CN105254708B - 一种胡萝卜籽抗氧化三肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胡萝卜籽抗氧化三肽及其制备方法与应用。该抗氧化三肽序列为Tyr‑Ser‑Leu（YSL），体外实验表明，该多肽可以有效清除DPPH和ABTS自由基，同时该多肽具有较好的稳定性。本发明所涉及的抗氧化三肽具有结构简单、抗氧化活力强等特点，可作为现有人工合成抗氧化剂的辅助和替代，对新型抗氧化保健品开发与应用方面具有重要价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种胡萝卜籽天然抗氧化三肽及其制备方法和在保健品领域中的应用，属于保健食品领域。
背景技术
我国作为农业大国，农作物的种类繁多，产量丰富。由于受到农产品加工技术条件的所限，农作物的加工大都处于初级阶段。一些农作物加工后的残余物中仍有较大含量的蛋白质，而它们大多主要用于饲料工业或自然排放，不仅浪费了资源，同时也造成环境污染。植物活性肽概念的提出及分离检测技术的提高，使人们开始逐渐重视对富含蛋白质的农副产品的深加工并从中获得多种活性肽，如酪蛋白磷酸肽、降血压肽和易消化吸收肽等，植物来源活性肽的研究和开发对提高我国农产品深加工的附加值具有重要作用。
抗氧化剂近些年来在国内外发展很快，用途也越来越广。自从Harman 提出自由基理论以来，人们认识到人体内氧化产生的自由基与人的衰老和许多疾病有关，因此抗氧化剂不仅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作为功能因子用于保健食品及化妆品等的开发。抗氧化剂的种类很多，然而化学合成的抗氧化剂如BHA、BHT等，由于其本身具有毒副作用，各国政府纷纷对其强制规定了ADI值控制其过量添加。于是人们把目光逐步转向从各种植物和动物组织中提取天然抗氧化剂。抗氧化活性多肽由于低毒、高效等特点，作为食品和机体的抗氧化剂，被认为是人工合成抗氧化剂的理想替代者。
抗氧化肽能有效地清除体内过剩的活性氧自由基，保护细胞和线粒体的正常结构和功能，防止脂质过氧化的发生，而氧化与人类及其他动物的许多疾病诸如癌症、老化、动脉硬化等的发病机理有关。适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低体内自由基水平，防止脂质过氧化，帮助机体抵御疾病。目前使用植物和动物蛋白为原料，制备抗氧化肽的专利也有很多，主要采用酶解蛋白质的方法制备抗氧化多肽。由于不同植物蛋白的蛋白质种类差异较大，因此蛋白质酶解也有不同的工艺条件，以及不同的酶解产物的分离纯化方法。
胡萝卜籽作为我国的传统中药，化学成分丰富，生理活性广泛，是一种应用价值很高的优质植物蛋白资源。目前，有关胡萝卜籽的研究主要集中在胡萝卜籽油、胡萝卜素和黄酮类等，并未对胡萝卜籽蛋白和活性肽进行相关探索。因此，有必要充分利用我国胡萝卜籽植物资源，对其进行深入系统研究，对其中的蛋白质进行提取和酶解，并对其中具有较强抗氧化活性的多肽进行分离纯化，为开发新型、高效、安全的保健食品提供科学依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备简单，抗氧化活性强的胡萝卜籽抗氧化三肽，并且可以将该抗氧化三肽应用于保健食品的研制与开发。
本发明的一种抗氧化三肽，其氨基酸序列为Tyr-Ser-Leu。用单字母表示为YSL，即由酪氨酸-丝氨酸-亮氨酸3个氨基酸残基构成。
胡萝卜籽蛋白酶解产物的制备：采用减提酸沉法得到胡萝卜籽蛋白，采用酸性蛋白酶将其在最佳酶解条件（酶添加量419.36 U/g, 底物浓度5.28%（w/v））下解酶时间3.50h，沸水浴10min灭活，经12000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为胡萝卜籽籽蛋白质酶解产物；
胡萝卜籽抗氧化三肽的分离纯化：取胡萝卜籽蛋白的酶解产物，利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0~5 min，5%（V/V）乙腈；5~55 min，5%~40%（V/V）乙腈；55-65 min，40%（V/ V）乙腈；流速为1.0 mL/min，检测波长214 nm，收集21%（V/V）乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗氧化三肽。
本发明的优点在于：
所述抗氧化三肽具有较强ABTS自由基清除作用，并具有较高的稳定性，表明其在抗氧化活性开发和应用方面有重要价值。胡萝卜籽抗氧化三肽对ABTS自由基具有较强的清除活力，在浓度为 2.5 µg/mL时自由基清除率已达 70%，当浓度增加到 25.0 μg/mL 时，三肽 YSL 的自由基清除率几乎达到 95%，相当于同浓度的阳性对照 GSH的自由基清除率。三肽 YSL 有很强的耐碱性和较强的耐酸性，在酸性条件下活性虽有下降，但其结构却未被破坏，仍能保持活性。
附图说明
图1：胡萝卜籽蛋白酶解物Sephedex G-25凝胶过滤色谱图。
图2：凝胶色谱洗脱峰3反相高效液相色谱图。
图3：抗氧化三肽的质谱图。
图4：抗氧化三肽对ABTS自由基清除作用。
图5：抗氧化三肽的温度稳定性。
图6：抗氧化三肽的pH稳定性。
具体实施方式
本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不仅限于下述的实施例。
实施例1
本发明所述抗氧化三肽的分离纯化包括Sephadex G-25凝胶过滤色谱和反相高效液相色谱（RP-HPLC）两个步骤。
