CN101501062B

CN101501062B - 新型生物活性肽及其新用途

Info

Publication number: CN101501062B
Application number: CN2006800270466A
Authority: CN
Inventors: 王伟明; 林刚
Original assignee: SHEN ZHEN KANGZHE PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: Tianjin Kangzheweisheng Pharmaceutical Technology Development Co ltd
Priority date: 2005-07-26
Filing date: 2006-07-21
Publication date: 2012-07-18
Anticipated expiration: 2026-07-21
Also published as: NZ591825A; WO2007015918A3; JP2013188227A; AU2006276083B2; US20080214469A1; WO2007015918A2; US20130190241A1; US20120171234A1; EP2417981A1; US8703695B2; JP5329955B2; EP1909815A4; CN101501062A; US8586528B2; KR101381337B1; RU2008106920A; RU2423375C2; KR20080030048A; JP2009506757A; EP1909815A2

Abstract

本发明公开了新型肽及其作为药物组合物的用途。本发明还公开了制造药物组合物的方法及其对人体的治疗。

Description

新型生物活性肽及其新用途

技术领域

本发明涉及短肽及其用途。特别地，本发明涉及具有生物活性的短肽。

背景技术

在本领域中，已知肽用于治疗疾病并作为药物组合物。例如，美国第6,191,113号专利公开了一种对平滑肌细胞生长具有抑制活性的肽，这种肽因此可用于预防及治疗与平滑肌细胞生长相关的疾病，例如动脉硬化、血管成形术之后的再狭窄、血管移植后的管腔狭窄和平滑肌肉瘤。美国第6,184,208号专利公开了另一种肽，其被发现可调节一些生理过程，例如上皮生长带的重量增加活性以及毛发生长。另外，PCT公开号WO03/006492和美国专利申请第10/237,405号揭示了某些肽以及它们的药物组合物具有生物活性并能够调节免疫反应。

因此，本发明的一个目的在于提供具有生物活性的一种或多种短肽。

发明内容

本发明所涉及的肽分别通过标准的化学方法合成。使用已知的动物及体外方法，利用下述文献所描述的方法分析这些肽的不同生物功能。上述肽的名称为在编码“CMS”后跟一个数字。肽序列和相应的ID号示于表1中。共鉴定了7个具有体内生物活性的新型肽，用ID号之后加星号作为表示。虽然其余的肽已经在WIPO国际公开WO03/006492中有所报道，但在本发明中发现了新型且有创造力的新象征。为了方便参考，在WO03/006492中找到的序列给予相同的序列ID号。

表1

因此，本发明的一个方面涉及具有SEQ ID Nos.4，5，8-11序列的基本上纯的肽。本发明还涉及一种基本上纯的肽，其含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及一种基本上纯的肽，其基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。本发明还涉及一种基本上纯的肽，其由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。在具体实施方式中，该肽可以调节、但并不局限于调节下述的一种或多种情况：疲劳、营养失调、代谢失调、脂类代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的排斥反应、肿瘤生长及食欲。

在更优选的实施方式中，该肽可以调节、但并不局限于调节下述的一种或多种情况：肝糖原贮积、血液乳酸水平、放射线疗法所导致的免疫缺陷、乙型肝炎病毒感染、皮肤移植物排斥、肝癌、胃癌、炎症、血脂、甘油三酸酯和总胆固醇、免疫过敏性、T淋巴细胞增殖、混合淋巴细胞增殖、肥胖症以及超过正常体脂。

本发明的另一方面涉及基本上纯的肽，其为具有ID No.4，5，8-11序列的肽的功能性衍生物。因此，本发明还涉及一种基本上纯的肽，其包含生物活性肽的功能性衍生物的氨基酸序列，所述生物活性肽具有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及一种基本上纯的肽，其基本上由生物活性肽功能性衍生物的氨基酸序列组成，所述生物活性肽具有选自SEQ IDNos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及一种基本上纯的肽，其由生物活性肽功能性衍生物的氨基酸序列组成，所述生物活性肽具有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。在具体实施方式中，功能性衍生物的肽可以调节、但并不局限于调节下述的一种或多种情况：疲劳、营养失调、代谢失调、脂类代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的排斥反应、肿瘤生长及食欲。

本发明的另一个方面涉及含有编码下述肽的核苷酸序列的基因载体，所述肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11之一的氨基酸序列。本发明还涉及含有编码下述肽的核苷酸序列的基因载体，所述肽基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11之一的氨基酸序列组成。本发明还涉及含有编码下述肽的核苷酸序列的基因载体，所述肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11生物活性氨基酸序列的功能性衍生物。本发明还涉及含有编码下述肽的核苷酸序列的基因载体，所述肽基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11生物活性氨基酸序列的功能性衍生物组成。

本发明的另一方面还涉及杂交肽，该杂交肽包含邻近于下述肽的前导肽，所述肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列、或基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成、或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。本发明还涉及杂交肽，该杂交肽包含邻近于下述肽的前导肽，所述肽含有生物活性肽的功能性衍生物，该生物活性肽含有选自SEQID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列、或基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成、或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。

本发明还涉及含有编码一种肽的核苷酸序列的基因载体，所述肽包含相邻于生物活性肽的前导氨基酸序列，该生物活性肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11生物活性氨基酸序列的功能性衍生物。本发明还涉及含有编码一种肽的核苷酸序列的基因载体，所述肽包含前导氨基酸序列，该前导氨基酸序列相邻于编码生物活性肽的核苷酸序列，所述生物活性肽基本上由选自SEQ IDNos.4，5，8-11的生物活性氨基酸序列的功能性衍生物的氨基酸序列组成。

在具体实施方式中，在上述基因载体中产生的肽可以调节但并不局限于以下的一种或多种情况：疲劳、营养失调、代谢失调、脂类代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的排斥、肿瘤生长及食欲。

本发明另一方面涉及带有一种基因组的微生物，该基因组含有编码肽的核苷酸序列，所述肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及带有一种基因组的微生物，该基因组含有编码肽的核苷酸序列，所述肽基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。

本发明的另一个方面涉及带有遗传物质的微生物，该遗传物质含有编码肽的核苷酸序列，更优选涉及含有氨基酸序列的外源性肽，所述氨基酸序列为选自SEQ ID Nos.4，5，8-11氨基酸序列的生物活性氨基酸序列的功能性衍生物。本发明还涉及带有遗传物质的微生物，该遗传物质含有编码外源性肽的核苷酸序列，所述外源性肽基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的生物活性氨基酸序列的功能性衍生物组成。这里使用的外源性肽是指在自然、不修饰状态下，具有与微生物正常表达的其它任何肽所不同的氨基酸序列。

本发明的另一方面涉及带有遗传组成的微生物，该遗传组成含有编码肽的核苷酸序列，更优选涉及含有相邻于一个肽的前导氨基酸序列的外源性杂交肽，该肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及带有一种基因组的微生物，该基因组含有编码杂交肽的核苷酸序列，所述杂交肽包含相邻于一个肽的前导氨基酸序列，该肽基本上由或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。

本发明的另一个方面涉及带有遗传组成的微生物，该遗传组成含有编码外源性杂交肽的核苷酸序列，所述外源性杂交肽包含相邻于一个肽的前导氨基酸序列，该肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的生物活性氨基酸序列的功能性衍生物的氨基酸序列。本发明还涉及带有遗传组成的微生物，该遗传组成含有编码外源性杂交肽的核苷酸序列，所述外源性杂交肽包含相邻于一个肽的前导氨基酸序列，该肽基本上由或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的生物活性氨基酸序列的功能性衍生物的氨基酸序列组成。

在具体的实施方式中，在上述任何微生物中产生的肽可以调节但并不局限于以下的一种或多种情况：疲劳、营养失调、代谢失调、脂类代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的排斥、肿瘤生长及食欲。

本发明的另一个方面涉及含有基本上纯的肽的药物组合物，所述基本上纯的肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及含有基本上纯的肽的药物组合物，所述基本上纯的肽基本上由或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列构成。

本发明还涉及含有基本上纯的肽的药物组合物，所述基本上纯的肽含有生物活性肽的功能性衍生物，所述生物活性肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及含有基本上纯的肽的药物组合物，所述基本上纯的肽基本上由生物活性肽的功能性衍生物构成，该生物活性肽具有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。本发明还涉及含有基本上纯的肽的药物组合物，所述基本上纯的肽由生物活性肽的功能性衍生物构成，该生物活性肽具有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。

在具体实施方式中，在上述药物组合物中存在的肽可以调节但并不局限于以下的一种或多种情况：疲劳、营养失调、代谢失调、脂类代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的排斥、肿瘤生长及食欲。

本发明的另一个方面涉及制造药物组合物的方法，其包括：提供含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11氨基酸序列的基本上纯的肽；将所述基本上纯的肽与可药用载体相混合。本发明还涉及制造药物组合物的方法，其包括：提供基本上由或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11氨基酸序列组成的基本上纯的肽，将所述基本上纯的肽与可药用载体相混合。

本发明的另一个方面涉及制造药物组合物的方法，其包括：提供含有作为生物活性肽的功能性衍生物的氨基酸序列的基本上纯的肽，所述生物活性肽具有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列；将所述基本上纯的肽与可药用载体混合。

本发明还涉及制造药物组合物的方法，其包括：提供基本上由或由作为生物活性肽的功能性衍生物的氨基酸序列组成的基本上纯的肽，所述生物活性肽具有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列；将所述基本上纯的肽与可药用载体混合。

与上述任何所述方法相关，所述肽可以调控但并不局限于调控以下的一种或多种情况：免疫活性、疲劳、营养失调、代谢失调、脂质代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的免疫排斥、肿瘤的生长和食欲。

本发明的另一方面涉及人体治疗方法，其包括给予病人药学上有效剂量的基本上纯的肽，所述肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列、或所述肽基本上由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成、或所述肽由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。本发明还涉及人体治疗方法，其包括给予病人药学上有效剂量的基本上纯的肽，所述肽含有作为生物活性肽功能性衍生物的氨基酸序列、或所述肽基本上由作为生物活性肽功能性衍生物的氨基酸序列组成、或所述肽由作为生物活性肽功能性衍生物的氨基酸序列组成，所述生物活性肽具有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列。

在具体实施方式中，上述用于治疗人体的肽可以用于调控但并非局限于调控以下的一种或多种情况：疲劳、营养失调、代谢失调、脂质代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的免疫排斥、肿瘤的生长和食欲。

与任何上述核苷酸序列相关，这些核苷酸序列所表现的肽和/或杂交肽可以调控但并非局限于调控以下情况：疲劳、营养失调、代谢失调、脂质代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的免疫排斥、肿瘤的生长和食欲。

本发明的另一方面涉及生物活性肽在制造用于调控至少一种下述情况的药剂中的用途，所述生物活性肽包含选自SEQ ID No.1，2，15的氨基酸序列或其功能性衍生物、或所述生物活性肽基本上由或由选自SEQ ID No.1，2，15的氨基酸序列或其功能性衍生物组成，所述情况为：肝炎、疲劳、肝糖原贮积水平、血液乳酸水平以及个体的免疫反应。本发明还涉及调节肝炎、肝糖原贮积水平、血液乳酸水平或个体免疫反应的方法，其包括给予药学上有效剂量的生物活性肽，所述生物活性肽具有一个氨基酸序列，其基本上由选自SEQ ID No.1，2，15的氨基酸序列或其功能性衍生物组成。

本发明还涉及生物活性肽在制造用于调控至少一种下述情况的药剂中的用途，所述生物活性肽包含一个氨基酸序列，其含有选自SEQ ID No.3，7或21的氨基酸序列或其功能性衍生物、或基本上由或由选自SEQ ID No.3，7或21的氨基酸序列或其功能性衍生物组成，所述情况为：疲劳炎症、食欲、体重、体脂肪、血脂水平、血甘油三)酸酯水平、血胆固醇水平、炎症和免疫。本发明还涉及调控至少一种下述情况的方法，包括给予药学上有效剂量的生物活性肽，所述情况为：疲劳炎症、食欲、体重、体脂肪、血脂水平、血甘油三酸酯水平、血胆固醇水平、炎症和人体免疫，所述生物活性肽包含选自SEQ ID No.1，2，15的氨基酸序列或其功能性衍生物、或所述生物活性肽基本上由或由选自SEQ ID No.1，2，15的氨基酸序列或其功能性衍生物组成。

