JP5329955B2 - 新規な生物活性ペプチドおよびその新規な用途 - Google Patents
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Description
発見したペプチド配列に基づく遺伝子治療は、こうしたペプチドの1種をコードする核酸配列の設計によって行うことができる。該核酸は、化学的に合成し、プロモーターに作動可能に連結し、更に発現ベクター中にクローニングし得る。次いで、該発現ベクターは、遺伝子治療の形態として、人体細胞中に発現させるために人体中に投与される。本明細書で使用する場合の用語「遺伝子ベクター」には、こうした発現ベクターが含まれる。遺伝子治療に使用できるベクターは、アデノ随伴ウィルス(Mizuno, M. et al. (1998), Jpn J Cancer Res 89, 76-80)、LNSXベクター(Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) およびレンチウィルス(Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268)を包含するが、各開示内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
目的:CMS−001およびCMS−008がBALB/cマウスに及ぼす抗疲労効果の調査。
1.1 薬物および試薬
CMS−001およびCMS−008は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
尿素性窒素試薬キット:Beckman Coulter, Inc., Fullerton, California, USA
アントラセンケトン試薬キット:Shanghai Fifth Union Laboratory, Shanghai, China, PRC
MDAおよびSOD試薬キット:Nanjing Jiancheng Bio-engineering Corporation, Nanjing, China, PRC
ASTおよびALT試薬キット:Beijing Zhongsheng Bio-engineering High Technology Corporation, Beijing, PRC
特定病原体未感染(SPF)等級で、体重18〜22gの雄性BALB/cマウスをAcademy of Military Medicines and Sciences Experimental Animal Center, PR Chinaから入手した。
水泳槽(50cm×50cm×40cm)
完全自動Biochemistry Analyser RA-1000
乳酸自動分析装置1500SPORT
最後の注射から30分後、マウスの体重を測定し、体重の5%相当の鉛片を、体から約1cm離れたマウス尾部に巻きつけた。マウスを水深30cm、温度25±1℃の水泳槽に入れた。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。死亡するまでの水泳時間を記録した。
最後の注射から30分後、マウスを、水深30cm、温度30±1℃の水泳槽中でおもりを付けずに90分間泳ぐように配置した。次いで、マウスを30分間休ませ、血液を眼窩洞から採取した。血清を分離し、そのBUN量を完全自動Biochemistry Analyzerにより決定した。
最後の注射から30分後、マウスを頚椎脱臼により屠殺した後、肝臓を切除し、食塩水で洗浄し、ろ紙で吸い取って乾燥した。肝臓約100mgを正確に秤量し、肝グリコーゲン量をアントラセンケトン試薬キットで決定した。
肝臓各100g中のグリコーゲン重量(mg)=DU/DS×0.5×均質液容量/肝臓重量(g)×100×0.9
DU=試料の吸光度
DS=標準物の吸光度
均質液容量=8ml
最後の注射から30分後、眼窩洞から先ず血液20μlを採取した。次いで、マウスの体重を測定し、体重の4%相当の鉛片を、体から約1cm離れたマウス尾部に巻きつけた。マウスを水深30cm、温度30±1℃の水泳槽で10分間泳ぐように配置した。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。運動直後および20分の休息後に、眼窩洞から再び血液20μlを採取した。血液を低張緩衝液40μl中に添加し、その超音波処理をした。血液中の乳酸量を乳酸分析装置で決定した。
最後の注射から30分後、マウスを水深30cm、温度25±1℃の水泳槽でおもりを付けずに泳ぐように配置した。マウスが沈む初回時までに、マウスを救出し、直ちに眼窩洞から血液を採取した。血清を分離し、MDA、SOD、ASTおよびALT量を決定した。
群同士間の差異を分散分析ANOVAで分析した。
この試験は、CMS−001およびCMS−008が以下の特性を有することを示した。
1.マウスの水泳時間を延長し、CMS−001およびCMS−008が動物の運動能力を増強できることを示すこと[5]。
2.マウスのBUNを減少させ、CMS−001およびCMS−008が、運動中のエネルギー生成のためにタンパク質異化の必要性を減少させることができることを示すこと[6]。
3.休息中の動物の肝グリコーゲン蓄積量を増加させ、動物の運動能力を増強すること[6]。
4.運動後の血中乳酸量を減少させ、その後の乳酸消失速度を増加させて、CMS−001およびCMS−008が、運動中の乳酸生成または乳酸消失の速度を減少させることができることを示すこと[7]。
5.MDA量を減少させ、CMS−001およびCMS−008が運動中のフリーラジカル生成を減少させることができることを示すこと[8]。
6.SOD量を減少させ、CMS−001およびCMS−008が運動中のフリーラジカル消失を増加させることができることを示すこと[8]。
7.ALTおよびAST量を減少させ、CMS−001およびCMS−008が、運動中の心臓および肝臓の細胞傷害を保護できることを示すこと。
8.CMS−001およびCMS−008は、運動関連の疲労障害の管理に有用となり得ること。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Mizunoya W, Oyaizu S, Ishihara K, et al. Protocol for measuring the endurance capacity of mice in an adjustable-current swimming pool. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 May; 66(5):1133-6.