胡萝卜籽蛋白酶解产物的制备：采用减提酸沉法得到胡萝卜籽蛋白，采用酸性蛋白酶将其在最佳酶解条件（酶添加量419.36 U/g, 底物浓度5.28%（w/v））下解酶时间3.50h，沸水浴10min灭活，经12000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为胡萝卜籽籽蛋白质酶解产物；
Sephadex G-25凝胶过滤色谱：将胡萝卜籽蛋白酶解物的冻干粉，重新溶解于去离子水中，12000 rpm离心15 min，去上清液。Sephadex G-25凝胶柱（1.6cm×100 cm）用去离子水平衡，将得到的上清液用0.22 μm孔径微滤膜过滤后上柱。用去离子水洗脱，流速0.3mL/min，于214 nm波长处检测洗脱液吸光值，绘制曲线，如图1所示。收集洗脱峰峰3，冷冻干燥，-80 ℃低温保存备用。
高效液相色谱：去冷冻干燥后的峰3用去离子水复溶，离心（4°C，12000 r/min，10min）取上清，经 0.22 µm微滤膜过滤后用采用RP-HPLC进一步分离。液相色谱系统为LC-20A，装配Gemini 5μ C18 （250mm×10mm）反相柱 （Phenomenex，UK） ，用水和乙腈（含0.05%（V/V）三氟乙酸）构成的洗脱系统进行梯度洗脱。洗脱梯度：0~5 min，5%（V/V）乙腈；5~55min，5%~40%（V/V）乙腈；55-65 min，40%（V/V）乙腈；洗脱流速1.0 mL/min，检测波长214 nm，洗脱曲线如图2所示。收集21%（V/V）乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即为本发明所述抗氧化三肽。
将收集到的抗氧化组分冷冻干燥，采用高效液相色谱检验所得到的组分纯度。经检测，该抗氧化肽组分纯度达到95%，可测定其氨基酸序列。
用液相色谱与质谱连用（LC-MS/MS）方法测定氨基酸序列（图3），得到该组分的氨基酸序列YSL。
实施例2
实施例1中得到的抗氧化三肽进行固相合成，将合成后的多肽进行活性研究：
ABTS自由基清除作用：用蒸馏水配制7 mmol/L的ABTS+溶液和2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液（使用前必须先在室温下放置16 h）,分别将ABTS+和过硫酸钾溶液按1∶1体积比混合，临用前用pH 7.4，5 mmol/L 的磷酸盐缓冲溶液将混合液稀释至吸光值A734 为0.70±0.02。取0.5 mL不同浓度的样品和0.5 mL的ABTS自由基溶液混合静置10 min后于734 nm下测其吸光值。用去离子水和还原型谷胱甘肽代替样品分别作空白对照和阳性对照。ABTS自由基清除活力按下列公式（1）计算：
式中，A0：空白对照组吸光值；As：样品组吸光值。
经本实施实例测定，胡萝卜籽抗氧化三肽YSL对ABTS自由基具有较强的清除活力，在浓度为 2.5 µg/mL时自由基清除率已达 70%，当浓度增加到 25.0 μg/mL 时，三肽 YSL的自由基清除率几乎达到 95%，相当于同浓度的阳性对照 GSH的自由基清除率（图4）。
实施实例3
本发明所述抗氧化三肽的稳定性：
对胡萝卜籽抗氧化肽YSL在 20°C ~ 100°C 下分别热处理 1 h ~ 5 h，每隔 1 h测定其 ABTS 自由基清除率。如图5，经测定YSL在温度为 20°C、40°C 和 60°C 下分别处理5 h后自由基清除率均无显著性变化（p > 0.05）。用不同 pH的去离水溶液（2.0、 4.0、6.0、 8.0 和10.0）对胡萝卜籽抗氧化肽YSL分别处理 1 h ~ 5 h，每隔 1 h 测定其 ABTS自由基清除率。经测定，三肽 YSL 有很强的耐碱性和较强的耐酸性，在酸性条件下活性虽有下降，但其结构却未被破坏，仍能保持活性（图6）。
SEQUENCE LISTING
<110> 福州大学
<120> 一种胡萝卜籽抗氧化三肽及其制备方法与应用
<130> 1
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> 氨基酸序列
<400> 1
Tyr Ser Leu
1
Claims (2)
1.一种胡萝卜籽抗氧化三肽的制备方法，其特征在于：所述抗氧化三肽氨基酸序列为Tyr-Ser-Leu；
其制备方法具体步骤包括如下：
(1)胡萝卜籽蛋白酶解产物的制备：采用碱提酸沉法得到胡萝卜籽蛋白，采用酸性蛋白酶将其在最佳酶解条件下酶解：酶添加量419.36 U/g，底物浓度5.28%（w/v）、解酶时间3.5h，沸水浴10min灭活，经12000rpm离心20min，取上清液冷冻干燥，即为胡萝卜籽蛋白质酶解产物；
(2)胡萝卜籽抗氧化三肽的分离纯化：取胡萝卜籽蛋白的酶解产物，利用Sephadex G-25凝胶色谱进行分离，以去离子水为洗脱液，流速0.3 mL/min，测量洗脱组分214 nm波长处的吸光值；收集具有最佳抗氧化活性的峰，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进一步分离；RP-HPLC的洗脱梯度为0~5 min，5%（V/V）乙腈；5~55 min，5%~40%（V/V）乙腈；55-65 min，40%（V/ V）乙腈；流速为1.0 mL/min，检测波长214 nm，收集21%（V/V）乙腈浓度的洗脱峰，冷冻干燥即得所述抗氧化三肽。
2.一种如权利要求1所述方法制备获得的胡萝卜籽抗氧化三肽在制备抗氧化保健品中的应用。
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