本发明的另一个方面涉及一种营养组合物，其包含肽，所述肽含有选自SEQ ID No.4，5，8-11的氨基酸序列或其功能性衍生物、或所述肽基本上由或由选自SEQ ID No.4，5，8-11的氨基酸序列或其功能性衍生物组成，且同样用于制造营养辅助品的应用。

本发明的另一个方面涉及SEQ ID Nos.4，5，8-11的肽的强化衍生物和功能性衍生物。这些肽的强化衍生物包含强化分子，该强化分子与这些肽可操作地连接，用以促进或增强所述肽的治疗效果。该强化效果可以是延长的效果、缩短的效果、效果的延缓发生、效果的加快发生、效果的增加强度、效果的减弱强度、副作用的减少、创造一个或更多效果、效果的减缓失活、效果的加快失活以及肽在个体中不连续位置的定位。这种强化分子和衍生物的例子如下所示。本发明中，所述强化肽可以治疗或预防但并非局限于治疗或预防病毒感染和免疫失调。本发明的其它方面包括提高肽的治疗效果的方法，其包括将所述肽可操作地与提高治疗效果的分子连接，所述肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的肽及其衍生物、或所述肽基本上由或由选自SEQ IDNos.4，5，8-11的肽及其衍生物组成。在本发明中，所述提高治疗效果的可操作连接的分子并非是自然存在的与选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的肽及它们衍生物相邻的肽。

本发明的另一方面涉及一种组合物，其含有基本上纯的肽，所述基本上纯的肽包含选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列、或所述基本上纯的肽基本上由或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。

本发明的另一方面涉及通过给予药学上有效剂量的生物活性肽来降低人类疾病的方法，所述生物活性肽含有选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列、或所述生物活性肽基本上由或由选自SEQ ID Nos.4，5，8-11的氨基酸序列组成。在一些实施方式中，人体遭受下述情况中的至少一种：疲劳、营养失调、代谢失调、脂质代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、器官移植的排斥反应、肿瘤的生长和食欲。

本发明的另一方面涉及调控或治疗以下情况的方法，其包括给予生物活性肽，该生物活性肽包含SEQ ID No.1的氨基酸序列或其功能性衍生物、或该生物活性肽基本上由或由SEQ ID No.1的氨基酸序列或其功能性衍生物组成，所述情况选自：疲劳、肝糖原贮积水平、血液乳酸水平、人体的免疫反应。

本发明的另一方面涉及调控肝糖原贮积水平、血液乳酸水平、人体免疫反应的方法，通过给予药学上有效剂量的生物活性肽而实现，所述生物活性肽含有氨基酸序列、或基本上由或由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列含有SEQ ID No.1或其功能性衍生物、或所述氨基酸序列基本上由或由SEQ IDNo.1或其功能性衍生物组成。

本发明的另一方面涉及一种生物活性肽及其在制造用于治疗肝炎的药剂中的使用，所述生物活性肽含有选自SEQ ID No.2或15或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由选自SEQ ID No.2或15或其功能性衍生物的氨基酸序列组成。

本发明的另一方面涉及治疗肝炎的方法，其包括给予药学上有效剂量的生物活性肽，所述生物活性肽含有选自SEQ ID No.2或15或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由选自SEQ ID No.2或15或其功能性衍生物的氨基酸序列组成。

本发明的另一方面涉及一种生物活性肽及其在制造用于减缓疲劳的药剂中的使用，所述生物活性肽含有SEQ ID No.3或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由SEQ ID No.3或其功能性衍生物的氨基酸序列组成。

本发明的另一方面涉及减轻人体疲劳的方法，其通过给予药学上有效剂量的生物活性肽而实现，所述生物活性肽含有SEQ ID No.3或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由SEQ ID No.3或其功能性衍生物的氨基酸序列组成。

本发明的另一方面涉及生物活性肽在制造调控至少一种下述情况的药剂中的应用，所述生物活性肽含有SEQ ID No.21或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由SEQ ID No.21或其功能性衍生物的氨基酸序列组成，所述情况为炎症、食欲、体重、体脂肪、血液脂质水平、血液甘油三酸酯水平、血液胆固醇水平、炎症和免疫性。

本发明的另一方面涉及调控以下情况中至少一种的方法，包括给予药学上有效剂量的生物活性肽，所述情况为：炎症、食欲、体重、体脂肪、血液脂质水平、血液甘油三酸酯水平、血液胆固醇水平、炎症和个体免疫性，所述生物活性肽含有SEQ ID No.21或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由SEQ ID No.21或其功能性衍生物的氨基酸序列组成。

本发明的另一方面涉及生物活性肽在制造调控人体免疫系统的药剂中的应用，所述生物活性肽含有SEQ ID No.7或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由SEQ ID No.7或其功能性衍生物的氨基酸序列组成。

本发明的另一方面涉及调控人体免疫系统的方法，通过给予药学上有效剂量的生物活性肽而实现，所述生物活性肽含有SEQ ID No.7或其功能性衍生物的氨基酸序列、或基本上由或由SEQ ID No.7或其功能性衍生物的氨基酸序列组成。

具体实施方式

如上所述，已知所述肽具有重要的生理活性。所述肽可以通过标准的合成方法由L-氨基酸容易地合成，但也可以通过使用核苷酸的基因工程合成，所述核苷酸具有编码每个肽的序列。在此编入所有参考。

本发明所用的“基本上纯的肽”是指至少40％、优选60％、更优选90％纯度的肽。在更优选的实施方式中，纯度大约为99％～100％。所述基本上纯的肽能够用于制备可以为下述混合物的药物组合物或营养组合物。

本发明所用的“杂交肽”是指包含插入到最初生物活性肽中的辅助肽的肽，但仍然基本保持相似活性，所述生物活性肽具有上述详细说明过的序列或其功能性衍生物。所述辅助肽包括前导肽，该前导肽包含，例如，一段在杂化蛋白分泌到细胞外部时能够被一种或多种原核或真核细胞作为信号识别的氨基酸序列。所述分泌可以是直接分泌或者通过分泌囊泡的间接分泌。

如上所述，本发明的另一实施方式为基本上由本发明肽组成的肽或多肽。本发明所用的术语“基本上由...组成”是指包含本发明肽的氨基酸序列以及在C端和/或N端具有其它氨基酸，并保持本发明所述肽活性的肽或多肽。因此，作为非限制的实施例，其中本发明肽的活性是调控免疫活性，“基本上由本发明肽组成”的肽或多肽就该肽而言将具有调控免疫活性的活性，不会具有以下特征：实质上降低肽或多肽调控免疫活性的能力、或者对作为免疫活性调控因子的肽的基本或新型特征造成物质改变。因此，在上述例子中，具有初级活性而非调控免疫活性以及包含本发明肽的氨基酸序列的全长天然多肽不能构成“基本上由本发明肽组成”的肽或多肽。同样，在上述例子中，具有初级活性而非调控免疫活性但是包含本发明肽的氨基酸序列的基因工程肽或多肽不能构成“基本上由本发明肽组成”的肽或多肽。

在优选的实施方式中，术语“基本上由...组成”是指除了本发明的一条肽之外还具有最多4个氨基酸的肽或多肽，在更优选的实施方式中，相同术语是指除了本发明的一条肽之外还具有2个氨基酸的肽或多肽。在进一步优选的实施方式中，相同术语是指除了本发明的一条肽之外还具有1个氨基酸的肽或多肽。

除了用于上述例证的免疫活性调控例子之外，考虑到这些肽的活性，上述定义也适用于本发明的所有肽。特别是，使用上述定义的本发明肽具有调控疲劳、营养失调、代谢失调、脂质代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的排斥反应、肿瘤生长和食欲的活性。

通过下述试验测量肽或多肽的活性，所属领域的技术人员可以容易地判定肽或多肽是否基本上由上述定义的本发明肽组成。

通过调控失调的实验测定肽或多肽的活性，所属领域的技术人员可以容易地判定肽或多肽是否基本上由上述定义的本发明肽组成，所述失调如疲劳、营养失调、代谢失调、脂质代谢失调、酸中毒、免疫活性、放射影响、肝炎、移植器官的排斥反应、肿瘤的生长和食欲，并提供了针对本发明一种特殊肽的实验方法。

此处及权利要求中所用的术语“失调”是指通过标准方法测得的人体任何脱离正常水平的情况。例如，在人体中，“脂质代谢失调”是指通过正常医学诊断检测，体内的任何脂质水平均超过基于性别、体重和年龄的特定个体的正常水平。

所述肽可以通过任何合适的途径给药。给药途径的例子有静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射、具有或没有传递促进装置例如脂质体的皮下种植、缓释剂等。因此，本发明包括将所述肽注入到患者中的设备。一些实施方式中，所述装置为注射器。所述肽还可以通过任何口服方式给药。实施例包括但并不限于处于没有修饰的普通方式或缓释方式或者具有或没有胃肠保护的片剂、胶囊、混悬剂、溶液、糖衣片等。所述肽还可以通过任何形式的局部给药进行给药，例如软膏、乳膏、具有或没有皮肤通过促进装置的凝胶、粉末的吸入剂、溶解的形式或脂质体保护方式。

可以理解，作为本发明实施的另一个方法，可以在上述肽的N端或C端上加上辅助氨基酸。例如，可以在不影响其生物功能的情况下在所述肽上加以1个或2个氨基酸。加上3个或4个氨基酸仍然可以维持该肽的功能。这些均指同一个肽的变异体。或者，还可以在不影响生物活性的情况下从所述肽上删除1个或2个氨基酸。进一步，可以在不影响生物活性的情况下从所述肽上删除3个或4个氨基酸。这是指这些肽的碎片。而且，肽衍生物，例如在相同功能类别区内一个氨基酸保守性替换成另一个氨基酸，可以用于实施本发明的其他方面。例如，具有非极性或疏水侧链的肽能够在不降低生物活性的情况下用一个侧基取代另一个侧基。作为一个进一步的例子，可以在肽中插入一个连接子/间隔区形成变异体，但是所述变异体仍然保持本研究中所用最初肽的活性部分。这也可以认为是肽的变异体。本发明所用的肽类似物包括具有天然氨基酸模拟结构例如不同主链结构或D-氨基酸取代类似物的氨基酸分子。作为进一步的例子，尽管用于合成肽的氨基酸为L-光学异构体，但是序列中一个或多个氨基酸用D型光学异构体取代的肽可以具有相似生物活性。权利要求所用的术语“功能性衍生物”包括肽的碎片、变异体、类似物或化学衍生物。

药物制剂中的上述肽可用于治疗本发明所述病症，例如免疫紊乱、癌症、疲劳、移植排斥等。该制剂中可以包含一种上述确认的肽和其它活性或无活性成分，包括其它的肽。或者，可以将上述列出的一种肽和其它未列出的肽一起使用来制备制剂。这些制剂可以通过静脉注射、肌肉注射、皮内注射、皮下注射或真皮内注射给药。给药方式可以为动脉内注射以使得根据治疗需要直接到达器官。其它的给药方式为经皮给药、作为粉末或喷雾吸入的方法以及其它已知的给药方式。该制剂还可以口服给药，可以包含能够用于防止口服该肽后胃消化的载体或其它任何本领域已知的载体。

药物制剂可以包含任何已知的药用载体。合适的载体例子包括本领域技术人员熟知的任何标准可药用载体。这些载体包括(但不限于)生理盐水、水、包含油和水混合物的乳胶或甘油三酸酯乳胶、其它类型的试剂、填充剂、包衣片和胶囊。恰当的载体可以根据药物组合物的给药方式进行选择。

