ) либо двух 5-цепей и двух у-цепей (НЬ Портланд). В ходе дальнейшего змбриогенеза преобладающая форма состоит из фетального гемоглобина (НЬРЕ), которьй включаєт две о-цепи и две у-цепи. Синтез зрелого гемоглобина (20- и 2р-цепи) начинаєтся в течение фетального периода развития; в момент рождения около 5095 гемоглобина представлено зрелой формой и сч р Переход завершается, приблизительно, к шестимесячному возрасту. Преобладающая часть гемоглобина у взросльїх (около 97906) представлена разновидностью с двумя о- и двумя р-цепями (НБА) с небольшими о поддающимися обнаружению количествами НЬЕ и 5-цепью (НБА»).

Гем зкстенсивно изучался в отношений его воздействия на гемопозз (см. обзорнье статьи: С. Сасса (5.

Зазза), Зетіпагз Нетаї, 25: 312-20, 1988 и Н. Абрахам (Аргапат) и др., ІпФ 9. СеїЇ Сіопіпд 9: 185-210, б зо 1991). Гем необходим для созревания зритробластов; іп міго гемин (хлорферропротопорфирин ІХ - т.е. гем с дополнительньмм йоном хлора) усиливаєт пролиферацию СРО-ЗЕММ (колониегобразующая единица - гранулоцитов-зритроцитов-макрофагов-мегакариоцитов - КОЕ-ГЗОММ), ВРО-Е (зритроидная бурстобразующая со единица - БОЕз) и СРО-Е (зритроидная колонигобразующая единица - КОЕ 3). Подобньм же образом гемин повьішает обьем клеточного содержимого в культурах клеток костного мозга. « 1. Химиотерапия и лучевая терапия рака ю

В результате продуктивньїх исследований стимуляторов роста в клиническую практику введен ряд зтих факторов (зритропозтин, З-С5Е, ОМ-С5Е и тод). Зти факторьі снизили заболеваемость и смертность, связанньсе с химио- и радиотерапией. Дальнейшую клиническую пользу для пациентов, подвергающихся химио- либо радиотерапии, могла бьі принести альтернативная стратегия блокирования вступления стволовьїх клеток в « 0 стадию митотической активности, что защитило бь их от токсических побочньїх действий. 2 с ІЇ. Трансплантация костного мозга

Трансплантация костного мозга (ВМТ) является зфофективньм способом лечения различньх з гематологических, аутоиммунньїх и злокачественньїх заболеваний; к числу современньїх терапевтических средств отнесеньі гемопозтические клетки, полученньюе из крови пупочного канатика либо из периферической

Крови (как неактивированной, так и активированной с помощью такого фактора, как 5-С5Е), а также из костного г мозга.

В настоящее время для размножения стволовьїх клеток крови до обьемов популяции, пригодной для ве пересадки, прибегают к манипулированию гемопозтическими клетками ех мімо. Для оптимизации зтой методики с необходимо: (1) достаточное количество стволовьїх клеток, способньїх поддерживать длительньй процесс Восстановления гемопозза; (2) истощение Т-лимфоцитов, вьізьівающих реакцию "трансплантат против хозяина"

Ш- и (3) отсутствие остаточньїх раковьїх клеток. Зта методика может бьіть оптимизирована посредством включения

Ге ингибитора(-ов) стволовьїх клеток для размножения ех мімо.

Зфофективность десенсибилизации гемопозтических клеток в результате удаления остаточньїх раковьх клеток с помощью цитотоксических препаратов ограничена вследствие токсичности зтих соединений для Нормальньх гемопозтических клеток и, особенно, для стволовьїх клеток. Необходима зффективная защита нормальньх клеток в процессе десенсибилизации; защита может бьть обеспечена посредством изьятия (Ф. стволовьїх клеток из процесса циклирования с помощью зффективного ингибитора. ка ІП. Сбор периферических стволовьїх клеток

Стволовьіе клетки периферической крови (РВЗС) обладают рядом потенциальньх преимуществ перед бо Костньм мозгом для аутологической пересадки. У пациентов, лишенньїх подходящих участков сбора клеток костного мозга вследствие наличия опухолей либо предшествующей радиотерапии, может производиться сбор

РВЗО. Использование стволовьїх клеток крови исключает необходимость вьіполнения общего анестезирования и хирургической операции у больньїх, плохо их переносящих. Методика афереза, осуществляемая для сбора клеток крови, зффективна и общедоступна в большинстве крупньїх медицинских центров. Основньми 65 Оограничениями данной методики являются как низкая частота встречаемости стволовьїх клеток в периферической крови при гомеостазе, так и их вьісокая митотическая активность после активации с помощью препаратов либо факторов роста (например, циклофосфамида, С-СЗЕ, фактора роста стволовьїх клеток).

Зффективньй ингибитор стволовьїх клеток бьіл бьії полезен для их возврата в состояние покоя, предотвращая тем самьїм их утрату вследствие дифференциации.

ІМ. Лечение гиперпролиферативньх расстройств

Ряд заболеваний характеризуется состоянием гиперпролиферации, при котором хаотически делящиеся стволовьіе клетки способствуют возникновению переизбьтка клеток на терминальной /стадий дифференцировки. Подобнье заболевания включают, но не ограничиваются, псориаз, при котором наблюдается перепроизводство зпидермальньх клеток, и предраковое состояние желудочно-кишечного тракта, 7/0 Которое характеризуется появлением полипов в кишечнике. Ингибитор стволовьїх клеток бьл бь полезен при лечений подобньх состояний.

М. Перенос генов

В настоящее время в клинической практике находит применение перенос генетической информации в гемопозтические клетки. Гемопозтические клетки являются подходящей мишенью для генотерапии благодаря 7/5 простоте доступа, обширному опьіту манипулирования и обработки зтой ткани ех мімо и благодаря способности клеток крови просачиваться сквозь ткани. Далее, корректирование некоторьїх генетических дефектов человека оказьівается возможньі!м благодаря вставке функционального гена в стволовье клетки крови гемопозтической системь! человека.

Существуеєет несколько ограничений для вставки генов в гемопозтические клетки человека с помощью го ретровирусньїх векторов либо физических способов переноса генов: (1) Низкая частота встречаемости стволовьіх клеток в гемопозтических тканях обусловила необходимость разработки вьісокозффективньмх способов переноса генов; и (2) биістрее циклирующие стволовье клетки оказались более восприймчивьми к векторной инфекции, однако повьішение частотьї инфицирования путем стимуляции пролиферации стволовьх клеток факторами роста оказьівает отрицательное воздействие на долгосрочную зкспрессию генов, поскольку с ов клетки, содержащие трансгень), вьінужденьї необратимо дифференцироваться и теряют способность к самовосстановлению. Острота зтих проблем может бьіть ослаблена применением ингибитора стволовьїх клеток і) для предотвращения дифференциации и потери способности к самовосстановлению.

Настоящее изобретение относится к полипептидам, которье являются ингибиторами пролиферации стволовьїх клеток (ИНПРОЛ" (ІМРКОЇ)), и их применению. Ге! зо Настоящее изобретение включает ингибитор пролиферации стволовьх клеток, характеризующийся следующими свойствами: - (а) Удельная активность (ІС 50) менее или равна 2Онг/мл в реакциий с колонигобразующими единицами с селезенок мьішей (СЕРИО-5 - КОЕ-С) (см. Пример 4), (Б) Молекулярная масса больше 10.000 и меньше 100.000 Дальтон (ультрафильтрация), « (с) Активность чувствительна к грипсинизации, ю (4) Гидрофобнеє, чем МІР-15 либо ТОЕр и отделяєтся от обоих вьісокозффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой (см. Пример 12), (е) Биологическая активность сохраняется после нагревания в течение одного часа при 37"С, 5572 либо 757С в водном растворе и « () Биологическая активность сохраняется при осаждений 195 соляной кислотой в ацетоне. 8 с Настоящее изобретение, далее, характеризуется и отличается от других возможньїх ингибиторов стволовьсх й клеток (например, МІР-19, ТОЕрД и различньїх олигопептидов) способностью обеспечения ингибирования в "» реакциях іп міго после непродолжительной преинкубации (см. Пример 5).

Настоящее изобретение включаєт также фармацевтические составьі), содержащие ИНПРОЛ, для лечения ряда расстройств. 1 Настоящее изобретение предоставляет способ лечения человека, которьій должен бьїть подвергнут воздействию фактора, обладающего способностью убивать либо повреждать стволовье клетки, посредством т введения упомянутому человеку зффективного количества состава, ингибирующего стволовье клетки. 9) Стволовьми клетками, защищаемьми зтим способом, могут бьіть гемопозтические стволовье клетки, обьічно присутствующие и делящиеся в костном мозгу. В альтернативном варианте, стволовьми клетками могут бьіть зпителиальнье клетки, находящиеся, например, в кишечнике либо в волосистой части кожи головьі или на (Че) других участках тела, или же половье клетки, находящиеся в репродуктивньх органах. Способ, соответствующий настоящему изобретению, может бьїть, желательно, использован на людях, хотя зтим способом предусматриваєтся также и лечение животньїх. Терминь! "субьект" либо "пациент", используемье в данном описаний, относятся к животному, например, млекопитающему, включая человека.

В другом аспекте изобретение предоставляет способ защить! и восстановления гемопозтической, иммунной і) либо других систем стволовьїх клеток пациента, проходящего курс химиотерапии, которьій включает введение ко пациенту зффективного количества ИНПРОЛа.

В следующем аспекте настоящее изобретение предоставляет способ дополнительного лечения любого бо ракового заболевания, включая характеризующиеся наличием твердьх опухолей, посредством введения раковому больному зффективного количества ИНПРОЛа для защить стволовьх клеток костного мозга, желудочно-кишечного тракта или других органов от токсического воздействия химио- либо радиотерапии.

В следующем аспекте настоящее изобретение предоставляет способ лечение лейкоза, включающий обработку гемопозтических клеток, содержащих в своей среде пролиферативнье лейкознье клетки, 65 Ззффективньм количеством ИНПРОЛа для ингибирования пролиферации нормальньїх стволовьїх клеток, и обработку костного мозга цитотоксическим средством для уничтожения лейкозньїх клеток. Действенность зтого способа может бьіть усилена последующей обработкой костного мозга другими средствами, стимулирующими его пролиферацию, например, колониестимулирующими факторами (КСФ). В оодном из вариантов осуществления настоящего изобретения зтот способ реализуется іп мімо. В альтернативном варианте, зтот способ пригоден таюке для десенсибилизации и размножения гемопозтических клеток для пересадки ех мімо.

В следующем аспекте, способ включаєет лечение субьекта имеющего расстройство, вьзванное пролифериующими стволовьіми клетками. Такие расстройства, как псориаз, миелодисплазия, некоторье аутоиммуннье болезни, иммуно-депрессивнье состояния при старениим лечатся посредством введения субьекту зффективного количества ИНПРОЛІа для частичного ингибирования пролиферации соответствующих 7/0 Стволовьх клеток.

Настоящее изобретение предоставляет способ обратимой защить! стволовьїх клеток от повреждения цитотоксическим средством, способньм убить либо повредить стволовьіе клетки. Способ включает введение субьекту, подлежащему воздействию подобного средства, зффективного количества ИНПРОЛ а.

Настоящее изобретение также предоставляет ингибитор пролиферации стволовьїх клеток, вбіделенньїй из /5 бВвИНОГО либо другого костного мозга следующим способом (см. Пример 12): (а) Зкстрагирование костного мозга и удаление макрочастиц посредством фильтрации, (Б) Тепловая обработка при 56"7С в течение 40 минут с последующим охлаждением на ледяной бане, (с) Удаление осадка центрифугированием при 10.000об/мин в течение З минут при 47С, (4) Кислотное осаждение посредством добавления супернатанта к 10 обьемам перемешиваемого ледяного го ацетона, содержащего 1(06.)96 концентрированной соляной кислотьі и инкубирование при 4"С в течение 16 часов, (е) Вьіделение осадка центрифугированием при 20.000об/мин в течение ЗО минут при 4"С и промьівка ледяньім ацетоном с последующим вьісушиванием, (9 Вьіделение вьісокозффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой и контроль активности с 2г5 посредством ингибирования образования колоний клетками костного мозга, предварительно обработанньми 5-фторурацилом и инкубированньми в присутствий мьішиного ИЛ-3, а также абсорбцией на 280нм и і) злектрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (5О5-РАСЕ).

Настоящее изобретение предоставляет также:

Способ очистки ингибитора пролиферации стволовьїх клеток, по существу, свободного от других белковьїх (33 зо материалов, включающий предшествующие зтапь, а таюке подробнее описанньй далее.

Настоящее изобретение предоставляет также: -

Способ лечения людей либо животньїх, в соответствии с которьім ингибитор пролиферации стволовьх со клеток нейтрализует иммуносупрессию, обусловленную гиперпролиферацией стволовьїх клеток.

Способ лечения людей либо животньїх, в соответствии с которьім упомянутьій ингибитор пролиферации ю стволовьіх клеток вводится после того, как пролиферация стволовьїх клеток бьла вьізвана воздействием цитотоксического препарата либо облучением. Стволовье клетки находятся обьічно в состояний покоя, однако их митотическая активность стимулируется химиотерапией. Вследствие зтого они становятся более восприимчивьми к повторному введению химиотерапевтических препаратов, данньій способ обеспечиваєет их « 0 защиту от подобной обработки. в с Настоящее изобретение предоставляет также:

Способ лечения людей или животньїх, в соответствии с которьім упомянутьій ингибитор пролиферации ;» стволовьїх клеток вводится как адьювант до или во время вакцинации с целью усиления иммунной реакции.

Настоящее изобретение предоставляет также способ лечения людей либо животньїх, принимающих цитотоксические препаратьї, либо подвергающихся лучевой терапий, включающий введение зффективного с количества ингибитора пролиферации стволовьїх клеток для защить! стволовьїх клеток от повреждения.

Изобретение включаєт также фармацевтический состав, содержащий гемоглобин и фармацевтически о приемлемьій носитель. оо Изобретение включает также фармацевтический состав, содержащий (а) полипептид, вьібранньй из группь, бостоящей из о-цепи гемоглобина, р-цепи гемоглобина, у-цепи гемоглобина, 5-цепи гемоглобина, є-цепи і гемоглобина и 5-цепи гемоглобина и (Б) фармацевтически приемлемьй носитель. Подобньіе фармацевтические (Че) составьі могут состоять из одного полипептида, вьібранного из упомянутой группьї, смеси полипептидов, вьібранньїх из упомянутой группьї либо полипептидов из указанной группь! в виде димеров или полимеров с/без гема.

Изобретение включает также пептидьі, имеющие следующие последовательности:

Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал, о Цис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал-Цис іме) где два цистеиновьїх остатка образуют дисульфидную связь

Цис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал-Цис во где два цистеиновьїх остатка соединяются углеродньім мостиком, и

Асп-Ала-Лєй-Тре-Асн-Ала-Вал-Ала-Гис-Вал-Асп-Асп-Мет-Про-Асн-Ала-Лей-Сер-Ала.

Изобретение также включает последовательности ДНК, кодирующие вьішеупомянутье пептидь, векторь, содержащие указаннье последовательности ДНК и клетки-хозяева, содержащие указаннье векторьІ. Зти пептидьі могут бьіть синтезированьії с помощью стандартньїх химических способов (например, твердофазньй 65 метод синтеза) либо с помощью рекомбинантньїх способов (например, системьї слияния наподобие использующих глутатион-5-трансферазу (Д.Б. Смит) (0.8. Зтійй) и К.С. Джонсон (К.5. Чдоппзоп), Сепе 67: 31-40,

1988), тиоредоксин (Ла Велли (Іа Маїше) и др., ВіоїесппоЇоду 11: 187-193, 1993) либо убиквитин (Батт (Ви) и др., РМАЗ 86: 2540-4, 1989, патент США 5.391.490)).

Наряду с зтим, изобретение включает способ ингибирования пролиферации стволовьїх клеток, включающий Ввведение гемопозтических клеток в контакт с соединением, способньм связьвать опиатнье рецепторь, в предпочтительном варианте, подкласс ц опиатньїх рецепторов. Из гемоглобина бьли вьіделень! пептидь (названнье "геморфинами"), проявляющие опиатоподобную активность (например, Брант (Вгапіе) и др., Еинг. у.

