CN1210294C - 序列号21的生物活性肽 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了30种高纯度并且有生物活性的肽。还公开了能够编码生物活性肽的核酸序列以及由肽制备的药物配方。

Description

序列号21的生物活性肽
技术领域
本发明涉及免疫学领域。特别是，本发明涉及能够调节免疫反应的肽及其药物组合物。
背景技术
本领域已知生物活性肽可用于治疗疾病和用作药物组合物。例如，US 6,191,113公开了一种对平滑肌细胞生长具有抑制活性的肽，其因此可以用于防治与平滑肌细胞生长有关的病理状态，如动脉硬化、血管成形术后的再狭窄、移植血管后的腔狭窄、及平滑肌肉瘤等。US 6,184,208公开了另一种肽，发现其调节一些生理过程，如上皮生长带的增重活性和头发生长。
发明内容
因此，本发明的目的是鉴别生物活性肽。首先以标准的化学方法合成许多肽，然后鉴定其生物活性。肽编号用字母CMS和其后的数字表示。共有30条肽被鉴定为在体内具有生物活性。这些生物活性肽的序列及其相应的识别号(SEQ ID NO)参见表A。
表A
 SEQ ID NO：   肽名称 肽序列
    1   CMS001 Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe
    2   CMS002 Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
    3   CMS008 Lys Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu
    4   CMS010 Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala ProLeu Asn Pro Lys
    5   CMS012 Leu Gly Met Glu Ala Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr
    6   CMS013 Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu
    7   CMS014 Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val
    8   CMS015 Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met
    9   CMS016 Ile Gly Met Glu Ser Ala Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr
    10   CMS018 Val Gly Met Gly Glu Lys Asp Ser Tyr
    11   CMS019 Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr
    12   CMS020 Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val
    13   CMS021 Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu
    14   CMS022 Tyr Ser Phe
    15   CMS023 Ala Ala Phe
    16   CMS024 Tyr Ser Leu
    17   CMS026 Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met
    18   CMS027 Phe Glu Glu Asn Met
19 CMS028 Phe Glu Pro Ser Phe
    20   CMS029 Phe Asn Glu Glu
    21   CMS030 Phe Glu Glu Met
    22   CMS032 Phe Glu Glu Glu
    23   CMS033 Phe Glu Ser Phe
    24   CMS034 Pro Glu Asn Phe
    25   CMS035 Phe Val Asn Asp
    26   CMS036 Phe Gln Pro Ser Phe
    27   CMS003 Phe Asn Phe Val Pro Pro
    28   CMS007 Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe
    29   CMS009 Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
    30   CMS011 Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
相应地，本发明的一个方面涉及基本上纯化的肽，其具有SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：30所示的序列。因此，本发明还涉及包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的基本上纯化的肽。本发明还涉及基本上由选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列组成的基本上纯化的肽。在一具体实施方案中，本发明的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
本发明的另一方面涉及是具有SEQ ID NOs：1-30的氨基酸序列的肽的功能衍生物的基本上纯化的肽。因此，本发明还涉及包含一种氨基酸序列的基本上纯化的肽，该氨基酸序列是选自SEQ IDNOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物。本发明还涉及基本上由一种氨基酸序列组成的基本上纯化的肽，该氨基酸序列是选自SEQID NOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物。在一具体实施方案中，本发明的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
本发明的另一个方面涉及具有上述SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：30之肽的编码序列的核酸。本发明进一步涉及含有如下SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：30所示肽的核酸序列的表达载体。因此，本发明的这一方面还涉及一种包含编码一种肽的核苷酸序列的遗传载体，所述的肽包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列。本发明还涉及一种包含编码一种肽的核苷酸序列的遗传载体，所述的肽基本上由选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列组成。本发明还涉及一种包含编码一种肽的核苷酸序列的遗传载体，所述的肽包括选自SEQ ID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物。本发明还涉及一种包含编码一种肽的核苷酸序列的遗传载体，所述的肽基本上由是选自SEQ ID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列组成。
本发明的再一方面涉及含有与一种包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的肽相邻的前导或信号肽的杂合肽。本发明还涉及含有与一种肽相邻的前导肽的杂合肽，该肽包括具有选自SEQ IDNOs：1-30的一种氨基酸序列的肽的功能衍生物。
本发明还涉及一种包含编码一种肽的核苷酸序列的遗传载体，所述肽包含与一种包含一功能氨基酸序列的肽相邻的前导氨基酸序列，所述功能氨基酸序列是选自SEQ ID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物。本发明还涉及一种包含编码一种肽的核苷酸序列的遗传载体，所述肽包含与一种基本上由一功能氨基酸序列组成的肽相邻的前导氨基酸序列，所述功能氨基酸序列是选自SEQID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物。
在一具体的实施方案中，由上述任一种遗传载体产生的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
本发明的再一方面涉及具有包含编码一种肽的核苷酸序列的基因组的微生物，所述肽包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列。本发明还涉及具有包含编码一种肽的核苷酸序列的基因组的微生物，所述肽基本上由选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列组成。
本发明的再一方面涉及具有包含编码一种外源肽的核苷酸序列的遗传物质的微生物，所述外源肽包含一种是选自SEQ ID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列。本发明还涉及具有包含编码一种外源肽的核苷酸序列的遗传组成的微生物，所述外源肽基本上由一种是选自SEQ ID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列组成。本文所用的外源肽是指具有与天然未修饰形式的该微生物正常表达的任何其它肽不同的氨基酸序列的肽。
本发明的再一方面涉及具有包含编码一种外源杂合肽的核苷酸序列的遗传组成的微生物，所述外源杂合肽包含与一种肽相邻的前导氨基酸序列，该肽包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列。本发明还涉及具有包含编码一种杂合肽的核苷酸序列的基因组的微生物，所述杂合肽包含与一种基本上由选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列组成的肽相邻的前导氨基酸序列。
本发明的再一方面涉及具有包含编码一种外源杂合肽的核苷酸序列的遗传组成的微生物，所述外源杂合肽包含与一种肽相邻的前导氨基酸序列，该肽包含一种是选自SEQ ID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列。本发明还涉及具有包含编码一种外源杂合肽的核苷酸序列的遗传组成的微生物，所述外源杂合肽包含与一种肽相邻的前导氨基酸序列，所述肽基本上由一种是选自SEQ ID NOs：1-30的一种生物活性氨基酸序列的功能衍生物的功能氨基酸序列组成。
在一具体的实施方案中，由上述任一种微生物产生的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
本发明的另一个方面涉及包含一种基本上纯化的肽的药物组合物，所述基本上纯化的肽包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列。本发明还涉及包含一种基本上纯化的肽的药物组合物，所述肽基本上由选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列组成。
本发明的另一个方面涉及包含一种基本上纯化的肽的药物组合物，所述基本上纯化的肽包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物。本发明还涉及包含一种基本上纯化的肽的药物组合物，所述肽基本上由选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物组成。本发明还涉及基本上由一种基本上纯化的肽组成的药物组合物，所述肽基本上由选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物组成。
在一具体的实施方案中，上述任一种药物组合物中存在的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
本发明的另一方面涉及制备药物组合物的方法，包括提供一种包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的基本上纯化的肽，并将所述基本上纯化的肽与一种药物可接受载体混合。本发明还涉及制备药物组合物的方法，包括提供基本上由SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列组成的基本上纯化的肽。
本发明的另一方面涉及制备药物组合物的方法，包括提供一种基本上纯化的肽，并将所述基本上纯化的肽与一种药物可接受载体混合，所述基本上纯化的肽包含一种是选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物的氨基酸序列。本发明还涉及制备药物组合物的方法，包括提供一种基本上纯化的肽，所述肽基本上由是选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物的一种氨基酸序列组成。在上述任一种方法中，所述的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
本发明的另一个方面涉及人的治疗方法，包括给予人药学上有效量的包含选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的基本上纯化的肽。本发明还涉及人的治疗方法，包括给予人药学上有效量的基本上纯化的肽，所述肽包含是选自SEQ ID NOs：1-30的一种氨基酸序列的功能衍生物的氨基酸序列。。
在一具体的实施方案中，用于治疗人的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
从上述任一种核酸序列表达的肽和/或杂合肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
本发明的另一方面涉及治疗疾病的方法，包括给予药物学有效量的具有SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：30的序列的基本上纯化的肽。在一具体实施方案中，如此给予的肽可以调节，但不限于调节，如下一或多种作用：免疫活性；肝炎感染，包括但不限于乙型肝炎感染；肾炎；癌症的生长，包括但不限于肉瘤、肝癌、白血病和黑素瘤；以及体重。
如上所述，本发明的另一实施方案是基本上由本发明的肽组成的肽或多肽。本文所用术语“基本上由...组成”是指这样的一种肽或多肽，其包括本发明的肽的氨基酸序列和羧基末端和/或氨基末端的额外氨基酸并保持本文提供的本发明的肽的活性。因此，作为一非限制性例子，当本发明的肽的活性是能调节免疫活性时，“基本上由”本发明的肽“组成”的肽或多肽将具有本文提供的与该肽有关的调节免疫活性的活性，并且不具有实质上降低肽或多肽的调节免疫活性的能力或者构成对该肽作为免疫活性调节剂这一基本新特征的实质改变的任何特征。因此，在前述例子中，其主要活性不是调节免疫活性并且在其中的某处含有本发明的肽的氨基酸序列的全长天然存在的多肽不是“主要由”本发明的肽“组成”的肽或多肽。类似地，在前述例子中，其主要活性不是调节免疫活性但是在其中的某处包括本发明的肽的氨基酸序列的基因工程化肽或多肽不是“主要由”本发明的肽“组成”的肽或多肽。
除了上述举例的免疫活性调节作用的例子外，前述定义也适用于本发明的所有多肽的各种活性。特别是，前述定义适用于具有下述详细描述中所述的调节病毒感染程度、调节肝炎感染程度、调节肾炎程度、调节癌症生长或调节体重等活性的本发明的肽。
通过使用本文提供的针对本发明具体肽的测定调节病毒感染程度、调节肝炎感染程度、调节肾炎程度、调节癌症生长或调节体重等活性的分析来测定一种肽或多肽的活性，本领域技术人员能容易地确定所述肽或多肽是否符合前述定义基本上由本发明的肽组成。
在优选的实施方案中，术语“基本上由...组成”是指除了本发明的肽之外另外还有少于20个氨基酸残基的肽或多肽。在更优选的实施方案中，该术语是指除了本发明的肽之外另外还有少于15个氨基酸残基的肽。在进一步优选的实施方案中，该术语是指除了本发明的肽之外另外还有少于10个氨基酸残基的肽。在另一优选的实施方案中，该术语是指除了本发明的一个肽之外另外还有少于6个氨基酸残基的肽或多肽。在另一优选的实施方案中，该术语是指除了本发明的一个肽之外另外还有少于4个氨基酸残基的肽或多肽。在最优选的实施方案中，该术语是指除了本发明的一个肽之外另外还有少于2个氨基酸残基的肽或多肽。
具体实施方案
这些肽可以用标准的合成方法从L-氨基酸原料合成，也可用基因工程的方法，使用编码各个肽的核酸序列合成每个肽。
一、生物活性
为了解这些肽的可能的生物活性，检查了它们对动物模型的免疫学作用，依据的是中华人民共和国卫生部药政局1993年颁布的《新药(西药)临床前研究指导原则》[1]。
使用T淋巴细胞转化实验、NK细胞胞毒活性的检测、T淋巴细胞分泌IL-2和γ-IFN细胞因子活性测试检测这些肽对特异细胞免疫功能的任何可能的作用。使用小鼠碳粒清除测试检测这些肽对非特异性细胞免疫功能的任何可能作用。使用绵羊红血细胞(SRBC)溶血测试检测这些肽对体液免疫功能的任何可能作用。使用免疫器官重量测试检测这些肽在器官水平的任何可能作用。
本研究中，肽样品选择了4个任意浓度，相邻浓度间差距为10倍，因此最高与最低浓度相差1000倍。同时以生理盐水组作为阴性对照，以目前较公认的免疫增强剂IL-2和IFN-γ组[10]作为阳性对照。另外，由于缺乏对剂量应答关系的了解，而机体的免疫反应又具有相当的复杂性，因此无论在任何剂量组与阴性对照比较具有统计学显著差异均被认为具有生物活性。
本研究所得结论如下：
1.肽CMS001、CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS015、CMS019、CMS021、CMS029、CMS034能够促进T淋巴细胞转化，与生理盐水组比较具有显著性差异。肽CMS014及CMS036能抑制T淋巴细胞转化，与生理盐水组比较具有显著性差异。
2.肽CMS001，CMS002，CMS003，CMS008，CMS009，CMS010，CMS011，CMS012，CMS013，CMS015，CMS016，CMS020，CMS021，CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036具有增强NK细胞杀伤活性的作用，与生理盐水组比较具有显著性差异。肽CMS008及CMS012在适当浓度，亦具有降低NK细胞杀伤活性的作用，与生理盐水组比较具有显著性差异。
3.肽CMS001、CMS003、CMS007、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS015、CMS020、CMS022、CMS034能够促进T淋巴细胞分泌白介素-2(IL-2)，与生理盐水组比较具有显著性差异。
4.肽CMS001、CMS003、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS016、CMS021、CMS022、CMS028能够促进T淋巴细胞分泌IFN-γ，与生理盐水组比较具有显著性差异。
5.肽CMS001、CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能促进在抗原攻击时合成抗SRBC抗体，与生理盐水组比较具有显著性差异。肽CMS002、CMS003、CMS009、CMS010、CMS011、CMS013、CMS014、CMS015、CMS018、CMS019、CMS020、CMS026、CMS028、CMS029、CMS030、CMS034、及CMS036在适当浓度，亦能抑制在抗原攻击时合成抗SRBC抗体，与生理盐水组比较具有显著性差异。
6.肽CMS003，CMS008，CMS009，CMS010，CMS011，CMS013，CMS016，CMS018，CMS019，CMS020，CMS022，CMS024，CMS027，CMS030，CMS035，CMS036能够增强单核吞噬细胞的吞噬功能，与生理盐水组比较具有显著性差异。
7.肽CMS001、CMS002、CMS008、CMS010、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能够增加胸腺的重量，与生理盐水组比较具有显著性差异。
8.肽CMS019、CMS020、CMS030能够增加脾脏的重量，与生理盐水组比较具有显著性差异。肽CMS001、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS013、CMS014、CMS015、CMS021、CMS023、CMS024、CMS027、CMS029、及CMS036在适当浓度能降低脾脏的重量，与生理盐水组比较具有显著性差异。
用于分析肽对小鼠的作用的材料与方法现描述如下：
材料
1.实验动物：纯系健康BALB/c小鼠，体重18-22g，雌雄各半，中国医学科学院实验动物中心提供。
2.给药方法：
重组鼠干扰素-γ(rmIFN-γ)组：3×105IU/kg/天
重组人白介素-2(rhIL-2)组：3×105IU/kg/天
生理盐水组：0.5ml/只/天
CMS肽剂量I组：500μg/kg/天
CMS肽剂量II组：50μg/kg/天
CMS肽剂量III组：5μg/kg/天
CMS肽剂量IV组：0.5μg/kg/天
各组药物均溶于0.5ml生理盐水中，经腹腔注射，每日一次，连续给药15天。
1.主要药品及试剂
肽：美国肽类公司
重组鼠干扰素γ(rmIFN-γ)：北京邦定生物技术有限公司
重组人IL-2(rhIL-2)：上海华新生物高技术有限公司
RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清：美国GIBCO公司
四甲基偶氮唑盐(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)：美国SIGMA公司
淋巴细胞分离液：中国医学科学院血液研究所
水泡性口膜炎病毒(VSV)、IFN-γ、IL-2标准品：中国药品生物制品样品检定所。
HT-2细胞、L929细胞：北京大学免疫学系WF Chen教授惠赠。
方法
1.肽对细胞免疫性的作用
1.1脾细胞悬液的制备[1，2]
BALB/c小鼠，随机分为肽组、IFN-γ组、IL-2组、生理盐水组，每组10只。于末次给药后次日，将小鼠颈椎脱臼致死，无菌操作取脾，用注射针轻轻捻碎脾组织，使单个细胞通过100目不锈钢网(孔径150μm)进入冷Hanks液中，将细胞悬液移至离心管中，200g离心10min后弃上清，加10倍体积的Tris-NH4Cl至细胞沉淀中，混匀后，室温下静置10min，150g离心10min，再用冷Hanks液洗涤细胞2～4次，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，调整细胞数至所需浓度。
1.2肽对T淋巴细胞转化影响实验[1，2]
将1×106/ml脾细胞悬液加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，每份样品设3个复孔。向分析孔中加入100μl/孔的100μg/ml ConA，，加100μl/孔的RPMI-1640作为对照。然后将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养66hr，再将细胞培养板150g离心10min，取上清，-20℃保存，以备检测细胞因子IL-2和IFN。
向去上清后的细胞培养板的细胞沉淀中加1mg/ml MTT液50μl/孔，振荡2min后，37℃、5％CO2培养箱中继续培养4hr。再将细胞培养板150g，离心10min，弃上清。向细胞沉淀中加入40mM盐酸-异丙醇120μl/孔，振荡3min后，在ELISA-reader上测吸光度(OD值)，测定波长570nm，参考波长630nm。
计算：
每个小鼠形成3个分析孔和3个对照孔。每个小鼠的刺激指数(SI)是通过首先计算3个复孔的平均OD值，然后将分析孔的值除以对照孔的值而获得。
1.3肽对NK细胞杀伤活性影响实验[3，4]
将小鼠的脾细胞按1.1中的方法制备成4×106/ml，将已达到对数生长期的YAC-1细胞制成1×105/ml。于96孔细胞培养板中加入脾细胞100μl/孔和细胞培养基100μl/孔，作为效应细胞孔；加YAC-1细胞100μl/孔和培养基100μl/孔，作为靶细胞孔；加YAC-1细胞100μl/孔和脾细胞100μl/孔，作为实验孔。每份样品均设3个复孔。将加好样品的96孔培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养4hr。
将细胞培养板150g，离心10min，弃上清。加1mg/ml MTT液50μl/孔，振荡2min后，37℃、5％CO2培养箱中继续培养4hr。将细胞培养板150g，离心10min，弃上清。加入40mM盐酸-异丙醇120μl/孔，振荡3min后，在ELISA-reader上测吸光度(OD值)，测定波长570nm，参考波长630nm。
计算：
每个小鼠有9个孔：3个仅含脾细胞的对照，3个仅含靶细胞的对照，3个含有脾细胞和靶细胞的分析孔。每个小鼠的NK细胞活性指数通过首先得出每一组合的三个复孔的平均OD值，然后将这一平均OD值代入如下公式而获得：
NK细胞活性指数＝[1-(脾细胞和靶细胞孔平均OD值-仅含脾细胞孔的平均OD值)÷(靶细胞孔平均OD值)]×100％
1.4肽对T淋巴细胞分泌IL-2活性影响实验[5]
取已达对数生长期的HT-2细胞，150g离心10min，弃上清，冷Hanks液重悬并离心洗细胞三次，在RPMI-1640中重悬收集的HT-2细胞，37℃、5％CO2培养30min，再用RPMI-1640重悬并离心洗细胞两次，用RPMI-1640配成2×105/ml浓度的细胞悬液。
将1.2中获得的上清液用RPMI-1640细胞培养基，倍比稀释成以下浓度：100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％。
用RPMI-1640细胞培养基将rIL-2稀释成以下浓度：500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、62.5IU/ml、31.25IU/ml、15.5IU/ml。
在96孔细胞培养板中，按以下每一组合设置3个平行孔：
阴性对照孔：100μlRPMI-1640+100μlHT-2细胞悬液
rIL-2标准品孔：100μlrIL-2溶液+100μlHT-2细胞悬液
分析孔：100μl稀释好的细胞上清液+100μlHT-2细胞悬液
将加好样品的细胞培养板放入37℃、5％CO2孵箱中培养68小时，150g离心15min，轻轻甩去上清，于各孔中加入用无酚红RPMI-1640配制的0.5mg/ml MTT，100μl/孔，振荡3～4min，继续培养4小时。150g离心15min，轻轻甩去上清，加盐酸—异丙醇(1∶300v/v)，120μl/孔，振荡混匀3～4min。酶标仪上选择检测波长570nm，参考波长630nm测定OD值。
计算：
取每一稀释度的3个平行孔的平均OD，并在半对数纸上绘图，浓度为X轴。获得测试上清和rIL-2的50％OD饱和度时的浓度。样品IL-2活性＝(样品达50％最大反应时的稀释度÷rIL-2标准品达50％最大反应时的稀释度)×rIL-2标准品达50％最大反应时的稀释度(IU/ml)
1.5肽对T淋巴细胞分泌IFN活性影响实验[6]
将1.2中获得的上清液用RPMI-1640细胞培养基，倍比稀释成以下浓度：100％、50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％。
用RPMI-1640细胞培养基将rIFN标准品稀释成以下浓度：500IU/ml、250IU/ml、125IU/ml、62.5IU/ml、31.25IU/ml、15.5IU/ml。
用RPMI-1640细胞培养基，将已达对数生长期的L929靶细胞调整至2×105/ml，调整VSV病毒原液的攻击强度为100TCID50。
在96孔细胞培养板中，按以下方法设置3个平行孔。
阴性对照孔：150μlRPMI-1640+100μlL929细胞
阳性对照孔：100μlRPMI-1640+100μlL929细胞+50μLVSV病毒
rIFN活性孔：100μlrIFN标准品+100μlL929细胞+50μLVSV病毒
分析孔：100μl稀释好的细胞上清液+100μlL929细胞+50μLVSV病毒
将加好样品的96孔细胞培养板37℃、5％CO2培养箱中培养24hr。于倒置显微镜下定期观察阳性对照孔以证实细胞裂解，然后如上述1.4部分所述收集、洗涤并读所有孔的OD。
计算：
如1.4部分相同方式获得在50％最大反应时的浓度。如下计算样品的IFN活性：
样品IFN活性＝(样品达50％最大反应时的稀释度÷rIFN标准品达50％最大反应时的稀释度)×rIFN标准品达50％最大反应时的稀释度(IU/ml)
2.肽对抗体形成影响的实验研究[7]
绵羊红血细胞(SRBC)如下制备：无菌条件下自健康成年绵羊外颈静脉取血，置于有玻璃珠的三角烧瓶中，摇动三分钟，然后将血液与Alsever溶液(葡萄糖2.05g，氯化钠0.4g，柠檬酸钠0.8g，加蒸馏水至100ml)混匀，置4℃冰箱备用。临用前样品在130g离心5分钟以收集SRBC。通过在生理盐水中重悬并离心洗涤细胞2次，然后经180g离心10分钟收集细胞沉淀。按2％(v/v)以生理盐水稀释，即得所需的绵羊红血细胞(SRBC)悬液。
将新鲜豚鼠血清按10∶1(v/v)加入离心压积SRBC中，于4℃轻轻振荡30min，制备补体。200g离心10min吸取上清液，用生理盐水1∶10稀释制备成所需补体工作溶液。
BALB/c小鼠，随机分为肽组、IFN组、IL-2组、生理盐水组，每组10只。按照1.1部分中描述的给药方法给药，在给药后第12天，腹腔注射SRBC悬液0.2ml，进行免疫。免疫4天后，摘除眼球取血，室温下放置1h，使血清充分渗出。以200g离心10分钟，取上层血清，用生理盐水稀释500倍。
在反应试管内先加已稀释鼠血清样品1ml，再加入SRBC悬液0.5ml，冰浴中冷却试管，向每管内加入补体工作溶液1ml。将试管移至37℃恒温水浴中，保温10min，随即置入冰浴中终止反应。以200g离心10min，取上清液供比色测定用。
测定样品的吸光度值：分别取上述上清液1ml置入试管中，加入Drabkin试剂(碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，蒸馏水1000ml)3ml，充分摇匀，室溫放置10min后，于540nm波长下比色，记录吸光度。
计算：
测定SRBC溶血时的对照吸光度值：取SRBC悬液0.25ml，加Drabkin试剂至4ml，摇匀，室溫放置10min，于540nm波长下比色，记录吸光度值。
样品血清指数＝(测试样品OD540nm÷参照OD540nm)×500
3.肽对单核吞噬细胞吞噬功能及免疫器官的重量影响的实验研究[8，9]
于末次给药后次日(第16天)，每只鼠尾静脉注射1∶5生理盐水稀释的印度墨汁0.1ml/kg体重。
分别于注射墨汁后1min和5min，采用经肝素溶液预先湿润过的采血吸管，从眶后静脉丛取血20μl。将取出的血与2ml 0.1％Na2CO3溶液混合。测定OD680nm。按下列公式计算廓清指数K值：
K＝(lgA1-lgA2)÷(t2-t1)
式中A1为1min OD680nm，
A2为5min OD680nm，
t2为5分钟，
t1为1分钟
于末次给药后次日(第16天)，分离肝、脾和胸腺并用滤纸吸干，称重。按下列公式计算吞噬指数α值：
α＝(3√K)(W÷WLS)
其中
W为体重，WLS为肝脾和重。
胸腺指数(％)＝(胸腺重量/体重)×100％，脾指数(％)＝(脾重量/体重)×100％
结果
由于所得结果原始数据数量较多，只记录了最终统计结果，其中凡与生理盐水组比较，无统计学差别的组均省略。
1.肽对T淋巴细胞转化的影响
以500μg/kg/天，CMS002、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS012、CMS015、CMS019、CMS021、CMS029，能够促进T淋巴细胞转化，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS010、CMS015与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表1：
                  表1
组别              动物数          X±SD(刺激指数)
CMS002            8               1.8±0.3*
CMS007            9               1.6±0.1*
CMS008            9               1.7±0.1*
CMS009            10              1.7±0.2*
CMS010            9               2.0±0.3*@^
CMS012            9               1.6±0.2*
CMS015            9               1.9±0.3*@^
CMS019            9               1.8±0.3*
CMS021            10              1.6±0.1*
CMS029            9               1.7±0.3*
IFN-γ                          10              1.6±0.2*
IL-2              10              1.7±0.2*
生理盐水          10              1.3±0.1
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天时，CMS001、CMS002、CMS003，能够刺激小鼠T淋巴细胞转化，与生理盐水组、IFN-γ组、IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，有统计学意义。CMS014及CMS036能够抑制小鼠T淋巴细胞转化，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，有统计学意义。结果详见于表2：
                  表2
组别              动物数          X±SD(刺激指数)
CMS001            10              2.2±0.5*@^
CMS002            10              2.6±0.3*@^
CMS003            8               2.2±0.5*@^
CMS014            9               1.0±0.1*
CMS036            9               1.0±0.1*
IFN-γ                          9               1.7±0.2*
IL-2              10              1.8±0.2*
生理盐水          10              1.3±0.1
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天时，CMS001、CMS003、CMS007、CMS034能够刺激小鼠T淋巴细胞转化，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，有统计学意义。结果详见于表3：
                  表3
组别              动物数          X±SD(刺激指数)
CMS001            10              1.7±0.2*
CMS003            10              1.6±0.2*
CMS007            8               1.7±0.1*
CMS034            9               1.5±0.2*
IFN-γ                          10              1.6±0.2*
IL-2              9               1.6±0.1*
生理盐水          10              1.3±0.1
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天时，CMS008、CMS010、CMS011能够刺激小鼠T淋巴细胞转化，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，有统计学意义。结果详见于表4：
                  表4
组别              动物数           X±SD(刺激指数)
CMS008            10               1.7±0.3*
CMS010            9                1.7±0.3*
CMS011            10               1.6±0.4*
IFN-γ                          10               1.6±0.2*
IL-2              10               1.6±0.1*
生理盐水          10               1.3±0.1
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
2.肽对NK细胞胞毒活性的作用
当CMS肽给药剂量为500μg/kg/天时，CMS010、CMS013、CMS016、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能够增强NK细胞胞毒活性，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS010、CMS016、CMS030肽组与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表5：
                  表5
组别              动物数          X±SD(％)
CMS010            9               91±4*@^
CMS013            8               84±9*
CMS016            9               91±7*@^
CMS023            10              79±12*
CMS024            10              89±8*
CMS026            10              89±7*
CMS027            10              88±8*
CMS028            10              90±5*
CMS029            10              87±4*
CMS030            10              91±5*@^
CMS032            10              87±5*
CMS033            9               89±8*
CMS034            11              85±9*
CMS035            8               90±10*
CMS036            10              88±7*
IFN-γ                          10              77±8*
IL-2              10              77±8*
生理盐水          8               63±9
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天，CMS001、CMS003、CMS015、CMS021、CMS026、CMS035能够增强NK细胞胞毒活性，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。其中CMS021与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。CMS012能抑制NK细胞胞毒活性，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表6：
                  表6
组别              动物数          X±SD(％)
CMS001            10              85±10*
CMS003            10              85±6*
CMS012            9               40±9*
CMS015            8               78±8*
CMS021            8               88±12*@^
CMS026            10              76±9*
CMS035            10              72±9*
IFN-γ                          10              73±10*
IL-2              10              74±8*
生理盐水          10              56±8
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天，CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS020、CMS024、CMS034、CMS036能够增强NK细胞胞毒活性，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS008、CMS009与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表7：
                  表7
组别              动物数          X±SD(％)
CMS008            10              92±4*@^
CMS009            8               92±6*@^
CMS010            10              82±9*
CMS011            10              76±10*
CMS012            10              85±7*
CMS020            9               91±6*
CMS024            9               78±3*
CMS034            8               90±5*