本发明的另一方面提供了上述肽的强化衍生物及功能衍生物。本发明的生物活性肽可以结合于其它有生物活性效果或作用的肽，以提供辅助效果或作用或增强它们的治疗效果。很多潜在的结合分子、其生物效果及其结合于肽的方法，都是本技术领域已知的。典型的结合分子包括(但不限于)有机化合物、碳水化合物、糖、多糖、氨基酸、氨基酸聚合物、肽、甾体、蛋白、蛋白质的分离域、脂质分子、脂肪酸、胆汁酸、多胺、蛋白酶抑制剂等。还可以使用结合分子的复合物。

本发明的一些肽在特定的细胞或组织型上具有不同的治疗效果。对于肽类药物来说，结合分子的重要目的之一为将肽靶向于正在接受治疗的个体体内的特定位置或腔室。这样，肽类药物及其作用可以集中在该细胞或组织型的位置处，具有预期的治疗效果。这可以增强相近摩尔数的游离、未连接结合分子的肽所具有的效果。结合分子的其它目的包括例如延长肽的寿命、改变肽的溶解性、改变肽的活性、改变肽的生物活性。

本领域技术人员不需要过度的实验，就可推导出这些肽与结合配体相结合的化学反应。已知有很多结合技术，例如Haas et al.，KidneyIntl.，52(6)：1693，1997；Fiume et al.，Ital J Gastroenterol Hepatol，29(3)：275，1997；Di Stefano et al.，Biochem.Pharmacol.，61(4)：459，2001；Huang et al.，Chem.Biol.，7(7)：453，2000；Leopold et al.，J.Pharmacokinet.Biopharm.，23(4)：397，1995；Patel et al.，Bioconjugate Chem.，8(3)：434，1997；Kramer et al.J.Biol.Chem.，269(14)：10621，1994；Toth et al.(J.Med.Chem.，42(19)：4010，1999；Kimetal.，(Biomaterials，23：2311，2002；Oldham et al.(Int.J.Oncology，16：125，2000；and Fitzpatrick et al.Anticancer Drug Design，10：1，1995，所有文献在此全文引入作为参考。

基因治疗及治疗方法

基于上述肽序列的基因疗法是通过设计编码这些肽之一的核酸序列而进行。核酸可化学合成并与启动子有效连接而克隆到表达载体内。表达载体随后以基因治疗的形式给予人体，以在人体细胞内表达。本文所采用的“基因载体”一词包括这些表达载体。可以用于基因治疗的载体包括腺相关病毒(Mizuno，M等(1998)，Jpn J Cancer Res 89，76-80)、LNSX载体(Miller，A.D.等(1993)Methods Enzymol 217，581-599)和慢病毒(Goldman，M.J.等(1997)Hum Gene Ther 8，2261-2268)，所有公开文献在此全文引入作为参考。

用于肽输送的其它载体包括编码所需肽的表达载体，该表达载体能被转移至一种生物体，该生物体可在欲施用该肽的宿主生物体中复制，而该肽对该宿主生物体的健康不产生明显有害的影响。例如，表达载体可以被转移至对欲使用该肽的宿主生物体是非致病性的生物体中。在某些实施方案中，表达载体在细菌或真菌生物中产生所需的肽，该细菌或真菌生物对将被施用该肽的宿主生物体的健康没有明显有害的作用。例如，编码所需的肽的表达载体可以是在如乳酸菌、大肠杆菌或酵母的生物体中产生所需的肽的表达载体。在一个实施方案中，表达载体在一种哺乳动物肠道中通常存在的微生物或哺乳动物消化道耐受的微生物中产生所需的肽。可以表达所需的肽的一些微生物物种包括但不限于乳杆菌菌种，如嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)，食淀粉乳杆菌(L.amylovorus)，干酪乳杆菌(L.casei)，卷曲乳杆菌(L.crispatus)，鸡乳杆菌(L.gallinarum)，加氏乳杆菌(L.gasseri)，约氏乳杆菌(L.johnsonii)，类干酪乳杆菌(L.paracasei)，植物乳杆菌(L.plantarum)，路氏乳杆菌(L.reuteri)，鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)等；双歧杆菌菌种，如青春双歧杆菌(B.adolescentis)，动物双歧杆菌(B.animalus)，双歧双歧杆菌(B.bifidum)，短双歧杆菌(B.breve)，婴儿双歧杆菌(B.infantis)，乳酸双歧杆菌(B.lactis)，长双歧杆菌(B.longum)等；粪肠球菌(Enterococcus faecalis)或屎肠球菌(Ent.facium)；菊糖芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus inulinus)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；大肠杆菌(Escherichia coli)；费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)；或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或酵母益生菌(Saccharomycesboulardii)。

化学合成或以其它方式包括但不限于将mRNA逆转录产生cDNA分子而产生的编码本发明肽的核酸序列被并入表达载体中，通过本领域技术人员熟知的基因工程方法将基因转移进所希望的宿主中。表达载体可以是DNA载体或RNA载体。例如，表达载体可以基于质粒或病毒遗传因子。表达载体可以是染色体外复制的载体或者整合进染色体的载体。

表达载体包括与编码本发明肽的核酸可操作地连接的启动子。启动子可以是可调控的启动子，如诱导型启动子或组成型启动子。在一些实施方案中，可以选择启动子以提供所需水平的肽表达。另外，如果需要，表达载体可以包括其它序列以促进肽的产生、呈递和/或分泌。在一些实施方案中，编码本发明肽的核酸与指导肽分泌的核酸序列可操作地连接。例如，编码本发明肽的核酸可以与编码信号肽的核酸序列可操作地连接。

在一些实施方式中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在组成哺乳动物正常消化道菌群的细菌菌种如乳杆菌菌种和枯草芽孢杆菌中表达本发明肽的表达载体。这种表达载体的例子可参见Casas的美国专利6,100,388和Bellini的美国专利5,728,571。这些文献以其全文引入本文作参考。应理解的是促进本发明肽在生物体中表达的任何表达载体均可使用，所述生物体对给予该肽的宿主生物体的健康无害。

在一些实施方案中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在哺乳动物消化道耐受的酵母菌种如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或更优选地酵母益生菌(Saccaromyces boulardii)(其可在人消化道中寄居并用于治疗某些形式的腹泻)中表达本发明肽的表达载体。可用于组成型表达异源蛋白和肽的酵母表达载体，非常稳定，因此在有丝分裂和减数分裂过程中可以传递至子代，并可包括指导重组蛋白高水平分泌的信号肽编码序列。这种酵母载体的例子参见Jang等的美国专利6,391,585，该文献引入本文作参考。

编码本发明肽的表达载体可以经本领域已知技术导入欲表达该肽的生物体中。这些技术包括转化细菌、酵母或其它微生物的传统方法，例如经使用化学感受态细菌细胞、电穿孔或乙酸锂转化(用于酵母)，以及对这些方法具抗性的细菌菌种的转化方法的最近进展。在一些实施方案中，表达载体用Leer等(WO95/35389)公开的方法导入已知抗转化的乳酸菌中(该文献引入本文作参考)。导入的序列可以并入微生物染色体DNA中或保持染色体外DNA元件的形式。

含有表达载体的基因工程微生物随后可以接种消化道、阴道、气管等以实现持久的免疫治疗。在一些实施方案中，表达本发明肽的生物体以无活性形式摄入，或者优选地，以活性形式摄入。在消化道中，这些微生物产生所述肽，通过分泌或微生物的裂解将其释放进腔内，或以其它方式将肽呈递给宿主，由此肽产生其对宿主生物体的预期作用。在其它实施方案中，在鼻通道粘膜、阴道粘膜或小肠粘膜处将肽呈递给宿主生物体。

另一种治疗方法是使用脂质体作为输送特异核酸至人体细胞的方式。核酸(如含有编码本发明所述肽的核酸序列的表达载体在有利于细胞吸收和染色体并入的环境中被输送，如Gao，X.和Huang，L.(1995)，Gene Ther 2，710-722和美国专利6,207,456所述，上述公开全文引入本文作参考)。或者，使用US6,245,427的方法，肽本身可被包在脂质体中并直接输送。上述所有科学出版物和专利均引入本文作参考。

可用于上述基因治疗和治疗方法的核酸序列包括编码这些肽及其功能衍生物的序列。基于简并密码子系统，许多核酸序列中的任何一种均可用于编码这些肽及其衍生物。

实施例1

CMS-001及CMS-008对运动性疲劳小鼠的治疗作用

目的：研究CMS-001和CMS-008对BALB/c小鼠的抗疲劳效果。

方法：应用BALB/c小鼠力竭游泳模型观察CMS-001和CMS-008的抗疲劳效果。在给予CMS-001和CMS-008后观察小鼠游泳时间、肝糖原、血清尿素氮(BUN)和血液乳酸水平。检测血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平来初步研究CMS-001和CMS-008可能的抗疲劳机理。

结果：CMS-001和CMS-008在适当的浓度可以延长小鼠的游泳时间、降低BUN水平、增加肝糖原水平、降低血液乳酸的累积，与生理盐水对照比较具有统计学差异(P＜0.05)。另外，CMS-001和CMS-008在力竭运动过程中可以降低血液MDA、ALT、AST水平以及增加SOD活性，与生理盐水对照比较具有统计学差异(P＜0.05)。

结论：CMS-001和CMS-008具有抗疲劳作用且可用于疲劳相关病症的治疗。

1材料和方法

1.1药物和试剂

CMS-001和CMS-008由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

尿素氮试剂盒：Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，California，USA.

蒽酮试剂盒：中国上海第五联合实验室

MDA和SOD试剂盒：中国南京建成生物工程公司

AST和ALT试剂盒：中国北京中生生物工程高技术公司

1.2动物

雄性BALB/c小鼠、无特异病原体(SPF)级、重量18～22g从中国军事医学科学实验动物中心获得。

将小鼠随机分组为CMS-001组(20μg/kg/天，5μg/kg/天)、CMS-008(500μg/kg/天，125μg/kg/天)组和生理盐水对照组。通过腹腔注射给予受试药物，每天一次、连续给药30天。在给药一周后，训练小鼠在水温25±1℃下游泳10分钟。

1.3实验器材

游泳槽(50cm×50cm×40cm)

全自动生物化学分析仪RA-1000

乳酸自动分析仪1500SPORT

1.4CMS-001和CMS-008对小鼠力竭游泳时间的影响^[1]

在最后一次注射30分钟后，称量小鼠，将相当于小鼠重量5％的铅块包在距离身体1cm远的尾巴上。将该小鼠放在水深30cm、温度25±1℃的游泳槽中。在整个过程中使小鼠四肢保持运动。记录游泳时间直至死亡。

1.5CMS-001和CMS-008对运动后的血清尿素氮水平的影响

在最后一次注射30分钟后，将小鼠无负重放在水深30cm、温度30±1℃的游泳槽中游90分钟。然后，使小鼠休息30分钟，由眼内眦采血。分离血清，通过全自动生物化学分析仪分析BUN。

1.6CMS-001和CMS-008对小鼠肝糖原水平的影响^[2]

在最后一次注射30分钟后，通过颈脱位法处死小鼠，切出肝脏，用生理盐水洗涤，并用滤纸吸干。精确称量100mg肝脏，用蒽酮试剂盒测定肝糖原水平。

每100g肝脏的糖原重量(mg)＝DU/DS×0.5×匀浆液体体积./肝脏重量(g)×100×0.9.