Рпагт., 125: 309-100, 1986; Девис (ЮОамів) и др., Реріїдев 10: 747-51, 1989; Карелин (Кагеїїп) и др., Віосп.

Віорпуз. Кев. Сотт, 202: 410-5, 1994; Жао (2пао) и др., Апп. М.М. Асай. Зсі. 750: 452-8, 1995). Каждая из 7/0 зтих статей включена в настоящеє описание в качестве ссьІлки.

Изобретение также включает способ ингибирования пролиферации стволовьїх клеток, включающий введение гемопозтических клеток в контакт с пептидом, вьібранньм из группь! геморфинпептидов, имеющих последовательность:

Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен,

Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг,

Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн,

Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре,

Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп,

Лей-Вал-Вал-Тир-Про,

Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн,

Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен,

Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг,

Тир-Про-Трп-Тре-Глн, и

Тир-Про-Трп-Тре. с

Вьішеупомянутье пептидьії имеют последовательность, сходную с другими опиатоподобньми пептидами, например, с пептидами из семейства Тир-МІЕ-1 (см. обзорную статью Рида (Кееад) и др., Мешгозсі, Віорепау. Кем. о 18: 519-25, 1994), казеин-производньіми, казоморфинами (Брантл и др., Норре-ЗеуЇегз 7. РНувзіої. Спет. 360: 1211-16, 1979; Лукас (ІоиКавз) и др., Віоспет. 22: 4567-4573, 1983; Фиат (Ріабд и Джоль (доПев), Мої. Сеї)..

Віоспет. 87: 5-30, 1989), пептидами, полученньіми из цитохрома в, именуемьми цитохрофинами (Брантл и др., Ф)

Еншг. у. Ріагт. ІЇЇ: 293-4, 1985), а также с пептидами, полученньми из комбинаторньїх библиотек, отобранньх для связи с опиатньіми рецепторами (см. обзорную статью Дули (Оооіеу) и др., Рерііїде Кезеагсі 8: 124-137, 1995). -

Каждая из зтих статей включена в настоящее описание в качестве ссьІлки. со

Изобретение включаєт также способ ингибирования пролиферации стволовьїх клеток, включающий введение гемопозтических клеток в контакт с пептидом, вьібранньм из группь,, включающей пептидь, З

Зз5 родственнье Тир-МІР-1, казоморфинь и цитохрофиньі. В частности, включень! пептидь! Тир-МІР-17, имеющие (|З последовательности:

Тир-Про-Три-Гли-МН»,

Тир-Про-Лиз-Гли-МН»,

Тир-Про-Лей-Гли-МН» и «

Про-Лей-Гли-МН». шщ с Изобретение включает также способ проведения генотерапий млекопитающего, включающий: й а) удаление гемопозтических клеток из упомянутого млекопитающего, "» Б) факультативную обработку указанньїх гемопозтических оклеток ех мімо, как минимум, одним стимулирующим цитокином для того, чтобь! вьізвать пролиферацию стволовьх клеток; с) трансфекцию указанньїх гемопозтических клеток предопределенньм геном; сл а) введение указанньїх трансфектированньїхх гемопозтических клеток ех мімо в контакт с ИНПРОЛоОМм, е) пересадку млекопитающему гемопозтических клеток зтапа а, ть Ї) факультативную обработку указанного млекопитающего іп мімо ИНПРОЛом. г) Изобретение включает также способ размножения стволовьх клеток ех мімо, включающий обработку указанньїх гемопозтических клеток ИНТРОЛом и, как минимум, одним стимулирующим цитокином. ИНПРОЛ і вводится в контакт с гемопозтическими клетками до, во время и/или после контакта со стимулирующим (Че) цитоКиноМм.

Изобретение включает также фармацевтический состав, включающий: (а) ИНПРОЛ и (Б) как минимум, одно ингибирующее соеєединение, вьібранноеє из группьії, состоящей из МІР-1 0, ТОЕр, ТМЕо, ІМЕо, ІМРД, ІМРУ, пентапептида пироГлу-Глу-Асп-Дис-Лиз, тетрапептида М-ацетил-Сер-Асп-Лиз-Про и трипептида глутатион о (Гли-Цис-уГлу).

Изобретение включает также фармацевтический состав, включающий (а) ИНПРОЛ и (Б) как минимум, одно ко стимулирующее соединение, вьібранное из группьії, включающей ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9,

ИЛ-11, ИЛ-13, ИЛ-14, ИЛ-15, 5-С5Е, ОМ-С5Е, М-С5Е, зритропозтин, тромбопозтин, фактор роста стволовьх 60 клеток и лиганд ЯК2ЛІКЗ.

Настоящим изобретением описьіваєется ингибитор стволовьїх клеток (ИНПРОЛ), отличающийся от известньх в данной области, например, МІР-19, ТОЕр, тетрапептида Фриндела и др. либо пентапептида Пуковица и др. (ср. Райт и Прагнелл 1992 (цитированное сочинениє)). Молекулярная масса естественного ИНПРОЛа превьішает 10.000 Дальтон (ультрафильтрация), что отличает его как от тетрапептида, так и от пентапептида. 65 Он отличается большей гидрофобностью, чем МІР-1о, или ТОЕД в хроматографических системах с обращенной фазой, что отличает его от указанньїх цитокинов. Далее, способ его действия отличается от способа действия любого ранее описанного ингибитора тем, что он активен в реакции іп міго, будучи использованньм лишь в течение преинкубационного периода (Пример 5). Далее, естественньй ИНПРОЛ оактивен в реакции, измеряющей "клетки с внісоким пролиферативньїм потенциалом" (НРР-РЕС), в то время как у МІР-1у; подобная активность отсутствует (Пример 6).

На фиг.1 - 4 представленьі фракции продукта после каждого зтапа очистки (ДСН-ПАГЗ).

Фиг.1 - полоса 1 - химотрипсиноген, полоса 2 - овальбумин, полоса З - бьічий сьівороточньій альбумин, полоса 4 - фракции «ЗОкД; полоса 5 - фракции З0 - 5ОкКД и полоса 6 - фракции 50 - 100кКД.

Фиг.2 - полоса 1 после осаждения сульфатом аммония (40 - 8095) и полосьї 2 - 5 - фракции 7/0 дизтиламинозтила (полоса 2 представляет активную фракцию).

Фиг.3 - полоса 1 супернатант после осаждения сульфатом аммония, полоса 2 - активная фракция дизтиламинозтила, полось З - 5 - фракции гель-фильтрации (полоса 5 - активная фракция).

Фиг.4 - полоса 2 - конечньїй продукт.

Фиг.5 - хроматограмма ОФ ВЖХ конечной очистки.

Фиг.6 - включение тимидина, меченого тритием (число импульсов в минуту) в клетки линий ЕОСР-тіх без (контроль - 956 ингибирования) и с различньми концентрациями ИНПРОЛАа, очищенного из свиного костного мозга (ОИНПРОЛ). Даннье нормализовань!ї против контрольной величинь.

Фиг.7 - процент клеток в 5-фазе клеточного цикла после обработки мьішей тестостеронпропионатом (Т5Р),

Т5РЯСИНПРОЛ либо наполнителем (контроль). Каждая группа состояла из 25 животньїх (3 - 4 на точку времени).

Фиг.8 - виіживаемость мьішей, обработанньхх двумя дозами 5ФУ с/без обработки ОМИНПРОЛом. Каждая группа состояла из 30 животньх.

Фиг.9 - виіживаемость облученньїх животньїх с/без обработки ОМИНПРОЛом. Каждая группа состояла из 50 жЖивотньх. с

Фиг.10А и 108 - восстановление долгоживущей культурь! клеток нормального костного мозга Через 1 неделю (10А) и З недели (108) после обработки Ага-С плюс ОМИНПРОЛ. о

Фиг.11 - вьіживаємость мьшей (75 в группе) после летального облучения и трансплантации З х 107 костномозговьїх клеток после прейнкубации с питательной средой (контроль) либо ОМНПРОЛОоМм (25нг/мл) в течение 4 часов. Вьїживаемость контролировали в течение 30 дней. Ге»)

Фиг.12 - количество КОЕ-ГМ, образованное после 14 дней культивирования клетками костного мозга мьіІши после летального облучения и восстановления костномозговьіми клетками донора, проинкубированньми с в

ОИНПРОЛом либо питательной средой в течение 4 часов. со

Фиг.13 суспендированнье клетки долгоживущей лимфоидной культурь, отбиравшиеся каждую неделю, промьвавшиеся и вьісевавшиеся с ИЛ-7 (1Онг/мл) после преинкубирования с питательной средой либо в

ОМНПРОЛОМ в течение 4 часов. ю

Фиг.14 - повьішение репопуляционного потенциала лейкозньїх клеток периферической крови, обработанньх

ОИНПРОЛОомМ. Количество клеток, инициирующих долгоживущую культуру (ІТС-ІС), определялось посевом адгезивньїх и неадгезивньїх клеток долгоживущей культурь! с/без ОМНПРОЛа и подсчетом КОЕ-ГМ на 7 день.

Данньсе нормализовань к контрольньім величинам. «

Фиг.15А - хроматограмма ОФ-ВЖХ СА - злюирование очищенньм ОМИНПРОЛоМм с 5395 ацетонитрила. Полоса ШЩ-) с 1 - неочищенньй материал; полоса 2 - маркерьї молекулярной массь, полоса З - очищенньій материал. Фиг.158 й - хроматограмма ОФ-ВЖХ С4 - злюирование МІР-19 с 43,995 ацетонитрила. Фиг.15С - хроматограмма "» ДСН-ПАГЗ неочищенного препарата ОМНПРОЛ и очищенного препарата после обращенной фази.

Фиг.16 - последовательность гемоглобина: Фиг.16бА - последовательности кДНК и аминокислот о-гемоглобина человека; Фиг.168В8 -последовательность кКДНК и аминокислот р-гемоглобина 1 человека. Нумерация по аминокислоте. Фиг.16С - сравнение аминокислотньїх последовательностей -о- їз и рД-цепей гемоглобина человека, мьішей и свиней.

Фиг.17 - сравнение следов ОМНПРОЛ Іа (Фиг.17А) и кристаллизированного свиного гемоглобина (Фиг.178) на і хроматограммах ОФ-ВЖХ Са. -І 20 Фиг.18 - гель ДСН-ПАГЗ фракций ОФ-ВЖХ С4 разделения кристаллизированного свиного гемоглобина.

Полоса 1 - маркерьї молекулярной массь, полоса 2 - фракции 48 - 49, полученньсе с первого пика (на 47,11мин.), с полоса З - фракции 50 - 51, полученнье со второго пика (на 49,153мин.), полоса 4 - фракции 54 - 55, полученньюе с третьего пика (на 52,25мин.) и полоса 5 - фракции 56 - 57, полученнье с четвертого пика (на 53,61Змин.). 29 Фиг.19 - сравнение 2-мерного гель-злектрофореза оОИНнНПРОЛа (Фиг19А) и очищенного

ГФ) свиного р-гемоглобина (Фиг.19В). юю Фиг.20 - сравнение действия очищенного свиного о-гемоглобина, р-гемоглобина либо ОМНПРОЛа при анализе ЕОСР-МІХ.

Фиг.21 - отделение с обращенной фазой свиного гемоглобина с использованием пологого градиента. 60 Для более полного понимания настоящего изобретения далее представлено подробное описание.

Настоящее описание, поясняющее данное изобретение, не является ограничивающим, и изменения, очевиднье для специалистов в данной области, должнь!ї считаться включенньіми в обьем настоящего изобретения.

ИНПРОЛ обратимо ингибирует деление стволовьїх клеток. В частности, ИНПРОЛ зффективен при временном ингибирований деления гемопозтических стволовьх клеток. Следовательно, способ, бо соответствующий настоящему изобретению, может применяться для смягчения нежелательньїх побочньх воздействий химиотерапии на гемопозтическую, миелоидную и иммунную системь!й больного посредством защить! стволовьїх оклеток от повреждений, вВьізьваемьх химиотерапевтическими препаратами либо облучением, применяемьми для уничтожения раковьїх либо вирусинфицированньіїх клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, ИНПРОЛ вводится больному в дозе, достаточной для ингибирования деления стволовьїх клеток в процессе воздействия химиотерапевтического препарата на больньсе клетки. После завершения воздействия химиотерапевтического препарата процесс деления стволовьсх клеток, ингибированньй ИНПРОЛ ом, возвращается в норму без какого-либо дальнейшего вмешательства. При необходимости стимулирования регенерации гемопозза, дополнительно могут применяться стимуляторь роста 7/0 либо цитокинь.

Термин "ИНПРОЛ", используемьй в настоящем описаний, включаєт белки млекопитающих, очищеннье посредством методов, представленньх в Примерах, гемоглобин, о-цепь сгемоглобина (с/без группь! гема), Д-цепь гемоглобина (с/без группь! гема), смеси со- и Д-цепей (с/без группь! гема), а также фрагменть! либо аналоги зтих белков, включая змбриональньєе, фетальнье либо зрелье формь! (например, о-, Д-, у-, б-, в- 75 либо Е-цепи, отдельно либо в виде смесей, димерь либо полимерь), с/без группьі гема), обладающие способностью ингибировать пролиферацию стволовьїх клеток. Термин " ИЙНПРОЛ" включает как естественньє, так и искусственнье (например, полученнье рекомбинацией) формь! зтих белков.

В обьічньїх клинических условиях схема введения ИНПРОЛ'а больному включаєт внутривенное введение либо вливание в виде унифицированной (стандартной) дозьії, например, из расчета от 0,01 до 10Омг/кг, в предпочтительном варианте, от 0,1 до 1,Омг/кг, например, за 4 - 60 часов до проведения стандартньїх химио- либо лучевьїх терапевтических процедур.

В другом варианте осуществления изобретения, предварительное введение ИНПРОЛа позволяет увеличить дозь! химиотерапевтических препаратов либо облучения, по сравнению с дозами, назначаемьми больньм в обьічньїх условиях. Ге!

Значительная часть гемопозтических стволовьїх клеток находится, как правило, в фазе ОС о (покоящиеся (5) клетки). После химиотерапевтических процедур, однако, преобладающая часть стволовьїх клеток возобновляет митотическую активность в качестве компенсаторной реакции на повреждения гемопозтическоий системь, вьізваннье химиотерапией, вследствие чего они становятся особо уязвимьми к воздействию последующих доз цитотоксических химиотерапевтических препаратов либо лечебного облучения. Введение ИНПРОЛАа, (о) благодаря его ингибирующему воздействию на циклирование стволовьїх клеток, позволяет производить более м раннее либо более частое введение последующих доз (как обьічньїх, так и повьішенньїх) цитотоксических химиотерапептичсских препаратов. со

В одном из вариантов осуществления изобретения, ИНПРОЛ (от 0,1мг до 6бг - в предпочтительном варианте « от 1,0 до боОмг) вводится, приблизительно, через 24 час. - 10 дней после начальной дозь химиотерапевтического препарата. По истечении последующих 4 - 60 часов, в предпочтительном варианте 24- М) 48 часов, вводится следующая доза химиотерапевтического препарата. Подобное перемежающееся введение химиотерапевтического препарата и ИНПРОЛа продолжаєтся в зависимости от благотворного лечебного воздействия. Химиотерапевтические препарать! и схемь! введения подбираются согласно приемлемости для « конкретньїх видов оопухолей в стандартной клинической практике Для последующего улучшения восстановления гемопозтических функций после химко- либо лучевой терапиий применяют, факультативно, - с факторь роста, такие как С-С5НЕ, фактор роста стволовьїх клеток. "» ИНПРОЛ в условиях ех мімо используется в дозах от 0,Тнг до 1ООнг/10 б клеток/мл, в предпочтительном " варианте 20 - 5О0нг/109 клеток/мл. В следующем варианте осуществления настоящего изобретения, ИНПРОЛ применяется в способе подготовки аутологических гемопозтических клеток для трансплантации.