CMS036            10              75±9*
IFN-γ                          10              80±8*
IL-2              10              80±8*
生理盐水          10              60±9
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天，CMS002、CMS011、CMS012、CMS022、CMS028、CMS035能够增强NK细胞胞毒活性，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS008能够抑制NK细胞胞毒活性，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表8：
                  表8
组别              动物数          X±SD(％)
CMS002            8               76±9*
CMS008            10              46±12*
CMS011            9               79±3*
CMS012            9               77±6*
CMS022            10              73±11*
CMS028            8               79±3*
CMS035            10              76±10*
IFN-γ                          10              72±9*
IL-2              10              74±10*
生理盐水          11              58±7
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
3.肽对T淋巴细胞分泌IL-2活性的影响
当给药剂量为500μg/kg/天，CMS007、CMS009、CMS010、CMS015能够促进T淋巴细胞分泌IL-2，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS007、CMS015组与IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS009、CMS010与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表9：
                  表9
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS007            9               86±15*^
CMS009            10              114±13*@^
CMS010            9               125±17*@^
CMS015            9               85±17*^
IFN-γ                          10              100±18*
IL-2              10              70±13*
生理盐水          10              39±10
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天，CMS001、CMS003能够促进T淋巴细胞分泌IL-2，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS003与IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表10：
                  表10
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS001            10              60±10*
CMS003            8               86±9*^
IFN-γ                          9               99±16*
IL-2              10              72±12*
生理盐水          10              39±10
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天，CMS007、CMS012、CMS020能够促进T淋巴细胞分泌IL-2，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表11：
                  表11
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS007            8               64±12*
CMS012            9               65±16*
CMS020            8               63±11*
IFN-γ                          10              96±14*
IL-2              10              77±13*
生理盐水          10              37±9
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天，CMS010、CMS011、CMS012、CMS022、CMS034能够促进T淋巴细胞分泌IL-2，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS034与IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS011、CMS022组与IL-2组、IFN-γ组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表12：
                  表12
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS010            9               66±11*
CMS011            10              101±19*@^
CMS012            8               59±13*
CMS022            9               109±14*@^
CMS034            10              85±10*^
IFN-γ                          10              87±15*
IL-2              10              73±13*
生理盐水          10              38±13
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
4.肽对T淋巴细胞分泌IFN活性的影响
当给药剂量为500μg/kg/天，CMS010、CMS013、CMS016能够促进T淋巴细胞分泌IFN，与生理盐水组、IFN-γ组、IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表13：
                  表13
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS010            9               167±13*@^
CMS013            9               154±15*@^
CMS016            6               162±19*@^
IFN               10              139±16*
IL-2              10              120±13*
生理盐水          10              65±11
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天，CMS001、CMS003、CMS021能够促进T淋巴细胞分泌IFN，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS021与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表14：
                  表14
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS001            10              110±15*
CMS003            8               106±16*
CMS021            8               143±17*@^
IFN-γ                          9               125±18*
IL-2              10              113±17*
生理盐水          10              61±11
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天，CMS009、CMS012能够促进T淋巴细胞分泌IFN，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS009与IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表15：
                  表15
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS009            10              121±15*^
CMS012            9               86±9*
IL-2              9               105±14*
生理盐水          10              66±10
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天，CMS010、CMS011、CMS022、CMS028能够促进T淋巴细胞分泌IFN，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS010、CMS022与IFN-γ、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表16：
                  表16
组别              动物数          X±SD(IU)
CMS010            9               142±18*@^
CMS011            10              89±18*
CMS022            9               145±13*@^
CMS028            10              96±113*
IFN-γ                          10              124±16*
IL-2              10              107±13*
生理盐水          10              64±1
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
5.肽对抗体形成的影响
当给药剂量为500μg/kg/天，CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS023、CMS024、CMS029、CMS033、CMS035能够促进抗SRBC抗体形成，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS013、CMS019、CMS024、CMS035与IFN-γ组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS014、CMS015、CMS016、CMS020、CMS023、CMS029、CMS033与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见表17：
                  表17
组别              动物数          X±SD
CMS002            10              87±18*@
CMS003            10              96±18*@
CMS007            10              69±17*@
CMS008            10              82±15*@
CMS009            10              113±22*@^
CMS010            10              112±30*@^
CMS011            8               188±16*@^
CMS012            8               141±21*@^
CMS013            10              80±16*@
CMS014            10              130±24*@^
CMS015            10              136±22*@^
CMS016            8               143±38*@^
CMS018            10              66±16*
CMS019            10              91±26*@
CMS020            6               155±35*@^
CMS022            8               68±31*
CMS023            9               109±45*@^
CMS024            8               75±29*@
CMS029            8               115±22*@^
CMS033            10              143±27*@^
CMS035            10              88±16*@
IFN-γ                          9               37±10
IL-2              10              71±11*
生理盐水          10              32±7
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天，CMS003、CMS011、CMS012、CMS013、CMS015、CMS021、CMS022、CMS023、CMS026、CMS027、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能够促进抗SRBC抗体形成，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。其中CMS011、CMS013、CMS015组与IFN-γ组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS021、CMS022、CMS023、CMS026、CMS027、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。CMS009則能够抑制形成抗SRBC抗体，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，具有统计学意义。结果详见于表18：
                  表18
组别              动物数          X±SD(HC50)
CMS003            10              52±11*
CMS009            8               13±5*
CMS011            9               67±9*@
CMS012            8               50±14*
CMS013            8               70±9*@
CMS015            10              54±9*@
CMS021            9               94±20*@^
CMS022            9               110±16*@^
CMS023            8               84±11*@^
CMS026            9               98±9*@^
CMS027            9               93±11*@^
CMS029            10              143±13*@^
CMS030            10              141±33*@^
CMS032            9               131±24*@^
CMS033            8               112±15*@^
CMS034            10              136±11*@^
CMS035            8               97±10*@^
CMS036            10              118±11*@^
IFN-γ                          9               37±10
IL-2              10              71±11*
生理盐水          10              32±7
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天，CMS001、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS011、CMS012、CMS013、CMS015、CMS016、CMS019、CMS020、CMS021、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能够促进抗SRBC抗体形成，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS003、CMS008、CMS009、CMS012、CMS015、CMS016、CMS020、CMS021组与IFN-γ组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS001、CMS007、CMS011、CMS019、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于下表19：
                  表19
组别              动物数          X±SD(HC50)
CMS001            9               110±24*@
CMS003            9               91±24*@
CMS007            9               122±12*@^
CMS008            9               97±26*@
CMS009            8               79±18*@
CMS011            10              115±27*@^
CMS012            10              81±22*@
CMS013            10              93±28*@
CMS015            8               94±37*@
CMS016            9               93±32*@
CMS019            10              118±20*@^
CMS020            10              89±24*@
CMS021            9               82±30*@
CMS023            10              166±27*@^
CMS024            7               171±39*@^
CMS026            9               191±17*@^
CMS027            9               117±45*@^
