CN103275180B

CN103275180B - 马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103275180B
Application number: CN201310194592.0A
Authority: CN
Inventors: 迟长凤; 施晓燕; 王斌; 王玉梅; 杨瑞婷; 叶吉珍
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2013-05-23
Filing date: 2013-05-23
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-05-23
Also published as: CN103275180A

Abstract

本发明公开了一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途，该抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY），ESI-MS测定分子量为672Da。本发明制备工艺科学合理，酶解过程易监控，制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等应用。<b/>

Description

马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽，本发明还涉及该马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的制备方法，本发明还涉及该马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的用途。

背景技术

研究表明人体新陈代谢和食品氧化变质产生的自由基均会对人体细胞和组织造成严重的氧化损伤，从而导致身体衰老、癌症、动脉硬化和心血管疾病等。因此，将抗氧化剂作为食品添加剂添加到日常膳食中可以帮助捕获并中和自由基，祛除自由基对人体的损害和保护食物免受氧化损伤变质。目前，食品行业普遍使用化学合成抗氧化剂，如BHA（叔丁基烃基茴香醚）、BHT（2, 6-二叔丁基对甲酚）、PG（没食子酸丙脂），除TBHQ外，在不同程度上对人体的肝脏、肾脏等器官均有不利影响。因此寻找高效、低毒的抗氧化剂成为人们的研究热点。近年来，人们研究发现水解蛋白质得到的多肽也具有良好的抗氧化活性，如大豆肽、乳蛋白肽和肌肽。

马面鲀为革鲀科马面鲀属的鱼类，俗名橡皮鱼、剥皮鱼、猪鱼、皮匠鱼，分布于朝鲜、日本、印度洋非洲东岸以及中国东海、黄海、上海地区见于长江口等海域，属于外海近底层鱼类。食用过程中，绿鳍马面鲀的鱼皮和鱼头常被作为废物丢掉，未能体现其应有的价值，同时也对环境造成了不良影响。因此，绿鳍马面鲀的鱼头和鱼皮的高值化利用成为研究的焦点，而利用活性肽开发的酶解技术，通过酶解、超滤分级和色谱精制等方法，研制一系列天然、高效、新颖的生物活性肽成为一种重要的途径。

申请人在实验中发现，以马面鲀鱼头为原料，利用酶解技术制备抗氧化肽的工艺研究处于空白阶段，而以马面鲀鱼头蛋白酶解产物为材料制备高活性抗氧化肽及其应用也未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状提供一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽，该抗氧化肽安全无毒副作用，抗氧化活性强和易于消化吸收，可通过清除自由基达到抗氧化作用。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的制备方法，工艺科学合理、易操作。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的应用。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY），ESI-MS测定分子量为672 Da。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将洗净的马面鲀鱼头按固液比1 g：2 ~ 3 mL放入双蒸水中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1：3 ~ 5放入乙醚中脱脂15 ~ 25 h，在3~5 ℃、4000 ~ 5000 rpm条件下离心15 ~ 20 min除去乙醚，收集固形物，冻干，即得到脱脂马面鲀鱼头粉末。

2）以脱脂马面鲀鱼头粉末作为原料，按固液比1 g：15 ~20mL加入磷酸盐缓冲液，用HCl或NaOH调节pH到5.7 ~ 7.0，得混合液；

3）将混合液温度升至55 ℃ ~ 6 5 ℃搅拌预热10 ~ 15 min，按照脱脂马面鲀鱼头质量的1.0 % ~ 1.5 %加入蛋白酶，酶解温度为55 ℃ ~ 65 ℃，酶解时间3 h ~ 5 h，得酶解液；

4）将得到的酶解液升温至90 ℃~ 95℃，并于此温度保持10 ~15min后，冷却至15 ~ 20 ℃，然后于4000 ~ 5000 rpm离心20 ~ 25 min，收集上清液，冻干得酶解物；再将酶解物溶解，经超滤分级和色谱精制得到马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽。