2. HE Ling, WANG Ming, CHEN Run etc. The effect of blood lactic acid、blood serum carbamide nitrogen and liver hepatin affected by gen-seng. Prevent Medicine Literature Information, 2002, 8(3):293-294.
3. WANF Xiao-xue, QIU Juan, SONG Yu etc. Study on Effect of Theanine of Fatigue. China Commonality Sanitation Journal, 2002, 18(3):315-317.
4. Thomas D P,Marshall K I. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structure. Int J Sport Med,1988, (9):257-260.
5. JIN Zong-lian. Evaluation principle and method of function food. Beijing: Beijing University Publishing Company, 1995.
6. Sanitation ministry, Evaluation progress and test methods of health care food. Ministry of Public Health, PR China.
7. Westerblad, et al. Changes of intracellular pH due to repetitive stimulation of single fibers from mouse skeletal muscle. J Physiol; 1992 Apr; (499):49-71.
8. Groussard C, Rannou-Bekono F, Machefer G, et al. Changes in blood lipid peroxidation markers and antioxidants after a single sprint anaerobic exercise. Eur J Appl Physiol. 2003 Mar; 89(1):14-20.
目的:放射線療法誘発免疫低下動物モデルに対するCMS−001の免疫調節効果の観察。
1.1 薬物および試薬
CMS−001:Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
ハンクス液、ウシ胎児血清およびRPMI−1640:Hyclone, Logan, Utah
ConAおよびMTT:Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
特定病原体未感染等級(SPF)で、体重18〜22gの雄性BALB/cマウスをAcademy of Military Medicines and Sciences experimental animal center, PR Chinaから入手した。
マウスをCMS−001群(20μg/kg/日、5μg/kg/日)、食塩水対照群、および通常対照群に無作為に振り分けた。通常対照群を除く全てのマウスをCs137の600rad(82.83rad/分を7.2分間)に曝露した。試験物質を食塩水0.5mlに溶解し、照射後15日間連続して1日1回腹腔内に投与した。試験物質の最終投与の翌日、マウスの脾臓を無菌的に切除した。その脾臓を個々の細胞にばらし、洗浄し、細胞濃度をRPMI−1640で4×106個/mlに調節した。96穴培養プレートに、1穴当たり細胞100μlおよびConA100μl(最終濃度5μg/mlに)を添加した。ConAを含まない基準ブランク対照も調製した。その細胞を37℃、5%CO2で68時間インキュベートした。Tリンパ球の増殖量をMTT法により決定した[2]。刺激指数を以下の通り算出した。刺激指数(SI)=ConA入り穴の平均OD値/基準ブランク穴の平均OD値。
CMS−001は、統計的有意性をもって、放射線誘発免疫低下マウスにおけるTリンパ球増殖を刺激できることが判明し、CMS−001は、放射線療法後の免疫低下患者に対する免疫刺激剤として使用し得ることを示す。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. New drugs (Western medicine) research direction principle before clinic. Chinese Sanitation Ministry Drug Political Situation. 1993, 7:128-137.
2. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003, 3(28).
目的:皮膚同種移植片モデルによるCMS−014の免疫抑制効果の調査。
1.1 薬物および他の試薬
CMS−014:Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによりにより特注合成された。
サイクロスポリンA(CsA):Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland
食塩水:China OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, PR China
Na2S:Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China
受容動物:特定病原体未感染等級(SPF)の6週齢で、体重18〜22gのBALB/c(H−2d)マウス:Military Medical Academy of Science, China
供与動物:SPFの6週齢で、体重18〜22gのC57BL/6(H−2b)マウス:Military Medical Academy of Science, China
2.1 群別および試験物質投与
BALB/cマウスをCMS−014群(500μg/kg/日、250μg/kg/日、125μg/kg/日)、サイクロスポリンA群(10mg/kg/日)、および食塩水対照群(0.5ml/日)に無作為に振り分けた。そのマウスの半数は雄性、半数は雌性であった。
BALB/cマウス背部の毛1パッチを8%Na2S溶液で除去した。翌日、その皮膚を外科的に除去することにより、約1cm2の創傷床を生成し、次いでその創傷床上に、同性のC57BL/6J供与マウスの全厚尾部皮膚片1cm2を載せた。その手術部位をパラフィンガーゼ層で被覆、保護した後、絆創膏を施した。移植から6日後に絆創膏を外し[1]、同種移植片の生存性について受容マウスを毎日監視した。拒絶の終点は、同種移植片の10%未満だけがなお生存しているときに設定した[2]。
統計分析は、Kaplan−Meier生存検定で行った。
CMS−014は、食塩水対照と比較して統計的有意性(p<0.05)をもって、皮膚同種移植片の生存を延長できることが判明した。CMS−014は、臓器移植後の拒絶反応を抑制するために、免疫抑制剤として使用し得る。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Ming Jiankuo, Wang Xingbing, Huang Baojun, et al. Peptide Nucleic Acid Antisense Prolongs Skin Allograft Survival by Means of Blockade of CXCR3 Expression Directing T Cells into Graft. The Journal of Immunology, 2003, 170:1556?1565.