CMS028            10              121±48*@^
CMS029            9               147±23*@^
CMS030            9               158±37*@^
CMS032            9               157±37*@^
CMS033            7               128±39*@^
CMS034            8               172±37*@^
CMS035            9               176±39*@^
CMS036            8               179±34*@^
IFN-γ                          9               37±10
IL-2              10              71±11*
生理盐水          10              32±7
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天，CMS021、CMS023、CMS024、CMS027、CMS033能够促进抗SRBC抗体形成，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS023、CMS024、CMS027与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。CMS021、CMS033组与IFN-γ组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS002，CMS003，CMS009，CMS010，CMS011，CMS013，CMS014，CMS015，CMS018，CMS019，CMS020，CMS026，CMS028，CMS029，CMS030，CMS034，及CMS036能抑制形成抗SRBC抗体，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表20：
                  表20
组别              动物数          X±SD
CMS002            9               4±1*
CMS003            9               2±1*
CMS009            9               2±1*
CMS010            10              10±3*
CMS011            10              5±3*
CMS013            10              7±1*
CMS014            10              15±6*
CMS015            9               13±4*
CMS018            9               3±1*
CMS019            9               12±3*
CMS020            9               10±3*
CMS021            9               57±9*@
CMS023            10              108±21*@^
CMS024            10              98±6*@^
CMS026            10              19±6*
CMS027            10              99±14*@^
CMS028            10              18±5*
CMS029            9               18±7*
CMS030            9               19±7*
CMS033            9               78±12*@
CMS034            10              20±2*
CMS036            9               20±6*
IFN-γ                          9               37±10
IL-2              10              71±11*
生理盐水          10              32±7
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
6.肽对单核吞噬细胞吞噬功能的影响
当给药剂量为500μg/kg/天，CMS003、CMS008、CMS020、CMS022、CMS024能够增强单核吞噬细胞吞噬功能，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。其中CMS022与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表21：
                  表21
组别              动物数          X±SD(吞噬指数)
CMS003            10              6.6±0.7*
CMS008            10              6.5±1.2*
CMS020            10              6.4±0.6*
CMS022            10              7.4±0.6*@^
CMS024            10              6.4±1.0*
IFN-γ                          10              6.4±0.9*
IL-2              9               5.7±0.8
生理盐水          10              5.1±0.6
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天，CMS019、CMS024、CMS030能够增强单核吞噬细胞吞噬功能，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。其中CMS019与IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表22：
                  表22
组别              动物数          X±SD(吞噬指数)
CMS019            9               6.7±0.9*^
CMS024            8               6.6±0.7*
CMS030            10              6.3±0.5*
IFN-γ                          10              6.4±0.9*
IL-2              9               5.7±0.8
生理盐水          10              5.1±0.6
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天，CMS003、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS013、CMS016、CMS018、CMS019、CMS035能够增强单核吞噬细胞吞噬功能，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。其中CMS003、CMS009、CMS010、CMS016、CMS019、CMS035与IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于下表23：
                  表23
组别              动物数          X±SD(吞噬指数)
CMS003            9               6.9±0.9*^
CMS008            9               6.4±0.5*
CMS009            9               6.9±0.9*^
CMS010            10              7.1±0.7*^
CMS011            10              6.4±1.1*
CMS013            10              6.7±0.2*
CMS016            9               6.9±0.8*^
CMS018            8               6.7±1.2*
CMS019            8               6.8±0.6*^
CMS035            9               6.9±0.9*^
IFN-γ                          10              6.4±0.9*
IL-2              9               5.7±0.8
生理盐水          10              5.1±0.6
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天，CMS024、CMS027、CMS036能够增强单核吞噬细胞吞噬功能，与生理盐水组比较具有显著性差异(P＜0.05)。其中CMS024组与IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表24：
                  表24
组别              动物数          X±SD(吞噬指数)
CMS024            10              6.7±0.5*^
CMS027            10              6.4±0.6*
CMS036            9               6.2±0.3*
IFN-γ                          10              6.4±0.9*
IL-2              9               5.7±0.8
生理盐水          10              5.1±0.6
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
7.肽对免疫器官的重量的影响
当给药剂量为500μ/kg/天，CMS008、CMS010、CMS016、CMS019、CMS020、CMS022、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036能够增加小鼠胸腺的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS027、CMS034组与IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS008、CMS022、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS035与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表25：
                  表25
组别              动物数          X±SD(％)
CMS008            8               0.21±0.03*@^
CMS010            10              0.19±0.04*
CMS016            9               0.18±0.05*
CMS019            10              0.19±0.02*
CMS020            10              0.19±0.04*
CMS022            9               0.26±0.05*
CMS026            10              0.20±0.03*
CMS027            8               0.20±0.03*^
CMS028            10              0.19±0.02*
CMS029            10              0.22±0.04*@^
CMS030            8               0.30±0.03*@^
CMS032            8               0.25±0.03*@^
CMS033            9               0.25±0.04*@^
CMS034            9               0.20±0.05*^
CMS035            10              0.21±0.03*@^
CMS036            9               0.18±0.02*
IFN-γ                          10              0.15±0.04
IL-2              9               0.14±0.04
生理盐水          9               0.12±0.02
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为500μg/kg/天，CMS019能够增加小鼠脾的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS001，CMS003，CMS007，CMS009，CMS011，CMS013，CMS014，CMS015，CMS021，CMS023，CMS024，CMS027，及CMS036能够減轻小鼠脾的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表26：
                  表26
组别              动物数          X±SD(％)
CMS001            10              0.43±0.07*
CMS003            8               0.40±0.04*
CMS007            9               0.32±0.05*
CMS009            9               0.41±0.03*
CMS011            9               0.41±0.04*
CMS013            10              0.44±0.07*
CMS014            10              0.04±03*
CMS015            9               0.36±0.07*
CMS019            9               0.63±0.08*
CMS021            9               0.36±0.04*
CMS023            9               0.36±0.06*
CMS024            9               0.34±0.05*
CMS027            10              0.37±0.03*
CMS036            10              0.40±0.03*
生理盐水          10              0.53±0.05
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天，CMS002、CMS008、CMS012、CMS014、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS036能够增加小鼠胸腺的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS034与IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS002、CMS008、CMS012、CMS014、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS030、CMS032、CMS036与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表27：
                  表27
组别              动物数          X±SD(％)
CMS002            10              0.21±0.02*@^
CMS008            10              0.20±0.04*@^
CMS012            10              0.26±0.02*@^
CMS014            10              0.21±0.02*@^
CMS016            10              0.20±0.03*@^
CMS018            10              0.23±0.02*@^
CMS019            10              0.20±0.03*@^
CMS020            10              0.27±0.03*@^
CMS022            10              0.30±0.03*@^
CMS023            10              0.20±0.02*@^
CMS024            10              0.27±0.02*@^
CMS026            10              0.27±0.02*@^
CMS027            8               0.21±0.03*@^
CMS028            10              0.18±0.04*
CMS029            9               0.18±0.05*
CMS030            10              0.25±0.04*@^
CMS032            10              0.27±0.03*@^
CMS033            9               0.18±0.03*
CMS034            8               0.19±0.04*^
CMS036            9               0.22±0.02*@^
IFN-γ                          10              0.15±0.04
IL-2              9               0.14±0.04
生理盐水          9               0.12±0.02
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为50μg/kg/天，CMS008，CMS010，及CMS029能够減轻小鼠脾的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表28：
                  表28
组别              动物数          X±SD(％)
CMS008            10              0.39±0.08*
CMS010            10              0.38±0.05*
CMS029            10              0.42±0.04*
IFN-γ                          10              0.50±0.04
IL-2              9               0.62±0.07
生理盐水          9               0.53±0.05
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天，CMS001、CMS002、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS036能够增加小鼠胸腺的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS002、CMS014、CMS024、CMS030组的胸腺指数与IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS010、CMS012、CMS018、CMS019、CMS020、CMS022、CMS026、CMS028、CMS032、CMS034、CMS036与IFN-γ组、IL-2组比较，有显著性差异，具有统计学意义(P＜0.05)。结果详见于表29：
                  表29
组别              动物数          X±SD(％)