DU＝样品的吸收性能

DS＝标准样品的吸收性能

匀浆液体体积＝8ml

1.7CMS-001和CMS-008对小鼠运动后的血液乳酸水平的影响^[3]

在最后一次注射30分钟后，首先由眼内眦采血20μl。称量小鼠，将相当于小鼠重量4％的铅块包在距离身体1cm远的尾巴上。将该小鼠放在水深30cm、温度30±1℃的游泳槽中游泳10分钟。在整个过程中使小鼠四肢保持运动。运动后立即从眼内眦采血20μl，运动休息20分钟后，再次从眼内眦采血20μl。将该血液加入到40μl的低渗缓冲液进行超声处理。通过乳酸分析仪分析血液中的乳酸水平。

运动后的乳酸增加量如下求得：运动后的乳酸水平减去运动前的乳酸水平。

休息后的乳酸消除量如下求得：运动后的乳酸量减去休息后的乳酸水平。

1.8CMS-001和CMS-008对力竭运动后的血清SOD、MDA、AST和ALT水平的作用

在最后一次注射30分钟后，将该小鼠无负重地放在水深30cm、温度25±1℃的游泳槽中游泳^[4]。当小鼠首次沉下，将其救出后立即从眼内眦采血。分离血清，测定MDA、SOD、AST和ALT的水平

1.9统计方法

通过方差分析(ANOV)分析两组之间的差异。

2结果

表1.1CMS-001和CMS-008对小鼠力竭游泳时间的影响

*：与生理盐水对照相比、P＜0.05

表1.2CMS-001和CMS-008对运动后的血清尿素氮水平的影响

组	剂量(μg/kg/day)	No.	尿素氮(mmol/l)
				CMS-001	20	17	7.3±2.1*
CMS-001	5	18	6.9±1.6*
				CMS-008	500	17	7.1±2.0*
CMS-008	125	18	7.2±2.3*
				Saline		17	9.0±2.5

*：与生理盐水对照相比、P＜0.05

表1.3CMS-001和CMS-008对小鼠肝糖原水平的影响

*：与生理盐水对照相比、P＜0.05

表1.4CMS-001和CMS-008对运动后小鼠的血液乳酸水平的影响

*：与生理盐水对照相比、P＜0.05

表1.5CMS-001和CMS-008对力竭运动后的血清SOD、MDA、AST和ALT水平的影响

*：与生理盐水对照相比、P＜0.05

结论

该研究表明CMS-001和CMS-008具有以下性质：

1、延长小鼠游泳时间，表明CMS-001和CMS-008可以增加动物的运动能力^[5]。

2、降低小鼠的BUN，表明CMS-001和CMS-008可以降低在运动过程中蛋白分解代谢产能的必要性^[6]。

3、在休息过程中增加动物的肝糖原储备，增加动物的运动能力^[6]。

4、运动后降低血液乳酸水平，之后加快乳酸消除速度，表明CMS-001和CMS-008可以在运动过程中降低乳酸产生的速度或者乳酸消除^[7]。

5、降低MDA水平，表明CMS-001和CMS-008可以降低运动过程中的自由基产生^[8]。

6、增加SOD水平，表明CMS-001和CMS-008可以增加运动过程中的自由基消除^[8]。

7、降低ALT和AST水平，表明CMS-001和CMS-008可以在运动过程中保护心脏和肝脏的细胞损伤。

8、CMS-001和CMS-008在运动导致的疲劳病症的治疗中有效。

参考文献：

下述参考文献完整引入本文作为参考。

1.Mizunoya W，Oyaizu S，Ishihara K，et al.Protocol for measuring theendurance capacity of mice in an adjustable-current swimming pool.BiosciBiotechnol Biochem.2002May；66(5)：1133-6.

2.何聆，王明，陈润，等.西洋参对血乳酸、血清尿素氮和肝糖原含量的影响.预防医学文献信息，2002，8(3)：291-294.

3.王小雪，邱隽，宋宇，等.茶氨酸的抗疲劳作用研究.中国公共卫生，2002，18(3)：315-317.

4.Thomas D P，Marshall K I.Effects of repeated exhaustive exercise onmyocardial subcellular membrane structure.Int J Sport Med，1988，(9)：257-260.

5.金宗濂.功能食品评价原理及方法.北京：北京大学出版社，1995.

6.卫生部.保健食品功能学评价程序和检验方法.中华人民共和国卫生部.

7.Westerblad，et al.Changes of intracellular pH due to repetitive stimulationof single fibers from mouse skeletal muscle.J Physiol；1992Apr；(499)：49-71.

8.Groussard C，Rannou-Bekono F，Machefer G，et al.Changes in blood lipidperoxidation markers and antioxidants after a single sprint anaerobic exercise.EurJ Appl Physiol.2003Mar；89(1)：14-20.

实施例2

CMS-001对放射线疗法导致的免疫缺陷小鼠的免疫调节作用

目的：研究CMS-001对放射线疗法导致的免疫缺陷小鼠模型的免疫调节作用

方法：Cs¹³⁷辐射建立免疫缺陷小鼠模型，然后给予CMS-001，通过MTT方法分析T淋巴细胞增殖率的变化

结果：在20μg/kg/天的剂量下，CMS-001可以增加T淋巴细胞增殖率，具有统计意义(P＜0.05)。

1材料及方法

1.1药物及试剂

CMS-001：由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

Hank’s溶液、胎牛血清、RPMI-1640：Hyclone，Logan，Utah.

ConA及MTT：Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA.

1.2实验动物

雄性Balb/c小鼠、无特异病原体级(SPF)、重量18～22g，从中国军事医学科学实验动物中心获得。

1.3动物模型的准备、CMS-001给药以及T淋巴细胞增殖率的定量^[1]

将Balb/c雄性小鼠随机分组：CMS-001组(20μg/kg/天，5μg/kg/天)、生理盐水对照和正常对照。将正常对照组以外的所有小鼠暴露于600拉德Cs¹³⁷(82.83拉德/分钟、7.2分钟)。受试物溶解在0.5ml生理盐水中，辐射后进行腹腔内注射，每天一次、连续15天。在最后给药受试物的翌日，将该脾脏分散为单个细胞，洗涤，用RPMI-1640将细胞浓度调整至4×10⁶/ml。接种于96孔板中，每孔加入100μl细胞和100μl Con A(达到最终浓度5μg/ml)。同时准备未加ConA的空白对照。在37℃、5％CO₂下培养细胞68小时。利用MTT方法^[2]测定T淋巴细胞的增殖。如下计算刺激指数：刺激指数(SI)＝ConA孔的平均OD值/空白对照孔的OD值。

2结果

表2.1CMS-001对辐射所导致的免疫缺陷小鼠T淋巴细胞增殖的作用

组	剂量	No.	SI
				CMS-001	20μg/kg/day	10	1.27±0.19*
生理盐水对照		8	1.11±0.08
				正常对照		10	3.42±0.93*

*与生理盐水组相比P＜0.05

3结论

CMS-001可以刺激辐射所导致的免疫缺陷小鼠T淋巴细胞增殖，具有统计学意义，表明CMS-001可以用作放射线疗法后的免疫功能低下病人的免疫促进剂。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考。

1、新药临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：128-137.

2、仇志强，杜兰宁，张子理.扶正补血膏对放疗患者造血及免疫功能的影响.兰州医学院学报.2002，28(1)：60-60.

实施例3

CMS-014对小鼠皮肤同种异体移植物存活的影响

目的：利用同种异体小鼠皮肤移植模型研究CMS-014的免疫抑制作用。

方法：将来自于C₅₇BL/6小鼠的尾部皮片移植于BALB/c小鼠，观察皮肤同种异体移植物的平均存活时间(MST)。

结果：CMS-014可以延长同种异体皮肤移植物的存活，相比较于生理盐水对照具有统计学意义(p＜0.05)。

结论：CMS-014可以用作控制器官移植排斥反应的免疫抑制剂。

1材料

1.1药物及其它试剂

CMS-014：由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

环胞素A(CsA)：Novartis Pharmaceutical Co.Ltd.，Basel，Switzerland.

生理盐水：中国天津OTSUKA药厂有限公司

Na₂S：中国天津北连化学有限公司

1.2动物

受体：Balb/c(H-2^d)小鼠、无特异病原体级(SPF)、6周龄、重量18～22g：中国军事医学科学院

供体：C₅₇BL/6(H-2^b)小鼠、SPF、6周龄、重量18-22g：中国军事医学科学院

2分组及治疗

2.1分组及受试物给药

将Balb/c小鼠随机分组，CMS-014(500μg/kg/day，250μg/kg/day，125μg/kg/day)、环胞素A(10mg/kg/day)和生理盐水对照(0.5ml/day)。雌雄各半。

受试物溶解在0.5ml生理盐水中，在皮肤移植前腹腔注射5天，皮肤移植后每日注射直至皮肤移植物排斥的终点。

2.2皮肤移植

利用8％Na₂S溶液去除Balb/c小鼠背部的一小部分毛发。第二天，外科移除大约1cm²的皮肤，然后将来自性别相配的供体C₅₇BL/6J小鼠的1cm²尾部皮肤放置到该伤口上。用一层石蜡油纱布覆盖并保护手术部位，且覆盖石膏。在移植后第6天移走石膏^[1]，每日监测受体小鼠的同种异体移植物的成活力。当仅有不足10％的同种异体移植物仍成活时作为排斥终点^[2]。

2.3统计分析

利用卡普兰-迈耶曲线生存率试验进行统计分析。

3结果

表3.1CMS-014对小鼠皮肤同种异体移植物的MST的作用

组	剂量	No.	MST(天)
				CMS-014	500μg/kg/day	9	9.8±0.4*
CMS-014	250μg/kg/day	10	9.8±0.5*
				CMS-014	125μg/kg/day	9	10.0±0.5*
CsA	10mg/kg/day	9	11.6±0.8*
				生理盐水	0.5ml/day	8	8.1±0.4

*：与生理盐水对照组相比、p＜0.05

4结论

CMS-014可以延长皮肤同种异体移植物的存活，与生理盐水对照相比具有统计学意义(p＜0.05)。CMS-014可以用作控制器官移植排斥反应的免疫抑制剂。

5参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考。

[1]Jiankuo M，Xingbing W，Baojun H，et al.Peptide Nucleic AcidAntisense Prolongs Skin Allograft Survival by Means of Blockade of CXCR3Expression Directing T Cells into Graft.J Immunol.2003；170(3)：1556-1565.

[2]Steven H.Borenstein，Jeremy Graham，et al.CD8+T Cells Are Necessaryfor Recognition of Allelic，But Not Locus-Mismatched or Xeno-，HLA Class ITransplantation Antigens.The Journal of Immunology，2000；165：2341-2353.

实施例4

CMS-017和CMS-023对体外乙型肝炎病毒的抑制效果

实施例4a 人肝炎

将测试肽加入到2.2.15细胞系的培养基中。培养后，测定培养基中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)的浓度，与对照相比较。在适当的浓度下的肽CMS-017和CMS-023在体外具有抗乙型肝炎病毒活性，与对照相比具有统计学意义(P＜0.05)。说明这些肽可以用于治疗乙型肝炎病毒感染。

1材料

肽CMS-017和CMS-023由美国肽公司、Sunnyvale，California，USA常规地合成(l-氨基酸起源)。

转染了人乙型肝炎病毒(HBV)DNA的2.2.2.15细胞株由上海药物筛选国家中心以及北京大学第一附属医院感染性疾病科提供。

细胞培养基MEM购自

Invitrogen，Carlsbad，California，USA.