作为优选，所述步骤3）中的蛋白酶为木瓜蛋白酶，酶活力≥1.5×10⁶U/g。

作为改进，所述步骤4）的超滤分级和色谱精制的具体过程为：

超滤分级：将步骤4）得到的酶解物溶于pH 5.7 ~ 7.0的磷酸盐缓冲液制成浓度为10 ~ 15 mg/mL溶液，于0.1 ~ 0.15 MPa的工作压力和20 ~ 25 ℃的工作温度下采用超滤膜（截留分子量1 kDa）进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；

色谱精制：将上述超滤酶解物用pH 5.7 ~ 7.0的磷酸盐缓冲液配成8 ~ 12 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09 ~ 0.11 mol/L、0.45 ~ 0.55 mol/L和0.9 ~ 1.1 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冻干，其中，羟自由基清除活性最高组分为离子交换酶解物；将所述离子交换酶解物用pH 5.7~7.0磷酸盐缓冲液配成8 ~ 12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冻干，其中，羟自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物；将上述凝胶制备酶解物用双蒸水配成1.0 ~ 1.5 mg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据羟自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY）。

优选，所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱条件为：进样量15 ~ 20 μL（浓度1.0 ~ 1.5 mg/mL）；色谱柱为Zorbax C18 （150×4.6，5 μm）；柱温为25 ~ 30℃；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。

最后，所述马面鲀为绿鳍马面鲀。

本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的应用，其特征在于Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY）对DPPH 自由基（EC₅₀2.17 mg/mL）、羟基自由基（EC₅₀0.16 mg/mL）、ABTS自由基（EC₅₀0.22 mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC50 0.13 mg/mL)具有良好的清除作用。Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY）具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明工艺科学合理，选用木瓜蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的抗氧化肽具有较高的活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。

附图说明

图1是本发明的超滤酶解物的阴离子交换树脂（DEAE-52纤维素）层析图。

图2 是本发明的离子交换酶解物的葡聚糖凝胶G-25色谱图。

图3 是本发明的凝胶制备酶解物的反相高效液相色谱（RP-HPLC）图。

图4 是本发明的Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY）的反相高效液相色谱（RP-HPLC）图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

一种马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的制备方法，制备工艺流程如下：马面鲀鱼头"脱脂"酶解"酶解物"超滤"离子交换层析"凝胶过滤层析"高效液相色谱制备"抗氧化肽。

实施例1：

1）将洗净的绿鳍马面鲀鱼头按照固液比1 g：2 mL放入双蒸水中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1：5放入乙醚中脱脂20 h，在4 ℃、4500 rpm条件下离心20 min除去乙醚，收集固形物，冻干，得脱脂马面鲀鱼头粉末；

2）将脱脂马面鲀鱼头粉末按固液比1 g：20mL加入磷酸盐缓冲液，用0.10 mol/L HCl或0.10 mol/L NaOH调节pH到6.0，得混合液；

3）将混合液温度升至60 ℃搅拌预热15 min，按照脱脂马面鲀鱼头质量的1.2 %加入木瓜蛋白酶，酶解温度为60 ℃，酶解时间4 h，得酶解液；

4）将得到的酶解液升温至90 ℃，并于此温度保持10 min后，冷却至20 ℃，然后于4500 rpm离心25 min，收集上清液，冻干，得酶解物；再将酶解物溶解，经超滤分段和色谱精制得到马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：

①超滤分级：将得到的酶解物溶于pH 6.0的磷酸盐缓冲液制成浓度为10 mg/mL溶液，于0.1 ~ 0.15 MPa的工作压力和25 ℃的工作温度下采用超滤膜（截留分子量1 kDa）进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；

②阴离子交换层析：将上述超滤酶解物用pH 6.0的磷酸盐缓冲液配成10 mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.10 mol/L、0.50 mol/L和1.0 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冻干，其中，羟自由基清除活性最高组分为离子交换酶解物（F3）；

③凝胶色谱层析：将所述离子交换酶解物用pH 6.0磷酸盐缓冲液配成10 mg/mL的溶液，经过葡聚糖凝胶G-25凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220 nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冻干，其中，羟自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物（F33）；