[2] Steven H. Borenstein, Jeremy Graham, et al. CD8+ T Cells Are Necessary for Recognition of Allelic, But Not Locus−Mismatched or Xeno−, HLA Class I Transplantation Antigens. The Journal of Immunology, 2000; 165:2341−2353.
実施例4a ヒト肝炎
試験ペプチドを2.2.15細胞系の培地へ添加した。インキュベーション後、培地中のB型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、およびB型肝炎ウィルスDNA(HBV−DNA)の各濃度を決定し、対照と比較した。適切な濃度のペプチドCMS−017およびCMS−023は、対照と比較して統計的有意性(p<0.05)をもって、インビトロで抗B型肝炎ウィルス活性を有することが判明した。これらのペプチドは、B型肝炎ウィルス感染の管理に使用し得ると結論される。
ペプチドcms−017およびcms−023は、American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, California, USAにより(l−アミノ酸源で)特注合成された。
第1試験:最大無毒濃度でのHBsAgおよびHBeAgに対するペプチドの抑制効果
対数増殖期の2.2.15細胞を採集し、MEM(10%ウシ胎児血清、ペニシリン100mg/mlおよびストレプトマイシン100U/mlを含有)で2×106個/mlに調節した。その懸濁液を24穴培養プレート上に1.5ml/穴で接種し、付着させるために37℃、5%CO2で48時間インキュベートした。1試料当たり並行穴3個を用いて、該ペプチドを最終濃度400μg/mlに添加した。ブランク対照1組(穴3個)も調製したが、その場合ペプチドを培地に置き換えた。プレートを37℃、4日間インキュベートし、次いで培地を調製直後の培地(元の培地と同じ組成)で交換し、プレートを更に4日間インキュベートした。インキュベーションの終了までに、培養物の上清を集め、HBsAgおよびHBeAgの力価を、検出キット製造業者の使用説明書に従ってELISA法で決定した。薬物の抑制率(%)は、以下のように算出した。
抑制率(%)=(対照の平均濃度−試料の平均濃度)/対照の平均濃度×100%
細胞懸濁液の調製およびインキュベーションを前記第1試験同様に繰り返したが、ペプチド濃度は160μg/mlとした。インキュベーションの終了までに、上清を集め、HBV−DNA濃度を検出キット製造業者の使用説明書に従って蛍光定量PCRで決定した。
抑制率(%)=(対照の平均DNA濃度−試料の平均DNA濃度)/対照の平均DNA濃度×100%
統計分析のためにステューデントのt検定を用いた。P<0.05を統計的に有意と見なした。
適切な濃度では、CMS−017およびCMS−023は、対照と比較して統計的有意性(p<0.05)をもって、インビトロでB型肝炎ウィルスの発生を抑制できることが判明した。これは、CMS−017およびCMS−023が、B型肝炎関連ウィルス感染の管理に使用し得ることを示す。
目的:インビボでのアヒルB型肝炎ウィルス(DHBV)に対するCMS−017の抗ウィルス効果の調査。
食塩水に溶解したCMS−017を、筋肉内注射により28日間ChongqingアヒルB型肝炎動物モデルへ投与した。DHBV DNAおよびDHBsAg(アヒルB型肝炎表面抗原)の各血清量を、各々血清ドットブロットハイブリッド形成およびELISAにより観察し、ブランク対照と比較した。
CMS−017は、処置期間中にDHBV DNAおよびDHBsAgの各血清量を低下させることができることが判明した(P<0.01)。7日間処置を中断しても、リバウンドを認めなかった。
1 動物モデル[2]
1日齢のChongqingアヒルの腹腔内にDHBV DNA陽性血清(5×107コピー/ml)0.1mlを接種することにより、肝炎動物モデルを樹立した。接種から10日後、血液試料を外頚静脈から採取し、ジゴキシ標識DHBV DNAプローブとのドットブロットハイブリッド形成[3]により、感染済みであることを確認した。アヒルを2週齢まで飼育して、試験に参加させた。
DHBV感染を確認したアヒルを以下の群に無作為に振り分けた。
1)対照群(n=12):生理食塩水を1日1回、1ml/日で筋肉内注射で投与
2)CMS−017群(n=12):CMS−017(生理食塩水1mlに溶解)を1日1回、200μg/kg/日で筋肉内注射で投与
1)DHBV DNA血清量
DHBV DNAプローブは、製造業者(Roche Co.)の標識キット手順に従って蛍光標識をした。アヒル血清は、ニトロセルロース膜上にドットブロットし(2点/試料)、DHBV DNAの定量のために蛍光標識プローブとハイブリッド形成させた[3]。DHBV DNA40μl+DHBsAg100μlを内部標準として使用した。CDP-Star蛍光測定試薬を蛍光増幅のために使用した。Vuego Scan (Brisa-620st)スキャナーを膜走査のために使用し、Discovery Series Quantity Oneソフトウェアをブロットの定量分析のために使用した。ブロット数値は「容量」(容量=強度×mm2)として記述した。
DHBsAg量は、ELISA法[5〜8]で決定し、OD値をELISAリーダー(Bio-TEK Co.)により490nmで得た。
各群に対してSPSSソフトウェアを用いて、対応のあるt−検定を行った。
1.血清DHBV DNA濃度の変化
適切な濃度では、CMS−017は、食塩水対照と比較して統計的有意性(p<0.05)をもって、インビボで抗肝炎性を有することが判明した。CMS−017は、ウィルス感染関連障害の管理に使用し得る。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2):89-91.