Гемопозтическиє клетки обрабатьшваются ех мімо зффективньм количеством ИНПРОЛ'а для ингибирования іні деления стволовьїх клеток, а затем культурьі! костномозговьїх клеток десенсибилизируются в результате їз удаления раковьїх клеток посредством введения зффективного количества химиотерапевтического препарата, либо облучения. Предпочтение отдается химиотерапевтическим препаратам, обладающим специфичностью к о митотически активньм клеткам. Костньій мозг, подвергшийся подобной обработке, повторно вводится -і 20 аутологическому донору. Для улучшения восстановления гемопозтических функций, больному, факультативно, вводится препарат, обладающий свойствами стимулировать гемопоз3з. с В следующем варианте осуществления настоящего изобретения ИНПРОЛ используется в качестве дополнительного терапевтического средства при лечении лейкоза. Например, в случаях заболеваний, когда лейкознье клетки не реагируют на введение ИНПРОЛа, лейкознье гемопозтические клетки обрабатьвваются 22 МНПРОЛОМ ех мімо. Введение ИНПРОЛа препятствуєт пролиферации нормальньх стволовьх клеток.

ГФ) Следовательно, в то время, когда пролиферирующие лейкознье клетки обрабатьвваются циклоспецифическим цитотоксическим препаратом, популяция нормальньх стволовьїх клеток оказьваєтся защищенной от о повреждения. В дополнение к зтому, в процессе обработки препаратом либо облучением, вводят (факультативно) стимулирующий цитокин, например, ИЛ-3 либо ЗМ-С5Е, для индуцирования циклирования 60 лейкозньїх клеток, в то время как нормальнье стволовьіе клетки защищеньї ИНПРОЛом. Больной получаєт химиотерапевтические препарать! либо подвергается облучению для уничтожения лейкозньїх клеток, после чего десенсибилизированньй костньій мозг вновь пересаживаєется зтому больному для восстановления гемопозтических функций.

Подобньм же образом, в следующем варианте осуществления настоящего изобретения, для лечения 62 больньїх с серьезньми вирусньми инфекциями, поражающими клетки крови либо лимфоцить, например,

ВиИЧ-инфекция, гемопозтические клетки обрабатьваются ИНПРОЛОом ех мімо, с последующей обработкой противовирусньіми лекарственньмми средствами, препаратами, уничтожающими инфицированньсе клетки, либо системами на основе антител, для удаления инфицированньїх клеток. После противовирусной либо химиотерапевтической обработки удаленного костного мозга для уничтожения вирусньїх клеток-хозяев, костномозговне клетки, обработаннье ИНПРОЛ ом, вновь возвращаются больному.

В следующем варианте осуществления настоящего изобретения, ИНПРОЛ используется при лечений заболеваний, вьізванньїх гиперпролиферацией стволовьїх клеток. Например, псориаз представляет собой заболевание, вьізьіваемое гиперпролиферацией зпителиальньїх клеток кожи и для лечения зтого заболевания 7/0 Многда используют цитотоксические препарать. Другие предраковье поражения, при которьїх наблюдается пролиферация стволовьїх клеток, также поддаются лечению зффективньми количествами ИНПРОЛАа, используемого для полного либо частичного ингибирования пролиферации стволовьїх клеток. С зтой целью, в качестве альтернативь! парентеральному введению, применяют, по мере возможности, составьї), включающие

ИНПРОЛ, предназначеннье для местного либо чрезкожного введения, например, мази, лосьоньі, гели либо /5 пластьіри. В большинстве случаєв лейкоза лейкозньмми клетками-предшественниками являются популяции дифференцированньх клеток, на которне ИНПРОЛ не воздействует и которне, вследствие зтого, подвергаются обработке способами с использованиегм ИНПРОЛиа, например, описанньіми ранее. В случаях, когда лейкознье клетки-предшественники совершенно недифференцированьі и непосредственно восприимчивь! /к ингибированию ИНПРОЛ ом, пролиферация лейкозньїх клеток замедляется введением зффективньїх количеств МИНПРОЛА.

Антитела, моноклональнье либо поликлональнье, к полипептидам ИНПРОЛ получают стандартньми методиками. Зти антитела либо полипептидьі ИНПРОЛ метятся поддающимися обнаружению метками, большое количество которьіїх известно в данной области. После зтого меченнье ИНПРОЛ- либо анти-МНПРОЛ-антитела используются в качестве маркеров стволовьїх клеток для идентификации и вьіделения сч об последних путем их непосредственного введения пациенту в диагностических целях. В альтернативном варианте зти меченнье полипептидьї или антитела используются ех мімо для идентификации стволовьїх клеток і) в препарате гемопозтических клеток для их удаления перед удалением раковьх клеток из костного мозга.

Подобньм же образом, такие меченнье полипептидьй или антитела применяют для вьіделения и идентификации зпителиальньх либо иньїх стволовьїх клеток. В дополнение к зтому подобнье антитела, (зу зо Ммеченнье либо не меченньве, используются в терапевтических целях для нейтрализации активности ИНПРОЛ'а либо в диагностических целях для обнаружения уровней ИНПРОЛ Іа в системе кровообращения. -

ИНПРОЛ может клонироваться из библиотек генов либо кДНК человека для зкспрессим ИНПРОЛа человека с с помощью стандартньхх методик. Например, используя даннье секвенирования очищенного белка, конструируются олигонуклеотидньюе зондь, которье могут метиться, например, с помощью Ро 2, и З использоваться для скрининга подходящей библиотеки кДНК (например, из костного мозга). В альтернативном ою варианте, библиотека зкспрессируемьїх последовательностей из подходящего источника (например, из костного мозга), подвергается скринингу на кодирование ИНПРОЛа кДНК с помощью антител либо посредством подходящей функциональной реакции (например, описанной в Примере 2). Сам по себе гемоглобин, также « как о- и Д-цепи по отдельности, клонировали и зкспрессировали с помощью способов, известньїх в данной области (см. Панье (Радпіег) и др., Кему. Ег. Тгапеїив. Нетобіоії. 35: 407-15, 1992; Лукер (ІГооКег) и др., - с Маїйге, 356: 258-60, 1992; Меїйодз іп Епгутоіоду, т. 231, 1994). Каждая из зтих статей включена в данное а описание в качестве ссьлки. є» Настоящим изобретением охватьвшваются последовательности ДНК, которье включают: включение кодонов, "предпочтительньїх" для зкспрессиий отдельньми хозяевами, не являющимися млекопитающими; предоставление сайтов для расщепления зндонуклеазами рестрикции (рестриктазами) и предоставление 1 дополнительньх начальньїх, концевьїх либо промежуточньїх последовательностей ДНК, облегчающих 1» конструирование легкозкспрессируемьїх векторов либо продуцирование или очистку о-, р-, у-, 6-; є- Й/ИЛИ 2-цепи гемоглобина. о Настоящее изобретение предоставляет также последовательности ДНК, кодирующие полипептиднье -1 50 аналоги либо производнье о-, р-, у-, 5-» є- И/ИЛИ 2-цепей гемоглобина, отличающиеся от естественньіїх форм с точки зрения идентичности либо размещения одного или более аминокислотньїх остатков (например,

Ме) делеционнье аналоги, число остатков у которьїх меньше указанного; заместительнье аналоги, у которьїх один или более из указанньїх остатков замещен другим остатком; и присоединеннье аналоги, у которьїх к концевому либо среднему участку полипептида добавлен один или более аминокислотньїх остатков) и которне обладают го некоторьіми либо всеми свойствами естественньїх форм.

ГФ! В предпочтительном варианте оосуществления МНПРОЛ является продуктом зкспрессийи хозяином-прокариотом либо зукариотом (например, культурой клеток бактерий, дрожжей, вьісших растений, о насекомьїх либо млекопитающих) последовательностей зкзогенной ДНК, полученньїх клонированием генов либо

КДНК или синтезом генов, т.е. в предпочтительном варианте осуществления, ИНПРОЛ является 60 "рекомбинантньм ИНПРОЛом". Продукт зкспрессии у клеток-хозяев, в качестве которьїх вьіступают типичнье дрожжи (например, Засспаготусез сегемізіає) либо прокариоть (например, Е. соїї), не ассоциируется ни с одним из белков млекопитающих. Продукть! зкспрессии у клеток позвоночньїх (например, у млекопитающих, кроме человека (например, клетки ямчников китайского хомячка) и птиц) не ассоциируются ни с одним из белков человека. В зависимости от использованного хозяина, полипептидь), соответствующие настоящему бо изобретению, могут бьть как гликозилированньми, так и негликозилированньми. Полипептидь, соответствующие настоящему изобретению, могут также, факультативно, включать начальньй метиониновьй аминокислотньй остаток (в положении - 1).

Настоящим изобретениєм охватьшваются также другие продуктьї, например, полипептиднье аналоги о-, р-, у-, б-, є- /или г-цепей гемоглобина. Подобнье аналоги включают фрагменть! о-, Д-, у-, б-, 6-

М/йли 2-цепей гемоглобина. Применяя общейизвестнье методики, можно легко запрограммировать и получить геньї, коюдирующие микробную зкспрессию полипептидов, основнье последовательности которьїх отличаются от указанньїх в данном описаний с точки зрения идентичности либо расположения одного или нескольких остатков (например, замещений, концевьїх и промежуточньїх присоединений и делеций). В альтернативном варианте, модификации кДНК и генов генома могут легко осуществляться с помощью общеизвестньїх методик 70 сайтнаправленного мутагенеза и использоваться для получения аналогов и производньх о-, р-, у б 67 и/или єг-цепей гемоглобина. Подобньсе продукть! обладают, как минимум, одним из свойств ИНПРОЛА, но могут, отличаться другими. В качестве примера, к числу продуктов, соответствующих настоящему изобретению, относятся о-,р-, у-,5-; є- либо є-цепи, которне предварительно укорачиваются, например, делециями; либо более устойчивье к гидролизу (и следовательно, обладающие более вьіраженньімм либо более длительньм 75 воздействием, по сравнению с естественньми); либо подвергшиєся изменению для уничтожения либо добавления одного или более потенциальньх сайтов для О-гликозилирования и/или М-гликозилирования либо имеющие один или более цистеийновьій остаток, удаленньій либо замещенньй, например, алониновьіми либо сериновьіми остатками, и легче вбіделяющиеся в активной форме из микробньїх систем; либо имеющие один или более тирозиновьїх остатков, замещенньїх фенилаланином и более или менее легко связьивающиеся с белками-мишенями либо рецепторами клеток-мишеней. Подразумеваются также фрагменть! полипептидов, дублирующие лишь часть непрерьівной аминокислотной последовательности либо вторичнье конформации в пределах о-, Д-, у-, б-, є- или --цепей, фрагменть! которьїх могут обладать одним из свойств ИНПРОЛа (например, связьивание рецепторов) и бьть мишенями других (например, ингибирующая активность в отношений стволовьїх клеток). Следует заметить, что активность не является обязательньім свойством для с 29 одного либо более продуктов, соответствующих настоящему изобретению, для их терапевтической пригодности г) (см. Вейланд (У/ейапа) и др., Віші 44: 173-5, 1982) либо пригодности для других целей, например, для реакций антагонизма ингибирующих факторов. Конкурирующие антагонистьі пригодньї в случаях перепроизводства ингибиторов стволовьїх клеток либо их рецепторов.

Наряду с зтим, пептидь), полученнье из последовательности белков, сохраняющей биологическую Ме. активность, могут бьіть синтезированьіь химическим путем с помощью стандартньх способов. Настоящим М изобретением предоставляется также кодирование последовательностей для пептидньїх аналогов либо производньїх со-, Д-, у-, б-, є- и/или 5-цепей гемоглобина, отличающихся от природньх с точки зрения Ше идентичности либо размещения одного или более аминокислотньх остатков (например, делеционньїх аналогов, -«ф содержащих не все указаннье остатки; заместительньїх аналогов, у которьіх один или более из указанньх остатков замещен другими остатками либо встречающимися в природном виде, либо другими аналогами, о известньми в данной области, например, О-аминокислотами; и присоединенньїх аналогов, у которьїх один или более аминокислотньій остаток химически модифицирован для повьішения стабильности, растворимости и/или устойчивости к протеолизу) и обладающих некоторьіми либо всеми свойствами естественньїх форм. «

Последовательности пептидов, подобнье описанньім ранее, могут идентифицироваться рядом способов. З 70 Путем сравнения трехмерньїх структур нативньїх гемоглобиновьїх Цепей, активньх в реакции с (например, о-цепь) со структурно родственньми белками, которье не проявляют активности (например, :з» миоглобин), могут бьть идентифицированьй участки, имеющие отличнье конформации в трехмерном пространстве и которье, вследствие зтого, являются возможньми участками для активньїх пептидов. В другом подходе используется избирательньй протеолиз, в ходе которого протеазьі катализируют гидролиз Ццепей сл 15 гемоглобина, в результате чего образуются пептидь, которне могут отделяться с помощью вьісокозффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой и затем проверяться на ингибирование стволовьїх клеток. т. Пептидь! могут бьіть также полученьі химическим синтезом (например, твердофазньі!м методом синтеза): легко о может бьть ополучен ряд перекрьвающихся пептидов (например, 15--ленньїх), охватьвающий последовательность представляющей интерес цепи гемоглобина (например, о-цепи), и испьітан в реакциях со -і 20 стволовьіми клетками. Могут образовьваться комбинаторнье библиотеки, в которьїх проводится с множественньій химический синтез и в которьїх отдельнье позиции аминокислот становятся изменчивьми, следствием чего является большое количество пептидньїх аналогов для скрининга (например, Дули (Юооіеу) и др., Реріїде Кезеагсп 8: 124-137, 1995). В альтернативном варианте могут бьіть использованьії рекомбинантнье 5 Методнь. Сайтнаправленньій мутагенез может использоваться для идентификации критических остатков, необходимьх для активности определенной гемоглобиновой цепи. МИзвестнье участки цепи, активнье в (Ф) качестве ингибитора стволовьїх клеток (например, о-цепь), могут заменяться участками родственного, но не

ГІ обладающего активностью белка (например, миоглобина), и испьітьіваться в реакциях со стволовьіми клетками, обеспечивая возможность идентификации участков, необходимьїх для активности. Подобнье во идентифицированньюе участки могут зкспрессироваться в виде пептидов и испьітьшваться на активность в реакциях с циклирующими стволовьіми клетками.

Гомологические либо аутологические вариантьї ИНПРОЛІа от других видов находят различное применение в ветеринарии, подобно описанньіїм ранее терапевтическим вариантам осуществления настоящего изобретения.

ИНПРОЛ воздействует на циклирующие стволовье клетки посредством обратимого перевода их в де Неделящееся "покоящееся" состояние. Когда возникает необходимость перевода покоящихся стволовьіх клеток в состояние митотической активности, например, после введения пациенту противораковьх химиотерапевтических препаратов либо после облучения, больному вводят колониестимулирующие факторь и другие гомопозтические стимуляторь. К числу примеров подобньх факторов относятся, но ими не ограничиваются, следующие: М-С5Е (макрофагальньй колониестимулирующий фактор) (С5Б-1 -колониестимулирующий фактор - КСФ-1), (ЗМ-С5ЗЕ (гранулоцитарно-макрофагальньй колониестимулирующий фактор), 5-С5Е, мегакариоцитньй колониестимулирующий фактор, тромбопозтин, фактор роста стволовьх клеток и другие цитокиньі, например, ИЛ (интерлейкин)-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11,

ИЛ-12, ИЛ-13, ИЛ-14 или зритропозтин.

Полипептидьї ИНПРОЛ или активнье фрагментьі, обладающие ингибирующей активностью в отношений 7/0 Стволовьїх клеток, очищаются либо синтезируются с помощью обьічньїх химических процессов в сочетаний с подходящими биопробами на ингибирующую активность в отношений стволовьїх клеток, что иллюстрируется приведенньіми далее примерами.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения, терапевтически зффективное количество белка ИНПРОЛ'а либо его терапевтически зффективньій фрагмент используется в смеси с фармацевтически /5 приемлемьм носителем. ИНПРОЛ подобного состава вводится, как правило, парентеральньм введением либо вливанием. Подкожное, внутривенное либо внутримьшечное вливание вьбираєется в зависимости от достигаемого терапевтического зффекта.

При систематическом введений терапевтический состав, соответствующий настоящему изобретению, вьіполняется в виде апирогенного водного раствора, приемлемого для парентерального введения. В данной 2о области известнь! способьі изготовления фармацевтически пригодного стерильного белкового раствора с соответствующими показателями в отношений рнН, изотоничности, стабильности, белков-носителей и т.п.