用于分析HBsAg和HBeAg的酶联免疫吸附测定试剂盒购自中国上海Shiye Kehua生物技术公司

用于确定HBV-DNA的荧光定量PCR试剂盒购自中国广州中山大学的DA-AN基因公司。

2方法

试验1：最大无毒性浓度的肽对HBsAg和HBeAg的抑制作用

收集处于对数期的2.2.15细胞，用MEM(含有10％胎牛血清、100mg/ml青霉素、100U/ml链霉素)调整至2×10⁶/ml。将混悬液接种于24孔板中，每孔1.5ml，在37℃、5％CO₂下培养48小时贴壁。加入肽达到终浓度400μg/ml，每个样品3个平行孔。还准备空白对照(3孔)，在其中用培养基代替肽。在37℃下培养该板4天，用新鲜培养基替换培养基(与最初相同成分)，继续培养4天。在培养结束时，收集上层液，根据检测试剂盒厂家说明书的ELISA方法确定HBsAg和HBeAg的滴定量。药物的抑制率如下计算：

％抑制＝(对照的平均浓度-样品的平均浓度)/对照的平均浓

度×100％

试验2：肽对HBV-DNA的抑制作用

重复上述试验1中细胞悬液的准备和培养，但是肽浓度为160μg/ml。在培养结束时，收集上层液，根据检测试剂盒厂家的说明书，通过荧光定量PCR确定HBV-DNA浓度。

％抑制＝(对照的平均DNA浓度-样品的平均DNA浓度)/对照的平均DNA浓度×100％

统计

用T检验进行统计学分析。当P＜0.05时，认为统计学有意义。

结果

表4.1400μg/ml的肽对HBsAg和HBeAg的抑制作用

肽	对HBsAg的抑制率	对HBeAg的抑制率
			CMS-017	68.6％*	62.2％*
CMS-023	58.4％*	53.7％*

*与空白对照相比：P＜0.05

表4.2160μg/ml的肽对HBV-DNA的抑制作用

肽	％HBV-DNA抑制
		CMS-017	90.8％*
CMS-023	70.8％*

*与空白对照相比：P＜0.05

结论

在适当的浓度下，CMS-017和CMS-023可以抑制体外乙型肝炎病毒的发展，与对照相比具有显著性差异(P＜0.05)。这说明CMS-017和CMS-023可以用于治疗与乙型肝炎病毒有关的病毒感染。

实施例4b CMS-017的体内抗鸭乙型肝炎病毒作用

目的：观察CMS-017的体内抗鸭乙型肝炎病毒(DHBV)作用

方法

建立重庆鸭乙型肝炎病毒动物模型，肌肉注射CMS-017盐水溶液，给药28天，分别通过血清斑点杂交和酶联免疫吸附测定，观察DHBV的DNA和DHBsAg(鸭乙型肝炎表面抗原)的血清水平，并与空白对照相比较。

结果

CMS-017在治疗期间可以降低DHBV DNA和DHBsAg的血清水平(P＜0.01)。在治疗7天后停止治疗时，未见反复。

材料和方法

1动物模型^[2]

将0.1ml DHBV DNA阳性血清(5×10⁷拷贝/ml)接种于1日龄重庆鸭的腹腔中建立肝炎动物模型。接种10天后，从颈外静脉采集血液样品，通过与标记有地高辛的DHBV DNA探针的斑点杂交确认感染成功^[3]。饲养该鸭子至2周龄，以便进一步研究。

2分组和给药

将DHBV感染的鸭子随机分为以下几组：

1)对照组(n＝12)：肌肉注射正常生理盐水、每天1ml、一天一次。

2)CMS-017组(n＝12)：肌肉注射200μg/kg/day CMS-017(溶解于1ml正常生理盐水中)、一天一次。

该治疗持续4周，观察在治疗结束后再持续一周。从开始治疗的第0、7、14、21、28、35天从颈外静脉采集1ml血液样品。分离血清^[4]并储存于-20℃直至分析。

3监测的参数

1)DHBV DNA血清水平

根据厂家的标记试剂盒试验规程对DHBV DNA探针进行荧光标记(Roche Co.)。将鸭子血清斑点标记(每个样品2点)在硝基纤维素膜上，与荧光标记探针相杂交，进行DHBV DNA定量^[3]。将DHBV DNA40μl+DHBsAg 100μl作为内参。CDP-Star荧光比色试剂用于放大荧光。Vuego扫描器(Brisa-620st)用于膜的扫描、Discovery Series Quantity Onesoftware用于对点进行定量分析。点值描述为“体积”(体积＝密度Xmm²)。

2)DHBsAg血清水平

使用ELISA方法确定DHBsAg水平^[5-8]，通过酶标仪(Bio-TEK Co.)在490nm获得O.D值。

4统计学分析

使用SPSS软件对每组进行配对t检验。

结果

1.血清DHBV DNA浓度的变化

表4.3在处理前和处理后的血清DHBV DNA滴定度

*与生理盐水对照相比P＜0.05

2.血清DHBsAg水平的变化

表4.4治疗前和治疗后的血清DHBsAg O.D.值

*与生理盐水对照相比P＜0.05

结论

在适当的浓度，CMS-017在体内具有抗肝炎性质，与生理盐水对照相比

具有统计学意义(P＜0.05)。CMS-017可以用于病毒感染相关疾病的治疗。

参考文献：

参考文献完整引入本文作为参考。

1.陈压西，郭树华，张定凤，等.重庆麻鸭乙肝动物模型的建立及应用.中华肝脏病杂志.1993；1(2)：89-91.

2.陈压西，郭树华，陈学华.地高辛标记DHBV DNA探针的制备及应用.重庆医科大学学报，1994；19(4)：295-297.

3.唐霓，黄爱龙，郭树华，等.鸭乙型肝炎病毒体液免疫血清学指标的系统建立与应用.中华肝脏病杂志，2001：9(1)：13-15.

4.唐霓，黄爱龙，郭树华，等.鸭乙型肝炎病毒表面抗原的纯化及应用.重庆医科大学学报-2001：26(1)-14-16

5.唐霓，黄爱龙，郭树华，等.DHBV感染鸭特异免疫应答比较.中华肝脏病杂志.2001；9(3)：166-168.

6.唐霓，黄爱龙，齐珍元，等.急性鸭乙型肝炎病毒感染病毒清除机理研究.中国免疫学杂志.2002；18(2)：122-125.(Tang Ni，Huang Ailong，Qi Zhenyuan，et al.Immune response of acutely infected ducks to duck hepatitis B virus.ChineseJournal of Microbiology and Immunology 2000；2(4)：24-29.)

7.陈压西，郭树华，齐珍元，等.拉米夫定联合泛昔洛韦抗鸭乙型肝炎病毒的实验研究.中华肝脏病杂志.2001；9(4)：209-211.

8.仇志强，杜兰宁，张子理.扶正补血膏对放疗患者造血及免疫功能的影响.兰州医学院学报.2002，28(1)：60-60.(Qiu Zhi-qiang.The influence ofFuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected byradiotherapy.Lanzhou Medical Transaction，2003，3(28).)

实施例5

CMS024-16对移植裸鼠的人胃癌BGC-823异种移植物的抑制作用

1材料

1.1药物和试剂

CMS024-16：由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

5-Fu：中国天津金耀氨基酸公司。

胎牛血清(FBS)：Hyclone，Logan，Utah.

RPMI-1640细胞培养基：

Invitrogen，Carlsbad，California，USA.

1.2动物

健康的雌性BALB/c(nu/nu)裸鼠、无特殊病原体级(SPF)、4-5周龄：中国军事医学科学院。

1.3细胞系

人胃癌细胞系BGC-823：中国医学科学院癌症研究所

2方法

2.1动物模型的制备及抗肿瘤效果的观察^[1]

调整处于对数生长期的人胃癌细胞系BGC-823至浓度2×10⁷/ml，皮下接种于裸鼠背部(0.1ml每只小鼠。将接种的动物随机地分组：CMS024-16(160μg/kg/day、320μg/kg/day、640μg/kg/day，均为0.2ml/day)、阳性对照(5-Fu、20mg/kg/day、0.2ml/day)、阴性对照(正常生理盐水、0.2ml/day)。在接种肿瘤后的第二天腹腔内给药受试物、一天一次、连续30天。在最后注射的第二天，剥取肿瘤称重。

抑制率＝(阴性对照的平均重量-试验组的平均重量)/(阴性对照的平均重量)×100％

2.2统计学分析

数据表示为平均值±SD。使用SPSS软件的ANOVA进行统计分析。P值＜0.05为统计上有意义。

3.结果

组

剂量

N

肿瘤重量(g)

抑制率(％)

CMS024-16	640μg/Kg/day	8	1.31±0.77*	54.4*
					CMS024-16	320μg/Kg/day	8	1.59±1.017*	44.7*
CMS024-16	160μg/Kg/day	8	1.32±0.68*	54.0*
					5-Fu	20mg/Kg/day	9	1.70±0.70*	40.8*
生理盐水	0.2ml/day	8	2.87±1.05

表5.1CMS024-16对的人胃癌BGC-823裸鼠移植瘤的抑制作用

*：对生理盐水相比，p＜0.05.

4.结论

CMS024-16在剂量160-640μg/kg/day时可以抑制人胃癌BGC-823裸鼠移植瘤的生长，与生理盐水对照相比有统计学意义(P＜0.05)。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考

1.李新华，张桂英，罗非君.等.胃癌细胞系幽门螺杆菌感染对金属蛋白酶表达的影响.世界华人消化杂志.2003，11(5)：544-546.

实施例6

肽对体内肝癌H22的抑制作用

目的：研究肽对小鼠肝癌H22的抑制作用。

方法：将BALB/C小鼠随机分组为生理盐水对照组、5-Fu组、正常对照组、肽组。通过腹腔内注射移植肝癌H22细胞，腹腔注射受试药物，每天一次。记录小鼠的存活时间并与对照相比较。

结果：在剂量80μg/kg/day下，CMS-024.04、CMS-024.05、CMS-024.14、CMS-024.16可以延长肝癌H22荷瘤小鼠的生存时间，与生理盐水对照组相比有统计学意义(P＜0.05)。

结论：CMS-024.04、CMS-024.05、CMS-024.14和CMS-024.16可以延长肝癌H22荷瘤小鼠的寿命，表明这些肽可以用于治疗癌症。

1材料和方法

1.1药品和试剂

CMS-024.04、CMS-024.05、CMS-024.14、CMS-024.16由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

5-FU(5-氟尿嘧啶)购自中国天津金耀氨基苯酚有限公司。

生理盐水来自中国天津OTSUKA药学有限公司。

RPMI-1640和胎牛血清(FBS)购自

Invitrogen，Carlsbad，California，USA.

D-Hanks’溶液购自Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA.

1.2动物

健康BALB/c小鼠(CLA级、6-8周、重量18-22g)购自中国北京军事医学科学院的动物中心。

1.3细胞系

鼠源肝癌H22细胞株来自于中国医学科学研究院的肿瘤所、北京、中国。

1.4动物的分组

健康BALB/c小鼠随机分组为CMS-024.04、CMS-025.05、CMS-024.14和CMS-024.16(80μg/kg/day)、5-Fu(20mg/kg/day、每2天1次)、生理盐水(0.2ml/day)、正常组(未接种肿瘤细胞)。

1.5肝癌H22小鼠模型的给药

处死接种肝癌6-8天的小鼠。收集腹水，用D-Hanks’溶液调整细胞浓度至5×10⁷/ml，取0.2ml接种于除正常对照之外的每只BALB/c小鼠的腹腔内。

1.6受试物给药

在接种肿瘤细胞的第2天开始给予受试物。每日给予肽和生理盐水、每2天给予5-FU一次，连续60天或者直至小鼠死亡。

1.7记录存活时间

记录死亡的时间，计算生命延长率。生命延长率如下计算：

生存延长(％)＝(测试组的平均生存天数)-(生理盐水对照组平均生存天数)/(生理盐水组平均生存天数)×100％.

生存超过60天的小鼠认为是长期存活者。

1.8统计学方法

用卡普兰-迈耶方法进行统计学比较，P值小于等于0.05者为统计学上有意义。

2结果

该研究在2个独立实验中进行，具有以下结果。

表6.1肽对移植H22肝癌的小鼠存活时间的影响

*：与生理盐水对照组相比，P＜0.05

表6.2肽对移植H22肝癌的小鼠存活时间的影响

*：与生理盐水对照组相比，P＜0.05

3结论

CMS-024.04、CMS-024.05、CMS-024.14和CMS-024.16可以延长接受移植肝癌(H22)的小鼠的存活时间，与生理盐水对照组相比有统计学意义，表明这些肽可用于肿瘤的治疗。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考[1]翟羽，吕占军.反应停对小鼠肝癌细胞H22移植瘤生长的影响.癌症，2003；22(12)：1301-6.

[2]杨云霞，朱玲，何晓，等.肝靶向药米托蒽醌毫微球对小鼠肝癌的抑瘤作用.四川大学学报：医学版，2004；35(1)：68-70.

实施例7

CMS-030对鹿角菜胶所引起的大鼠足爪肿胀的治疗作用

目的：研究CMS-030的抗炎作用。

方法：应用鹿角菜胶所引起的大鼠足爪肿胀模型研究CMS-030的抗炎作用。

结果：在剂量2-20μg/ml，CMS-030在治疗组中可以抑制足爪肿胀，与对照组比较具有统计学意义(P＜0.01)。

结论：CMS-030对于鹿角菜胶所引起的大鼠足爪肿胀模型具有显著的抗炎效果。

1材料和方法

1.1药品和试剂

CMS-030：由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

鹿角菜胶：Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA.