2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua. Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4):295-297.
3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1):13-15.
4. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Purification of Duck hepatitis B surface antigen and its applications. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 2001; 26(1):14-16.
5. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. A comparison of specifically immune response in DHBV-infected ducks. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(3):166-168.
6. Tang Ni, Huang Ailong, Qi Zhenyuan, et al. Immune response of acutely infected ducks to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Microbiology and Immunology 2000; 2(4):24-29.
7. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4):209-211.
8. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003,3 (28).
1 材料
2 薬物および試薬
CMS024−16:Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
5−Fu:Tianjin Jinyao Amino Acid Co., Tianjin, PR China
ウシ胎児血清:Hyclone, Logan, Utah
RPMI−1640細胞培養培地:GIBCO(登録商標), Invitrogen, Carlsbad, California, USA
特定病原体未感染等級(SPF)の4〜5週齢で、健常な雌性BALB/c(nu/nu)ヌードマウス:Academy of Military Medical Sciences, China
ヒト胃癌細胞系BGC−823:Cancer Research Department, China Medical Science Institute
2.1 動物モデルの調製および抗腫瘍効果の決定[1]
対数増殖期のヒト胃癌細胞系BGC−823を2×107個/mlの濃度に調節し、次いでヌードマウスの背部皮下に接種した(0.1ml/マウス)。接種済み動物を、CMS024−16(160μg/kg/日、320μg/kg/日、および640μg/kg/日、全て0.2ml/日)、陽性対照(5−Fuを0.2ml/日で20mg/kg/日)、ならびに陰性対照(生理食塩水、0.2ml/日)の各群に無作為に分けた。腹腔内注射による試験物質の投与は、腫瘍移植後の翌日に始めて毎日1回30日間継続して行った。最後の注射後の翌日、腫瘍塊を採集し、その重量を測定した。抑制率=(陰性対照の平均重量−試験群の平均重量)/(陰性対照の平均重量)×100%
データは平均値±SDで表わした。統計分析のためにSPSSソフトウェアのANOVAを使用した。P値<0.05を統計的に有意性ありと見なした。
160〜640μg/kg/日の投与量のCMS024−16は、生理食塩水群と比較して統計的有意性(P<0.05)をもって、ヌードマウス移植ヒト胃癌BGC−823異種移植片の増殖を抑制できることが判明した。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Li XH, Zhang GY, Luo FJ, Xu MH, Li Q. The effect of Helicobacter pylori on the expression of metallo proteinases in gastric carcinoma cell lines. World J Chinese Digestion, 2003, 11(5):544-546.
目的:マウスにおける肝癌H22の増殖に対するペプチドの効果の調査。
1.1 薬物および試薬
CMS024.04、CMS024.05、CMS024.14、およびCMS024.16は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
健常BALB/cマウス(CLA等級、6〜8週、体重18〜22g)は、Animal Center of Military Medical Academy of Science, Beijing, Chinaから入手した。
肝癌H22細胞株を保持したマウスは、Tumor Department of Medical Institute of China Medical Academy of Science, Beijing, Chinaから入手した。
健常BALB/cマウスは、CMS024.04、CMS024.05、CMS024.14、およびCMS024.16(80μg/kg/日)、5−Fu(20mg/kg/日、2日毎に1回)、食塩水(0.2ml/日)、および正常群(腫瘍細胞を接種していない)の各群に無作為に分けた。
6〜8日間肝癌を接種したマウスを屠殺した。腹水を採集し、細胞濃度をD−ハンクス液で5×107個/mlに調整した。これを0.2ml、正常対照を除外して各BALB/cマウスの腹腔内に接種した。
試験物質の投与は、細胞接種後の翌日に開始した。該ペプチドおよび食塩水を毎日、5−FUは2日毎に1回、60日間連続して、またはマウスが死ぬまで投与した。
死亡時期を記録し、生存期間の延長を算出した。生存期間延長を以下のように算出した。
生存期間延長率(%)=(試験群の平均生存日数)−(食塩水対照群の平均生存日数)/(食塩水群の平均生存日数)×100%
60日間を超えて生存したマウスを長期間生存マウスと見なした。
統計的比較のためにKaplan−Meier法を用い、0.05以下のP値を統計的に有意性ありと見なした。
実験は別々に2回行い、その結果は以下の通りである。
CMS024.04、CMS024.05、CMS024.14、およびCMS024.16は、食塩水対照群と比較して統計的有意性をもって、H22肝癌の移植を受けたマウスの生存を延長できることが判明し、これらのペプチドが癌の管理に使用し得ることを示した。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Y Zhai and ZJ Lu. Effect of thalidomide on tumor growth in mouse hepatoma H22 model. Ai Zheng, Dec 2003; 22(12):1301-6.