В обьем изобретения включаются также фармацевтические составь, содержащие терапевтически зффективнье количества полипептидов, соответствующих настоящему изобретению, вместе с подходящими разбавителями, консервантами, растворителями, змульгаторами, адьювантами и/или носителями, с об Мспользуемьіми при лечений ИНПРОЛОоМм. Термином "терапевтически зффективное количество", используемьм в настоящем описаний, обозначается такое количество, которое обеспечивает лечебньій зффект при данном і) заболевании и схеме введения лекарственного средства. Такими составами являются жидкости, гели, мази, лиофилизированнье либо иньми способами вьісушеннье лекарственнье формь, которье включают разбавители с различньм содержанием буфера (например, трис-буфер-НСІ, ацетатного, фосфатного) Ге! зо различного рН и ионной силь, добавки, например, альбумин либо желатин, для предотвращения адсорбирования на поверхности, детергенть! (например, Твин 20, Твин 80, Плюроник (Ріпгопіс) Е 68, соли - желчной кислоть!), растворители (например, глицерин, полизтиленгликоль), антиоксидантьі (например, «93 аскорбиновая кислота, метабисульфит натрия), консервантьі (например, тимеросал, бензиловьй спирт, парабень), наполнители или модификаторьй тоничности (например, лактоза, маннитол), ковалентного - з5 присоединения полимеров, например, полизтиленгликоля к белку, комплексообразования с ионами металлов ю либо включения материала в/на макрочастичнье препарать! полимерньїх соединений, например, полимера

МмолочнОой кислотьЬІ, полигликолевой кислотьІ, гидрогелей и т.д. либо в липосомьї, ниосомьї, микрозмульсии, мицелльі, одно- либо многослойнье пузьірьки, биоразрушающиеся микрокапсульй либо микросферь! для впрьіскивания, либо белковье матриць, гемолизированнье зритроцить!, сферопласть!і, кожнье пластьтри либо « Мнье известньюе способьі вьіпуска или упаковки лекарственньїх препаратов. Подобньюе составьоказьшвают 7) с воздействие на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость вьіделения іп мімо и скорость вьіведения іп мімо ИНПРОЛа. Составьі с контролируемьм либо пролонгированньм вьіделением включают ;» лекарственную форму в липофильньх депо (например, жирньх кислотах, восках (парафинах), маслах). В обьем настоящего изобретения включаются также макрочастичнье составьі), покрьітье полимеразами (например, полоксамерами либо полоксаминами) и ИНПРОЛ, соединенньй с антителами, направленньми против с тканеспецифичсских рецепторов, лигандов либо антигенов или соединенньій с лигандами тканеспецдцифических рецепторов. Другие варианть! осуществления составов, соответствующих настоящему изобретению, включают о макрочастичнье формь защитньх покрьтий, факторьі ингибирования протеазьь либо стимуляторь оо проницаемости для различньїх путей введения, включая парентеральньй, легочньй, назальньй, местньй (кожа либо слизистая) и пероральньйй. В следующем варианте осуществления, состав, содержащий ИНПРОЛ, ш- вводится локально либо чрезкожно с помощью пластиьря.

Ге В одном из вариантов осуществления составьї, являющиеся предметом изобретения, расфасовьіваются стандартньіми дозами в стерильнье ампуль! или флаконь!.

Изобретение охватьіваєт также составьі), включающие один или более дополнительньїх факторов, например, дв Химиотерапевтические препаратьі (например, 5-фторурацил (5ФУ), цитозинарабинозид, циклофосфамид, цисплатин, карбоплатин, доксирубицин, зтопозид, таксол, алкилирующие агентьї), противовируснье препарать!

Ф) (например, АЗТ, ацикловир), ТНФ, цитокиньі (например, интерлейкиньі)), антипролиферативнье препарать,, ка антиметаболить и препаратьї, подавляющие метаболизм ДНК.

Схема приема лекарственного средства, включенная в способ лечения больного, которому назначено бо введение цитотоксических препаратов либо для воздействия на гиперпролиферативнье стволовье клетки, определяется лечащим врачом, учитьівающим различнье факторьії, модифицирующие действие лекарственньх средств, как-то: состояние, вес, пол, рацион пациента, тяжесть заболевания, время введения и другие клинические факторні.

После введения больному цитотоксического препарата либо облучения, терапевтическим методом, 65 соответствующим настоящему изобретению, факультативно, предусматриваеєтся введение одного или более лимфокинов, колониестимулирующих факторов либо других цитокинов, гемопозтинов, интерлейкинов либо факторов роста для общего стимулирования роста и деления стволовьх клеток (и их потомков), ингибированньїх предшествующим введением ИНПРОЛа. К числу таких терапевтических средств, стимулирующих гемопозз, относятся МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3, МИЛ-4, МЛ-5, МИЛ-6б, ИЛ-7, мегакариоцитньй колониестимулирующий фактор, М-С5Е (С5Е-1), ЗМ-С5Е, 5-С5Е или зритропозтин. Дозировка зтих препаратов подбирается в соответствии с данньіми, полученньмми в процессе их клинических испьітаний для определения зффективности стимулирования восстановления гемопозтических функций после химиотерапии либо трансплантации гемопозтических стволовьїх клеток. Зти дозировки подбираются в индивидуальном порядке для компенсации различий в физическом состоянии больного, а также количества (обьема) и типа 7/0 Химиотерапевтического препарата и дозьі облучения, воздействию которьїх подвергался больной. Обратимость ингибирования стволовьїх клеток, обусловленного введением ИНПРОЛАа, у больного контролируется обьічньімМи методами.

При лечений лейкоза предпочтительно введение ИНПРОЛІа для ингибирования нормального циклирования стволовьіїх клеток и стимулятора роста лейкозньїх клеток, например, ИЛ-3 или ЗМ-С5Е, с одновременньм /5 введением цитотоксического препарата либо в процессе облучения. При подобной схеме введения возможно достижение максимальньхх различий между состояниями циклирования и чувствительности к препаратам нормальньх и лейкозньх клеток.

Пример 1. Тест ингибирования пролиферации стволовьїх клеток іп мімо

Для обнаружения пролиферации стволовьїх клеток, количество КОЕ-С в 5-фазе митотического цикла измеряли методом "самоубийства" ЗН-тимидином (Бекер (Вескег) и др., Віооа 26: 296-308, 1965).

Незрелье гемопозтические клетки-предшественники - колонигобразующие единицьі селезенки (КОЕ-С) - могут обнаруживаться іп мімо образованием макроскопических колоний в селезенках летально облученньх мьішей через 8 - 12 дней после внутривенного введения гемопозтических клеток (Тилл и (ТіЇїЇ) и МакКаллох (МесСипосі), 1961). с

Для стандартной реакции пролиферации КОБЕ-С обьічно применяется метод "самоубийства". ЗН-тимидином о (Бекер и др., 1965). Метод основан на включений меченного радисактивнь!м изотопом тимидина (ЗН-тимидина), предшественника ДНК, в клетки на зтапе синтеза ДНК. КОЕ-С, находящиеся в 5-фазе цикла во время испьітания, гибнут от вьісокой радиоактивности и, вследствие зтого, не могут образовьшвать колоний в селезенке. Таким образом, разница между количеством КОЕ-С, образованньх введением пробь оклеток, инкубированньїх без ЗН-тимидина, и теми же самьми клетками, инкубированньми с ЗН-тимидином, показьввает ї- процент пролиферации КОЕ-С в исходной пробу.

МИнгибитор не может испьітьшваться на популяции стволовьїх клеток костного мозга нестимулированньх о животньх, поскольку ингибитор воздействует лишь на циклирующие КОЕ-С, которьіе составляют всего ЛИШЬ 7 - «Кк 1096 от общей популяции КОЕ-С в костном мозге нормальной мьіши.

Зо Для стимулирования пролиферации КОЕ-С использовали фенилгидразин либо сублетальное облучение о (Лорд, 1976).

Нами разработан способ применения тестостеронпропионата, основанньійй на стимулирующем воздействий последнего на циклирующие КОЕ-С (Байрон (Вугоп) и др., Майшге, 228: 1204, 1970), которьій упростил проверку и « не вьізьівает никаких побочньїх действий. Результатьь стимулирования пролиферации КОЕ-С, вьізванного тестостеронпропионатом в течение 20 - 24 часов после введения, могут наблюдаться в течениє, как минимум, 7 З с дней. "» Для отбора фракций в процессе очистки ингибитора использовалась следующая методика: " Миьіши: В течение всего испьітания использовали линии мьішей ВОЕ; либо СВЕ..

Мьішей-доноров обрабатьівали из расчета 1о0мг/100г тестостеронпропионата посредством внутрибрюшинного введения 0,2мл/мьішь для индуцирования 30 - 3595 КОЕ-С в 5-фазе. о Через 24 часа из бедренной кости отбирали костньій мозг для приготовления суспензии клеток. С їх различньмми контрольньмми и испьітательньми фракциями в течение 3,5ч при 37"С на водяной бане инкубировали от пяти до десяти млн. клеток/мл. Для каждой группь! использовали две пробирки (одна горячая о (радисактивная) и одна холодная (нерадисактивная)). -І 20 Через 3,54 в каждую горячую пробирку доливали ЗН-тимидин (1мКи/мл, удельная активность 18 - 25Ки/ммоль) из расчета 200мкл на ї7мл суспензии клеток; в холоднье пробирки не добавляли ничего. с Инкубирование продолжали в течение последующих 30 минут при 3770.

После ЗОмин. инкубирования киллинг-реакцию приостанавливали, доливая 1Омл холодной (4"С) средь, содержащей 40Омкг/мл нерадисоактивного тимидина, с последующей зкстенсивной промьїівкой клеток (З раза). 25 Клетки ресуспендировали и разбавляли до необходимой концентрации для впрьіскиваний, обьічно, 2 - 4 х

ГФ) 104 клеток/мьішь в 0,3 - О0,Бмл. з Мьішей-реципиентов (8 - 10 на группу) облучали не позднее 6 часов перед иньекциями.

Сбор клеток селезенок рецепиентов производили на 9 - 12 день с фиксацией в растворе Теллесницкого (ТеПезпіїзку); подсчет колоний производили невооруженньім глазом. Количество клеток в З-фазе в процентном бо отношений вьічисляли по формуле: ва - 8-5, 009) а где: а - количество КОЕ-С без ЗН-тимидина; 65 Ь - количество КОЕ-С с ЗН-тимидином.

Результать! испьітания ИНПРОЛа, представленнье в Таблице 1, показьівают, что циклирующие стволовье клетки после обработки ИНПРОЛом приобретают устойчивость к "Н-тимидину. В зтом и во всех последующих примерах термином "ОМИнНПРОЛ" обозначаєтся белок из свиного костного мозга. Подобная же, устойчивость наблюдается и в отношений специфических для 5-фазьї цитотоксических препаратов цитозинарабинозида и гидроксимочевинь! (даннье не приведеньі). Если обработаннье стволовье клетки промьіть холодной средой, содержащей нерадисактивньй тимидин, вьіжившие стволовье клетки пролиферируют в селезенках мьшей с нормальньм образованием колоний. о і

Пример 2.

Тест ингибирования пролиферации стволовьїх клеток іп уйго

Прямое действие ИНПРОЛа демонстрировали с помощью следующей тест-системьі (Лорд и др., Пе

Іппіріоге ої Нетайороїіевів, стр. 227 - 239, 1987), Колониестимулирующий фактор (ИЛ-3)-зависимую линию стволовьїх клеток РЕОСР тіх А4 (А4) вниіращивали на среде ІМОМ (среда Дульбекко, модифицированная по способу Исков), дополненной 2095 лошадиной сьіворотки и 1095 кондиционированной средь! УУЕНІ-3, служащей источником колониестимулирующего ИЛ-3.

Для измерения пролиферации использовали реакцию включения тимидина, меченного тритием: клетки А4(5 щ су 25-х 107 в 100мкл средь с 2095 лошадиной сьіворотки и 5095 концентрированной средь! УЕНІ-3) инкубировали при (5) 37"С в 595 СО» в течение 16 часов.

Вначале добавляли ОМНПРОЛ либо неочищенньій зкстракт костного мозга (фракция ІМ). Затем к каждой группе добавляли тимидин, меченньй тритиєм ((ЗН-Таг), 3,7 КБеккереля в 5Омкл при 740 ГБеккерелях/ммоль) с последующим Зчас. инкубированием. Уровень пролиферации измеряли сбором клеток и 95 ингибирования (2) ввічисляли по формуле: їч- обингибирова ния - число импульсов в минуту без МНПРОЛ'а-число импульсов в минут с ИНПРОЛ ом м (100 гу число импульсов в минуту без ИНПРОЛ'а о

Включение тимидина, меченного тритием (ЗН-Таг), клетками БОСР тіх-А4, вьіращенньми в присутствий Ж определенного количества зкстракта нормального костного мозга либо ОМНПРОЛа, изображено на фиг.б. ю

Видно, что очищенньій состав ОМНПРОЛ, как минимум, в 1000 раз активнее исходного материала. Время зкспозиции (16 часов) является важньм фактором для зффективного ингибирования и демонстрирует наличие прямого воздействия ОМНПРОЛ а на стволовьне клетки линии клеток А4.

Пример 3. « дю Ингибирование пролиферации КОЕ-С ИНПРОЛ ом, введенньм іп мімо: дозьї и продолжительность действия -

Результатьь исследований действия ИНПРОЛа, введенного іп мімо. показали, что ИНПРОЛ может с зффективно блокировать рекрутинг КОЕ-С в цикле, тем самьмм защищая зти клетки от цитотоксического :з» действия дальнейшей обработки, и продемонстрировали его потенциальную пригодность для клинического применения.

Схемой проведения зксперимента преследовалось две цели: проверить действие ИНПРОЛ'а на КОЕ-С при сл 395 введений его іп мімо и определить продолжительность зффективного действия ИНПРОЛа в отношений циклирующих стволовьїх клеток. т» Для стимулирования пролиферации КОЕ-С применяли иньекции тестостеронпропионата, исходя из его действия, упомянутого в Примере 1. (95) -

Мьішам линии ВО в день 0 ввели тестостеронпропионат (1О0мг/100г); через 24 часа мьшшам каждой -і 20 зкспериментальной группь (по 4 мьіши в группе) единоразово ввели ОМНПРОЛ в дозах Омкг, 5мкг и 15мкг/мьІшШь вьінутрибрюшинно. іЧе) -

Через 24 часа после введения ИНПРОЛ'а мьішей забивали и с помощью теста, описанного в Примере 1, определяли процент циклирующих КОЕ-С. Введение тестостеронпропионата вьізьівало циклирование около 506 КОЕ-С, по сравнению с 795 у необработанньїх мьішей. ОМНПРОЛ в дозе, составлявшей всего 2мкг/мьїішь, ингибировал пролиферацию, вьізванную тестостеронпропионатом, до нормального уровня.

ГФ) Для определения продолжительности действия одной группе мьішей (21 мьішь в группе) вводили только

ГФ тестостеронпропионат, в то время как другой группе ввели как тестостеронпропионат, так и ОМНПРОЛ (через 24 часа после тестостеронпропионата). Циклирование КОЕ-С измеряли каждье 24 часа в течение недели посредством отбора З доноров из каждой группьі и определения стадий цикла КОЕ-С в их костном мозге с бо помощью описанного метода (см. Пример 1). Даннье, представленнье на фиг.7, показьівают, что, в то время, как продолжительность действия тестостеронпропионата составляет, как минимум, 7 дней, однократное введение ИНПРОЛ'а может вернуть КОЕ-С в состояние покоя и удерживать их от циклирования в течение не более 48 - 72 часов. Поскольку большинство химиотерапевтических препаратов, используемьх для химиотерапиий рака и лейкоза, имеет сравнительно короткий период полувьіведения іп мімо, составляющий, как бо правило, менее 24 часов, действие ИНПРОЛа, согласно полученньм данньім, продолжаеєется дольше, чем сохраняется активность іп мімо химиотерапевтических препаратов, например, цитозинарабинозида либо гидроксимочевинь. Что более важно, в случае химиотерапиий и радиотерапиий с более продолжительньми промежутками времени (более 24 часов и менее 96 часов) между первьім (не вьізьівающим повреждения СтволоВЬх клеток) и вторьм (вьізьівающим оповреждение КОЕ-С) введением препарата (облучением), однократное введение ИНПРОЛа в промежутке времени между двумя введениями химиотерапевтического препарата либо двумя сеансами облучения оказьівается достаточньім. Учитьївая продолжительность действия

ИНПРОЛ»Аа, такая же стратегия может применяться для нескольких повторньїх циклов цитотоксической терапий либо лучевой терапии. 70 Пример 4.