地塞米松(DXM)：中国天津金耀有限公司。

1.2动物

Wistar大鼠6-8周龄、重量180-220g、中国北京Vitalriver试验动物有限公司。

1.3方法^[1]

将Wistar大鼠随机分组为DXM组(0.2mg/kg/day)、生理盐水对照组(1ml/day)、和CMS-030的三个剂量组(2、10、20μg/ml/day)。用生理盐水稀释所有药品至0.5ml，每日腹膜内给药。给药2周后，在大鼠右足皮下注射0.15ml的1％鹿角菜胶生理盐水溶液。0.5小时后，精确测量右足围，通过从激发后的值中减去激发前的值，计算足爪肿胀。抑制系数(％)＝(生理盐水对照组的足肿胀-给药组的足肿胀)/(生理盐水对照组的足肿胀)×100％

1.4统计学分析

利用单侧ANOVA分析进行统计学分析。

2结果

表7.1CMS-30对鹿角菜胶所引发的大鼠组肿胀的抗炎作用

**：与生理盐水对照组相比，P＜0.01。

结论：

鹿角菜胶所导致的大鼠足爪肿胀是已经确立的体内急性炎症动物模型，且用于评估药物的抗炎作用^[2]。鹿角菜胶可以导致炎症部位的前列腺素过度合成。与其它的血管活性物质一起，过度产生的前列腺素将会导致局部肿胀。CMS-030可以抑制鹿角菜胶所导致的大鼠足肿胀，具有统计学意义(P＜0.01)。CMS-030因而显示出具有抗炎性质。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考[1]李金华，张惠琴，郑克智，等.奥克丁(SOD)对角叉菜胶诱发大鼠足爪肿胀的抑制作用.苏州大学学报(医学版)，2002，Vol，22(4)：386-388.

[2]Huang Zhili，Kagoshima Masatoyo，Kagawa Eiichiro，Anti-inflammatoryand ulcerogenic effects of 3-(N，N-diethylamino)propylindometacin HCl.ActaPharmacologica Sinica，1997，Vol，18(4)：306-308.

实施例8

CMS-030对肥胖症的作用

目的：使用多食大鼠作为动物模型确定CMS-030的抗肥胖症作用。

方法：通过用高营养物质饲养大鼠6周来建立肥胖症模型。然后用CMS-030(皮下注射、剂量150、300、600μg/kg/day)或生理盐水处理大鼠4周。每周称重，处死后在试验的最后测定腹部和睾丸的脂肪垫及血脂。

结果：CMS-030可以降低大鼠的体重、脂肪垫系数、血清甘油三酸酯水平以及总血清胆固醇，与生理盐水对照组相比具有统计学意义(P＜0.05)。

结论：CMS-030具有抗肥胖症性质，可以用于饮食所导致的肥胖症疾病的治疗。

材料和方法

1材料

1.1受试物和动物

CMS-030由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

斯普拉-道来(氏)(SD)大鼠、无特殊病原体级、重量135±15g，、雄性：第一军医大学的实验动物中心。

1.2试剂盒

甘油(三)酸酯试剂盒：上海荣成生物技术实验室。

总血清胆固醇试剂盒：Zhongsheng Beikong Biotechnology Holding Ltd.

2方法

根据中国国家食品及药品管理局(SFDA)所发布的抗肥胖症药物临床前研究规定^[1]，配制高营养和正常营养的食物。

用高营养物质饲养大鼠6周来建立肥胖症模型^[2]。将正常食谱的大鼠作为正常对照。然后将肥胖大鼠用CMS-030(皮下注射、剂量150、300、600μg/kg/day、1天1次)或生理盐水处理4周。在受试物治疗过程中，所有大鼠均为正常饮食。每周进行称重，在试验最后处死大鼠，测定腹部和睾丸的脂肪垫、以及脾脏、肝、肾、胸腺的重量。采集大鼠血液用以分析血脂。

脂肪垫指数如下计算：脂肪垫重量(g)/体重(g)×1000。

器官指数如下计算：器官重量(g)/体重(g)×1000。

3统计学分析

数据表示为平均值±标准差。使用软件DAS(药品及统计Ver1.0)进行配对t检验或单因素ANOVA比较各组及组间差异。P＜0.05认为有统计学意义。

4结果

表8.1CMS-030对大鼠体重的影响(单位：克)

与生理盐水对照相比：*p＜0.05

表8.2CMS-030对大鼠脂肪垫指数的影响

组	n	脂肪垫指数	睾丸脂肪垫的指数
				正常对照	10	4.3±1.2*	4.6±0.9*
生理盐水对照	10	6.0±1.8	5.5±0.9
				CMS-030：600μg/kg/day	12	4.5±1.1*	5.0±0.7*
CMS-030：300μg/kg/day	12	3.8±2.1*	4.0±1.1*
				CMS-030：150μg/kg/day	12	3.9±1.6*	3.6±0.9*

与生理盐水对照相比：*p＜0.05

表8.3CMS-030对大鼠血液甘油三酯(TG)和总胆固醇(TCH)的影响

组	n	TG(mg/dL)	TCH(mg/dL)
				生理盐水对照	8	101.8±31.2	333.3±24.5
正常对照	8	36.4±9.1*	225.7±55.0*
				CMS-030：600μg/kg/day	12	40.6±7.9*	228.1±39.8*
CMS-030：300μg/kg/day	11	32.7±6.7*	234.9±39.1*

CMS-030：150μg/kg/day

12

51.5±19.4*

270.9±33.0*

与生理盐水对照相比：*p＜0.05

表8.4CMS-030大鼠摄食的影响(单位：g/day)

组	Week one	Weektwo	Week three	Weekfour
					正常对照	13.2±1.3*	18.3±6.1*	18.6±0.35	17.6±2.7
生理盐水对照	11.7±2.3	15.5±3.0	18.21±0.43	18.4±0.59
					CMS-030：600μg/kg/day	13.8±5.4	15.9±1.7	18.2±0.69	18.5±0.61
CMS-030：300μg/kg/day	13.2±4.8	16.9±1.6	18.1±0.74	18.4±0.59
					CMS-030：150μg/kg/day	13.2±3.1	16.1±1.8	18.3±0.67	17.8±0.53*

与生理盐水对照相比：*p＜0.05

表8.5CMS-030对大鼠器官指数的影响

组	n	胸腺指数	肝指数	脾脏指数
					生理盐水对照	12	1.1±0.3	25.5±2.3	2.0±0.3
正常对照	8	1.3±0.3	25.5±1.2	2.4±0.2*
					CMS-030：600μg/kg/day	12	1.1±0.2	24.3±2.2	2.0±0.2
CMS-030：300μg/kg/day	12	1.0±0.3	23.1±1.3*	2.0±0.2
					CMS-030：150μg/kg/day	12	0.9±0.2	25.9±3.6	2.0±0.2

与生理盐水对照相比：*p＜0.05

结论

CMS-030在合适的剂量下可以导致营养性肥胖大鼠的体重减轻和降低血脂水平，与生理盐水对照组相比有显著性差异(P＜0.05)。在给药期间，食欲并未受到明显影响。CMS-030在营养相关的肥胖症和高脂血症的治疗中有用。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考1.新药临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：128-137.

2.Bays HE.Current and investigational antiobesity agents and obesitytherapeutic treatment targets.Obes Res.2004Aug；12(8)：1197-211.

实施例9

CMS-030对小鼠的迟发型超过敏反应的影响

目的：研究CMS-030对小鼠的迟发型超过敏反应(DTH)的抑制作用。

方法：使用2，4-二硝基氟苯(DNFB)导致的耳肿胀证明CMS-030的免疫抑制作用。

结果：在10μg/kg/day下，CMS-030可以抑制DNFB导致的小鼠耳肿胀，与生理盐水对照组相比具有统计学意义(P＜0.01)。

结论：CMS-030具有免疫抑制性质，在免疫相关疾病的治疗中有效。

1材料和方法

1.1药品和试剂

CMS-030：由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

2，4-二硝基氟苯(DNFB)：Smack Co.Ltd.

硫化钠(Na₂S)：中国天津北连化学有限公司。

1.2动物

Balb/c小鼠、无特异病原体级(SPF)、6-8周龄、体重18-22g：中国军事医学科学研究院。

1.3方法

BALB/c小鼠随机分组为生理盐水对照组(0.5ml/day)、CMS-030(10μg/kg/day)。受试物溶解在0.5ml生理盐水中，一天一次进行腹膜内给药，在致敏前给药2周。

在致敏前的一天利用8％Na₂S溶液脱去小鼠腹部的毛发。DNFB溶解在丙酮/橄榄油(4∶1)中至终浓度为1％、取50μl至去毛部位用于致敏。在最初致敏后的4天，在右耳局部施与10μl的1％DNFB溶液诱发迟发型超过敏反应。将没有DNFB的同等体积溶剂施与左耳作为基线。24小时后，使用6mm直径的打洞器从左右耳的同一位置采集耳组织，精确称量该组织。通过从相同小鼠的右耳组织重量中减去左耳组织重量计算耳肿胀^[1]。抑制率(％)＝(生理盐水对照的耳肿胀-试验组的耳肿胀)/生理盐水对照的耳肿胀×100％.

1.4统计学分析

通过SPSS利用单向因素ANOVA进行统计分析。

2结果

表9.1CMS-030对小鼠迟发型超过敏反应的抑制作用

组	剂量	n	耳肿胀(mg)	抑制率(％)
					CMS-030	10μg/kg/day	17	3.69±2.31*	46.5*
生理盐水	0.5ml/day	18	6.91±2.50

*：与生理盐水对照组相比，p＜0.01

3结论

CMS-030可以抑制小鼠对DNFB的迟发性超敏感性应答，与生理盐水对照相比具有统计学意义(P＜0.05)。这表明CMS-030可用于超敏反应相关免疫疾病的治疗。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考[1]李卫东，任连生，林志彬，等.阿克他利免疫调节作用的初步研究.北京医科大学学报，2000，Vol，1(32)：1-3.

实施例10

研究CMS-030的体内免疫抑制性质

目的：研究CMS-030的抗同种异体移植物排斥作用以及可能的作用机理。

方法：利用体外T淋巴细胞增殖实验和混合淋巴细胞反应(MLR)观察CMS-030的免疫抑制性质。在体内小鼠皮肤和心肌同种异体移植物动物模型中观察CMS-030对同种异体移植物存活的作用。还观察CMS-030对同种异体移植物受体的T细胞转化和脾细胞IL-2分泌的影响。

结论：CMS-030具有抗同种异体移植物排斥性质。这可能通过抑制T-淋巴细胞活性和淋巴细胞所导致的IL-2分泌而完成。

1材料和方法

1.1动物

五周龄的无特殊病原体雌、雄Balb/c(H-2^b)和C₅₇BL/6J(H-2^d)小鼠：军事医学科学研究院(北京、中国)的实验动物研究所。雌雄各半。

C57BL/6新生鼠为自行繁殖。

1.2药品和试剂

CMS-030：由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

环孢霉素A(CsA)：Novartis Pharmaceutical Co.Ltd.，Basel，Switzerland。对所有的CsA组，稀释成0.5ml终体积。

牛血清、RPMI-1640、Hank’s溶液：Invitrogen，Carlsbad，California，USA.

MTT，ConA：Sigma Chemical Co.，St.Louis，Missouri，USA.

NaS：中国天津北连化学有限公司。

小鼠IL-2ELISA试剂盒：R&D Systems Inc.，Minneapolis，Minnesota，USA.

1.3动物的分组

为了体内试验，将小鼠随机分为6组：

CMS-030(10μg/kg/day).

CMS-030(2μg/kg/day).

CsA(10mg/kg/day).

正常生理盐水(0.5ml/day).

