CN103524597A

CN103524597A - 一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN103524597A
Application number: CN201210230801.8A
Authority: CN
Inventors: 王斌; 罗红宇; 李忠瑞; 栗丽
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2012-07-03
Filing date: 2012-07-03
Publication date: 2014-01-22

Abstract

本发明公开了一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽及其制备方法和应用，该抗氧化肽的氨基酸序列分别为Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 476.40[M+H]⁺或者/和m/z 668.60[M+H]⁺；制备时，以鲨鱼肉为原料，利用乙醇提取鲨鱼醇溶蛋白，然后再以木瓜蛋白酶作为酶解用酶，通过酶解技术同时融合大孔树脂脱盐、超滤分级和色谱精制得到抗氧化肽。本发明的制备方法工艺科学合理，酶解过程易监控，制得的抗氧化肽具有较高的活性，与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。

Description

一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及的是一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽及其制备方法和应用，是一种利用乙醇提取鲨鱼醇溶性蛋白的方法及利用酶工程技术和色谱技术制备高抗氧化活性醇溶蛋白肽的方法。

背景技术

近年来，由于化学抗氧化添加剂的不安全性和食品安全的考虑，化学抗氧化添加剂如BHA（丁基羟基茴香醚）、BHT（2,6-二叔羟基对甲酚）和TBHQ（特丁基对苯二酚）等的应用受到了较大限制。因此，高效、低毒的天然食品抗氧化剂的开发成为研究热点领域。

目前，已从各种植物、动物组织中提取得到了抗氧化活性显著的物质，如茶叶中的茶多酚、大豆中的异黄酮、枸杞中的多糖等物质。而已有的研究发现，生物体内天然多肽也具有显著的抗氧化活性，如存在于肌肉组织中的肌肽不仅可以有效抑制脂肪氧化，而且在肉制品贮藏时有护色作用。另外，以生物蛋白为原料，采用酶解技术得到的酶解物及其组成多肽也具有显著的抗氧化活性。如张学忠等发现大豆酶解多肽具有清除超氧阴离子自由基，减少人体红细胞氧化溶血程度以及抑制脂质氧化导致的脂质体膜的破坏；徐怀德等研究发现甲鱼蛋白的木瓜蛋白酶酶解产物可清除羟基自由基和超氧阴离子自由基和DPPH自由基。

醇溶蛋白早在18世纪末就被人们发现，是植物种子储存蛋白的组分之一。不溶于水，可溶于50%～90%乙醇。由于醇溶蛋白为单链蛋白，单肽通过氢键和疏水键相互作用，这两种键的键能较低，容易被“打断”，所以醇溶蛋白使面筋具有黏性和延伸性，在食品保鲜、药品缓释剂、美容护肤等方面具有较大用途。但是目前尚未有关于动物醇溶蛋白的报道。

申请人在实验中发现，路氏双髻鲨鱼肉中含有大量的醇溶蛋白，且醇溶蛋白的酶解产物具有较好的抗氧化活性，而文献检索发现以鲨鱼肉为原料提取制备醇溶蛋白，利用酶解技术和色谱技术制备醇溶蛋白抗氧化肽的工艺研究处于空白阶段，而鲨鱼醇溶蛋白肽在清除自由基和抑制脂质过氧化方面的应用更是未见报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽，具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽的制备方法，利用酶解技术和色谱技术进行制备，工艺科学合理、易操作。

本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽的应用。

本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为：一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽，其特征在于氨基酸序列分别为Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 476.40[M+H]⁺或者/和m/z 668.60[M+H]⁺。

本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为：一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽的制备方法，其特征在于步骤依次为：

1）以鲨鱼醇溶蛋白作为原料，按固液比1g:5mL~1g:10mL，加入pH5~6磷酸盐缓冲液，用HCl或NaOH调pH到5~7，得混合液；

2）将混合液温度升至50~60℃搅拌预热15min~20min，按照醇溶蛋白质量的0.8%~1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解温度为50~60℃，酶解时间1~3h；

3）将酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽。

作为优选，所述步骤2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×10⁶U/g。

作为改进，所述步骤3）中的灭酶处理为：将步骤2）所得的酶解产物升温至90~100℃，并于此温度保持10min~15min，再冷却至10~20℃以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液。

作为改进，所述步骤3）的脱盐、超滤和层析的具体过程为：

脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15mg/mL~20mg/mL溶液，加入到大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用质量浓度60~80%乙醇进行解析，除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；

超滤：将脱盐酶解物干粉溶于pH6.8~7.2磷酸盐缓冲液配成8~12mg/mL的溶液，于0.1MPa~0.15MPa的工作压力和20℃~30℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液；