Большинство гемопозтических стволовьїх клеток, стимулированньїх для вступления в циклирование вскоре после введения 5-фторурацила (5-ФУ), оказьіваются задищенньми ИНПРОЛОомМ от повторного воздействия 5-ФУ.

Препарат 5-фторурацил (5-ФУ) резко сокращаєт число клеток в миелоидной и лимфоидной системах. 7/5 Препарат относят к числу циклоспецифических, воздействующих на бьістропролиферирующие клетки, поскольку результатом включения нуклеотидного аналога в ДНК в 5З-фазе клеточного цикла либо на более ранней стадии является гибель клетки. Единичная доза 5-ФУ не оказьівает воздействия на длительное вьживание и восстановление иммуногемопозтических функций костного мозга мьіши; бьіло показано, однако (Гаррисон (Нагтізоп) и др., Віосіа 78: 1237-1240, 1991), что плюрипотентнье гемопозтические стволовье клетки (РНЗС) становятся уязвимьми ко второй дозе 5-ФУ в течение непродолжительного промежутка времени около З - 5 дней после первоначальной дозьі. Зто может обьясняться тем, что РНЗС обьічно циклируют слишком медленно для того, чтобьї единичная доза 5-ФУ оказалась зффективной. Стимулом к ускорению циклирования оказьивается начальное введение 5-ФУ. Мьї предложили возвращать РН5ОС в стадию медленного циклирования с помощью ИНПРОЛ а и, тем самь/м, защищать их от повторного введения 5-ФУ. сч

В зтих зкспериментах использовали мьішей-самцов линии ВО. Маточньїй раствор 5-ФУ (бідта) готовили в физрастворе с концентрацией 1Омкг/мл. Каждой мьіши в день 0 зксперимента в хвостовую вену вводили 2мг і) 5-ФУЛОГг массь! тела; через 24 часа мьішам внутривенно вводили ОМНПРОЛ (1Омкг/100г массь! тела) и в день З зксперимента вводили вторую дозу 5-ФУ. Анализ вьіживаемости проводили посредством контролирования гибели мьішей в зкспериментальной (введениге ОМНПРОЛАа) и контрольной группах (по ЗО мьішей в каждой). (33

Зо Кривье вьіживаемости приведень на фиг.8.

Пример 5. -

Результать! преинкубирования клеток костного мозга с ИНПРОЛ ом и МІР-19, с

Цель данного зксперимента заключалась в сравнений ингибирующего действия преинкубирования с оОИНПРОЛОомМ и МІР-19, на клетки мьішиного костного мозга іп міго. З

Использовали следующую методику: іп мімо: мишам линии ВО (возраст 6 - 15 недель) вводили 20Омг/кг 5-ФУ внутрибрюшинно за 48 часов до сбора клеток костного мозга из бедра.

Іп міго: просчитьівали одиночньій субсидированньй клеточньй пул и 5 х 109 клеток инкубировали в общем обьеме 2мл с/без ОМНПРОЛа либо МІР-1у9 с 595 лошадиной сьіворотки, средами ІМОМ, дополненньіми «

Ї-глутамином, при 37"С и 595 СО» в течение 4 часов. Затем клетки дваждь! промьівали и пересчитьівали. Клетки

Ввісевали на метилцеллюлозу при следующих конечньїх условиях: ші с 0,890 метилцеллюлозь, ч 2595 лошадиной сьіворотки, » 2Онг/мл рекомбинантного мьішиного ИЛ-3 с добавлением І -глутамина 5 х 105 клеток на мл о среда ІМОМ їх Чашки инкубировали в течение 11 дней при 37"С и 595 СО» в условиях 10095 влажности. Подсчитьввали колонийи, состоящие более чем из 50 клеток. (95) 4» с о Пример 6.

ИНПРОЛ ингибирует пролиферацию колонигеобразующих клеток с вьісоким пролиферативньм потенциалов ко (НРР-СЕС)

Анализом іп міго для оценки восстановления мьішиньїх стволовьїх клеток и недифференцированньїх клеток бо является анализ колонигобразующей активности клеток с вьісоким пролиферативньм потенциалом; другие родственнье анализь, например КОЕД, КОЕ-ГМ, КОЕЗз и КОБЕ-ГЗММ, позволяют обнаружить популяции клеток-предшественников с прогрессирующей утратой способности к дифференцировке (М. Мур (М. Мооге),

Віоса 177: 2122-2128, 1991). Зтот пример показьівает, что предварительная обработка клеток ОИНПРОЛ'омМ ингибирует их пролиферацию, в то время как в случае с МІР-1ю в таких же зкспериментальньїх условиях 65 подобное не наблюдаеєтся.

Мьішей линии ВОЕ1, перед подсчетом количества НРР-СЕС в костном мозге, обрабатьвали 5-ФУ (200мг/кг внутрибрюшинно). Клетки промьівали центрифугированием и инкубировали в градиентах плотности 109 - 5 х 105/мл в среде без добавки фактора (контроль), с ОИНПРОЛоМм (25нг/мл) либо с МІР-19о, (20Онг/мл) в течениеє 4 часов. После инкубирования клетки промьмшвали и вьсевали на агар (0,395) с 3095 фетальной телячьей сьворотки и смешанной кондиционированной средой линий оклеток 5637 и МУУЕНІ-З3В (7,595 каждой кондиционированной средь, согласно рекомендациям Шарпа (ЗпПагр) и др., 1991). Концентрация посева на бОмм чашки составляла 5 х 10"клеток/мл. Подсчет колоний производили на 14 день, результать! представлень! ниже. ї

Судя опо озтим результатам, МІР-1 9 не иигибирует пролиферацию большинства незрельх клеток-предшественников, если присутствует лишь в течение преинкубационного периода. ОЙМНПРОЛ в подобньх же условиях зффективно ингибирует пролиферацию, что свидетельствует о фундаментальньх различиях между ОМНПРОЛ ом и МІР-19, с точки зрения биологической активности.

Пример 7.

Терапевтическое действие ИНПРОЛа при вьіздоровлений от аплазии костного мозга, вьізванной облучением

Основную опасность в процессе лучевой противораковой терапиий представляет аплазия костного мозга.

Бьіло показано, что некоторне стимуляторь! роста (например, О-С5Е, СМ-С5Е, зритропозтин) могут ускорять вьіздоровление от аплазии костного мозга, вьїізванной облучением. Концепция защить), основанная на с примененим ингибитора пролиферации стволовьх клеток, представляєт собой оотличающийся и о дополнительньй подход в борьбе с гематологическим нарушением. В соответствии с ранее разработанной методикой обработки (Примерь 3, 4) бьіла разработана модель летального облучения мьішей. В данной области известно, что мьіши, облученнье кобальтом-60 в дозе 9Гр, начинают погибать через 10 - 14 дней; к 30 дню гибель приближается к 5095. Зта летальная доза, использовавшаяся в нашей модели, бьла разделена на Ме) два последовательньх сеанса по 4,5Гр каждьй с З дневньмм промежутком между ними. Предварительнье їм- даннье показали, что кривая вьіживаемости в зтой модели почти совпадала с кривой для облучения дозой Гр; более того, анализ пролиферации КОЕ-С показал, что через 24 часа после первого облучения началась і) пролиферация 35 - 5095 зтих клеток. Такие клетки могут бьіть защищень ингибитором стволовьїх клеток, « введенньїм перед второй дозой облучения.

Зо Для проверки подобной возможности мьіши (50 мьішей/группу) в день 0 бьіли подвергнуть! облучению в дозе Щео, 4,5Гр. Через 24 часа одной группе ввели ОМНПРОЛ (2мкг/мьішь внутрибрюшинно), а второй, контрольной -физраствор. Вторую дозу облучения (4,5Гр) мьіши получили на З день.

На фиг.9 показано повьішение вьїживаемости после разовой дозьії ОМНПРОЛа. Условия модели клинически « приемлемь для лечения любьх видов раковьх заболеваний, включая характеризующиеся твердьми опухолями; подобному лечению может подвергнуться любой раковьій больной. Оно заключаєтся во введений в) с зффективной дозь ИНПРОЛа между двумя последовательньми сеансами облучения, что обеспечиваєт "» возможность применения повьішенньїх доз при лечении рака. Подобную схему можно распространить на " химиотерапевтические препарати.

Пример 8.

Применение ИНПРОЛа при пересадке аутологического костного мозга о Пересадка костного мозга является единственньм способом лечения нескольких видов лейкозов їх (хронический миелолейкоз, острьій миелобластньй лейкоз и другие). Подготовка ех мімо аутологического костного мозга для пересадки могла бьі обеспечить потенциальнье аутологические источники нормальньмх і стволовьіх клеток, свободньїх от лейкозной контаминации и способньїх повторно заселить гематопозтическую -1 20 систему реципиента для проведения инвазивньїх и зффективньїх методов лечения. 1. Модель лейкоза на долгоживущей культуре клеток костного мозга 1210 для изучения действия с ИНПРОЛа по сохранению нормального гомопозза в процессе десенсибилизации с помощью АгасС

Долгоживущие культурь! клеток костного мозга (І ТВМС) готовили по методике Токсоза (ТокКзго2) и др. (Віосі 55: 931-936, 1980). Линию лейкозньїх клеток І 1210 адаптировали на ЇТВМС сокультивированием в течение 2 29 недель. В комбинированньїх культурах І ТВМС/ 1210 происходил одновременньй рост нормальньх и лейкозньйх

Ге) клеток-предшественников, что подобно ситуации в костном мозге лейкозного больного. Распознавание нормальньїх колониеобразующих единиц (КОЕ) и лейкозньх КОЕ бьло возможньм опосредством их о вьращивания в виде колоний на агаре в присутствии либо отсутствий кондиционированной средьі из УУЕНІ-З3 (мьішиная линия клеток, продуцирующих ИЛ-3). У нормальньїх клеток наблюдается апоптоз при отсутствий 60 МЛ-3, в то время как лейкознье клетки могут образовьшвать колонии при его отсутствиий. Суспендированнье клетки из смеси І ТВМС-11210 образуют, приблизительно, 150 колоний в присутствий ИЛ-3 (нормальнье гемопозтические клонь) и 70 колоний при вьіращиваниий без ИЛ-3 (лейкознье клоньі) на 50.000 вьісеянньйх клеток.

Применяли следующую методику десенсибилизации: в день 0 все суспендированнье клетки и средь бо (1Омл/матрас) вьливали из матрасов с ІТВМСОС-І1210 и заменяли 2мл сред, содержащих 200мкг цитозинарабинозида (АгаС) (Цирлова (Тзугпома) и др. в ІешкКетіа: Адмапсез іп Віоїсду апа ТПпегару, т. 35,

1988); после 20ч инкубирования матрась! промьівали и заливали 2мл чистьїх свежих сред (контрольная группа) либо средами, содержащими оИНПРОЛ (25нг/мл) на 4 часа. После зтого преинкубирования клетки инкубировали вновь в течение З часов при 37"С со 100мкг АгасС на матрас. Каждая группа включала 4 матраса.

Культурь І ТВМС-1Ї 1210 промьівали З раза и заменяли свежими средами І ТВС; они поддерживались как ранее в течение 3 - 4 недель для исследования восстановления функций.

Даннье представлень на фиг.10. В контрольньїх культурах, обработанньїх только АгаС, роста клеток не наблюдалось, в то время как в матрасах, задищенньх ИНПРОЛ ом, восстановление гемопозза проийсходило гораздо бьістрее благодаря пролиферации клеток-предшественников из адгезивного слоя. Более того, клетки 70 зкспериментальной группьї, будучи вьісеянньїми в агар, росли только в присутствий ИЛ-3, давая около 100 КОЕ на 50.000 клеток; рост лейкозньїх клеток не наблюдался, как минимум, в течение 4 недель. Таким образом, клетки костного мозга, обработаннье ех мімо зффективной дозой АгасС в сочетаний с ИННПРОЛ ом, могут бьть избавлень от раковьїх клеток с одновременной защитой стволовьїх клеток. Подобная схема может бьть распространена на другие видь!ї химио- либо лучевой терапии. 2. Репопуляционньій потенциал клеток костного мозга (МКА) и тридцатидневная радиозащита усиливаются при обработке ИНПРОЛ ом іп мйго

МА, способность клеток повторно заселять костньій мозг летально облученньїх мьішей, наряду со способностью обеспечивать радиозащиту в течение 30 дней, представляет собой непосредственное измерение іп мімо потенциала спасения миелосупрессированньїх животньх (Виссер (Міззег) и др., Віосіа СеїЇв 14: 369-384, 1988).

Для исследований по радиозащите мьішей линимй ВОЕ). облучали дозой 9,5Гр с последующей пересадкой костного мозга от тестостеронстимулированньїх доноров. Одной группе реципиентов пересаживали клетки костного мозга, преинкубированнье в течение 4 часов с питательной средой (контрольная группа А), а другой (группе В) - с 25нг/імл ОМНПРОЛАа. Клетки от обеихО групп промьівали и облученньм животньім пересаживали сч ов из расчета 30.000 клеток/мьішь. Данньюе по вьїживаемости представлень! на фиг.11, где показан суммарньй результат З зкспериментов в контролем, нормализованньм до 10095. Вьживаемость, при условийи і) инкубирования с ОМИНПРОЛ ом, возрастала в контрольной группе с 36,595 до 61,895 к 30 дню.

Повьшение МЕКА, индуцированное преийнкубацией с ИНПРОЛоОмМ, может бьть одним из механизмов улучшения радиозащить. Для проверки зтой гипотезьі МКА определяли по методике Виссера и др. б зо (цитированное сочинение). Вкратце, мьшей-доноров линии ВОБ. предварительно обрабатьівали тестостероном, их костньій мозг преинкубировали с питательной средой либо ОМНПРОЛ ом в течение 4 часов и - вводили облученньім животньім. На 1 - З день клетки костного мозга бедренной кости животньх-реципиентов (є внісевали на агаре З различньми концентрациями (0,01, 0,05, 0,1 зквивалента бедренной кости) в присутствий 2095 лошадиной сьіворотки и 1095 кондиционированной средь УХЕНІ. Число колоний на 7 день отображало МКА, « з5 поскольку КОЕ в костном мозге реципиентов на тот момент являлись клетками-предшественниками незримьїсх ю стволовьїх клеток донора.

Как показано на фиг.12, МКА популяции клеток, преинкубированньїх с ИНПРОЛ ом, вьіше, чем в контрольной группе (В).

Пример 9. «

Антигиперпролиферативное действие ИНПРОЛа на стволовье клетки может изменять аномалиий их з с дифференцировки

Гиперпролиферация КОЕ-С наблюдаєтся не только в процессе восстановления после воздействия ;» цитотоксических препаратов либо облучения, но и как следствие естественного старения, и зто, как полагают, является основной характерной особенностью миелодиспластического синдрома (МОБ). Он сопровождается расстройством дифференцировки, например, преобладанием зритроидной дифференцировки при сокращений с ее по гранулоцитарному пути.

Клетки костного мозга инкубировали в течение 4 часов при 377"С с 25нг/імл ОМИНПРОЛа либо питательной ве средь! (контроль), промьівали и вьісевали на агаре с 2095 лошадиной сьіворотки, 2ЕД/мл зритропозтина и 1090 2) кондиционированной средьї МЕНІ. Количество колоний БОЕз и ОМ-СРО подсчитьшвали на 7 день. Данньє, представленньсе в таблице 4, являются суммарньїм результатом З зкспериментов - из каждой группьі отбирали ш- по 4 животньїх на точку: засевали 4 чашки.