[2] YX Yang, L Zhu, X He, et al. Antitumor activity of mitoxantrone-nanosphere against murine liver tumor H22. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, Jan 2004; 35(1):68-70.
目的:CMS−030の抗炎症特性の調査。
1.1 薬物および試薬
CMS−030:Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
カラゲニン:Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
デキサメタゾン(DXM):Tianjin JinYao Co. Ltd., Tianjin, PR China
6〜8週齢で体重180〜220gのウィスターラット、Vitalriver Experiment Animal Co. Ltd., Beijing, PR China
ウィスターラットをDXM群(0.2mg/kg/日)、食塩水対照群(1ml/日)、および3投与量のCMS−030群(2、10、20μg/ml/日)に無作為に振り分けた。薬物は全て、食塩水で0.5mlに希釈し、毎日腹腔内(i.p)に投与した。薬物投与から2週間後、1%カラゲニン食塩水0.15mlを皮下注射で右足に接種した。0.5時間後、右足の周囲長を精確に測定し、接種後の周囲長から接種前の周囲長を差し引くことにより、足部腫脹を算出した。抑制指数(%)=(食塩水対照群の足部腫脹−薬物群の足部腫脹)/食塩水対照群の足部腫脹×100%。
一元配置ANOVAの分析を用いて統計分析を行った。
ラットにおけるカラゲニン誘発足部腫脹は、インビボでの急性炎症の確立された動物モデルであり、薬物の抗炎症効果の評価に使用された[2]。カラゲニンは、炎症部位にプロスタグランジンの過剰合成を誘発することができる。他の血管作用物質と共同して、過剰生成プロスタグランジンは局所的腫脹を誘発することになろう。CMS−030は、統計的有意性(P<0.01)をもって、ラットにおいてカラゲニンが誘発した足部腫脹を抑制できることが判明した。したがって、CMS−030は、抗炎症性を有することが示された。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Li Jinhua, Zhang Huiqing, Zheng Kezhi, et al. Inhibitory effects of Orgotein on the swelling of hind paw in rats induced by carrageenin. Suzhou University Journal of Medical Science, 2002, Vol, 22(4):386-388.
[2] Huang Zhili, Kagoshima Masatoyo, Kagawa Eiichiro, Anti-inflammatory and ulcerogenic effects of 3-(N,N-diethylamino) propylindometacin HCl. Acta Pharmacologica Sinica, 1997, Vol, 18(4):306-308.
目的:過食ラットを動物モデルとして用いたCMS−030の抗肥満効果の決定。
1 材料
1.1 試験物質および動物
CMS−030は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
特定病原体未感染等級で、体重135±15gの雄性スプレイグ・ドーリー(SD)ラット:Experimental Animal Center of First Military Medical University
トリグリセリドキット:Shanghai Rongcheng Biotechnology Laboratory
血清総コレステロールキット:Zhongsheng Beikong Biotechnology Holding Ltd.
高栄養および標準栄養食餌の処方は、State Food and Drug Administration, PR China (SFDA)刊行のGuideline for Pre-clinical Research of Anti-obesity Drug[1] に従って作成した。
データは、平均値±標準偏差として提示してある。ソフトウェアDAS(Drug And Statistics Ver1.0)を用いた各群内または群同士間の比較に、対応のあるt−検定または単一因子ANOVAを適用した。P<0.05を統計的に有意性ありと見なした。
適切な投与量のCMS−030は、食塩水対照と比較して統計的有意性(P<0.05)をもって、栄養肥満ラットにおける体重減少を誘発し、各血中脂質量を低減できることが判明した。該物質の投与中に、食欲に有意な変化はなかった。CMS−030は、栄養関連の肥満および脂質過多の管理に使用し得る。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. SFDA, PR China. The guideline for pre-clinical research of new drugs. 1993. 193-194.
2. Bays HE. Current and investigational anti-obesity agents and obesity therapeutic treatment targets. Obes Res. 2004; 12 (8):1197-1211.
目的:マウスにおける遅延過敏症(DTH)に対するCMS−030の抑制効果の調査。
1.1 薬物および試薬
CMS−030:Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
2,4−ジニトロフルオロベンゼン(DNFB):Smack Co. Ltd.
硫化ナトリウム(Na2S):Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China
特定病原体未感染等級(SPF)の6〜8週齢で、体重18〜22gのBalb/cマウス:Military Medical Academy of Science, PR China
BALB/cマウスを食塩水対照(0.5ml/日)およびCMS−030(10μg/kg/日)の各群に無作為に分けた。試験物質を食塩水0.5mlに溶解し、感作前の2週間、1日1回腹腔内に投与した。
統計分析は、SPSSによる一元配置ANOVAを用いて行った。
CMS−030は、食塩水対照と比較して統計的有意性(P<0.05)をもって、DNFBに対するマウスの遅延過敏症反応を抑制できることが判明した。これは、CMS−030が過敏症関連免疫障害の管理に使用し得ることを示した。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Li Weidong, Ren LianSheng, Lin Zhibin, et al. Preliminary study on immunomodulating actions of Actarit in mice. Journal of Beijing Medical University, 2000, Vol, 1(32):1-3.