CMS001            10              0.22±0.05*
CMS002            9               0.24±0.05*^
CMS010            9               0.27±0.05*@^
CMS011            10              0.22±0.04*
CMS012            10              0.27±0.06*@^
CMS013            10              0.21±0.05*
CMS014            10              0.23±0.06*^
CMS015            9               0.20±0.08*
CMS016            10              0.22±0.06*
CMS018            10              0.24±0.04*@^
CMS019            10              0.24±0.02*@^
CMS020            10              0.24±0.07*@^
CMS021            9               0.20±0.06*
CMS022            9               0.25±0.04*@^
CMS023            10              0.23±0.06*
CMS024            9               0.23±0.06*^
CMS026            10              0.31±0.05*@^
CMS028            10              0.28±0.06*@^
CMS029            10              0.21±0.03*
CMS030            10              0.23±0.07*^
CMS032            10              0.29±0.04*@^
CMS033            10              0.20±0.02*
CMS034            9               0.27±0.06*@^
CMS035            10              0.21±0.04*
CMS036            10              0.25±0.04*@^
IFN-γ                          10              0.15±0.04
IL-2              9               0.14±0.04
生理盐水          9               0.12±0.02
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为5μg/kg/天，CMS030能够增加小鼠脾的重量，与生理盐水组、IFN组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS015則能够減轻小鼠脾的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表30：
                  表30
组别              动物数          X±SD(％)
CMS015            9               0.38±0.15*
CMS030            10              0.64±0.09*
生理盐水          10              0.53±0.05
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天，CMS002、CMS008、CMS010、CMS012、CMS014、CMS018、CMS020、CMS022、CMS026、CMS028、CMS030、CMS032能够增加小鼠胸腺的重量，与生理盐水组比较，具有显著性差异(P＜0.05)，其中CMS008、CMS012与IL-2组比较，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS002、CMS020、CMS030与IFN组、IL-2组比较，有显著性差异(P＜0.05)。结果详见于表31：
                  表31
组别              动物数          X±SD(％)
CMS002            8               0.26±0.06*@^
CMS008            10              0.22±0.07*^
CMS010            9               0.21±0.03*
CMS012            10              0.22±0.06*^
CMS014            10              0.20±0.04*
CMS018            10              0.20±0.03*
CMS020            9               0.23±0.05*@^
CMS022            10              0.21±0.06*
CMS026            9               0.21±0.05*
CMS028            10              0.20±0.06*
CMS030            8               0.24±0.05*@^
CMS032            10              0.21±0.06*
IFN-γ                          10              0.15±0.04
IL-2              9               0.14±0.04
生理盐水          9               0.12±0.02
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
当给药剂量为0.5μg/kg/天，CMS020能够增加小鼠脾的重量，与生理盐水组，IFN-γ组，及IL-2組比較，具有显著性差异(P＜0.05)。CMS001則能减轻小鼠脾的重量，与生理盐水组比較，具有显著性差异(P＜0.05)。结果详见表32：
                  表32
组别              动物数          X±SD(％)
CMS001            10              0.40±0.05*
CMS020            8               0.68±0.09*@^
生理盐水          10              0.53±0.05
IFN-γ                          10              0.50±0.04
IL-2              10              0.62±0.07
注：*：与生理盐水组比较，P＜0.05
@：与IFN-γ组比较，P＜0.05
^：与IL-2组比较，P＜0.05
综上所述，经动物实验证实肽CMS001、CMS002、CMS003、CMS007、CMS008、CMS009、CMS010、CMS011、CMS012、CMS013、CMS014、CMS015、CMS016、CMS018、CMS019、CMS020、CMS021、CMS022、CMS023、CMS024、CMS026、CMS027、CMS028、CMS029、CMS030、CMS032、CMS033、CMS034、CMS035、CMS036在动物体内具有生物活性。
II.肽的体内抗病毒作用
为了明确这些肽是否对病毒性感染有治疗应用价值，我们使用鸭乙型肝炎感染动物模型来检验上述肽对染病动物的体内作用效果。
建立重庆麻鸭乙型肝炎感染模型，给予腹腔注射肽(50微克/公斤体重/天，每天1次)，疗程4周。用斑点杂交法测定血清鸭乙肝病毒DNA(DHBV-DNA)水平。同时设拉米夫定和生理盐水分别作为阳性、阴性对照。结果发现，肽CMS001在用药第4周可以显著降低血清DHBV-DNA水平(P＜0.05)。由此得出结论CMS001在合适剂量水平能单独或联合用于治疗乙型肝炎病毒感染。
材料和方法
1.肽由美国肽公司(American Peptide Company，Inc.)从L-氨基酸合成。
2.动物模型[1]
1日龄重庆麻鸭经腹腔注射接种0.1ml DHBV-DNA阳性血清，接种量为5×107拷贝/ml。1周后，从鸭颈外静脉取血，分离血清，与地高辛标记的DHBV-DNA探针做斑点杂交，以确定感染是否成功[2]。感染成功的鸭饲养至2周大小即可进入实验研究。
3.分组及治疗
DHBV感染鸭随机分为下列各组：
(1)阴性对照组(n＝9)：每只鸭腹腔注射1ml生理盐水，每天1次。
(2)拉米夫定组(n＝8)：为阳性对照组。每只鸭口服(灌胃)拉米夫定[4]50mg/kg/d，每天1次。
(3)肽组(n＝9)：每只鸭每天1次腹腔注射50μg/kg/d肽(用生理盐水调节至终体积为0.5-1ml)。
以上各组疗程4周，停药后再观察1周。于给药第0、7、14、21、28、35天分别从鸭颈外静脉取1ml血，立即分离血清置-20℃待测[3]。
4.血清DHBV-DNA滴度测定
DHBV-DNA探针按试剂盒制造商(Amersham Pharmacia BiotechCo.)提供的操作说明标记荧光。40μl鸭血清以每样本1个复制点在硝化纤维素膜上形成斑点，然后与荧光标记的DHBV-DNA探针杂交[2]。杂交完成后，斑点经CDP-Star荧光测定试剂(RPN3690)处理，用Vuego Scan(Brisa-620st)扫描仪进行扫描。用ImageMaster TotalLabv1.11.Ink软件对斑点作定量分析，统计学分析采用配对t检验，使用SPSS软件。
结果
            表II.1用药前后血清DHBV-DNA水平的变化
                         血清DHBV-DNA滴度(10 3 单位)                  
            第0天     第7天     第14天    第21天    第28天     第35天
生理盐水    26±12    45±31    49±23    102±66    60±38    50±43
拉米夫定    21±9     6±4*    7±6*    8±7*    8±5*    20±19
CMS001      21±18    11±13    20±18    14±14     5±3*    18±16
配对t检验：与同一动物给药第0天比较，*P＜0.05。
阴性(生理盐水)对照组和阳性(拉米夫定)对照组数据表明乙型肝炎感染动物模型的成功建立。与给药前相比，肽CMS001以50μg/kg/d剂量给药4周时能显著降低血清DHBV-DNA滴度(P＜0.05)，停药后血清DHBV-DNA反跳较为明显，提示CMS001抗病毒作用是可逆的，可能需要增加剂量和/或延长疗程才能铲除病毒。
讨论
鸭乙型肝炎感染模型[1]是研究人类乙型肝炎和筛选乙肝治疗药物的较为理想而成熟的工具。本研究发现，肽CMS001用药4周能够显著降低血清DHBV-DNA水平，表明CMS001在适当剂量和合理用药方案下，可以单独或与其它药物联合应用作为人类乙型肝炎综合治疗的手段。
本研究仅检验了腹腔注射这一给药途径，但不排除其它可能有效的给药途径。肽可以经静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射或皮下植入等途径给药，可以用或不用诸如脂质体、持续释放保护等药物传递易化装置。该肽也可以用片剂、胶囊、悬液、溶液等任何口服给药形式，以及有或没有胃肠保护的不作修饰的普通形式或缓释形式。该肽还可进一步用于局部，制成如油膏、乳膏、胶体等，可用或不用透皮易化装置，或制成吸入粉剂、溶剂或脂质体保护形式。该肽也可以翻译成基因序列，克隆进入一个表达系统，单独或者与其它肽序列结合产生一个经纯化或不经纯化的肽分子，其可利用的活性如本文所描述。
表II.2对乙型肝炎有效的肽
CMS代码                        SEQ ID N0：
CMS001                         1
参考文献
1.陈压西，郭树华，张定凤，等。重庆麻鸭乙型肝炎模型建立和应用，中华肝病学杂志，1993；1(2)：89-91
2.陈压西，郭树华，陈雪华。地高辛标记DHBV-DNA探针的制备与应用，重庆医科大学学报，1994；19(4)：295-297
3.唐霓，黄爱龙，郭树华，等。鸭乙肝病毒体液免疫血清学指标的系统建立与应用，中华肝病学杂志，2001；9(1)：13-15
4.陈压西，郭树华，齐珍元，等。拉米夫定联合泛昔洛韦抗鸭乙肝病毒的实验研究，中华肝病学杂志，2001；9(4)：209-211
III.肽对肾炎的作用
为研究这些肽对肾炎是否有可能的治疗作用，我们使用动物模型大鼠Masugi肾炎以测试上述肽对患病动物的体内作用[3，4]。
本研究旨在观察肽对大鼠慢性肾小球肾炎的体内治疗作用。通过给健康Sprague Dawley大鼠注射兔抗鼠肾皮质IgG构造大鼠Masugi肾炎模型，然后立即给予腹腔注射各肽。剂量为50μg/kg/天，给药3周。糖皮质激素氢化可的松为阳性对照药。结果发现，CMS014、CMS018、CMS030、及CMS036处理的大鼠蛋白尿、血清肌酐水平和脾指数与对照组相比均明显降低，有统计学显著性(p＜0.05)。死亡后肾脏的显微镜检查提示这些肽的治疗作用类似于氢化可的松治疗。因此，CMS014、CMS018、CMS030、及CMS036可用作慢性肾炎控制的手段。
材料
Sprague Dawley(SD)雄性大鼠，分别购于广州中医药大学实验动物中心及第一军医大学实验动物中心，平均体重120±20g。青紫兰兔，由广州中医药大学实验动物中心提供，体重约3kg。
肽为L-氨基酸来源，由American Peptide Company，Inc.，USA合成，使用时以生理盐水稀释为10μg/ml的注射液。阳性对照药氢化可的松由扬州市制药厂生产。
血清肌酐水平测定试剂盒购自上海荣盛生物技术公司。
方法
(1)制备兔抗鼠肾皮质抗血清[1]：20只健康SD大鼠经3％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后暴露腹主动脉，以冷生理盐水注入，充分洗涤至肾变苍白，取出肾脏分离皮质部分，加入5容积0.01M，pH 8.1的Tris-HCl缓冲液后2次匀浆，再经140目不锈钢筛滤过，收集滤过液，与GIBCO-RPE完全或不完全弗氏佐剂1∶1混合乳化，获得接种工作溶液。
给10只健康家兔皮下多点注射此接种溶液，首先用完全弗氏佐剂，随后用不完全佐剂。每10天1次，每次6点(0.1ml/点)。第6周起取兔耳缘静脉血，倍比稀释血清，测定抗体效价(双扩散法)[2]。第8周后即可将家兔用3％戊巴比妥钠(20mg/kg)静脉麻醉后暴露颈动脉，放血取抗血清。
另从15只健康SD大鼠收集全血。以生理盐水洗涤鼠红细胞3次，加入250ml左右的兔抗血清中，混匀4℃孵育过夜，离心去除红细胞，上清液56℃灭活30分钟，离心去除沉淀，再经三次硫酸铵(50％，33％，33％)沉淀[5]后上清液被分离、部分纯化，制备成粗IgG。将粗IgG再溶于125ml双蒸水，透析去除硫酸铵。双扩散法测定抗肾皮质抗体效价。
(2)诱导大鼠肾小球肾炎[5]：诱导前5天给健康大鼠腹腔注射0.25ml兔IgG-完全弗氏佐剂(含非特异的IgG约4mg)以加速诱导反应。  除下述生理盐水对照组外，其它各组大鼠腹腔注射1.0ml如方法1中所述制备的兔抗鼠肾皮质IgG，诱导肾小球肾炎。
(3)分组及给药：雄性SD大鼠，随机分为正常健康对照组(正常)、肾炎安慰剂对照组(安慰剂)、肾炎肽治疗组、肾炎氢化可的松治疗对照组(氢化可的松)，每组12只。诱导肾炎当天即用药，腹腔注射给药，肽剂量50μg/kg/天，阳性药氢化可的松剂量为3.3mg/kg/天，生理盐水用作安慰剂，疗程均为3周。
(4)观察指标[4]：
①尿蛋白水平：每只大鼠置于1个代谢笼内，自由饮水进食，收集24小时尿，考马斯蓝法测定蛋白含量，每周测定1次。
②血清肌酐水平：3周治疗结束时取大鼠血，测定血清肌酐水平。使用上海荣盛生物技术公司提供的肌酐试剂盒。
③脾重指数：平均脾重量÷平均体重即为脾重指数。
④肾脏组织病理检查：每组选6个重量最大的肾脏制作病理切片，显微镜下观察记录。
统计学分析：
组间比较采用t检验。截断值设定为p＜0.05。为保证模型的可靠性，规定每组大鼠删去2个尿蛋白最低值。
结果
1.肽治疗对大鼠尿蛋白水平的影响
表III.1肽对尿蛋白水平的影响(单位：mg)
组别            例数(n)    第1周        第2周          第3周
CMS014组        10         5.5±4.0*   6.3±6.8*    2.8±1.9*
CMS018组        10         7.0±3.7*   5.5±7.9*    3.3±3.4*
CMS030组        10         5.4±3.4*   9.5±16.2     2.4±1.5*
CMS036组        10         7.9±5.8*   5.0±7.1*    1.3±0.9*
氢化可的松组    10         3.1±2.0*   7.5±7.7      7.6±7.1
安慰剂组        10         22.9±22     17.2±14.5     20.2±29.0
正常组          9          1.7±1.3*   2.3±1.1*    0.4±0.2*
注：与安慰剂组比较，*P＜0.05
发现肽CMS014、CMS018、CMS030和CMS036在50微克/kg/天，每天1次的剂量下可降低Masugi肾炎大鼠模型的尿蛋白水平，与安慰剂治疗的对照组有统计学显著差异，p＜0.05。还注意到CMS014、CMS030和CMS036以及氢化可的松组的生长速率比正常组低。氢化可的松组的生长速率降至这样的程度，1周后治疗剂量不得不减半以避免严重的不耐受。
2.肽对血清肌酐水平的影响
        表III.2肽对大鼠血清肌酐水平的影响
组别            例数(n)            血清肌酐水平(μM)
CMS014组        10                 159±1*
CMS018组        10                 67±1*
CMS030组        10                 93±1*
CMS036组        10                 80±1*
氢化可的松组    10                 239±107
安慰剂组        10                 265±212
正常组          9                  80±1*
注：与安慰剂治疗的肾炎大鼠比较，*P＜0.05
从表可见，Masugi肾炎大鼠血清肌酐水平在安慰剂治疗组明显高于正常对照组(P＜0.05-0.01)，提示肾炎大鼠伴有肾功能异常。与安慰剂治疗的肾炎大鼠相比，肽CM014、CMS018、CMS030、CMS036在50微克/kg/天，每天1次的剂量可以降低血清肌酐水平，与肾炎大鼠安慰剂治疗组有统计学显著差异。
3.肽对大鼠脾指数的影响
        表III.3肽对大鼠脾指数的影响
组别            例数(n)                脾指数(×10-3)
CMS014组        10                     3.6±1.3*
CMS018组        10                     3.3±0.8*
CMS030组        10                     3.0±0.5*
CMS036组        10                     3.4±0.8*
氢化可的松组    10                     4.5±1.4
安慰剂组        10                     4.8±1.1
正常组           9                     2.4±0.1*
注：与安慰剂治疗组比较，*P＜0.05
所有被诱导肾炎的大鼠的脾指数均大于正常组，即有明显脾脏肿大，提示免疫因素参与肾炎的形成。CMS014、CMS018、CMS030、CMS036在50微克/kg/天，每天1次的剂量均显著降低脾指数，与安慰剂治疗组有统计学显著差异，p＜0.05。这提示这些肽可能通过免疫抑制机制而发挥抗肾炎效应。
4.肽对大鼠肾脏病理改变的影响
病理检查发现，安慰剂组大鼠肾小球球囊腔内有少许纤维素性渗出物，球囊壁层上皮细胞增生，部分形成新月体，肾小球毛细血管扩张、充血，近曲小管上皮细胞有轻度水变性，远曲小管及集合管内可见少许管型，符合慢性肾小球肾炎的病理改变，表明诱导肾炎成功。CMS014组仅有1个大鼠显示肾小球囊腔内有纤维素性渗出物，球囊壁层上皮细胞增生。该大鼠其它参数及同组其它大鼠与正常大鼠有基本相同的肾组织学。CMS018、CMS030、CMS036组的所有大鼠的所有病理学参数均是正常的。
结论
实验结果表明，肽CMS014、CMS018、CMS030、CMS036以剂量50μg/kg/天，每天1次腹膜给药对实验Masugi肾炎大鼠模型有治疗作用。这些肽可校正治疗大鼠的蛋白尿，肌酐水平和肾组织学，与安慰剂治疗对照组有统计学显著差异。由这些肽对脾重指数的影响指示这些肽可能提供免疫学机制起作用，但不排除其它可能的药理机制。
讨论