④高效液相色谱精制：将上述凝胶制备酶解物用双蒸水配成1.5 mg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱RP-HPLC进行纯化（条件为：进样量20 μL；色谱柱为Zorbax C18 （150×4.6，5 μm）；柱温为30℃；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm），根据羟自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽（F33-II）。

⑤结构测定：RP-HPLC检测收集的高活性抗氧化肽（F33-II）为单一峰（见图4），利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY），ESI-MS测定分子量为672 Da。

将上述制得的马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY）进行自由基清除实验。实验结果表明：Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr（LSHGPY）对羟基自由基（EC₅₀0.16 mg/mL）、DPPH 自由基（EC₅₀2.17 mg/mL）、ABTS自由基（EC₅₀0.22 mg/mL）和超氧阴离子自由基(EC50 0.13 mg/mL)具有良好的清除作用。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

<110> 浙江海洋学院

<120> 马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽及其制备方法和用途

<130> zjou-sy-006

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Leu Ser His Gly Pro Tyr

1 5

Claims

1.马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽，其特征在于该抗氧化肽的氨基酸序列为Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr，ESI-MS测定分子量为672 Da。

2.一种权利要求1所述的马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将洗净的绿鳍马面鲀鱼头按固液比1 g：2 ~ 3 mL放入双蒸水中，用高速组织捣碎机将其处理成匀浆，然后按照体积比1：3 ~ 5放入乙醚中脱脂15 ~ 25 h，在3 ~ 5 ℃、4000 ~ 5000 rpm条件下离心15 ~ 20 min除去乙醚，收集固形物，冻干，即得到脱脂马面鲀鱼头粉末。

3）将混合液温度升至55 ~ 6 5 ℃搅拌预热10 ~ 15 min，按照脱脂马面鲀鱼头质量的1.0 ~ 1.5 %加入蛋白酶，酶解温度为55 ~ 65 ℃，酶解时间3 ~ 5 h，得酶解液；

4）将得到的酶解液升温至90 ~ 95℃，并于此温度保持10 ~15min后，冷却至15 ~ 20 ℃，然后4000 ~ 5000 rpm离心20 ~ 25 min，收集上清液，冻干，得酶解物；再将酶解物溶解，经超滤分级和色谱精制得到马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽；

所述步骤3）中的蛋白酶为木瓜蛋白酶，酶活力≥1.5×10⁶U/g；

所述步骤4）的超滤分级和色谱精制的具体过程为：

超滤分级：将得到的酶解物溶于pH 5.7~7.0的磷酸盐缓冲液制成浓度为10 ~ 15 mg/mL溶液，于0.1 ~ 0.15 MPa的工作压力和20 ~ 25 ℃的工作温度下采用截留分子量1 kDa的超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1 kDa部分，冻干，得超滤酶解物；

色谱精制：将上述超滤酶解物用pH 5.7 ~ 7.0的磷酸盐缓冲液配成8 ~ 12 mg/mL的溶液，经过阴离子交换树脂分离，用水、0.09 ~ 0.11 mol/L、0.45 ~ 0.55 mol/L和0.9 ~ 1.1 mol/L NaCl溶液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冻干，其中，羟自由基清除活性最高组分为离子交换酶解物；将所述离子交换酶解物用pH 5.7 ~ 7.0磷酸盐缓冲液配成8 ~ 12 mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，根据220nm下的吸光度曲线收集洗脱组分，冻干，其中，羟自由基清除活性最高组分为凝胶制备酶解物，将上述凝胶制备酶解物用双蒸水配成1.0 ~ 1.5 mg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行纯化，根据羟自由基清除活性得1个高活性抗氧化肽Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述阴离子交换树脂为DEAE-52纤维素，所述凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱条件为：样品浓度为1.0 ~1.5 mg/mL，进样量为15~20 μL；色谱柱为150×4.6、5 μm 的Zorbax C18；柱温为25 ~ 30℃；流动相：30%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min；紫外检测波长220 nm。

4.权利要求1所述的马面鲀鱼头蛋白抗氧化肽的用途，其特征在于Leu-Ser-His-Gly-Pro-Tyr在制备保健食品或者作为食品添加剂中应用。