目的:CMS−030の抗同種移植片拒絶特性の調査。
1.1 動物
5週齢で、特定病原体未感染の雌性および雄性のBalb/c(H−2b)およびC57BL/6J(H−2d)マウス:Institute for Laboratory Animals of Military Medical Academy of Science (Beijing, China)。雄性および雌性が半々。
CMS−030:Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
サイクロスポリン(CsA):Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland。CsAの全群に対して最終容量0.5mlにして溶解。
ウシ血清、RPMI−1640、ハンクス液:GIBCO(登録商標), Invitrogen, Carlsbad, California, USA
MTT、ConA:Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
NaS:Tianjin Beilian Fine Chemicals Co., Ltd., Tianjin, PR China
マウスIL−2 Elisaキット:R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA
インビボ試験に対して、マウスを以下の各群に無作為に分けた。
CMS−030(10μg/kg/日)
CMS−030(2μg/kg/日)
CsA(10mg/kg/日)
生理食塩水(0.5ml/日)
健常Balb/cマウスの脾臓を無菌的に切除し、氷冷したD−ハンクス液に浸漬した。脾臓細胞は、RPMI−1640中、つや消しスライドグラスで脾臓を破壊することにより調製した。その細胞をRPMI−1640中、4℃および1200rpmで10分間、2回洗浄した。次いで、細胞数を計数し、各アッセイに必要な濃度に調整した。実験における細胞生存率は、トリパンブルー排除法で決定したが、95%を超えるべきである。
健常Balb/cマウスの脾臓細胞を氷冷したD−ハンクス液で洗浄し、RPMI−1640中8×106個/穴へ再懸濁することにより、応答細胞を形成した。健常C57BL/6Jマウスの脾臓細胞懸濁液に、37℃のRPMI−1640中、5%CO2中で45分間マイトマイシン(25μg/ml)とインキュベートした後、RPMI−1640で洗浄し、8×106個/穴へ再懸濁することにより、刺激細胞を形成した。試験群に対する96穴培養プレートを用いて、応答細胞100μgおよび刺激細胞100μg、更に最終濃度が40μg/ml、8μg/ml、1.6μg/mlまたは0.32μg/mlとなるように、CMS−030を20μl添加した。陽性対照群に対しては、応答細胞100μl、刺激細胞100μlおよびRPMI−1640を20μl添加した。陰性対照群に対しては、刺激細胞200μlおよびRPMI−1640を20μl添加した。並行する6穴を各組合せに対して用いた。37℃および5%CO2で5日間インキュベーションした後、リンパ球の増殖をMTT比色アッセイにより測定した。
24時間齢新生児C57BL/6Jマウスから、供与心臓を切除した。その心臓をD−ハンクス液に浸漬し、心臓腔から血液を一掃した。その心臓を健常成体Balb/c受容マウスの耳介道に皮下移植した。心臓および該経路中の空気は、僅かな圧力で追い出した。移植後の6日目から開始して、移植心臓の心電図(ECG)を毎日撮った。3日連続ECG信号がなければ、移植術が失敗であることを示し、そのマウスを統計分析から除外した。ECGは毎日追跡し、拒絶時期をECG信号が消えた日とした。試験物質は、手術の6日前から開始して腹腔内に投与した。1群につきマウスは10匹であった。サイクロスポリンAは10mg/kg/日、CMS−030は10μg/kg/日または2μg/kg/日、食塩水は0.5ml/kg/日を投与した。統計分析は、Kaplan−Meierの対数順位検定による食塩水処置群との比較を用いて行った。
Balb/cマウスの背部の毛1パッチを8%Na2S溶液により除去した。翌日、その皮膚を外科的に除去することにより、約1cm2の創傷床を生成し、次いでその創傷床上に、同性のC57BL/6J供与マウスの全厚尾部皮膚片1cm2を載せた。その手術部位をパラフィンガーゼ層で被覆、保護した後、絆創膏を施した。移植から8日後に絆創膏を外し、同種移植片の生存性について受容マウスを毎日監視した。拒絶の終点は、同種移植片の10%未満だけがなお生存しているときに設定した。試験物質による腹腔内処置は、手術の6日前に開始した。1群につきマウスは10匹であった。サイクロスポリンAは10mg/kg/日、CMS−030は10μg/kg/日または2μg/kg/日、食塩水は0.5ml/kg/日を投与した。処置は、手術後更に20日間継続した。
皮膚移植片受容マウスの脾臓細胞を分離し、RPMI−1640中で4×106個/mlに再懸濁した。細胞100μl/穴を96穴プレート中に添加した。試験穴に対しては、ConA100μlを添加して最終濃度5μg/mlとした。対照穴に対しては、RPMI−1640を100μl代わりに添加した。1条件につき並行穴4個。細胞は、37℃および5%CO2で68時間インキュベートした。リンパ球の増殖は、MTT比色アッセイにより測定した。各試料のODは、630nmを基準とした570nmで分光法で測定した。データは、試験群のODを対照群のODで割った刺激指数として表示した。
皮膚移植片受容マウスの脾臓細胞を分離し、RPMI−1640中で2×106個/mlに再懸濁した。細胞1.5ml/穴を24穴プレート中に添加し、付着させるために24時間インキュベートした。ConA100μlを添加して最終濃度10μg/mlとした。細胞を更に48時間インキュベートし、続いて遠心分離後に上清を採集した。培養上清中のIL−2量をELISAにより決定した。
Kaplan−Meierの対数順位検定による対照群との比較を用いて、同種移植片の生存期間の分析を行った。ステューデントの両側t検定による平均値の分散との比較は、他の実験のために使用した。
0.32μg/mlから40μg/mlの濃度で、CMS−030は、インビトロでのConA誘発Tリンパ球増殖を統計的に有意に抑制できることが判明し、CMS−030がインビトロでTリンパ球の増殖を抑制できることを示した。MLRは、異なるHLA−II分子に対するリンパ球の応答を判定するためのインビトロ実験であり、臓器移植後の拒絶性を予測するモデルである[7]。1.6μg/mlから40μg/mlの濃度で、CMS−030は、混合リンパ球反応を統計的に有意に抑制できることが判明し、CMS−030が臓器移植後の拒絶性を減少させることができることを示した。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Roma Kalra, Shashi P. Singh, Juan C, et al. Immunosuppressive and Anti−Inflammatory Effects of Nicotine Administered by Patch in an Animal Model. Clinical and Diagnostic Laborarory Immunology, May 2004, 563?568.