溶液通过腹膜内注射施与，一天一次、在移植前连续5天，在手术后连续施与20天。

1.4CMS-030对体外T-淋巴细胞增殖的影响^[1]

无菌取出健康Balb/c小鼠的脾脏，泡于冰冷的D-Hank’s溶液中。在RPMI-1640中利用毛玻璃片研磨脾脏准备脾细胞。在4℃、1,200rpm下、RPMI-1640中洗涤细胞10分钟。计数后调整浓度用于各个测定。利用台盼蓝排斥确定试验中的细胞活力，应该大于95％。

将健康小鼠的脾细胞接种于96孔板中，调整浓度至4×10⁵/孔。CMS-030加入到孔中，终浓度达到40μg/ml、8μg/ml、1.6μg/ml和0.32μg/ml。将培养板在加湿空气、37℃、5％CO₂在刀豆蛋白A(ConA)终浓度为5μg/ml的存在下孵育68小时。在阳性对照组中，不加入CMS-030。在阴性对照组中，既不加ConA也不加CMS-030。在培养结束时，通过3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四唑溴盐(MTT)比色测定来测量淋巴细胞的增殖。在每孔中加入20μl MTT，进一步培养4小时。然后加入100μl含0.04M HCl的异丙醇，以便溶解甲赞沉淀。在570nm、参考波长630nm下用分光光度计测定各个样品的OD值。

1.5CMS-030对体外混合淋巴细胞反应(MLR)的作用^[2]

使用冰冻D-Hank’s溶液洗涤健康Balb/c小鼠脾细胞，重悬于RPMI-1640达到8×10⁶/孔，形成反应淋巴细胞。在RPMI 1640中、37℃和5％CO₂下培养健康C₅₇BL/6J小鼠的脾细胞悬液与丝裂霉素(25μg/ml)45分钟，然后用RPMI-1640洗涤，再悬浮成8×10⁶/孔形成应激细胞。使用96孔培养板，对于试验组来说，加入100μg反应淋巴细胞和100μg应激细胞、20μlCMS-030达到终浓度40μg/ml、8μg/ml、1.6μg/ml或0.32μg/ml。对于阳性对照组中，加入100μl反应淋巴细胞、100μl应激细胞、和20μl RPMI-1640。对于阴性对照组来说，加入200μl应激细胞和20μl RPMI-1640。每个组合设6个平行孔。在37℃、5％CO₂下培养5天后，通过MTT比色法测定淋巴细胞的增殖。

1.6CMS-030对体内心脏移植存活的影响^[3]

供体心脏由24小时龄新生C₅₇BL/6J小鼠中获得。将供体心脏泡在D-Hank’s溶液中，除去心脏腔内的血液。将该心脏皮下移植到健康成年受体的耳轮廓通道中。通过轻压除去心脏及通道中的空气。移植后的第六天开始每日获取移植心脏的心电图(ECG)。连续3天没有ECG信号表明移植手术并不成功，在统计分析中排除该小鼠。ECG每日观察，将ECG消失的那天作为排斥的时间。在手术前的6天开始腹腔内给药受试物。每组10只小鼠。以10mg/kg/day的剂量给药环胞A，以10μg/kg/day或2μg/kg/day的剂量给药CMS-030、以0.5ml/kg/day的剂量给药生理盐水。使用Kaplan Meier检验与生理盐水组比较。

1.7CMS-030对体内皮肤同种异体移植物存活的影响^[4]

利用8％Na₂S溶液除去Balb/c小鼠背部部分毛发。次日通过外科手术移去大约1cm²的皮肤，之后将来自性别匹配的供体C₅₇BL/6J小鼠的1cm²全层尾部皮肤放置在伤口上。用一层蜡油纱布覆盖及保护手术部位，并覆盖石膏。在移植后第8天移走石膏，每日监测受体小鼠的同种异体移植物的成活力。当仅有不足10％的同种异体移植物仍成活时作为排斥终点。在手术前的6天开始腹腔注射受试物。每组10只小鼠。环胞素A的给药剂量为10mg/kg/day、CMS-030的给药剂量为10μg/kg/day或2μg/kg/day、生理盐水为0.5ml/kg/day。治疗持续到术后20天。

1.8CMS-030对体内T淋巴细胞增殖的影响^[5]

从皮肤移植物受体小鼠中分离脾细胞，用RPMI-1640重悬至4×10⁶/ml。将100μl/孔细胞加入到96孔板中。对于待测孔，加入100μl ConA达到终浓度5μg/ml。对于对照孔，加入100μl RPMI-1640。每种情况作4个平行孔。在37℃、5％CO₂下培养细胞68小时。利用MTT比色法测定淋巴细胞的增殖。在570nm、参考波长630nm下用分光光度计测定每个样品的OD。数据显示为刺激指数，即待测组的OD除以对照组的OD。

1.9CMS-030对体内IL-2水平的影响^[6]

从皮肤移植物受体小鼠中分离脾细胞，用RPMI-1640重悬至2×10⁶/ml。将1.5ml/孔细胞加入到24孔板中，培养24小时至贴壁。加入100μl ConA达到终浓度10μg/ml。再培养细胞48小时，离心后收集上清。通过ELISA测定上清液中的IL-2水平。

1.10统计学分析

使用Kaplan Meier检验来分析同种异体移植物的存活时间。对于其它实验数据使用双侧t检验比较。

2结果

表10.1CMS-030对体外T-淋巴细胞增殖的影响

组	药品的剂量	No.	OD
				CMS-030	40μg/ml	6	0.332±0.062*
CMS-030	8μg/ml	6	0.281±0.041*
				CMS-030	1.6μg/ml	6	0.311±0.027*
CMS-030	0.32μg/ml	6	0.315±0.043*
				阳性对照		6	0.421±0.055
阴性对照		6	0.109±0.003*

*：与生理盐水对照组相比，p＜0.01

表10.2Effect of CMS-030对体外混合淋巴细胞反应(MLR)的影响

组	药品的剂量	No.	OD
				CMS-030	40μg/ml	6	0.192±0.019*
CMS-030	8μg/ml	6	0.285±0.004*
				CMS-030	1.6μg/ml	6	0.361±0.036*
阳性对照		6	0.440±0.043

阴性对照

6

0.145±0.019

*：与生理盐水对照组相比，p＜0.01

表10.3CMS-030对体内心脏移植物存活的影响

组	药品的剂量	No.	Mean survival time(day)
				CMS-030	10μg/kg/d	9	12.0±2.2*
CMS-030	2μg/kg/d	9	11.5±1.9*
				CsA	10mg/kg/d	8	13.8±1.3*
生理盐水	0.5ml/d	10	9.1±1.4

*：与生理盐水对照组相比，p＜0.05

表10.4CMS-030对体内皮肤同种异体移植物存活的影响

组	药品的剂量	No.	Mean survival time(day)
				CMS-030	10μg/kg/d	9	14.1±1.2*
CMS-030	2μg/kg/d	10	13.4±1.5*
				CsA	10mg/kg/d	9	15.0±1.4*
生理盐水	0.5ml/d	9	11.0±1.3

*：与生理盐水对照组相比，p＜0.01

表10.5CMS-030对体内T淋巴细胞增殖的影响

组

药品的剂量

No.

Stimulation index

CMS-030	10μg/kg/d	9	1.6±0.3*
				CMS-030	2μg/kg/d	10	1.9±0.5*
CsA	10mg/kg/d	9	1.8±0.3*
				生理盐水	0.5ml/d	9	2.3±0.5

*：与生理盐水对照组相比，p＜0.01

表10.6CMS-030对体内IL-2水平的影响

组	药品的剂量	No.	IL-2(pg/ml)
				CMS-030	10μg/kg/d	9	599.0±121.8*
CMS-030	2μg/kg/d	10	577.4±163.1*
				CsA	10mg/kg/d	9	595.2±162.8*
生理盐水	0.5ml/d	9	787.4±227.8

*：与生理盐水对照组相比，p＜0.01

结论：

在浓度0.32μg/ml～40μg/ml，CMS-030可以明显抑制体外ConA所导致的T淋巴细胞增殖，具有统计学意义，这表明CMS-030可以在体外抑制T淋巴细胞的增殖。MLR是一个体外试验，用于确定淋巴细胞对不同HLA-II分子的反应，并且是一个在器官移植后预测排斥可能性的模型^[7]。在浓度1.6μg/ml～40μg/ml，CMS-030可以明显抑制混合淋巴细胞反应，具有统计学意义，这说明CMS-030可以在器官移植后降低排斥可能性。

心脏移植和皮肤同种异体移植物试验是用于研究抑制移植后的排斥反应的动物模型^[7]。在剂量2μg/kg/day和10μg/kg/day下，CMS-030可以延长移植物的存活，具有统计学意义，表明CMS-030通过宿主免疫应答可以抑制移植的排斥。对分离自皮肤移植物受体小鼠的脾细胞的分析表明，CMS-030可以抑制淋巴细胞的活性以及抑制T淋巴细胞分泌IL-2，均具有统计学意义，这说明通过抑制受体动物的免疫应答延长了同种异体移植物的存活。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考[1]Roma Kalra，Shashi P.Singh，JuanC，et al.Immunosuppressive and Anti-Inflammatory Effects of NicotineAdministered by Patch in an Animal Model.Clinical and Diagnostic LaboraroryImmunology，May 2004，563-568.

[2]Dubey DP，Yunis I，Yunis EJ，et al.Cellar typing：mixed lymphocyteresponse and cell mediated lympholysis.American Society for Microbiology，1986，847-848.

[3]Vakeva A Laurila P，Meri S，et al..Regulation of complement membraneattack complex formation in myocardial infarction.Am J Pathol，1993，143：65.

[4]Jiankuo M，Xingbing W，Baojun H，et al.Peptide Nucleic Acid AntisenseProlongs Skin Allograft Survival by Means of Blockade of CXCR3ExpressionDirecting T Cells into Graft.J Immunol.2003；170(3)：1556-1565.

[5]María A.Puertollano，Manuel A.de Pablo，et al.Relevance of DietaryLipids as Modulators of Immune Functions in Cells Infected with Listeriamonocytogenes.Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology.2002，9：352-357.

[6]Mayumi H，Himeno K，Shin T，et al.Drug-induced tolerance to allografts inmice.Immunobiology，1985，169(2)：147-161.

[7]Rene J.Duquesnoy Li YP.Transplantation immunobiology.2002，10：5-7.

实施例11

肽对运动导致的小鼠疲劳的作用

目的：研究肽对Balb/c小鼠的抗疲劳作用。

方法：观察雄性Balb/c小鼠游泳时间来研究肽的抗疲劳作用。

结果：CMS-001.30和CMS-001.31可以延长小鼠的游泳时间，与对照组相比具有统计学意义(P＜0.01)。

结论：CMS001-30和CMS001-31具有抗疲劳性质，可以用于疲劳相关疾病的治疗。

1材料和方法

1.1药品和试剂

CMS-001.30and CMS-001.31由中国深圳康哲药业有限公司常规合成。

红血球生成素(EPO)：Japan Kunpeng Medical Corporation.

1.2动物

Balb/c小鼠、雄无特殊病原体级(SPF)、体重18-22g：中国军事医学科学实验动物中心。

1.3分组和方法[1]

将Balb/c雄性小鼠随机分组为CMS-001.30(20μg/kg/day)、CMS-001.31(20μg/kg/day)、EPO(1000u/kg/day，每周3次)和生理盐水对照。受试物溶解在0.5ml生理盐水中腹膜内给药每天一次，连续给药30天(如果没有施与EPO，则用生理盐水替代)。在第10天，训练小鼠在水温25±1℃下游泳10分钟。在最后一次受试物给药后的30分钟，将小鼠放在游泳槽(50cm×50cm×40cm)中游泳。水深30cm、水温25±1℃。在整个过程中使小鼠的四肢保持运动。记录小鼠的游泳时间(分钟)直至死亡。

力竭游泳时间的延长率(ESTR)(％)＝(测试组的平均力竭游泳时间-生理盐水对照的平均力竭游泳时间)/(生理盐水对照的平均力竭游泳时间)×100％。

1.4统计学分析

使用ANOVA分析进行组间差异的比较。

2结果

表11.1肽对小鼠力竭游泳时间的影响

组	剂量	No.	游泳时间(分钟)	ESTR(％)
					CMS-001.30	20μg/kg/day	20	186.4±15.2*	88.3*
CMS-001.31	20μg/kg/day	20	174.3±29.2*	76.0*
					EPO	1000u/kg/day，每周3次	20	126.1±20.4*	31.3*
生理盐水	0.5ml/day	20	99.0±11.2

*：与生理盐水对照组相比，P＜0.01

3结论

CMS001-30和CMS001-31具有抗疲劳性质，并且可以用于疲劳相关疾病的治疗。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考1.Mizunoya W，Oyaizu S，Ishihara K，et al.Protocol for measuring the endurance capacity of mice in an adjustable-current swimming pool.Biosci Biotechnol Biochem.2002May；66(5)：1133-1136.