层析：将超滤酶解液用pH6.8~7.2磷酸盐缓冲液配成8~12mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.09~0.11mol/L、0.45~0.55mol/L和0.9~1.1mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集0.45~0.55mol/L NaCl的洗脱组分，得离子交换酶解液；将离子交换酶解液用pH6.8~7.2磷酸盐缓冲液配成8~12mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集所得的最高活性组，即凝胶制备酶解物；将凝胶制备酶解物用pH6.8~7.2磷酸盐缓冲液配成0.9~1.1mg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据抗氧化活性得2个高活性抗氧化肽。

作为优选，所述大孔树脂为D101

再优选，凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱的条件为：色谱柱为ZorbaxC18，进样量19~21μg；流动相：A水，含质量浓度0.09~0.11%三氟乙酸，B乙腈，含质量浓度0.09~0.11%三氟乙酸；梯度洗脱：0-10min：100%A；10-50min：0-100%B；洗脱速度0.9~1.1ml/min；紫外检测波长280nm。

进一步改进，所述步骤1）的鲨鱼醇溶蛋白的提取方法，包括以下步骤：

1）鲨鱼的鱼肉按1g:20mL~1g:30mL固液比加入质量浓度85%~95%的乙醇溶液，然后匀浆，在30℃~50℃温度下动态提取80min~120min；

2）将提取液的pH值用NaOH调至8.5~10.0，用蒸馏水将乙醇浓度调至质量浓度55%~65%，稀释后的提取液在25℃下放置30min~40min，于4000~5000rpm离心20min~30min，收集上清液；

3）上清液中加入NaCl至质量浓度为5%~8%，盐析10h~15h后，于4000~5000rpm离心10min~20min，收集沉淀；

4）沉淀用乙醚脱脂20h~30h，然后于10000~12000rpm离心10min~15min将乙醚去除、冻干，即得醇溶蛋白。

最后，所述鲨鱼为路氏双髻鲨。

本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为：一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽的应用，其特征在于Trp-Asp-Arg或/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys对羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，而对DPPH自由基显示出中等的清除活性；同时，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用和对β-胡萝卜素亚油酸体系中产生的过氧化氢自由基的良好清除作用；Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收优点，可以作为药品、保健食品或者食品添加剂上应用。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明工艺科学合理，利用乙醇提取醇溶蛋白，选用木瓜蛋白酶作为酶解用酶，通过生物酶解法同时融合大孔树脂脱盐、超滤分级和色谱精制，酶解过程易监控，同时制得的抗氧化肽具有较高的活性；与化学合成的抗氧化剂相比较，本发明制得的抗氧化肽具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收等优点，可以作为药品、保健食品和食品添加剂等。

附图说明

图1a、1b是本发明的葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的RP-HPLC分析：A为葡聚糖凝胶G-25制备酶解物的1到60min的洗脱曲线；B为15到34min的洗脱曲线；

图2a、2b是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的反相高效液相色谱（RP-HPLC）图：A Trp-Asp-Arg；B Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys；

图3a、3b是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的质谱图：A Trp-Asp-Arg；B Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys；

图4是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的DPPH自由基清除活性；

图5是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的羟基自由基清除活性；

图6是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的ABTS自由基清除活性；

图7是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的超氧阴离子自由基清除活性；

图8是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys在β-胡萝卜素-亚油酸体系中的抗氧化活性；

图9是本发明的Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys的脂质过氧化抑制活性。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

鲨鱼醇溶蛋白的提取及其制备抗氧化肽的方法，制备工艺流程如下：鲨鱼肉→醇提→醇溶蛋白→酶解→酶解物→大孔树脂脱盐→超滤→离子交换层析→凝胶过滤层析→高效液相色谱制备→抗氧化肽。

实施例1

1）路氏双髻鲨去鱼皮和鱼骨，鱼肉按1g:25mL固液比加入90%的乙醇溶液，用高速组织捣碎机将其制成匀浆，在45℃温度下动态提取90min；

2）将提取液的pH值用0.1mol/L的NaOH调至9.0，用蒸馏水将乙醇浓度调至60%。稀释后的提取液在25℃下放置30min，于4500rpm离心20min，收集上清液；

3）上清液中加入NaCl至浓度为5%，盐析12h后，于4500rpm离心15min，收集沉淀；

4）沉淀用乙醚脱脂24h，然后于11000rpm离心12min将乙醚去除，即得醇溶蛋白，冷冻干燥得粉末，储存于-20℃备用。

5）以鲨鱼醇溶蛋白作为原料，按固液比1g:5mL加入磷酸盐缓冲液（pH5.8），用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH调节pH到6，得混合液；