[2] Dubey DP, Yunis I, Yunis EJ, et al. Cellar typing: mixed lymphocyte response and cell mediated lympholysis. American Society for Microbiology, 1986, 847−848.
[3] Vakeva A Laurila P,Meri S, et al.. Regulation of complement membrane attack complex formation in myocardial infarction. Am J Pathol, 1993, 143:65.
[4] Ming Jiankuo, Wang Xingbing, Huang Baojun, et al. Peptide Nucleic Acid Antisense Prolongs Skin Allograft Survival by Means of Blockade of CXCR3 Expression Directing T Cells into Graft. The Journal of Immunology, 2003, 170:1556?65.
[5] Maria A. Puertollano, Manuel A. de Pablo, et al. Relevance of Dietary Lipids as Modulators of Immune Functions in Cells Infected with Listeria monocytogenes. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2002, 9:352−357.
[6] Mayumi H,Himeno K,Shin T, et al. Drug−induced tolerance to allografts in mice. Immunobiology, 1985, 169(2):147−161.
[7] Rene J.Duquesnoy Li YP. Transplantation immunobiology. 2002, 10:5−7.
目的:Balb/cマウスに対するペプチドの抗疲労効果の調査。
1.1 薬物および試薬
CMS−001.30およびCMS−001.31は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
エリスロポエチン(EPO):Japan Kunpeng Medical Corporation
特定病原体未感染(SPF)等級で体重18〜22gの雄性Balb/cマウス:Academy of Military Medicines and Sciences Experimental Animal Center, PR China
Balb/cマウスを、CMS−001.30(20μg/kg/日)、CMS−001.31(20μg/kg/日)、EPO(1000u/kg/日、週3回)、および食塩水対照の各群に無作為に分けた。試験物質を食塩水0.5mlに溶解し、1日1回30日間連続して腹腔内に適用した(EPOを適用しない場合、EPOを食塩水で代用した)。10日目に、マウスを水温25±1℃で10分間泳ぐように訓練した。試験物質の最終投与から30分後、マウスを水泳槽(50cm×50cm×40cm)中で泳ぐように配置した。水深は30cm、水温は25±1℃であった。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。死亡するまでのマウスの水泳時間(分)を記録した。
消耗的水泳時間延長率(ESTR)(%)=(試験群の平均消耗的水泳時間−食塩水対照の平均消耗的水泳時間)/(食塩水対照の平均消耗的水泳時間)×100%
群同士間の差異は、ANOVA分散分析で分析した。
CMS001−30およびCMS001−31は、抗疲労特性を有することが判明したので、疲労関連障害の管理に使用することができる。
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Mizunoya W, Oyaizu S, Ishihara K, et al.Protocol for measuring the endurance capacity of mice in an adjustable−current swimming pool. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 May; 66(5):1133−1136.
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Principles of Pre−clinical Research of New Drugs, People’s Republic of China. 1993, 7:134−135.
2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People’s Health Publishing House. 1991, 1221−1234.
3. Principle of new drug research in pre−clinic issued by Ministry of Health, People’s Republic of China. 1993, 7:140.
4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6):356−358.
5. Qian Wang. Modern medical experiment method. People’s Health Publishing House. 1998, 482−483.
6. Principle of new drug research in pre−clinic issued by Ministry of Health, People’s Republic of China. 1993, 7:141.
7. Principle of new drug research in pre−clinic issued by Ministry of Health, People’s Republic of China. 1993, 7:132−133.
8. Principle of new drug research in pre−clinic issued by Ministry of Health, People’s Republic of China. 1993, 7:128−129.
9. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Phamalogical experiment (second edition). People’s Health Publishing House. 1998, 137−138.