根据以上信息，通过上述肽可以制成不同的药物制剂。该药物制剂可以包含任何已知的药物载体。合适载体的例子包括任何本领域技术人员所熟知的标准可药用载体。其包括(但不限于)生理盐水溶液、水、包含油和水混合物的乳状液或甘油(三)酸酯的乳状液、其它形式的试剂、赋形剂、糖衣片剂和胶囊。可以根据药物组合物的给药方式选择恰当的载体。

该药物制剂可以通过静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射、皮下种植等方式给药。肽还可以通过任何口服给药方式给药，例如片剂、胶囊、混悬液、溶剂等，以没有修饰的常用形式或缓释形式或者有或没有胃肠保护的形式给药。该肽还可以通过任何外用药方式给药，例如软膏、乳剂、凝胶等，以有或没有经皮促进装置的方式给药。该肽还可以通过其自身或者与其它肽序列的组合来翻译出其基因序列、克隆到一个表达系统中，产生的肽分子能运用本发明所述肽的活性。

对于给药的注射方式，每种肽的剂量可以为每公斤体重1ng-10g肽。优选的剂量为每公斤体重10ng-10mg，更优选每公斤体重1μg-1mg。然而，由于一种或多种肽可以通过受体发挥作用，该受体会诱发一系列的正常生理学反应，因而有效剂量也可以是低至每公斤体重1ng。或者，一种或多种肽可以是整个系列反应的引发剂。对于口腔服用，数量可以为每天每公斤体重1ng-10g肽，更优选每天每公斤体重0.1μg-1g，进一步优选每天1μg-10mg。

基于上述肽序列的基因治疗可以通过本领域已知方法实施，也可以根据公开专利WO 03/006492A2实施，在本发明公开中完整地引入作参考。根据公开专利WO2004/055042A1所公开的技术，该肽还可以与其它的增强分子结合，在本发明公开中完整地引入作参考。

参考文献：

以下参考文献完整引入本文作为参考1.新药临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：134-135.

2.徐叔云，卞如濂，陈修.药理实验方法学.人民卫生出版社.1991，1221-1234.

3.新药临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：140.

4.何金生，李瑞珠，宗庭益.MTT还原法检测NK细胞活性的方法学研究.中国免疫学杂志.1996，1(6)：356-358.

5.汪谦.现代医学实验方法.人民卫生出版社.1998，482-483.

6.新药临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：141.

7.新药临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：132-133.

8.新药临床前研究指导原则汇编.中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：128-129.

9.章元沛，苏怀德.药理学实验(第二版).人民卫生出版社.1998，137-138.

10.李家泰，临床药理学(第二版).人民卫生出版社.1998，1338-1339.实施例12

经基因工程乳杆菌菌种输送肽

以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。用化学方法合成编码上述表A所列肽之一的DNA序列，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将该DNA序列插入一表达载体中。所选的表达载体含有：在乳杆菌中有功能的组成型启动子，一个用于以特异的5’至3’方向引入DNA序列的多克隆位点，以及一个赋予对抗生素有抗性的选择标记基因(以辅助克隆程序)，并且还可含有有助于肽的产生和/或分泌的其它序列，如信号肽序列。这种载体的一个例子参见Pavla的美国专利5,592,908，在本发明公开中完整地引入作参考。简要地，该专利讨论了在乳杆菌菌种中有功能的若干已知启动子，以及在所述细菌中发现新启动子的方法，这些启动子的任一种均可与编码本发明肽的核酸可操作地连接以在乳杆菌中表达所述肽。信号肽如美国专利5,592,908中所述的在乳酸乳杆菌中有活性的由16-35个主要为疏水氨基酸组成的肽，编码该信号肽的核酸被插入启动子和编码本发明肽的核酸之间，从而编码信号肽的核酸与编码本发明肽的核酸同框。

除了肽的编码序列之外，合成的DNA序列还可包括有助于将所述DNA连接并克隆进表达载体的序列。例如，与所述载体多克隆位点中发现的识别位点相应的限制酶识别位点可以并入合成的DNA序列的5’和3’末端，从而所述序列可以正确方向克隆进载体中。载体和合成DNA用特定限制酶消化，然后纯化。载体和合成DNA连接反应后转化进大肠杆菌合适菌株中。转化的细菌在含有载体赋予抗性的抗生素的培养基上铺板。选择转化细菌的菌落进行生长培养和质粒制备，证实存在正确方向的合成DNA。

然后将表达载体转化进乳杆菌菌种如嗜酸乳杆菌的细菌宿主细胞中。通过载体序列中的选择标记选择转化的细胞，肽的分泌可通过进行Western印迹、培养基中存在的肽的凝胶电泳及其它标准技术证实。选择细菌转化菌落并用于制备基因工程菌的大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理细菌培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存细菌的方法，另外可将细菌与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。例如，细菌可用于制备酸奶产品或其它食品供人类消费，从而表达肽的微生物寄居在人消化道中。将乳酸菌的特殊菌株掺入食品如酸奶、泡菜、乳酪和奶油的各种不同方法参见美国专利6,036,952，在本发明公开中完整地引入作参考。通过任一种途径摄入细菌后，工程菌可寄居在消化道中并使本发明肽经消化道的粘膜层呈递和/或吸收。

实施例13

经基因工程形式的枯草芽孢杆菌输送肽

以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的另一个举例方法。用化学方法合成编码上述表A所列肽之一的DNA序列，并用基因工程技术及本领域已知的所有技术将该DNA序列插入一表达载体中。所选的表达载体包括穿梭载体，如pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均能繁殖并含有抗生素抗性基因以挑选转化菌落的克隆。该载体可以含有在枯草芽孢杆菌中有活性的组成型启动子，如衍生自枯草芽孢杆菌SacB基因的启动子，以及编码在枯草芽孢杆菌中有活性的信号或前导肽的核苷酸序列，该信号或前导肽指导表达的异源蛋白从细菌细胞中有效输出。这种载体的一个例子参见Fahnestock的美国专利6,268,169，在本发明公开中完整地引入作参考。简要地，如上所述，以本领域熟知的技术合成具有限制酶位点和/或促进DNA克隆的其它序列的编码本发明肽的DNA。在转化进大肠杆菌、铺板、选择和繁殖质粒产生质粒原液后，将质粒转化进枯草芽孢杆菌，并根据对铺板培养基中的抗生素的抗性选择转化子。

使用本领域技术人员熟知的技术验证在遗传工程化的枯草芽孢杆菌中产生并分泌的肽，如在SDS-PAGE分析或Western印迹之后，将肽放射标记以进行放射自显影检测。

培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。

实施例14

经基因工程糖酵母菌种输送肽

以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的另一个举例方法。用化学方法合成编码上述表A所列肽之一的DNA序列，并用基因工程技术及本领域已知的所有技术将该DNA序列插入一表达载体中。所选的表达载体包括一稳定维持的酵母蛋白表达载体，包括组成型酵母启动子如pADH1，使载体在酵母和大肠杆菌中均能复制的位点，赋予营养缺陷型酵母突变体以原养型的用于选择目的的一种或多种情况基因，多克隆位点(MCS)，以及如果需要的编码信号肽的序列。这种载体是市售的并是本领域熟知的或者可用标准技术构建。在将合成DNA插入酵母载体、转化进大肠杆菌、在选择培养基上铺转化的大肠杆菌、挑选转化细菌的菌落并从所述菌落的细菌培养物中制备质粒DNA后，将载体经熟知技术如乙酸锂转化或电穿孔转化进酿酒酵母。选择用于转化的酿酒酵母菌株是突变的营养缺陷型菌株，其需要质粒上的一种基因以在基本培养基上生长。通过将酵母在缺少该载体上提供的基因的培养基上铺板而选择转化的酵母菌落。只有接受载体及其选择基因并表达该基因产物的酵母可在基本培养基上生长成菌落。通过进行Western印迹、存在于生长培养基中的肽的凝胶电泳或其它标准技术可以证实肽的分泌。

选择酵母转化菌落并用于制备大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程酵母的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该酵母可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理酵母培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存酵母的方法，另外可将酵母与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。在另一实施方案中，转化的酵母可用本领域技术人员已知技术制备食品如发酵奶制品如酸奶和酸乳酒。与这些食品中的活乳酸菌培养物一样，转化的酵母至少短时寄居在消化道中，并经消化道腔将肽提供给宿主。

本发明中上述所使用的方法、数据及肽的特定实施例仅用于示例，并非局限本发明。应该理解的是，本发明一些实施方式中所述的肽及原则还可以适用于其它功能上相同的经过改造但并未影响生物功能的肽中。而且，尽管列举了上述疾病和失调来支持所述肽的医药应用，但这些医药应用并非局限于实施例，也并非局限于权利要求。已知所述肽及其功能性衍生物的其他可能/潜在的用途，例如但不限于用于提高或增强免疫系统的健康食品，减缓疲劳、降低正常人或受感染病人的血液乳酸。这些用途均在本发明的范围内。

至于带有已发表过序列的肽，本发明提供了新型和意外的用途，可以坚信这些新适应症支持了这些已知肽在之前未预料到的工业用途中的应用。除了上述及权利要求中的新型医学用途，基于本发明提供的技术，其还可以用作提高健康人状况的膳食补充剂或营养补充剂。

序列表

<110>新型生物活性肽及其新用途

<120>Novel Biologically Active Peptides and Theii New Uses

<130>P001.009PCTUS

<150>US 60/702,542

<151>2005-07-26

<160>21

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>10

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>1

Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe

1 5 10

<220>2

<221>6

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>2

Ile Val Thr Asn Thr Thr

1 5

<210>3

<211>13

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>3

Lys Ala Val Lly His Leu Asp Asp Leu Pro Oly Ala Leu

1 5 10

<210>4

<211>6

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<120>

<121>Synthetically prepared peptide sequence

<400>4

Pro Thr The Lya The Tyr

1 5

<210>5

<211>8

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetically prepared peptide sequence

<400>5

ProThr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro

1 5

<210>6

<400>6

000

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>7

Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val

1 5 10

<210>8

<211>3

<212>PRT

<213>Artificial

<220>

<223>Synthetically prepared peptide sequence

<220>

<221>MCO_RES

<222>(3)..(3)

<223>Xaa＝Nie(Norleucine)

<400>8

Tyr Ser Xaa

1

<210>9

<211>3

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetically prepared peptide sequence

<400>9

Tyr Thr Val

1

<210>10

<211>3

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetically prepared peptide sequence

<220>

<221>NCO_RES

<222>(1)..(1)

<223>Xaa＝3，5-dibrome-tyrosine

<400>10

Xaa Ser Leu

1

<210>11

<211>3

<212>PRT

<213>Artificial Sequence

<220>

<223>Synthetically prepared pcptlde sequence

<400>11

Leu Tyr Ser

1

<210>12

<400>12

000

<210>13

<400>13

000

<210>14

<400>14

000

<210>15

<211>3

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>15

Ala Ala Phe

1

<210>16

<400>16

000

<210>17

<400>17

000

<210>18

<400>18

000

<210>19

<400>19

000

<210>20

<400>20

000

<210>21

<211>4

<212>PRT

<213>Sus scrofa

<400>21

Phe Glu Glu Met

1

Claims

1.一种生物活性肽在制备药物方面的应用，所述药物用于调节以下情况中至少一种：疲劳、肝糖原贮存水平、血液乳酸水平和人的免疫反应，所述生物活性肽为SEQ ID No.1氨基酸序列，所述疲劳为运动导致的疲劳，所述人的免疫反应为辐射导致的免疫反应。