Ге) Как следует из таблицьі 4, инкубирование нормальньїх клеток костного мозга (МВМ) интактньїх молодьх животньх (линия ВОЕ., возраст 8 - 12 недель) с ИНПРОЛом не изменяло ни количества, ни пропорции колоний различньїх типов. У доноров линий ВОР.;, предварительно обработанньїх тестостеронпропионатом (ТР), наблюдалось такое же увеличение пролиферации КОЕ-С, что и ранее (примерь! 1, 3, 4), небольшое увеличение числа зритроидньїх клеток-предшественников (колоний БОЕ»з) и снижение ОМ-СРИ, которое полностью

Ф) нейтрализовалось инкубированием с ИНПРОЛом. Наряду с зтим, аномально вьісокий уровень пролиферации ка КОБЕ-С возвращался к 1095 КОЕ-С в З-фазе клеточного цикла. Известно, что Гиперпролиферация КОЕ-С является отличительной особенностью некоторьїх линий мьішей, восприимчивьїх к индукции вирусного лейкоза, бо например, мьішей линии Ваїр/С (таблица 4), и может наблюдаться также у животньїх более старшего возраста (таблица 4). Подобное перераспределение коммитированньїх клеток-предшественников, наблюдаемое у мьішей линии ВОЕ), обработанньїх ТОР, отмечается у мьішей линии ВаЇр/С и у мьішей старшего возраста (23 - 25 месяцев) линимй ВОЕ 54, общим для которьїх является аномально вьісокий уровень пролиферации КОЕ-С.

Коррекция как пролиферации КОЕ-С, так и дифференцировки, индуцировалась инкубированием с ИНПРОЛ ом. 65 Еще более ценньім в клиническом отношений является то, что результатьі исследования показали, что иньекция ИНПРОЛАа іп мімо (2мкг/мьішь) оказьвала воздействие как на пролиферацию КОЕ-С, так и на соотношение колоний БОЕ»з и КОЕ-ГМ (таблица 4). лев 00001001 п2оя09 овлот то елегія ливо 00103 аиеля 00 зтвитня овояв, то

Линиявогр миють 20000000 832116 0 зоетоля пвлі?ав

Линявавс 01000000 Блоєт9 00 атяокоов зав зав лю 1711озокоя / |мевкова товонлов

Пример 10.

Иммуностимулирующее действие ИНПРОЛ'а

Наблюдали, что инкубирование костномозговьїх клеток, содержащих вьісокую долю КОЕ-С, с ИНПРОЛоОмМ не только изменяет циклирование КОЕ-С, но и их дифференцировку, переключая преимущественно зритроидную дифференцировку в пользу гранулоцитарньх и лимфоидньх клеток-предшественников. то свойство

ИНПРОЛа представляєтся важньм вследствие иммуносупрессорньїх побочньїх действий цитотоксической химио- либо радиотерапии, а такхе иммуносупрессии, сопровождающей гиперпролиферативнье расстройства стволовьїх клеток и старение.

В примере показано прямое воздействие ИНПРОЛа на дифференцировку /незрельх с клеток-предшественников из долгоживущей лимфоидной культурьі (ГТС), полученной по методу Уитлока о (МУЇШОсСК) и Уйитта (МУЩе) (Апп. Кем. Іттип. 3: 2133-35, 1985), в В-клетки-предшественники, измеряемое образованием колоний в метилцеллюлозе, содержащей ИЛ-7.

ЇЇ/ТС бьла получена, как указано ранее: замена питательной средьі для ГТС (компания Тегту Рох і аб,

Ванкувер, Канада) производилась дваждьй в неделю. Неприлипающие клетки собирали раз в неделю, Ф) промьівали от факторов и инкубировали в течение 4 часов с 25нг/імл ОМНПРОЛа либо только с питательной їм средой для контроля. После инкубирования клетки промьівали и вьісевали в концентрации 10 "клеток/мл на метилцеллюлозу, содержащую 3096 ЕС5 и ТОнг/мл ИЛ-7. На фиг.13 представленьії даннье, полученньюе в Ше течение З недель. Количество больших пре-В-колоний в контроле колебалось, возрастая со временем. Но « преинкубирование с ИНПРОЛоОом всегда стимулировало рост колоний в 4 - 8 раз больше контрольного уровня. Зто демонстрирует иммуностимулирующие свойства ИНПРОЛ'а, которьй оказьшваєтся пригодньм для юю корректирования иммунодефицитньїх состояний и усиления необходимьїх иммунньїх реакций, например, на вакцинацию.

Пример 11. «

ИНПРОЛ повьішает репопуляционньій потенциал стволовьїх клеток - клеток, инициирующих долгоживущую культуру (ІТС-ІС), от больньїх хроническим миелолейкозом но) с Хронический миелолейкоз (СМІ) - летальное раковое заболеваниє гемопозтических стволовьїх клеток. з» Лечение СМІ в хронической стадиий химиотерапевтическими препаратами, применение комбинированной химиотерапии, сплензктомия либо облучение селезенки, могут привести к исчезновению клинических признаков и симптомов заболевания, однако вьіживание существенно не продлевают. По мере развития СМІ и перехода из хронической стадии в стадию ускоренного развития, стандартная терапия становится незффективной. В і-й настоящее время пересадка костного мозга (ВМТ) является единственньім известньім способом лечения СМІ. їз Лечение посредством вм несовместимого донора затруднительно вследствие проблем гистонесовместимости. Менее 4095 пациентов с хроническим миелолейкозом можно подобрать совместимьсх о доноров, позтому предпочтение отдается аутологической трансплантации. Возможность подготовки -і 20 аутологического костного мозга ех мімо для последующей пересадки, а также умение вьібора нелейкозньх (Рі-отрицательньхх) миелоидньїх клеток-предшественников у Ри-положительньїх пациентов, вьіраженньїх в виде со долгоживущей культурь (ГТС), обеспечили бьі получение потенциальньїх источников нормальньх аутологических стволовьїх клеток для проведения зффективного и инвазивного лечения СМІ.

В контексте ВМТ, гемопозтическая стволовая клетка может определяться, как клетка, обладающая 22 способностью продуцировать зрельше клетки крови в течение продолжительньх периодов времени. Мь

ГФ) использовали долгоживущую культуру клеток человека, полученную К. Ивзом и А. Ивзом, как для определения количества стволовьїх клеток, так и в терапевтических целях. Клетки вьісеваются на предварительно о подготовленньій адгезивньій слой облученньїх костномозговьїх клеток человека; зти культурь! поддерживаются затем в течение 5 недель. Завершающим зтапом является полньій сбор культур клоногенньїх клеток (как 60 прилипающих, так и неприлипающих) в конце указанного периода времени. В подобньїх условиях наблюдаєтся линейная зависимость вьхода клоногенньїх клеток от первоначально введенного количества клеток-предшественников (клеток, инициирующих долгоживущую культуру (ІТС-ІС)); средний вьїход от отдельньїх человеческих І ТС-ІС составляет 4 клоногеннье клетки-предшественника на І ТС-ІС. Ранее бьло показано, что в случаеє попадания костного мозга пациента с СМі в подобнье условия, лейкознье бо (Рі-положительнье) клоногеннье клетки бьстро гибнут. Посредством количественного определения остаточньїх нормальньїх І ТС-ІС у пациентов с СМІ, появляется возможность вьібора тех из них, которьІм принесет пользу интенсивная терапия в сочетаниий с пересадкой культивированньїх аутотрансплантатов (Филипс (РПірз) и др., Вопе Маїгтом/ Тгапзріапіайоп 8: 477-487 1991).

Для изучения воздействия ИНПРОЛ а на количество клоногенньх клеток (І ТС-ІС) среди трансплантируемьх костномозговьіх клеток, полученньїх из периферической крови пациента с СМІ, использовали следующую методику.

Для вьіращивания долгоживущих культур использовали предварительно облученную строму. В качестве контроля использовали периферическую кровь здорового донора. Клетки периферической крови пациента с у/0 ЄМ преинкубировали с/без ОМНПРОЛ а (25нг/мл) в течение 4 часов, промьівали и помещали в систему І ТС-ІС на 5 недель для определения контрольного количества І ТС-ІС. В зкспериментальньїх целях в течение 10 дней вьіращивали другие, параллельньюе, культурь. Смесь адгезивньх и неадгезивньх оклеток из культур, вьращивавшихся в течение 10 дней, преинкубировали с/оез ОМНПРОЛа и помещали на предварительно подготовленнье фидерь! на 8 последующих недель. Количество І ТС-ІС в каждой зкспериментальной культуре /5 определялось вьісевом как адгезивньх, так и неадгезивньїх клеток на метилцеллюлозу с соответствующими стимуляторами роста (компания Тегпу Рох Іарогаїгіех, Ванкувер, Канада) и подсчетом получаемого в результате общего числа колонигобразующих клеток. Количество І ТС-ІС, получаемоеє с помощью данной методики, определяли, исходя из общего содержания клоногенньїх клеток (СЕС), по формуле:

Количество І ТС-ІС Количество СЕС/А

Данньсе, представленнье на фиг.14, показьівают, что в течение первьїх 10 дней культивирования клеток костного мозга здорового донора потерь І ТОС-ІС не наблюдалось, по истеченимй 5 недель в культуре по-прежнему сохранялось около 3095 начального количества І ТС-ІС. Количество І ТС-ІС пациента с СМІ. редко снижалось (приблизительно, до 895) в течение 10-дневного периода времени и при последующем инкубированиий не восстанавливалось, в то время как: в результате прейнкубирования клеток с ИНПРОЛом, сч ов уровень ІТС-ІС возрастал до 3095 от начального и сохранялся в течение 8 недель.

Клинически приемлемьм применением ИНПРОЛа, прогнозируемьм на оснований упомянутьх і) предварительньїх данньїх, является его использование в технологиях избирательного повьішения содержания нормальньїх стволовьїх клеток в свежих либо культивируемьїх трансплантатах костного мозга, технологиях интенсификации рекрутмента остаточньїх нормальньх стволовьїх клеток іп мімо, а таюке в схемах переноса ду зр нового генетического материала в костномозговне клетки человека для последующей пересадки пациентам.

Пример 12А. -

Способ вьіделения иммуноактивного ингибитора пролиферации стволовьїх клеток из препаратов костного (су мозга

Костньй мозг вьіделяли из свиньїх ребер. Ребра отделяли от свиньїх туш, удаляли мьішечньсе волокна и жир, - зв нарезали на куски и зкстрагировали костНньІій мозг с помощью гидравлического пресса (компания Віорпугргірог). ю

Клетки костного мозга определяли центрифугированием в центрифуге К-70 при 2.000об/мин в течение 20 минут.

В последующем надосадочная жидкость зкстрактов подвергалась последовательной ультрафильтрации на мембранньїх фильтрах ХМ-100, РМ-30 РМ-50 (компания Атісоп, США). По результатам злектрофореза, основньїм компонентом конечного продукта является альбумин, (см. фиг.1). «

Биохимическая очистка в с Костномозговой зкстракт и белковьіе компонентьі фракций анализировались на каждом зтапе очистки с помощью гель-злектрофореза (1096 полиакриламида т 0,195 додецилсульфата натрия). В образцьї добавляли ;» до 795 додецилсульфата натрия и до 0,5 - 195 меркаптозтанола с последующим инкубированием в течение 5 минут при 70"7С перед нанесением на гель.

Злектрофорез проводили на 20см пластинке геля в течение 5 часов. После зтого гель окрашивали кумасси «сл ярким синим СВВС250 (0,2590-ньім раствором в смеси зтанол : вода : уксусная кислота 5: 5: 1, 1 час при 2072) и несколько раз промьівали 7905 уксусной кислотой. Активность продукта оценивали методом ингибировария ве пролиферации гемопозтических стволовьїх клеток (КОЕ-С). Подробное описание метода приведено ниже. 2) Зтап 1. Очистка преципитацией сульфатом аммония

Активньій продукт очищали осаждением сульфата аммония при 2595 с 40 - 8095 насьщением, ш- подбиравшимся исходя из результатов, представленньх в таблице 5 3е) зв

ГФ) Количество препарата, использованное для проверки после каждого зтапа очистки, определялось в

Ге соответствии со степенью очистки й зквивалентном дозьі 2 х 107мг исходного продукта. Активньй продукт определяли по формуле: во убвизменения - 9о5а - 9655 где: Уоза - 965 в контроле доз - 965 после инкубирования с тест-фракцией.

Фракция обессоливалась для 20-кратного снижения концентрации сульфата аммония перед каждой проверкой активности. И перед каждьім последующим зтапом очистки. в5 Зтап 2. МИспользовали неочищенньй ингибитор зтапа 1 после обессоливания и фракционирования посредством ионообменной хроматографии (целлюлоза ОЕАЕ 23) с последующим злюированием градиентом натрий-ацетатного буфера (рН 6,0)

Активнье фракции ингибитора злюируются между З - 5ММ.

Обьем колонки - мл, скорость злюирования - 4мл/ч. Детектирование проводили хромагографом МіПісготе при 230 и 280нм. Вьіделяли фракцию 1 (см. фиг.2), демонстрировавшую максимальную активность, и злюировали в 5мММ натрий-ацетатном буфере (см. таблицу 6). я

Злектрофоретические даннье свидетельствуют о удалениий из зтой фракции основного белкового контамината - альбумина (см. фиг.3), что ведет к дополнительной четьірехкратной очистке.

Зтап 3. Частично очищенньй ингибитор зтапа 2 вносится непосредственно в колонку Зерпадех с-75.

Обьем колонки 20мл (20 х 1), скорость злюирования - 2мл/ч. Буфер для злюирования - 5Х0ММ Масі, 10мм т трис-НСІЇ, рН 7,5. Детектирование проводили на хроматографе Мійййспготе при 230 и 28Онм. Бьіла вьіделена фракция 5, обладавшая найвьісшей активностью.

Зтап 4. Хроматографию с обращенной фазой (система жидкостной хроматографии бьістрого разрешения,

РІПаптасіа) на колонках Рго-КЕС проводили на матрице ШНгазіега. Белок злюировали с помощью 0,190 трифторуксусной кислоть! в градиенте ацетонитрила. с

Анализ акриламид/натрий-додецилсульфатного геля показал, что гомогенность продукта с молекулярной о массой 16 - 17кКДальтон составляла 90905 (см. фиг.б). Результат представлен на фиг.4. Активность определяли по фракции 5. Конечньїй вьіїход продукта составил 595. В результате, общее количество белка с молекулярной массой 1бкДальтон после очистки составило б5Онг/мл исходного продукта. В процессе очистки продукт подвергался инкубированию при температуре 702С в течениє нескольких минут, однако зто не привело кпотере 9 биологической активности. їч-

Пример 128.

Альтернативньйй метод вьіделения повьішенньїх количеств ИНПРОЛ'а о

Начальное вьіделение «

Ребра свежих свиньїх туш очищали от мьшечного волокна и жира, нарезали на куски и заливали в

Зо забуференном фосфатом физрастворе в соотношений 1 : 1 (в отношений веса к обьєму). Полученную смесь Щео, дробили с помощью гидравлического пресса для отделения костного мозга от твердого костного материала.

Суспензию костномозговьіїх клеток собирали и отфильтровьівали от твердьїх частиц на сложенной вчетверо серпянке. Фильтрат инкубировали при 56"С в течение 40 минут, затем охлаждали до 4"С на ледяной бане. «

Образовавшийся осадок удаляли цетрифугированием при 10.000об/мин в течение ЗО минут при 4С и виібрасьівали. о) с Осветленньїйй супернатант прикальівали в течение ЗОмин к 10 обьеемам перемешиваемого ледяного ацетона, "» содержавшего 1(06.)96 концентрированной соляной кислотьі. Образовавшуюся смесь вьідерживали при 4"С в " течение 16 часов для полного осаждения. Осадок отделяли центрифугированием при 20.000об/мин в течение

ЗОмин при 4"С. В последующем осадок промьівали ледяньі/м ацетоном и вьісушивали.

Очистка посредством вьісокозффективной жидкостной хроматографиийи 1 Осадок растворяли в буфере А для злюирования, содержащем 595 ацетонитрила (МесмМм) и 0,195 їх трифторуксусной кислоть! (ТРА), до конечной концентрации белка 8 - 1Омг/мл. Зтот раствор (0,5 - О,бмл) вносили в колонку 250 х 4,б6мм, заполненную Роїїзвії 005-300 (1Омкм) и уравновешивали тем же буфером А. і Злюирование осуществляли градиентом буфера В (90956 Месм, 0,195 ТРА) в буфере А при расходе 1Імм/мин -|0720. по следующей программе: (Че) Время, мин 95 В о о

А о 5 25 о 25 90 іме) Дополнительньій зтап - 10095 В в течение 5мин используется для промьівки колонки перед повторньім уравновешиванием. После зтого колонка вновь уравновешивается для возврата в исходное состояние и может бо вноситься следующая порция белкового раствора. Типичная хроматограмма представлена на фиг.5.