10. Jiatai Li, clinical pharmacology(second edition). People’s Health Publishing House. 1998, 1338−1339.
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための一例の方法を提供する。上記の表Aに列挙したペプチドのうち1つをコードするDNA配列は、化学的手段によって合成され、該DNA配列は、当業者によく知られた遺伝子操作の標準的技術を用いて、発現ベクター中へ挿入される。選択された発現ベクターは、乳酸桿菌において機能的な構造性プロモーター、特定の5’ないし3’配向におけるDNA配列の導入のためのマルチプルクローニングサイト、ならびに抗生物質耐性(クローニング法において助けるための)を与える選択マーカー遺伝子を含有し、ペプチドの生産および/または分泌を補助するための他の配列、例えば、シグナルペプチド配列を含みうる。かかるベクターの例は、Pavlaの米国特許第5,592,908号(出典明示により、全体として本明細書の一部とされる)によって提供される。簡単に言うと、該特許は、乳酸桿菌種において機能する数個の既知のプロモーター、ならびに該細菌中の新規なプロモーター(そのいずれも、乳酸桿菌中でペプチドを発現するように、本発明のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されていてもよい)を見出す方法を論じる。上記の米国特許第5,529,908号に記載のようなラクトバシラス・ラクチス中で活性な16ないし35個のほとんど疎水性のアミノ酸よりなるペプチドのようなシグナルペプチドをコードしている核酸は、プロモーターと本発明のペプチドをコードしている核酸との間に挿入され、その結果、シグナルペプチドをコードしている核酸は、本発明のペプチドをコードしている核酸を有するフレーム内にある。
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Aに列挙したペプチドのうち1つをコードするDNA配列は、化学的手段によって合成され、該DNA配列は、遺伝子操作技術(全ての技術は当該分野で知られている)によって、発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、イー・コリおよびビー・サチルスの両方において増殖することができ、形質転換細菌のコロニーを選択するための抗生物質耐性遺伝子を含有するシャトルベクター、例えば、pTZ18R(Pharmacia, Piscataway, NJ)を含む。該ベクターは、ビー・サチルスにおいて活性な構造性プロモーター、例えば、ビー・サチルスのSac B遺伝子由来のプロモーターならびに細菌細胞からの発現した異種蛋白質の有効な輸送を指示するビー・サチルスにおいて活性なシグナルまたはリーダーペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含有することができる。かかるベクターの一例は、Fahnestockの米国特許第6,268,169号(出典明示により、全体として本明細書の一部とされる)に開示される。簡単に言うと、上記のように、本発明のペプチドをコードしているDNAは、当業者によく知られた技術によって、DNAのクローニングを容易にするための制限酵素部位および/または他の配列を用いて合成されるであろう。イー・コリ中への形質転換、播種、選択およびプラスミドを増殖してプラスミドストックを作成後、該プラスミドをビー・サチルス中に形質転換し、播種培地において、形質転換体を抗生物質耐性によって選択する。
遺伝子操作された細菌の培養物を増殖させ、少なくともその一部を細菌が増殖することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Aに列挙されたペプチドのうち1つをコードするDNA配列は、化学的手段によって合成され、該DNA配列は、遺伝子操作技術(全ての技術は当該分野で知られている)によって発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、安定に維持された酵母蛋白質発現ベクターを含み、それは、pADH1のような構造性酵母プロモーター、酵母およびイー・コリの両方におけるベクターの複製のための部位、選択目的のために栄養要求性酵母突然変異体に栄養を与える遺伝子、マルチプルクローニングサイト(MCS)および、所望により、シグナルペプチドをコードする配列を含む。このようなベクターは、商業的に入手可能であり、当該分野でよく知られているか、または標準的な技術を用いて容易に構築できる。合成DNAの酵母ベクター中への挿入、イー・コリ中への形質転換、形質転換したイー・コリの選択培地への播種、形質転換した細菌コロニーの選択および該コロニー由来の細菌の成長培養物からのプラスミドDNAの調製後、よく知られた技術、例えば、酢酸リチウム形質転換またはエレクトロポレーションによって、ベクターをサッカロミセス・セレビシエ中に形質転換する。形質転換のために選択されたサッカロミセス・セレビシエの株は、最少培地プレート上で生育するために、プラスミド上の遺伝子を必要とするであろう突然変異体栄養要求株である。形質転換された酵母コロニーは、ベクター上に提供される遺伝子を欠く成長培地上に酵母を播種することによって、単離される。ベクターおよびその選択遺伝子を受け取り、その遺伝子産物を発現している酵母だけが、最少培地上でコロニーに成長できるであろう。ペプチド分泌の証明は、ウェスタンブロットを行い、成長培地に存在するペプチドのゲル電気泳動を行うことによって、または他の標準的技術によって、得ることができる。
Claims (6)
- 疲労を低下させる医薬の製造における、配列番号1を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの使用。
- 疲労を低下させる医薬の製造における、配列番号1からなるアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの使用。
- 肝グリコーゲン貯蔵量を増加させる医薬の製造における、配列番号1を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの使用。
- 肝グリコーゲン貯蔵量を増加させる医薬の製造における、配列番号1からなるアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの使用。
- 血中乳酸量を低下させる医薬の製造における、配列番号1を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの使用。
- 血中乳酸量を低下させる医薬の製造における、配列番号1からなるアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの使用。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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