肽CMS014，CMS018，CMS030，CMS036本身或作为一部分而可以用于人类肾炎的治疗，例如用来减少尿蛋白排出或改善肾功能。这些肽可以单独使用、或两个以上肽合用、或与其它药物或食品添加剂联合用于肾炎的综合治疗。
表III.4对肾炎有效的肽
CMS代码                            SEQ ID NO：
CMS014                             7
CMS018                             10
CMS030                             21
CMS036                             26
参考文献
1.中华人民共和国卫生部编.新药(西药)临床前研究指导原则，1994：96(即抗肾炎药项下)
2.徐叔云，等.药理实验方法学，人民卫生出版社，北京，第2版，1991：1071
3.陈奇，等.中药药理研究方法学，人民卫生出版社，北京，第1版，1993：390
4.杜冠华主译.药理学实验指南—新药发现和药理学评价，科学出版社，北京，第1版，2001：598
5.王叔咸.肾脏病学，人民卫生出版社，北京，第11版，1987：244
IV.CMS肽对癌症的作用
为了探讨这些肽可能的抗癌治疗作用，我们在本研究中用各种标准动物癌症模型测试它们对患病动物的生物学效应。
材料
1.实验动物：BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠、DBA/2小鼠，体重18～22g，中国医学科学院实验动物中心提供。
2.细胞株：
小鼠肉瘤180(S180)细胞、小鼠黑色素瘤B16细胞、小鼠白血病L1210细胞：中国医学科学院肿瘤研究所提供。
YAC-1细胞：天津医科大学免疫教研室姚智教授惠赠。
3.主要药品及试剂：
肽：美国肽类公司
重组鼠干扰素γ(rmIFN-γ)：北京邦定生物技术有限公司
重组人白介素2(rhIL-2)：上海华新生物高技术有限公司
RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清：美国GIBCO公司
四甲基偶氮唑盐(MTT)、刀豆蛋白A(ConA)：美国SIGMA公司
淋巴细胞分离液：中国医学科学院血液研究所
环磷酰胺(CTX)：上海第十二制药厂
                          方法
1.给药方法
各种治疗药物均经腹腔注射，除环磷酰胺组于肿瘤接种后次日给药外，其余各组在肿瘤接种前5天开始给药，连续给药30天或直至动物死亡时结束。
2.肽对BALB/C小鼠中的移植的S180肉瘤相比的生长速率的影响以及对宿主的免疫学功能的影响
BALB/c小鼠随机分成肽组、环磷酰胺组、rmIFN-□组、rhIL-2组和生理盐水组，每组20只动物。
将冻存的小鼠肉瘤S180细胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，用无菌Hanks液室温下洗涤细胞3～4次，调整细胞数至1～2×109个/L。将0.2ml细胞悬液于腋窝皮下进行BALB/c小鼠接种。将已接种并饲养10～12天的S180瘤源小鼠颈椎脱臼处死，收集生长旺盛且无破溃的肿瘤块并用无菌生理盐水洗。将组织分散在生理盐水中，每克瘤组织加入4ml灭菌生理盐水，制成均一的细胞悬液。腋下注入悬液0.2ml制备荷瘤小鼠模型[1]。依方法1给药。
2.1肽对荷瘤小鼠单核吞噬细胞胞吞功能的检测[2，3]是通过于末次给药后次日，每只鼠尾静脉注射1∶5稀释的印度墨汁0.1ml/10g而进行。分别于注射墨汁后1min和5min，采用经肝素溶液预先湿润过的采血吸管，从眶后静脉丛取血20μl。将取出的血与2ml 0.1％Na2CO3溶液混合，测定OD680nm。按下列公式计算廓清指数K值：
K＝(lgA1-lgA2)÷(t2-t1)
式中A1为1min OD680nm，
A2为5min OD680nm，
t2为5分钟，
t1为1分钟
胞吞指数研究后，颈椎脱臼处死小鼠，分离肝、脾和胸腺并用滤纸吸干，称重。
按下列公式计算吞噬指数α值：
α＝(3√K)(W÷WLS)
其中
W为体重，WLS为肝脾和重。
2.2按下式计算肿瘤生长抑制指数：
肿瘤生长抑制指数＝(对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)÷对照组平均瘤重
3.肽对BALB/C小鼠腹水型肝癌H22的作用
将BALB/c小鼠随机分为肽组、环磷酰胺组、rmIFN-γ组、rhIL-2组、生理盐水组，每组20只。
将冻存的小鼠腹水型肝癌H22细胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，用无菌Hanks液洗涤细胞3～4次，调整细胞数至1～2×109个/L。将收集好的细胞，进行BALB/c小鼠腹腔接种，每鼠0.2ml。取接种6～8天的荷瘤小鼠，颈椎脱臼致死，消毒后剪开并剥去皮肤，用无菌注射器穿过腹壁肌层抽取腹水，放入无菌小瓶。将收集的腹水用Hanks液稀释至1×106/ml，无菌操作。分组后的每鼠腹腔注射腹水稀释液0.2ml，依方法1給药。记录小鼠存活数据。如动物在实验结束时仍生存，生存天数按实验天数计算。使用SPSS统计软件，应用Kaplan-meier方法统计平均生存时间。按以下公式计算存活指数：
存活指数＝(实验组平均生存天数—对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数×100％。
4.肽对移植腹水型肝癌H22的BALB/c小鼠的细胞免疫性的作用
4.1脾细胞悬液的制备[1，4]
将健康BALB/c小鼠，随机分为肽组、rmIFN-γ组、rhIL-2组、生理盐水组，每组15只，依照方法3，制作荷H22腹水型肝癌小鼠模型。植入癌细胞后，给药15日，之后将小鼠颈椎脱臼致死，无菌操作取脾，用注射器的针芯轻轻捻碎脾组织，使单个细胞通过100目不锈钢网(孔径150μm)进入冷Hanks液中，将细胞悬液移至离心管中，200g离心10min后弃上清，加10倍体积的Tris-NH4Cl至细胞沉淀中，混匀后，室温下静置10min，150g离心10min，再用冷Hanks液洗涤细胞2～4次，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，调整细胞数至所需浓度。
4.2肽对荷瘤小鼠T淋巴细胞转化的影响
将各组小鼠的脾细胞，制成1×106/ml悬液加入96孔细胞培养板中，100μl/孔，每份样品设3个平行孔。向孔中加入100μl/孔的于RPMI-1640中的100μg/ml ConA，作为分析孔，加入100μl/孔的RPMI-1640的孔作为对照孔。然后将96孔培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养66hr，再将细胞培养板150g离心10min，取上清，-20℃保存，以备检测细胞因子IL-2和IFN。
向细胞沉淀中加50μl/孔的1mg/ml MTT液，振荡2min重悬细胞。继续培养4hr。150g，离心10min，弃上清。加入120μl/孔的40mM盐酸-异丙醇，振荡3min。在ELISA-reader上测吸光度(OD570nm值)，参考波长630nm。
每个小鼠形成3个分析孔和3个对照孔。
每个小鼠的刺激指数(SI)是通过首先计算3个复孔的平均OD值，然后将分析孔的值除以对照孔的值而获得。
4.3肽对荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性影响实验[5，6]
将4.1中获得的小鼠脾细胞，调整细胞浓度至4×106/ml。将已达到对数生长期的YAC-1靶细胞制成1×105/ml。于96孔细胞培养板中，将100μl脾细胞和细胞培养基100μl加入仅含脾细胞的对照孔中；向仅含靶细胞的对照孔中加入100μl靶细胞和培养基100μl；向NK活性分析孔中加靶细胞100μl和脾细胞100μl。每个小鼠均如上所述设3个复孔。将加好样品的96孔培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中，培养4hr。
将样品150g离心10min收集细胞。加1mg/ml MTT液50μl/孔，振荡2min后，37℃、5％CO2培养箱中继续培养4hr。150g离心10min，弃上清。加入40mM盐酸-异丙醇120μl/孔，振荡3min后，在ELISA-reader上测吸光度(OD值)，测定波长570nm，参考波长630nm。
每个小鼠有9个孔：3个脾细胞对照，3个靶细胞对照，3个含有脾细胞和靶细胞的分析孔。每个小鼠的NK细胞活性指数通过首先获得每个组合的3个平行孔的平均OD值，然后将这一平均OD代入下式计算：
NK细胞活性指数＝[1-(脾细胞和靶细胞孔平均OD值-脾细胞孔平均OD值)÷(靶细胞孔平均OD值)]×100％
5.肽对具有移植的L1210白血病的DBA/2小鼠的存活的影响
将DBA/2小鼠，6～8周龄，体重18～22g，随机分为肽组、环磷酰胺组、rmIFN-γ组、rhIL-2组、生理盐水组，每组20只。
将冻存的小鼠白血病L1210细胞株，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，用无菌Hanks液洗涤细胞3～4次，调整细胞数至1×105/ml。将0.1ml细胞悬液植入数只健康DBA/2小鼠腹腔。取接种6～8天的白血病小鼠，颈椎脱臼致死，无菌取腹水。将收集的腹水用无菌Hanks液稀释至1×105/ml。将0.1ml细胞悬液植入每个测试动物中并记录动物的存活数据。测试动物依方法1給药。使用SPSS统计软件，应用Kaplan-meier方法统计各组的生存时间。如动物在实验结束时仍生存，生存天数按实验天数计算。按以下公式计算存活指数：
存活指数＝(实验组平均生存天数-对照组平均生存天数)÷对照组平均生存天数×100％
6.肽对携带移植的B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠的体液免疫性的影响
将C57BL/6小鼠，6～8周龄，体重18～22g，随机分为肽组、环磷酰胺组、rmIFN-γ组、rhIL-2组、生理盐水组，每组20只。
将冻存的小鼠B16黑色素瘤细胞，用含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃、5％CO2培养箱中培养72小时，用无菌Hanks液洗涤细胞3～4次，调整细胞数至1～2×105/ml。每鼠尾静脉注射0.1ml肿瘤细胞悬液以产生携带B16黑色素瘤的动物模型[7，8]。依方法1給药。
6.1肽对荷瘤小鼠体液免疫性的作用[9]
绵羊红血细胞(SRBC)如下制备：无菌条件下自健康成年绵羊外颈静脉取血，置于有玻璃珠的三角烧瓶中，摇动三分钟，然后将血液与Alsever溶液(葡萄糖2.05g，氯化钠0.4g，柠檬酸钠0.8g，加蒸馏水至100ml)混匀，置4℃冰箱备用。临用前样品在130g离心5分钟以收集SRBC。通过在生理盐水中重悬并离心洗涤细胞2次，然后经180g离心10分钟收集细胞沉淀。按2％(v/v)以生理盐水稀释，即得所需的绵羊红血细胞(SRBC)悬液。
将新鲜豚鼠血清按10∶1(v/v)加入离心压积SRBC中，于4℃轻轻振荡30min，制备补体。200g离心10min吸取上清液，用生理盐水1∶10稀释制备成所需补体工作溶液。
将各组小鼠在给药后第27天，腹腔注射0.2ml SRBC悬液以产生抗体。末次给药后次日，摘除眼球取血，室温下放置1h，使血清充分渗出。以200g离心10分钟，取上层血清，用生理盐水稀释500倍。
向1ml稀释的鼠血清样品中加入SRBC悬液0.5ml，冰浴中冷却，然后加入补体工作溶液1ml，在37℃恒温水浴中保温10min，随即置入冰浴中终止反应。以200g离心10min，取上清液。
向1ml上述上清液中加入Drabkin试剂(碳酸氢钠1.0g，高铁氰化钾0.2g，氰化钾0.05g，蒸馏水1000ml)3ml，室温放置10min后，测定OD540nm。
取SRBC悬液0.25ml，加Drabkin试剂至4ml，摇匀，室温放置10min，测定参考OD540nm。
溶血指数＝(样品OD540nm值÷参考OD540nm)×500
6.2体液免疫研究后，颈椎脱臼处死小鼠。取肺组织肉眼及显微镜下观察肺的病理形态学改变，计算肺转移灶结节数。
                        结果
1.肽对荷瘤小鼠(S180)吞噬细胞功能的影响实验结果(方法2.1)
表IV.1 CMS肽对携带移植的S180肉瘤的BALB/c小鼠吞噬指数的影响
组别              药物剂量         动物数      吞噬指数
CMS001            50μg/kg         20          6.24±0.33*^
CMS001            5μg/kg          19          6.67±0.43*^
CMS034            5μg/kg          19          6.20±0.44*^
CMS034            0.5μg/kg        20          6.35±1.02*
IL2               3×105IU/kg     19          6.96±1.37*
IFN-γ                          3×105IU/kg     17          5.45±0.71
环磷酰胺          20mg/kg          19          5.92±2.47
生理盐水          0.5ml            19          5.38±0.85
*：与生理盐水组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
^：与IFN-γ组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
CMS001在50微克/kg/天和5微克/kg/天，CMS034在5微克/kg/天和0.5微克/kg/天的剂量能增加吞噬指数，与生理盐水组有统计学显著差异。
2.肽对BALB/C小鼠的移植S180肉瘤的生长速率的影响(方法2.2)
                表IV.2肽对移植性S180肿瘤生长的影响
组别            药物剂量       动物数    瘤重(g)        抑瘤指数(％)
CMS010          500μg/kg      20        0.67±0.35*   48.4
CMS034          0.5μg/kg      20        0.83±0.48*   35.9
CMS035          5μg/kg        20        0.71±0.37*   44.6
rhIL-2          3×105IU/kg   20        0.69±0.37*   46.2
rmIFN-γ                  3×105IU/kg   18        0.96±0.45     25.3
环磷酰胺        20mg/kg        20        0.68±0.32*   47.3
生理盐水        0.5ml          20        1.29±0.50
*：与生理盐水组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
CMS010(500μg/kg/天)、CMS034(0.5μg/kg/天)和CMS035(5μg/kg/天)能降低移植的S180肉瘤的生长，与生理盐水组比较有统计学显著差异，P＜0.05。
3.肽对移植腹水型肝癌H22的BALB/C小鼠的存活的影响(方法3)
          表IV.3肽对小鼠移植性腹水型肝癌H22存活指数的影响
组别            药物剂量       动物数    生存时间(天)     存活指数(％)
CMS008          5μg/kg        20        50.7±20.9*&     67.8
CMS011          5μg/kg        20        36.4±14.8*&     60.2
CMS024          50μg/kg       20        36.3±12.7*&$    38.4
CMS024          5μg/kg        19        40.6±14.6*&$    54.8
CMS024          0.5μg/kg      19        46.4±14.8*^&$ 76.9
CMS032          0.5μg/kg      20        42.8±12.2*^&$ 63.3
rhIL-2          3×105IU/kg   18        13.6±0.5
rmIFN-γ                  3×105IU/kg   20        27.8±7.5         6.1
环磷酰胺        20mg/kg        20        24.7±10.2
生理盐水        0.5ml          19        26.2±6.8
*：与生理盐水组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
^：与IFN-γ组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
&：与IL-2组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
$：与环磷酰胺组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
CMS008(5μg/kg/天)、CMS011(5μg/kg/天)、CMS024(0.5μg/kg/天、50μg/kg/天)、CMS032(0.5μg/kg/天)，能够明显延长腹水型H22小鼠的存活时间，与生理盐水组比较，有显著性差异(P＜0.05)。还观察到CMS024(0.5μg/kg/天)组中，超过30％(n＝6)的小鼠可存活超过90天(实验结束后2个月)。小鼠的postmortum检查未示出有肿瘤迹象。因此，CMS024(0.5μg/kg/天)可通过感染肿瘤建立或诱导已建立的癌症的完全治愈而感染移植的H22的生长。
4.肽对腹水型肝癌H22小鼠T淋巴细胞转化的影响(方法4.2)
                表IV.4肽对T淋巴细胞转化的影响
组别            药物剂量         动物数        刺激指数
CMS010          500μg/kg        20            1.45±0.21*$
CMS019          0.5μg/kg        19            1.50±0.19*$
CMS024          0.5μg/kg        19            1.46±0.19*$
CMS024          5μg/kg          20            1.45±0.21*$
CMS034          0.5μg/kg        20            1.37±0.10*$
CMS035          0.5μg/kg        20            1.40±0.13*$
CMS035          5μg/kg          20            1.46±0.16*$
rhIL-2          3×105IU/kg     19            1.46±0.21*
rmIFN-γ                  3×105IU/kg     18            1.2715±0.1416
环磷酰胺        20mg/kg          19            1.0051±0.2317*
生理盐水        0.5ml            20            1.2514±0.0651
*：与生理盐水组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
$：与环磷酰胺组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
CMS010(500μg/kg/天)、CMS019(0.5μg/kg/天)、CMS024(0.5μg/kg/天和5μg/kg/天)、CMS035(0.5μg/kg/天和5μg/kg/天)能显著提高T淋巴细胞刺激指数，与生理盐水组比较，有显著增加(P＜0.05)。
5.肽对腹水型肝癌H22小鼠NK细胞活性的影响(方法4.3)
                表IV.5肽对NK细胞胞毒活性指数的影响
组别            药物剂量         动物数          NK活性指数(％)
CMS003          500μg/kg        17              37.9±14.5*^$
CMS014          0.5μg/kg        17              40.7±19.7*$
CMS024          0.5μg/kg        18              39.3±18.7*$
CMS024          5μg/kg          20              34.9±12.1*^$
CMS024          50μg/kg         20              43.6±13.9*^$&
CMS032          5μg/kg          20              52.6±12.5*^$&
CMS032          50μg/kg         19              41.0±18.7*^$&
CMS034          50μg/kg         20              57.3±17.9*^$&