В процессе разделения вьітекающий поток контролируется при 280нм для обнаружения белковьх пиков.

Фракции, содержащие белковьій материал, собирали, отдельнье пики смешивали и вьісушивали на роторном испарителе при 307"С. Полученнье остаточнье количества материала растворяли в дистиллированной воде, тестировали на биологическую активность и подвергали злектрофорезу в полиакриламидном геле в 65 присутствий додецилсульфата натрия (ДСН-ПАГОЗ) (505-Раде) (1490 гель, условия восстановления). Пик, содержащий активньй материал, злюировали между 70 и 8095 буфера А. Он содержал полосу белка массой

16кД и следьї биістрее перемещающихся белков, судя по результатам ДСН-ПАГЗ.

Анализ материала, полученного сбором только второго основного хроматографического пика, представлен на фигуре 15 (А и С). Материал, включающий оба пика (например, фиг.5), в данном описаний будет назьіваться препаратом ОМИНПРОЛа 1. Материал, включающий только второй пик, будет назьваться препаратом

ОоИНПРОЛа 2. 50Омкг активного продукта, очищенного препаратом ОМНПРОЛа 2, вносили в колонку С4 с обращенной фазой (Мудас) и злюировали с помощью линейного градиента 59,595 ацетонитрила в 0,195 трифторуксусной кислотьі. Материал злюировали в виде розового пика при 5395 ацетонитрила (фиг.15А) при прогоне 250мкг МІР-19у, (зкспериментальная система), однако, при идентичньїх условиях, он злюировался при 7/0 43,995 ацетонитрила (фиг.158 - обратите внимание на то, что более ранние пики, предшествующие 1490 ацетонитрила, являются артефактами и обусловленьі наличием воздушньїх пузьірьков в детекторе). Таким образом, гидрофобность естественного ИНПРОЛІа в зтих условиях гораздо вьіше, чем гидрофобность МІР-1 о.

Известно, что ТОЕрД злюируется при более низких концентрациях, чем наблюдаємье в случаге ОИНПРОЛАа в зтих условиях (Миазоно (Міуагопо) и др., у. Віо!: Спет. 263: 6407915, 1988).

Гель злюированого ОМНПРОЛ'а представлен на фиг.15С. Полоса 1 - неочищенньій материал, полоса 2 - маркерьї молекулярной массьі, полоса З - очищенньій материал. Существует две основнье полось! - одна, приблизительно, 14килоДальтон и вторая, приблизительно, ЗБбБкилоДальтон. Полагают, что полоса

ЗБбБкилоДальтон является полимерной формой полосьї 14килоДальтон.

Пример 13ЗА.

Активнье препаратьї ИНПРОЛа содержат о-цепь гемоглобина

ОИНПРОЛ готовили, как показано на фиг.5 (те. препарат ОИНПРОЛа 1 (см. Пример 128)). Материал прогоняли на ДСН-ПАГЗ и переносили на нитроцеллюлозу с помощью стандартньхх приемов. Материал подвергали М-терминальному секвенированию с помощью белкового секвенатора АВІ 477А, снабженного анализатором 120 Опііпе РТН-АА, используя стандартнье методьі Получили следующую М-терминальную Ге последовательность: (5)

ВалГисЛейСерАлаГлуГлуЛизГлуАлаВалЛейГлиЛей ТриглиЛизВалАснВалАспГлувВал...

Компьютерньй поиск в базе данньх белков показал, что подобная последовательность идентична

М-терминальной последовательности р-цепи гемоглобина свиней (см. фиг.16С).

Пример 138. (є)

Активнье препаратьї ИНПРОЛа содержат о-цепь гемоглобина їч-

Как показано на фиг.15С, белок, очищенньій сбором второго основного пика, изображенного на фиг.5 (т.е. препарат ОМНПРОЛ Іа 2), дал две основнье полосьії, соответствующие молекулярньім массам, приблизительно, і) 15кД и ЗОкД, а также несколько второстепенньїх полос. Гели ДСН-ПАГЗ бьіли перенесеньї на нитроцеллюлозу с « помощью стандартньїх методов, отдельнье полось бьіли вьрезаньй и подвергнутьї М-терминальному

Зо секвенированию, как в примере 13А. Для полосьї 155Д бьла получена следующая М-тсрминальная Щео, последовательность:

ВалЛейСерАлаАлаАспЛизАлаАснВалЛизАлаАлатТриГлиЛизВалГлигГлиглн...

Полосу ЗОкД оподвергали ограниченному протеолизу и получили следующую внутреннюю « последовательность: "«ФенПроГисФенАснЛейСерГисГлиСерАснГлнВаллиз... о) с Первая последовательность идентична М-терминальной последовательности о-цепи гемоглобина свиней, в з» то время как вторая последовательность идентична остаткам 43 - 56 у-цепи гемоглобина свиней (см. фиг.16С для сравнения последовательности 0- и рД-цепей гемоглобина человека, мьшей и свиней). Повторное секвенирование зтих ополос, также как и о некоторьїх второстепенньїх, постоянно давало участки 75 последовательности о-цепи гемоглобина. Таким образом, различнье полось, наблюдаемье на фиг.15С, і-й представляют собой либо фрагменть, либо совокупности у-цепи гемоглобина свиней. т. Пример 13С. Дальнейшая характеризация ИНПРОЛа свиней сю С целью дальнейшего сравнения ОМНПРОЛІа с гемоглобином свиней от компаний "Зідта Спетіса! Сотрапу" 5р Гопучили дваждь кристаллизованньй гемоглобин свиней, которьій подвергли вьісокозффективному -і жидкостному хроматографированию с обращенной фазой, как описано в примере 128 для фигурь! 15. Как с показано на фиг.17, хроматограмма интактного гемоглобина подобна хроматограмме препарата ОМНПРОЛ 1.

Далее, при прямом сравненийий, препарат ОМНПРОЛ 2, изображенньй на фиг.17А (т.е. полученньій со второго пика фиг.5), перекрьівается с препаратом двух вторьїх пиков свиного гемоглобина (фиг.178), при времени 5 удерживания 52,51 и 52,25мин для основньїх пиков соответственно. Следует заметить, что гем перемещается совместно с первьім основньім пиком гемоглобина, в зтом случае с временем удерживания 49,153мин; гем, (Ф) таким образом, является компонентом препарата ОМНПРОЛ 1, но не входит в состав препарата 2. Зто

Ге подтверждается отсутствием поглощения зтого препарата ОМНПРОЛ при 575нм - проверка наличия гема по длине волнь. во Предсказаннье молекулярньсе массь с- и дД-цепей свиного гемоглобина составляют 15038 Дальтон и 16034

Дальтон, соответственно. Как видно на хроматограмме ДСН-ПАГЗ на фиг.18, первне два пика состоят из цепи большей молекулярной массь, а два вторьїх - из цепи меньшей молекулярной массьі. Таким образом, первье два пика представляют р-цепь гемоглобина, вторне два - о-цепь гемоглобина.

Провели дополнительное разделение свиного гемоглобина, используя пологий градиент злюийрования вБ о (фиг.21). М-терминальньсе анализь зтих пиков показали, что первьйй из них является о-цепью, а второй рД-цепью свиного гемоглобина. Результатьь биопробь! подтвердили биологическую активность обеих вьіделенньх гемоглобиновьїх цепей (например, примерьі 14 и 15).

С целью дальнейшего сравнения препарата ОМНПРОЛ 2 и р-цепи гемоглобина бьл проведан двумерньй злектрофорез (фиг.19). В качестве первого разделения, изозлектрофокусирование проводили в стеклянньх трубках, используя 2795 амфолинь (диапазон рН 4 - 8), в течение 9600 В4. В качестве внутреннего стандарта использовали тропомиозин (молекулярная масса ЗЗКД, рН 5,2); его положение на пластинке показано стрелкой.

Гем уравновешиваєтся в буфере и наслаийвается на концентрирующий гель, находящийся на 12,590 полиакриламидном гелевом блоке. ДСН-ПАГЗ проводится в течение 4 часов при 12,5мА/гель. Гели окрашивали серебром и сушили. 70 При сравнений злектрофоретических профилей бьли обнаружень всего одно или два незначительньх пятна, различающихся между р-цепью гемоглобина, очищенного вьісокозффективньм /жидкостнь!м хроматографированием, и препаратом ОМНПРОЛ 2. Результатьь анализов методом Вестерна (УУевіегп) с использованием антисвиньїх гемоглобиновьіїх антител и одно- либо двумерною злектрофореза, подтвердили присутствие р-гемоглобина в препарате. Таким образом, активньій препарат ОМНПРОЛ 2, приготовленньй в 75 соответствий с примером 128, представляеєт собой, по сути, Д-цепь свиного гемоглобина.

Пример 14. о-цепь гемоглобина, р-цепь гемоглобина либо интактньй гемоглобин демонстрируют ингибирующую активность в отношений стволовьіх клеток

Для подтверждения того, что Др-цепь гемоглобина обладает активностью ИНПРОЛАа, поставили реакцию "самоубийства" с использованиєм костного мозга мьшей, обработанного тестостероном, по методологии, описанной в примере 1 с использованием материала, очищенного, как в примере 128. Как показано в таблице 8, у нормальньх мьішей бьло забито 1595 костномозговьїх клеток, в противоположность 3695 у животньмх, обработанньїх тестостероном. Как и ожидалось, зто показало, что обработка тестостероном увеличивала процент клеток в цикле (делая их тем самьм более уязвимьмми к забою - например, пример 1). В резком с противоречии с отим, клетки от животньх, обработанньх тестостероном, инкубировавшиеся либо с о

ОоИНПРОЛоОМм, либо с очищенной рД-цепью гемоглобина в дозе 40нг/мл, продемонстрировали резкое снижение процента клеток в цикле с 3695 до 095 и 795, соответственно. Более вьісокая доза 200нг бьіила менее зффективна для обоих белков. В качестве положительного контроля, ране охарактеризованньйй ингибитор стволовьх клеток

МІР-15; снижал циклирование до 13965. Ме.

Подобная же реакция может бьїть поставлена іп міо, используя состояние циклирования КОЕ-МІХ вместо -

КОЕ-5. Реакция может бьїть поставлена в соответствии с приведенньім вьіше описанием для реакции с КОЕ-С, за исключением того, что в качестве циклоспецифического токсического препарата вместо вьІсокой дозь о тимидина, меченого тритием, используют цитозинарабинозид (АгасС, ЗОмг/мл) (см. Б.И. Лорд в Наетороієевіз-А -«ф

Ргасіїса! Арргоасі, Н.Г. Теста (М.О. Тевіа) и Г. Мулино (0. Моїіпеаих) (Редакторьї)), ІКІ Ргезв, 1993; Прагнелл 39 и др. в Сийиге ої Нетаїйороїієеїйс СеїЇ5, Р.М. Фрешни (К.І. Егезппеу), И.Б. Прагнелл и М.Дж. Фрешни о (Редакторь), УМіеу І езз 1994) и вместо мьішей линии ВОРЕ;, обработанньїх тестостероном, используют линию мьішей с вьісокими зндогенньіми скоростями циклирования (Ва!/!р/С). Как показано в таблице 9, в зтой реакции активна как свиная р-цепь вьісокой степени очистки, так и свиная о-цепь вьісокой степени очистки. Следуєт «Щ заметить, что в зтой реакции уровни циклирования клеток, обработанньїх ОМНПРОЛоОмМ, иногда имели З7З 70 отрицательнье показатели, свидетельствующие о том, что пул, обработанньій АгаС, имел даже больше с колоний, чем пул, не подвергавшийся обработке. "з Как описано в примере 2, ОМИНПРОЛ ингибирует пролиферацию линии мьішиньх стволовьіїх клеток РОСР-МІХ в реакции включения тимидина, меченого тритием. На фиг.20 показано, что в зтой реакции активнь! как со-, так и Д-цепи очищенного гемоглобина, причем ингибирование наблюдается при « 2нг/мл. сл що Дальнейшее свидетельствует о том, что Д-цепь свиного гемоглобина демонстрирует активность ИНПРОЛа.

Другие даннье (например, таблица 9, фиг.20) показьвают, что вьіделенная о-цепь, также как и интактньй ве гемоглобин, проявляют активность в качестве ингибиторов стволовьїх клеток. Активнье препарать! также оо включают смеси с- и р-цепей (например, фиг.5).

Наблюдения касающиеся активности вьіделенньїх о- и/или р-цепей гемоглобина, показьівают, что активнье і продуктьї, описание которьїх представлено здесь, не нуждаются в трехмерной структуре интактного (Че) гемоглобина. Фрагменть о- и Д-цепи также обладают активностью в качестве ингибиторов стволовьх клеток з о

Які ши в бо 65 2ТРВМ - костньй мозг мьішей, обработанньїх тестостероном свиного гемоглобина). ю

Пример 15

Очищенньй ИНПРОЛ, о-цепь очищенного свиного гемоглобина или Д-цепь очищенного свиного гемоглобина активнь іп міго

Для оценки способности цепей очищенного свиного гемоглобина к действию іп мімо, мишам линии ВОЕ 4 вводили тестостеронпропионат, как описано в примере 1. Через 24 часа мьішам вводили 500нг ОМНПРОЛа или о-цепи свиного гемоглобина (очищенного из зритроцитов периферической крови, как на фиг.21) или д-цепи свиного гемоглобина (очищенного из зритроцитов периферической крови, как на фиг.21) или зквивалентньй обьем носителя внутривенно. Через 48 часов производили сбор клеток костного мозга каждой мьіши и ставили реакцию КОЕ-МІХ, как описано в примере 14. Как показано в таблице 10, ОМНПРОЛ, о- и Д-цепи свиного гемоглобина бьіли активнь іп мімо, снижая процент КОЕ-МІХ в цикле до исходньх уровней. с о

Ф ю в со ч

ІС в)

Пример 16. о-цепь очищенного гемоглобина человека, о-цепь биотинилированного гемоглобина человека, Др-цепь « 20 биотинированного гемоглобина человека, у-цепь гемоглобина человека и 5-цепь гемоглобина человека св) с демонстрируют ингибирующую активность в отношений стволовьїх клеток іп мйго

Гемоглобин человека получали от компаний Зідта СпНетіса! Согрогайоп либо вьіделяли стандартньми з способами из периферической крови взрослого человека либо крови пупочного канатика. Отдельнье цепи ввіделяли посредством обратнофазовой вьісокозффективной жидкостной хроматографии (0Ф-ВЖХ) подобно тому, как описано ранее для о-и р-цепей свиного гемоглобина (см. Б. Масала (В. Мавзаїа) и Л. Манка (1. «сл Мапса), Меїнодз іп Епгутоіоду, т. 231, стр. 21-44, 1944). Получили очищеннье о-, р-, у- и 5-цепи. Для биотинилированньїх о- и Д-цепей 1мг гемоглобина взрослого человека обрабатьвали 37мкг биотина МНЗ ІС т (Ріегса) и цепи отделяли посредством ОФ-ВЖХУ, как описано ранее. о Как показало в таблицах 11, 12 и 13, очищенньєе о-цепи, биотинилированньеє о-, р-, у- и б-цепи гемоглобина - 50 человека обладают активностью в анализе циклирования КОЕ-МІХ. с з о ю з бе у-цепь гемоглобина человека? 12

Конт! 168 тю

Я

Пример 17. о-цепь очищенного гемоглобина человека, о-р-димер либо гемоглобин обладают активностью іп мімо о-цепь очищенного гемоглобина человека, 0-Д-димер либо гемоглобин проверяли в реакции іп мімо, как описано в примере 15. Как показано в таблице 14, каждьй из них бьл активен в концентрации 5ООнг/мьішь. см о о зо щ

Пример 18. со

Свиной ИНПРОЛ активен в отношений мононуклеарньїх либо СО34" клеток крови пупочного канатика человека іп мйго в

Для исследования способности очищенного ИНПРОЛа свиного костного мозга воздействовать на ю циклирование клеток-предшественников человека получали клетки крови пупочного канатика. Использовали либо фракцию мононуклеарньх клеток в полном обьеме, полученную после отделения на фиколле, либо фракцию СОЗ34", полученную после фракционирования на колонках с иммобилизованньіми антителами к СО34"7 « (компания СеїІРго Іпс.). Клетки инкубировали в течение 48 часов іп мйго в присутствиий интерлейкина З (ИЛ-3) и фактора роста стволовьх клеток (ЗСЕ) (по 100нг/мл каждого) для включения в цикл недифференцированньх ей) с клеток. После преинкубирования проводили анализ циклирования, как описано в примере 14 для мьішей, за ц исключением того, что на 18 день после посева производили подсчет КОЕ-ГЗММ (вместо КОЕ-МІХ). Как "» показано в таблице 15, свиной ИНПРОЛ ингибировал циклирование КОЕ-ГЗМІМ как в основной массе мононуклеарньх клеток, так и во фракции СОЗА".