rhIL-2          3×105IU/kg     19              26.0±9.0
rmIFN-γ                  3×105IU/kg     18              20.9±3.3
环磷酰胺        20mg/kg          19              16.5±7.2*
生理盐水        0.5ml            20              24.0±8.2
*：与生理盐水组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
^：与IFN-γ组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
&：与IL-2组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
$：与环磷酰胺组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
CMS003(500μg/kg/天)、CMS014(0.5μg/kg/天)、CMS024(0.5μg/kg/天、5μg/kg/天和50μg/kg/天)、CMS034(50μg/kg/天)能显著提高NK细胞胞毒活性，与生理盐水组比较，有显著增加(P＜0.05)。
6.肽对具有移植的L1210白血病的DBA/2小鼠的存活的影响(方法5)
            表IV.6肽对小鼠移植性L1210白血病存活时间的影响
组别            药物剂量      动物数     生存时间(d)      存活指数(％)
CMS019          0.5μg/kg      20        21.1±5.8*      26.8
CMS035          0.5μg/kg      20        29.3±15.4*     76.1
rhIL-2          3×105IU/kg   20        32.0±13.7*     92.3
rmIFN-γ                  3×105IU/kg   20        15.6±2.2
环磷酰胺        20mg/kg        20        24.0±5.3*      44.2
生理盐水        0.5ml          21        16.6±5.6
*：与生理盐水组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
CMS019(0.5μg/kg/天)、CMS035(0.5μg/kg/天)能够明显延长移植性L1210白血病DBA/2小鼠的存活时间，与生理盐水组比较有显著性差异(P＜0.05)。
7.肽对具有移植的B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠的体液免疫性的影响(方法6.1)
表IV.7肽对具有移植的B16黑色素瘤的C57BL/6小鼠溶血指数的影响
组别              药物剂量           动物数        溶血指数
CMS001            0.5μg/kg          20            51.0±16.2*$
CMS001            5μg/kg            20            41.3±17.7*$
CMS001            50μg/kg           19            45.0±31.9*$
CMS001            500μg/kg          20            36.0±10.2*$
CMS003            0.5μg/kg          20            61.6±26.9*$
CMS003            5μg/kg            20            37.2±15.9*$
CMS003            50μg/kg           20            38.7±13.5*$
CMS003            500μg/kg          20            35.9±13.0*$
CMS008            0.5μg/kg          19            42.7±18.4*$
CMS008            5μg/kg            20            38.9±12.0*$
CMS008            50μg/kg           20            37.1±16.7*$
CMS008            500μg/kg          20            50.1±17.8*$
CMS010            0.5μg/kg          18            34.9±10.5*$
CMS010            5μg/kg            20            51.0±14.6*$
CMS010            50μg/kg           20            39.6±7.7*$
CMS010            500μg/kg          20            50.1±16.7*$
CMS011            0.5μg/kg          20            32.0±14.7*
CMS011            500μg/kg          20            34.4±19.4*
CMS016            500μg/kg          20            43.3±30.0*
CMS019            0.5μg/kg          20            42.0±12.0*$
CMS019            5μg/kg            20            35.4±15.1*$
CMS019            50μg/kg           20            28.3±7.6*
CMS024            0.5μg/kg          20            43.0±10.7*$
CMS024            5μg/kg            20            42.2±11.8*$
CMS024            50μg/kg           20            27.8±9.1*
CMS024            500μg/kg          18            30.1±10.0*
CMS034            0.5μg/kg          18            50.8±18.4*$
CMS034            5μg/kg            19            43.0±11.7*$
CMS034            50μg/kg           20            30.2±10.9*
CMS035            5μg/kg            20            38.9±21.2*$
CMS035            50μg/kg           20            44.7±22.7*$
CMS035            500μg/kg          19            40.5±25.8*
rhIL-2            3×105IU/kg       19            49.3±24.7*
rmIFN-γ                      3×105IU/kg       19            60.5±17.4*
环磷酰胺          20mg/kg            19            20.7±19.1
生理盐水          0.5ml              20            19.0±9.1
*：与生理盐水组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
^：与IFN-γ组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
&：与IL-2组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
$：与环磷酰胺组比较，具有显著性差异。P＜0.05。
CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS016、CMS019、CMS024、CMS034、CMS035，在表IV.7所示给药剂量时，能增强体液应答(溶血指数增加)，与生理盐水组比较有显著差异(P＜0.05)。
8.肽对C57BL/6小鼠中的接种的B16黑色素瘤细胞的存活性的影响(方法6.2)
在用CMS008(0.5μg/kg/天、5μg/kg/天、50μg/kg/天)、CMS016(5μg/kg/天、500μg/kg/天)处理的小鼠肺中没有任何存在B16黑色素瘤灶的迹象。
                        结论
本研究依据中华人民共和国卫生部药政局1993年颁布的《新药(西药)临床前研究指导原则》中的抗肿瘤药效学指导原则，观察肽对小鼠移植性肿瘤的治疗作用，得出以下结论：
1.CMS010、CMS034、CMS035在合适剂量能够明显抑制小鼠中移植S180肉瘤的生长；
2.CMS001、CMS034在合适剂量能够增强荷S180肉瘤小鼠吞噬细胞的吞噬免疫活性；
3.CMS008、CMS011、CMS024、CMS032在合适剂量能够延长腹水型肝癌H22小鼠的存活时间；
4.CMS010、CMS019、CMS024、CMS034、CMS035在合适剂量能促进腹水型肝癌H22小鼠T淋巴细胞转化；
5.CMS003、CMS014、CMS024、CMS032、CMS034在合适剂量可以增强用腹水型肝癌H22移植的小鼠的NK细胞胞毒活性；
6.CMS019、CMS035在合适剂量能够延长移植性L1210白血病小鼠的存活时间；
7.CMS008、CMS016在合适剂量可抑制小鼠中移植性B16黑色素瘤的发展；
8.CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS016、CMS019、CMS024、CMS034、CMS035在合适剂量能够促进移植有B16黑色素瘤的小鼠的体液免疫应答。
                     讨论
CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS014、CMS016、CMS019、CMS024、CMS032、CMS034、CMS035自己或作为一部分可用于人类癌症控制。比如，CMS001、CMS003、CMS008、CMS010、CMS011、CMS014、CMS016、CMS019、CMS024、CMS032、CMS034、CMS035可用于提高癌症病人的机体免疫功能；CMS008、CMS010、CMS016、CMS034、CMS035可用干扰肿瘤细胞的生长；CMS008、CMS011、CMS019、CMS024、CMS032、CMS035可用于延长肿瘤病人的生存时间。这些肽，可单独或联合使用、或与其它药物或食物成分共同作用，用于肿瘤的全程控制。
表IV.8对癌症有效的肽
CMS代码                                SEQ ID NO：
CMS001                                 1
CMS003                                 27
CMS008                                 3
CMS010                                 4
CMS011                                 30
CMS014                                 7
CMS016                                 9
CMS019                                 11
CMS024                                 16
CMS032                                 22
CMS034                                 24
CMS035                                 25
参考文献
1.新药(西药)临床前研究指导原则.  中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：137-143
2.新药(西药)临床前研究指导原则.  中华人民共和国卫生部药政局.1993，7：128-129
3.章元沛，苏怀德.药理学实验(第二版).人民卫生出版社.1998，137-138
4.徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.1991，1221-1234
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11.章元沛，苏怀德.药理学实验(第二版).人民卫生出版社.1998，131
V.对体重的作用
喂食健康大鼠高营养饲料5周，伴有或不伴有同时肽治疗(肌肉内300μg/kg/day)。注射生理盐水的正常饮食大鼠作为阴性对照组。治疗5周后，停止注射，维持相同饮食3周。每周测大鼠体重及观察行为变化。结果发现，在肽治疗过程中，接受CMS015治疗的大鼠体重增长幅度明显低于对照组，撤药后体重增长减缓的趋势逐渐减退。因此，表明合适剂量水平的肽CMS015对营养性肥胖大鼠的体重增长有可逆性抑制作用。
材料
Sprague Dawley(SD)大鼠，雌雄兼备，体重145±10g，购于广州中医药大学实验动物中心。肽，L-氨基酸来源，由American PeptideCompany，Inc.，USA合成，使用时以生理盐水稀释为10μg/ml的注射液。大鼠高脂肪高营养饲料及普通饲料配方参照国家药品监督管理局颁布的新药临床前研究指导原则[1]的“减肥药”项。
方法
健康大鼠随机分为实验组、阳性对照组及阴性对照组，每组10只，雌雄各半。实验组大鼠给予高营养饲料5周，同时给予肌注肽300μg/kg/day，每天1次。阳性对照组给予相同高营养饲料，但以安慰剂生理盐水注射，而阴性对照组大鼠食普通饲料和安慰剂注射，用来验证前两组造模是否成功。5周治疗后，停止注射，保持相同饲料3周。每周测大鼠体重及观察行为变化。
统计处理
实验数据表示为均数±标准差，用配对t检验及单因素ANOVA分析进行组间及组内比较。显著性差异为P≤0.05。
结果
1.肽对SD大鼠体重的影响
                            表V.1肽对SD大鼠体重的影响
             阳性对照组(g)              CMS015治疗组(g)
雄性n＝5  雌性n＝5  雄性n＝5 雌性n＝5
治疗前 145.6±13.6  133.6±46  145.6±8.5 129.2±3.3
治疗后第1周 194.4±14.5  164.4±8.7  183.8±10.6 157.8±8.3
治疗后第2周 239.6±13.4  188.0±6.4  220.6±12.2* 176.0±11.2*
治疗后第3周 265.0±11.8  208.8±8.2  239.0±16.0* 196.0±10.5*
治疗后第4周 287.4±17.7  227.2±8.2  258.2±18.1* 212.0±13.5*
治疗后第5周 299.4±21.2  236.6±10.9  268.8±17.7* 221.4±13.2*
治疗后第6周 333.4±27.1  249.4±16.3  299.4±21.2* 235.6±16.3
治疗后第7周 349.2±28.9  261.2±13.4  310.4±25.9* 242.2±18.8*
治疗后第8周 374.4±37.2  255.6±11.5  337.4±30.6 252.8±22.5
与阳性对照组相比：*P＜0.05
与对照组相比较，肽CMS015以300μg/kg/d给药能明显抑制营养性肥胖大鼠的体重增长(P＜0.05)。治疗组和对照组的差异随治疗时间加大。CMS015组停药后，治疗组和对照组的差异逐渐降低，在3周后差异不再统计学显著，表明肽对SD大鼠体重的作用是可逆的。
在整个实验期间，各组大鼠食欲和活动均未受影响。
讨论
从本实验结果可以得出，给予合适剂量的肽CMS015能够抑制营养性肥胖大鼠的体重增长，因此有潜力应用于人类减肥。该肽将来可以单独使用、或与两个以上肽类合用、或与其它药物或食疗合用于肥胖的综合治疗。
本研究仅检验了肌肉注射这一给药途径，但不排除其它可能有效的给药途径。肽CMS015可以经静脉注射、肌肉注射、腹腔内注射、皮下注射或皮下植入等途径给药，可以用或不用诸如脂质体、持续释放保护等药物传递易化装置。该肽也可以用片剂、胶囊、悬液、溶液等任何口服给药形式，以及有或没有胃肠保护的不作修饰的普通形式或缓释形式。该肽还可进一步用于表皮，制成如油膏、乳膏、胶体等，可用或不用透皮易化装置，或制成吸入粉剂、溶剂或脂质体保护形式。该肽也可以翻译成基因序列，克隆进入一个表达系统，单独或者与其它肽序列结合产生一个经纯化或不经纯化的肽分子，其可利用的活性正如本文所描述的那样。
表V.2对肥胖有效的肽
CMS代码                    SEQ ID NO：
CMS015                     8
参考文献
1.国家药品监督管理局，主编。新药临床前研究指导原则，1993年，第1版。
应理解的是可以在上述肽的氨基端或羧基端增加额外的氨基酸以作为实施本发明的另一方法。例如，在所述肽中增加一个或两个氨基酸而并未使其生物功能受到影响，也可以增加三或四个氨基酸而仍保持肽的功能。这些均称为该肽的变异体。或者，可从肽中缺失一个或两个氨基酸而并未使其生物活性受到影响，还可进一步缺失三或四个氨基酸而不影响肽的生物功能。这些称为本发明肽的片段。另外，肽的衍生物如在同一功能区内进行一个氨基酸的保守置换也可用于实施本发明的另一方面。例如，具有非极性端或称疏水侧链的肽可以被取代一个侧基而其生物学功能并不减弱。作为进一步的例子，接头/间隔基可被插入肽形成变体，但这些变体仍保持本研究中所用的原始肽的活性部分。这些被视为本发明肽的变体。本文所用术语肽类似物包括具有模拟天然氨基酸结构的氨基酸分子的肽，例如具有不同骨架结构或D-氨基酸取代的类似物。作为进一步的例子，尽管用于合成肽的氨基酸是L-光学异构形式，但是序列中一或多个氨基酸被D-型取代的肽可能具有类似的生物活性。本申请权利要求中所用术语“功能性衍生物”涵盖本发明肽的片段、变体、类似物和化学衍生物。
本文所用术语“杂合肽”是指含有插入具有SEQ ID NO：1-30的原始生物活性肽或其功能衍生物中的额外肽但仍保持基本类似的活性的肽。额外肽包括前导肽，其含有例如由一或多个原核或真核细胞识别作为将该杂合肽分泌至胞外的信号的氨基酸序列。分泌可以是直接分泌，或通过分泌小泡间接分泌。
“基本上纯化的肽”是指纯度至少为10％(w/w)的肽，优选纯度为20％，更优选为40％，更优选为60％，进一步优选为大于90％。在最优选的实施方案中，纯度大于99％。如下文所述，基本上纯化的肽可做为混合物中的部分成分进行药物或营养配方的制备。
上述肽用在药物配方中可用于治疗免疫失调以及对于免疫性有继发作用的疾病，如癌症或感染或任何上述症状。在这些肽的药物配方中，除含有一种已确定的肽外，还可能混有其它活性或非活性组分，这些组分包括其它肽，例如两个或若干个(例如3-5个)所列肽可以加到同一配方中，可伴有或不伴有其它成分。或者，一个所列肽可以与未列出的肽一起用于制备配方。此类配方可以经静脉、肌肉、皮内、皮下或真皮内给药，或动脉注射直接作用于器官，还可以以粉末、喷雾的方式经呼吸道吸入，经皮吸收或本领域已知的其它输送方式。配方还可以口服，并可含有可用于在口服后防肽的胃消化的载体，或本领域已知的任何其它载体(对于经皮，如脂质体)。
药物配方可包括任何已知的药物载体，合适的载体的例子包括本领域已知的任何标准药物学可接受的载体，包括但不局限于，生理盐水、水、乳剂如油水混合物或甘油三酯乳剂，或其他制剂，填充剂、包衣片剂或胶囊等等，适宜的载体依据给药方式进行选择。
肽可以经静脉注射、肌肉内注射、腹膜内注射、皮下注射和皮下植入而给药。肽还可以任一口服给药形式如片剂、胶囊、悬液、溶液等以未修饰的常用形式或缓释形式或胃肠道保护或不保护形式给药。肽可进一步以任何局部应用的形式如软膏、霜、凝胶等经或不经经皮促进装置给药。肽还可转成其遗传序列并克隆进表达系统，或以其本身或与其它肽序列组合以产生肽分子而利用本文所述肽活性。
每一种肽的给药剂量可以是1ng-10g/kg体重。注射用给药剂量可以是10ng-10mg/kg，更优选1μg-1mg/kg。药物的起效剂量可低至1ng/kg，这可能是通过一个或多个肽与受体结合，或者肽直接引起机体一系列级联式反应而起效的。对于口服，给药剂量可以是1ng-10g/kg体重/天，优选0.1μg-1g/kg体重/天，更优选是1μg-10mg/kg体重/天。
VI、基因治疗及治疗方法
基于所发现的肽序列的基因疗法是通过设计编码这些肽之一的核酸序列而进行。核酸可化学合成并与启动子有效连接而克隆到表达载体内。表达载体随后以基因治疗的形式给予人体，以在人体细胞内表达。本文所采用的“基因载体”一词包括这些表达载体。可以用于基因治疗的载体包括腺相关病毒(Mizuno，M.等(1998)，日本癌症研究杂志89，76-80)、LNSX载体(Miller，A.D.等(1993)酶学方法217，581-599)和慢病毒(Goldman，M.J.等(1997)人类基因治疗8，2261-2268)。