І; ть Мононуклеарнье лети о - длетисрми 1

Фо (ФІ Пример 19.

Очищенньй «с-гемоглобин человека активен в отношений КОЕ-ГЗММ человека о Получали мононуклеарнье клетки крови пупочного канатика человека, инкубировали их в ИЛ-3 и факторе роста стволовьїх клеток (5СЕ) и использовали в анализе циклирования, как описано в примере 18. Как показано 60 в таблице 16, активность в зтом анализе демонстрировали как свиной ИНПРОЛ, очищенньй из костного мозга, так и о-гемоглобин человека, очищенньїй из периферической крови. шк сш бо Контроль 100 винесли 18

Пример 20.

Пептидь, полученнье из последовательностей о-гемоглобина человека и Др-гемоглобина человека, обладают активностью

Для идентификации последовательностей активньїх пептидов, трехмерная структура миоглобина (не 70 проявляющего активности в зтом анализе) с помощью программьї компьютерного моделирования накладьівалась на трехмерную структуру нативной о-цепи, присутствующей в гемоглобине взрослого человека.

Идентифицировали два пептида (представляющие аминокислотьі 43-55 и 64-82, являющиеся участками, структурно отличающимися от миоглобина в трехмерном пространстве), обладающие активностью в анализе циклирования КОЕ-МІХ. Для более точного аппроксимирования петли, обнаруженной у нативной /-о-цепи, 75 синтезировали циклическое производное 43-55 пептида (с43-55) (используя дисульфидную связь), которое, как установили, также обладало активностью.

Последовательность зтих пептидов вьіглядит следующим образом: 43-55 Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал с(43-55). Цис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал-Цис (где два Цис остатка связаньї дисульфидной связью) 64-82 Асп-Ала-Лей-Тре-Асн-Ала-Вал-Ала-Гис-Вал-Асп-Асп-Мет-Про-Асн-Ала-Лей-Сер-Ала

Бьіли испьтаньі о последовательности двух геморфинов, геморфина 10 (аминокислоть! 32-41, последовательности р-цепи) и геморфина 7 (аминокислоть! 33-40). Установлено наличие активности.

Последовательности имеют следующий вид: с

Геморфин 10 Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп- Тре-Глн-Арг-Фен о

Геморфин 7 Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг

Для проверки активности зтих последовательностей провели анализ циклирования КОЕ-МІХ, как описано в примере 14. Как показано в таблицах 17 - 19, все зти пептидьі! проявили активность в процессе проведения зтого анализа. (22) т не ві зв пептидіи3в ю « ші с . г» з п Пепидівяваи 19 » о Геморфинт! 19 -І 3е) о Циклическийпетидя3-55| 0 ю во Описание настоящего изобретения представлено с точки зрения, вариантов его осуществления. Следует понимать, однако, что специалистам в данной области очевидньї возможнье изменения и модификации настоящего изобретения. Предполагаєется, что прилагаемая формула изобретения охватит все подобнье зквивалентньсе варианть, входящие в заявленньій обьем настоящего изобретения.

Claims

65 Формула винаходу

1. Фармацевтическая композиция, содержащая в основном (а) по меньшей мере один полипептид, вьібранньійй из группьї, включающей с: -цепь гемоглобина, й -цепь гемоглобина, У -цепь гемоглобина, 5 -цепь 9 гемоглобина, 5 -цепь гемоглобина и Е -цепь гемоглобина, и (Б) фармацевтически приемлемьй носитель.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, содержащая є -цепь гемоглобина и фармацевтически приемлемьй носитель.

З. Фармацевтическая композиция по п. 1, содержащая й -цепь гемоглобина и фармацевтически приемлемьй 70 носитель.

4. Фармацевтическая композиция по п. 2, дополнительно содержащая 8 -цепь гемоглобина.

5. Фармацевтическая композиция по п. 1 или 4, отличающаяся тем, что она содержит не менее двух из упомянутьїх полипептидов, которье, необязательно, находятся в форме димера.

б. Фармацевтическая композиция по п. 5, в которой указаннье пептидь вьібирают из группь, то включающей У -цепь гемоглобина-д -цепь гемоглобина, є -цепь гемоглобина- У -цепи гемоглобина, є -цепь гемоглобина-- 5 -цепь гемоглобина и 5 -цепь гемоглобина- 5 -цепи гемоглобина.

7. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1-6 в виде единичной дозированной форми.

8. Фармацевтическая композиция по п. 7, содержащая от 0,1 мг до б г одного или двух соединений, виібранньх из группьї, включающей Є тов - Ж 08-87 у Б - цепи гемоглобина.

9. Изолированньй пептид, вьібранньй из группьі, включающей пептидьї, имеющие последовательность: Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал, Цис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал-Цис с (где два остатка Цис образуют дисульфидную связь), Асп-Ала-Лей- ГТре-Асн-Ала-Вал-Ала-Гис-Вал-Асп-Асп-Мет-Про-Асн-Ала-Лей-Сер-Ала, о Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн, Ге»! Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре, Лей-Вал-Вал-Тир-Про-Трп, - Лей-Вал-Вал-Тир-Про, с Вал-Вал-Тир-Про-Трп-Тре-Глн, Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг-Фен, в Тир-Про-Трп-Тре-Глн-Арг, ю Тир-Про-Трп-Тре-Глн, и Тир-Про-Трп-Тре.

10. Изолированньй пептид по п. 9, имеющий последовательность Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал. «

11. Изолированньй пептид по п. 9, отличающийся тем, что он является циклическим пептидом, имеющим шщ с последовательность Цис-Фен-Про-Гис-Фен-Асп-Лей-Сер-Гис-Гли-Сер-Ала-Глн-Вал-Цис, где два остатка Цис . образуют дисульфидную связь. и?

12. Изолированньй пептид по п. 9, имеющий последовательность Асп-Ала-Лей- ГТре-Асн-Ала-Вал-Ала-Гис-Вал-Асп-Асп-Мет-Про-Асн-Ала-Лей-Сер-Ала.

13. Фармацевтическая композиция, содержащая (а) композицию по любому из пп. 1-6 и (б) по меньшей мере «сл одно ингибирующее соединение, вьібранное из группьі, включающей МІР-1Є, ТОД, ТМЕЄс, ІМЕ Є, ІМЕД, їх ІМЕ У , пентапептид пироГлу-Глу-Асп-Цис-Лиз, тетрапептид М-Ацетил-Сер-Асп-Лиз-Про и трипептид глутатион (Гли-Цис- Ух Глу). о 14. Фармацевтическая композиция, содержащая (а) композицию по любому из пп. 1-6 и (б) по меньшей мере -І 20 одно стимулирующее соединение, вьібранное из группьї, включающей ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-3, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-9, ИЛ-11, ИЛ-13, ИЛ-

14, ИЛ-15, 5-С5Е, ЗМ-С5Е, М-С5Е, зритропозтин, тромбопозтин, фактор стволовьїх ср клеток и лиганд ЯК2ЛЗ.

15. Способ ингибирования пролиферации стволовьїх клеток, включающий приведение гемопозтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовьїх клеток количеством композиции по любому из пп. 25 1-6. ГФ)

16. Композиция, содержащая по меньшей мере один изолированньй пептид по п. 9 и носитель.

17. Способ ингибирования пролиферации стволовьїх клеток, включающий приведение гемопозтических о клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовьїх клеток количеством композиции по п. 16.

18. Способ ингибирования пролиферации стволовьїх клеток, включающий приведение гемопозтических 60 клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовьїх клеток количеством композиции по п. 13.

19. Способ ингибирования пролиферации стволовьїх клеток, включающий приведение гемопозтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовьїх клеток количеством композиции по п. 14.

20. Способ стимулирования роста В-клеток, включающий приведение гемопозтических клеток в контакт со стимулирующим рост количеством композиции по любому из пп. 1-6. бо

21. Способ стимулирования роста В-клеток, включающий приведение гемопозтических клеток в контакт со стимулирующим рост количеством композиции по п. 16.

22. Способ лечения рака у млекопитающего, страдающего от него, согласно которому: а) проводят радио- либо химиотерапию, и Б) вводят ингибирующее пролиферацию стволовьїх клеток количество композиции по любому из пп. 1-6.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что стадии а и 5 повторяют один или большее количество раз.

24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что стадию а осуществляют после стадии Б.

25. Способ по п. 22, отличающийся тем, что стадию б осуществляют не ранее чем за 24 часа перед стадией а или не позже чем через 24 часа после стадии а. 70

26. Способ лечения рака у млекопитающего, страдающего от него, согласно которому: а) проводят радио- либо химиотерапию, и Б) вводят ингибирующее пролиферацию стволовьїх клеток количество композиции по п. 16.

27. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий: а) удаление у упомянутого млекопитающего гемопозтических клеток, 5) обработку упомянутьїх гемопозтических клеток композицией по любому из пп. 1-6 ех мімо, с) обработку упомянутьїх гемопозтических клеток со стадии Б с помощью химиотерапиий либо излучения, а) проведение миелоаблативной терапиий упомянутого млекопитающего, и е) пересадку упомянутому млекопитающему гемопозтических клеток со стадии с.

28. Способ по п. 27, отличающийся тем, что упомянутьм раком является лейкоз.

29. Способ лечения рака у млекопитающего, включающий: а) удаление у упомянутого млекопитающего гемопозтических клеток, 5) обработку упомянутьїх гемопозтических клеток композицией по п. 16 ех мімо, с) обработку упомянутьїх гемопозтических клеток со стадии Б с помощью химиотерапиий либо излучения, а) проведение миелоаблативной терапиий упомянутого млекопитающего, и с е) пересадку упомянутому млекопитающему гемопозтических клеток со стадии с.

30. Способ ингибирования деления стволовьїх клеток у млекопитающего, подверженного воздействию о вещества, которое повреждаєт либо уничтожаєт стволовьіе клетки, включающий введение ингибирующего пролиферацию стволовьїх клеток количества композиции по любому из пп. 1-6.

31. Способ по п. 30, в котором упомянутьім веществом является противовирусное средство. б зо

32. Способ ингибирования деления стволовьїх клеток у млекопитающего, подверженного воздействию вещества, которое повреждаєт либо уничтожаєт стволовьіе клетки, включающий введение ингибирующего ї- пролиферацию стволовьїх клеток количества композиции по п. 16. со

33. Способ сохранения гемопозтических стволовьїх клеток млекопитающих ех мімо, включающий приведение гемопозтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовьїх клеток количеством композиции « зв ПО любому из пп. 1-6. ю

34. Способ по п. 33, отличающийся тем, что упомянутье гемопозтические клетки вьібрань! из группь, включающей костномозговьіе клетки, клетки периферической крови, клетки активированной периферической крови и клетки пуповинной крови.

35. Способ поддержания гемопозтических стволовьїх клеток млекопитающих ех мімо, включающий « 70 приведение гемопозтических клеток в контакт с ингибирующим пролиферацию стволовьх клеток количеством ств) с композиции по п. 16.

36. Способ лечения миелопролиферативного или аутоиммунного заболевания либо гиперпролиферации з зпителиальньїх стволовьіїх клеток у млекопитающего, страдающего от них, включающий введение ослабляющего гиперпролиферацию количества композиции по любому из пп. 1-6.

37. Способ по п. 36, отличающийся тем, что указанньм миелопролиферативньмм заболеванием является с миелодиспластический синдром.

38. Способ лечения миелопролиферативного или аутоиммунного заболевания либо гиперпролиферации ве зпителиальньїх стволовьіїх клеток у млекопитающего, страдающего от них, включающий введение оо ослабляющего гиперпролиферацию количества композиции по п. 16.

39. Способ дифференцированной защить! нормальньх, но не раковьхх, стволовьїх клеток млекопитающего от - воздействия химиотерапии либо облучения, включающий введение защищающего стволовье клетки Ге количества композиции по любому из пп. 1-6.

40. Способ по п. 39, отличающийся тем, что упомянутую композицию вводят после индуцирования пролиферации упомянутьїх нормальньїх стволовьїх клеток посредством воздействия цитотоксичного лекарственного препарата или излучения.

41. Способ дифференцированной защить! нормальньмх, но не раковьїх, стволовьїх клеток млекопитающего от Ф) воздействия химиотерапии либо облучения, включающий введение защищающего стволовье клетки ка количества композиции по п. 16.

42. Способ вакцинации млекопитающего, включающий введение композиции по любому из пп. 1-6 в качестве бр адьюванта до, во время либо после введения вакцинь.

43. Способ вакцинации млекопитающего, включающий введение композиции по п. 16 в качестве адьюванта до, во время либо после введения вакцинь.

44. Композиция, содержащая изолированньій ингибитор пролиферации стволовьїх клеток, в основном не содержащий белковьїх веществ, полученньй в соответствии со способом, включающим следующие стадии: 65 а) вніделение костного мозга и удаление из зкстракта макрочастиц, Б) нагревание упомянутого зкстракта и удаление осадка,

с) осаждение упомянутого зкстракта с помощью кислоть и сбор осадка, и а) вьіделение упомянутого ингибитора с помощью хроматографии с обращенной фазой, причем упомянутьій ингибитор представляет собой по меньшей мере один пептид, вьібранньй из группь, Включающей с:-цепь гемоглобина, д -цепь гемоглобина, 5 -цепь гемоглобина и Е -Ццепь гемоглобина.

45. Композиция по п. 44, отличающаяся тем, что указанньій ингибитор пролиферации стволовьїх клеток очищен до явной однородности.

46. Способ лечения млекопитающего, страдающего от иммунодепрессии, вьізванной гиперпролиферацией стволовьіїх клеток, включающий введение упомянутому млекопитающему реверсирующего гиперпролиферацию 70 количества композиции по любому из пп. 1-6.

47. Способ лечения млекопитающего, страдающего от иммунодепрессии, вьізванной гиперпролиферацией стволовьіїх клеток, включающий введение упомянутому млекопитающему реверсирующего гиперпролиферацию количества композиции по п. 16.

48. Способ проведения генотерапиий у млекопитающего, включающий: а) удаление у упомянутого млекопитающего гемопозтических клеток, Б) трансфицирование упомянутьїх гемопозтических клеток с помощью некоторого предопределенного гена, с) приведение упомянутьїх трансфицированньїх гемопозтических клеток ех мімо в контакт с композицией по любому из пп. 1-6, а) пересадку упомянутому млекопитающему гемопозтических клеток со стадии с.

49. Способ по п. 48, дополнительно после стадии (а) включающий обработку упомянутьїх гемопозтических клеток по меньшей мере одним стимулирующим цитокином для индуцирования пролиферации стволовьх клеток.

50. Способ по п. 49, дополнительно после стадии (4) включающий лечение млекопитающего іп мімо с помощью композиции по любому из пп. 1-6. с

51. Способ проведения генотерапии у млекопитающего, включающий: о а) удаление у упомянутого млекопитающего гемопозтических клеток, Б) трансфицирование упомянутьїх гемопозтических клеток с помощью некоторого предопределенного гена, с) приведение упомянутьїх трансфицированньх гемопозтических клеток ех мімо в контакт с композицией по п. 16, (о) а) пересадку упомянутому млекопитающему гемопозтических клеток со стадии с. їм

52. Способ размножения стволовьїх клеток ех мімо, включающий приведение гемопозтических клеток в контакт с композицией по любому из пп. 1-6 и хотя бьі одним стимулирующим цитокином. со

53. Способ по п. 52, отличающийся тем, что упомянутье гемопозтические клетки являются клетками, « вьібранньми из группьї,, включающей костномозговье клетки, клетки пупочного канатика, клетки периферической крови и клетки активированной периферической крови. іс)

54. Способ размножения стволовьїх клеток ех мімо, включающий приведение гемопозтических клеток в контакт с композицией по п. 16 и хотя бьї одним стимулирующим цитокином.

-

. и? 1 щ» (95) -і 3е) іме) 60 б5