用于肽输送的其它载体包括可在宿主生物体中复制的生物中的编码所需肽的表达载体，该宿主生物体希望被给予该肽而不明显影响该宿主生物体的健康。例如，表达载体可以被转移至对希望被给予该肽的宿主生物体是非致病性的生物体中。在某些实施方案中，表达载体在一种对希望被给予该肽的宿主生物体的健康没有明显有害作用的细菌或真菌生物中以产生所需的肽。例如，编码所需的肽的表达载体可以是在如乳酸菌、大肠杆菌或酵母的生物体中产生所需的肽的表达载体。在一个实施方案中，表达载体在一种哺乳动物消化道中天然存在的微生物或哺乳动物消化道耐受的微生物中产生所需的肽。可以表达所需的肽的一些微生物物种包括但不限于乳杆菌菌种，如L.acidophilus，L.amylovorus，L.casei，L.crispatus，L.gallinarum，L.gasseri，L.johnsonii，L.paracasei，L.plantarum，L.reuteri，L.rhamnosus，等；双歧杆菌菌种，如B.adolescentis，B.animalus，B.bifidum，B.breve，B.infantis，B.lactis，B.longum等；Enterococcusfaecalis或Ent.facium；Sporolactobacillus inulinus；Bacillus subtilis或Bacillus cereus；Escherichia coli；Propionibacterium freudenreichii；或Saccharomyces cerevisiae或Saccharomyces boulardii。
化学合成的或以其它方式包括但不限于将mRNA逆转录产生cDNA分子而产生的编码本发明肽的核酸序列被掺入表达载体中，以通过本领域已知的基因工程方法基因转移进所希望的宿主中。表达载体可以是DNA载体或RNA载体。例如，表达载体可以基于质粒或病毒遗传元件。表达载体可以是染色体外复制的载体或者整合进染色体的载体。
表达载体包括与编码本发明肽的核酸有效连接的启动子。启动子可以是可调控的启动子，如诱导型启动子或组成型启动子。在一些实施方案中，可以选择启动子以提供所需水平的肽表达。另外，如果需要，表达载体可以包括其它序列以促进肽的产生、呈递和/或分泌。在一些实施方案中，编码本发明肽的核酸与指导肽分泌的核酸序列有效连接。例如，编码本发明肽的核酸可以与编码信号肽的核酸序列有效连接。
在一些实施方案中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在组成哺乳动物正常消化道菌群的细菌菌种如乳杆菌菌种和枯草芽孢杆菌中表达本发明肽的表达载体。这种表达载体的例子可参见美国专利6,100,388和5,728,571。这些文献以其全文引入本文作参考。应理解的是促进本发明肽在不损害希望给予该肽的宿主生物体的健康的生物体中的表达的任何表达载体均可使用。
在一些实施方案中，被工程化以编码本发明肽的表达载体可以是适于在被哺乳动物消化道耐受的酵母菌种如Saccharomycescerevisiae或更优选地Saccharomyces boulardii(其可在人消化道中寄居并用于治疗某些形式的腹泻)中表达本发明肽的表达载体。组成性表达异源蛋白和肽的酵母表达载体可以使用，因为其非常稳定，因此在有丝分裂和减数分裂过程中可以传递至子代，所述载体可包括信号肽或指导重组蛋白高水平分泌的肽的编码序列。这种酵母载体的例子参见美国专利6,391,585，该文献引入本文作参考。
编码本发明肽的表达载体可以经本领域已知技术导入欲表达该肽的生物体中。这些技术包括转化细菌、酵母或其它微生物的传统方法，例如经使用化学感受态细菌细胞、电穿孔或乙酸锂转化(用于酵母)，以及用这些程序无效的一些细菌菌种的转化方法的最近进展。在一些实施方案中，表达载体用Leer等(WO95/35389)公开的方法导入已知不能转化的乳酸菌中(该文献引入本文作参考)。导入的序列可以掺入微生物染色体DNA中或保持染色体外DNA元件的形式。
含有表达载体的这一基因工程微生物随后可以接种消化道、阴道、气管等以实现免疫治疗。在一些实施方案中，表达本发明肽的生物体以无活性形式摄入，或者优选地，以活性形式摄入。在消化道中，这些微生物产生所述肽，通过分泌或微生物的裂解将其释放进腔内，或以其它方式将肽呈递给宿主，由此肽产生其对宿主生物体的预期作用。在其它实施方案中，在鼻通道、阴道或小肠粘膜处将肽呈递给宿主生物体。
另一种治疗方法是使用脂质体作为输送特异核酸至人体细胞的方式。核酸(如含有编码SEQ ID NO：1-30的肽的核酸的表达载体)在有利于细胞吸收和染色体掺入的环境中被输送，如Gao，X.和Huang，L.(1995)基因治疗2，710-722和美国专利6,207,456所述。或者，使用US6,245,427的方法，肽本身可包在脂质体中并直接输送。上述所有科学出版物和专利均引入本文作参考。
可用于上述基因治疗和治疗方法的核酸序列包括编码这些肽及其功能衍生物的序列。基于简并密码系统，许多核酸序列中的任何一种均可用于编码这些肽及其衍生物。
下述参考文献引入本文作参考：
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2.徐叔云，卞如濂，陈修主编.药理实验方法学.1991，1221-1234
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10.李家泰.临床药理学(第二版).人民卫生出版社.1998，1338-1339
实施例1经基因工程乳杆菌菌种输送肽
以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码表A中所列的一个肽的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体含有在乳杆菌中有功能的组成型启动子，一个用于以特异的5′至3′方向导入DNA序列的多克隆位点，以及一个赋予对抗生素的抗性的选择标记基因(以辅助克隆程序)，并且还可含有有助于肽的产生和/或分泌的其它序列，如信号肽序列。这种载体的一个例子参见美国专利5,592,908，其引入本文作参考。简要地，该专利讨论了在乳杆菌菌种中有功能的若干已知启动子，以及在所述细菌中发现新启动子的方法，这些启动子的任一种均可与编码本发明肽的核酸有效连接以在乳杆菌中表达所述肽。编码信号肽如美国专利5,592,908所述的在乳酸乳杆菌中有活性的由16-35个多数为疏水的氨基酸组成的肽的核酸被插入启动子和编码本发明肽的核酸之间，从而编码信号肽的核酸与编码本发明肽的核酸同框。
除了肽的编码序列之外，合成的DNA序列还可包括有助于将所述DNA连接并克隆进表达载体的序列。例如，相应于载体的多克隆位点的一个位点的限制酶识别位点可被掺入合成DNA中，从而所述序列可以正确方向克隆进载体中。载体和合成DNA用特定限制酶消化，然后纯化。载体和合成DNA连接反应后转化进大肠杆菌合适菌株中。转化的细菌在含有载体赋予抗性的抗生素的培养基上铺板。选择转化细菌的菌落进行生长培养和质粒制备。证实存在正确方向的合成DNA。
然后将表达载体转化进乳杆菌菌种如L.acidophilus的细菌宿主细胞中。通过载体序列中的选择标记选择转化的细胞，肽的分泌可通过进行Western印迹、进行存在于培养基中的肽的凝胶电泳和其它标准技术证实。选择细菌转化菌落并用于制备基因工程菌的大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理细菌培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存细菌的方法，另外可将细菌与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。例如，细菌可用于制备酸奶产品或其它食品供人类消费，从而表达肽的微生物寄居在人消化道中。将乳酸菌的特殊菌株掺入食品如酸奶、泡菜、乳酪和奶油的各种不同方法参见美国专利6,036,952，其引入本文作参考。通过任一种途径摄入细菌后，工程菌可寄居在消化道中使得经消化道的粘膜层呈递和/或吸收本发明肽。
实施例2经基因工程形式的枯草芽孢杆菌输送肽
以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码表A中所列的一个肽的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体包括穿梭载体，如pTZ18R(Pharmacia，Piscataway，NJ)，其在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中均能繁殖并含有抗生素抗性基因以选择转化菌落。这一载体可以含有在枯草芽孢杆菌中有活性的启动子，如衍生自枯草芽孢杆菌SacB基因的启动子，以及编码在枯草芽孢杆菌中有活性的信号或前导肽的核苷酸序列，该信号或前导肽指导表达的异源蛋白从细菌细胞中有效输出。这种载体的一个例子参见美国专利6,268,169，其引入本文作参考。简要地，如上所述，以本领域熟知的技术合成具有限制酶位点和/或促进DNA克隆的其它序列的编码本发明肽的DNA。在转化进大肠杆菌、铺板、选择和繁殖质粒产生质粒原液后，将质粒转化进枯草芽孢杆菌，并根据对铺板培养基中的抗生素的抗性选择转化子。
用本领域熟知的技术如在SDS-PAGE分析或Western印迹后放射标记肽以放射自显影来证实基因工程枯草芽孢杆菌对肽的产生和分泌。
培养表达所需肽的基因工程菌的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该细菌可在其中复制的其它区域。
实施例3经基因工程糖酵母菌种输送肽
以下提供了将本发明肽输送至如上所述宿主中的一个举例方法。编码表A中所列的一个肽的DNA序列经化学方法合成，并用本领域技术人员熟知的标准基因工程技术将这一DNA序列导入一表达载体中。所选的表达载体包括一稳定维持的酵母蛋白表达载体，包括组成型酵母启动子如pADH1，使载体在酵母和大肠杆菌中均能复制的位点，赋予营养缺陷型酵母突变体以原养型的用于选择目的的一个或多个基因，多克隆位点(MCS)，以及如果需要的编码信号肽的序列。这种载体是市售的并是本领域熟知的或者可用标准技术构建。在将合成DNA插入酵母载体、转化进大肠杆菌、在选择培养基上铺板转化的大肠杆菌、选择转化的细菌菌落并从所述菌落的细菌培养物中制备质粒DNA后，将载体经熟知技术如乙酸锂转化或电穿孔转化进啤酒糖酵母。选择用于转化的啤酒糖酵母菌株是突变的营养缺陷型菌株，其需要质粒上的一种基因以在基本培养基上生长。通过将酵母在缺少该载体上提供的基因的培养基上铺板而选择转化的酵母菌落。只有接受的载体及其选择基因并表达该基因产物的酵母可在基本培养基上生长成菌落。通过进行Western印迹、存在于培养基中的肽的凝胶电泳或其它标准技术可以证实肽的表达。
选择酵母转化菌落并用于制备大规模培养物。培养表达所需肽的基因工程酵母的培养物并将其至少一部分给予宿主生物体的消化道、阴道、气管或该酵母可在其中复制的其它区域。如果需要，可以各种方式处理酵母培养物以产生由宿主肠道吸收的补剂。这些处理包括冻干或其它保存酵母的方法，另外可将酵母与载体试剂如溶液、溶剂、分散介质、缓释剂、乳液等组合。这些试剂制备补剂的用途是本领域熟知的。在另一实施方案中，转化的酵母可用本领域已知技术制备食品如发酵奶制品如酸奶和kefir。与这些食品中的活乳酸菌培养物一样，转化的酵母至少短时寄居在消化道中，并经消化道腔将肽提供给宿主。
                                序列表
<110>王伟明
     林刚
<120>序列号21的生物活性肽
<130>WILKG3.001CP1
<140>未知
<141>2002-06-20
<150>09/904,492
<151>2001-07-13
<160>30
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>10
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>1
Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe
 1               5                  10
<210>2
<211>9
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>2
Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
 1               5
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>3
Lys Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu
 1               5                  10
<210>4
<211>18
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>4
Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn
 1               5                  10                  15
Pro Lys
<210>5
<211>13
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>5
Leu Gly Met Glu Ala Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr
 1               5                  10
<210>6
<211>11
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>6
Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu
 1               5                  10
<210>7
<211>12
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>7
Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val
 1               5                  10
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>8
Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met
 1               5                  10
<210>9
<211>13
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>9
Ile Gly Met Glu Ser Ala Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr
 1               5                  10
<210>10
<211>9
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>10
Val Gly Met Gly Glu Lys Asp Ser Tyr
 1               5
<210>11
<211>9
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>11
Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr
 1               5
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>12
Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val
 1               5                  10
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>13
Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu
 1               5                  10
<210>14
<211>3
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>14
Tyr Ser Phe
 1
<210>15
<211>3
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>15
Ala Ala Phe
 1
<210>16
<211>3
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>16
Tyr Ser Leu
 1
<210>17
<211>7
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>17
Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met
 1               5
<210>18
<211>5
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>18
Phe Glu Glu Asn Met
 1               5
<210>19
<211>5
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>19
Phe Glu Pro Ser Phe
 1               5
<210>20
<211>4
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>20
Phe Asn Glu Glu
 1
<210>21
<211>4
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>21
Phe Glu Glu Met
 1
<210>22
<211>4
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>22
Phe Glu Glu Glu
 1
<210>23
<211>4
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>23
Phe Glu Ser Phe
 1
<210>24
<211>4
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>24
Pro Glu Asn Phe
 1
<210>25
<211>4
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>25
Phe Val Asn Asp
 1
<210>26
<211>5
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>26
Phe Gln Pro Ser Phe
 1               5
<210>27
<211>6
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>27
Phe Asn Phe Val Pro Pro
 1               5
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>28
Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe
 1               5                  10
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>29
Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
 1               5                  10
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>Sus scrofa
<400>30
Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
 1               5                  10

Claims (10)

1、一种具有SEQ ID NO：21的肽。
2、一种遗传载体，其包含编码具有SEQ ID NO：21肽的核苷酸序列。
3、一种微生物，包含权利要求2所述的遗传载体。
4、一种药物组合物，其包含具有SEQ ID NO：21的肽。
5、一种制备权利要求4所述的药物组合物的方法，包括将所述肽与药物学可接受载体混合。
6、如权利要求5所述的方法，包括将纯化的肽与药物学可接受载体混合。
7、如权利要求6所述的方法，包括将纯度是不少于90％w/w的肽与药物学可接受载体混合。
8、如权利要求7所述的方法，包括将纯度是不少于99％w/w的肽与药物学可接受载体混合。
9、具有SEQ ID NO：21的肽在制备调节免疫活性药物中的应用。
10、具有SEQ ID NO：21的肽在制备治疗肾炎药物中的应用。
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