6）将混合液温度升至55℃搅拌预热15min，按照醇溶蛋白质量的1.0%加入木瓜蛋白酶，酶解温度为55℃，酶解时间2h；

7）将酶解产物先经灭酶处理得酶解液，再将酶解液依次经脱盐、超滤和层析，得到抗氧化肽，利用氨基酸序列分析和质谱测定其结构，具体过程为：

①灭酶处理：将酶解产物升温至95℃，并于此温度下保持10min后，冷却至20℃，离心，得酶解液；

②大孔树脂脱盐：将得到的酶解液制成浓度为15mg/mL，加入到D101大孔树脂层析柱进行脱盐，然后用70%乙醇进行解析，除去乙醇，浓缩液进行冷冻干燥，得脱盐酶解物干粉；

③超滤：将上述脱盐酶解物干粉溶于磷酸盐缓冲液（pH7.0）配成10mg/mL的溶液，于0.15MPa的工作压力和25℃的工作温度下采用超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于1kDa部分，得超滤酶解液；

④阴离子交换层析：将上述超滤酶解液用磷酸盐缓冲液（pH7.0）配成10mg/mL的溶液，经过DEAE-52纤维素阴离子交换树脂分离，用水、0.1mol/L、0.5mol/L和1.0mol/L NaCl溶液进行洗脱，收集0.5mol/L NaCl的洗脱组分，得离子交换酶解液；

⑤凝胶柱层析：将上述离子交换酶解液用磷酸盐缓冲液（pH7.0）配成10mg/mL的溶液，经过凝胶柱层析分离，用磷酸盐缓冲液进行洗脱，利用DPPH法测定抗氧化活性，收集所得的最高活性组，即凝胶制备酶解物。

⑥反相高效液相色谱精制：将上述凝胶制备酶解物用磷酸盐缓冲液（pH7.0）配成1mg/mL的溶液，利用反相高效液相色谱（RP-HPLC，色谱条件：样品浓度100μg/ml；进样量20μg；色谱柱为Zorbax C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温为室温；流动相：A水（含0.1%三氟乙酸）和B乙腈（含0.1%三氟乙酸）；梯度洗脱：0-10min：100%A；10-50min：0-100%B；洗脱速度1.0ml/min；紫外检测波长280nm）进行纯化，利用DPPH法测定抗氧化活性，收集活性最高的2个抗氧化肽（见图1）。

⑦结构检测：收集活性最高的2个抗氧化肽经检测为单一峰（见图2），利用蛋白/多肽序列分析仪测定2个抗氧化肽的氨基酸序列分别为Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 476.40[M+H]⁺和m/z 668.60[M+H]⁺（见图3）。

实施例2

1）路氏双髻鲨去鱼皮和鱼骨，鱼肉按1g:20mL固液比加入85%的乙醇溶液，用高速组织捣碎机将其制成匀浆，在30℃温度下动态提取100min；

2）将提取液的pH值用0.1mol/L的NaOH调至10.0，用蒸馏水将乙醇浓度调至55%。稀释后的提取液在25℃下放置35min，于4000rpm离心30min，收集上清液；

3）上清液中加入NaCl至浓度为7%，盐析10h后，于4000rpm离心20min，收集沉淀；

4）沉淀用乙醚脱脂20h，然后于10000rpm离心15min将乙醚去除，即得醇溶蛋白，冷冻干燥得粉末，储存于-20℃备用。

5）以鲨鱼醇溶蛋白作为原料，按固液比1g:10mL加入磷酸盐缓冲液（pH5.8），用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH调节pH到7，得混合液；

6）将混合液温度升至50℃搅拌预热20min，按照醇溶蛋白质量的0.8%加入木瓜蛋白酶，酶解温度为50℃，酶解时间3h。

下面步骤同实施例1。

实施例3

1）路氏双髻鲨去鱼皮和鱼骨，鱼肉按1g:30mL固液比加入95%的乙醇溶液，用高速组织捣碎机将其制成匀浆，在50℃温度下动态提取80min；

2）将提取液的pH值用0.1mol/L的NaOH调至10.0，用蒸馏水将乙醇浓度调至65%。稀释后的提取液在25℃下放置40min，于5000rpm离心20min，收集上清液；

3）上清液中加入NaCl至浓度为8%，盐析15h后，于5000rpm离心10min，收集沉淀；

4）沉淀用乙醚脱脂20h，然后于12000rpm离心10min将乙醚去除，即得醇溶蛋白，冷冻干燥得粉末，储存于-20℃备用。

5）以鲨鱼醇溶蛋白作为原料，按固液比1g:8mL加入磷酸盐缓冲液（pH5.8），用0.1mol/L HCl或0.1mol/L NaOH调节pH到5，得混合液；

6）将混合液温度升至60℃搅拌预热15min，按照醇溶蛋白质量的1.2%加入木瓜蛋白酶，酶解温度为60℃，酶解时间1h。

下面步骤同实施例1.

将制得的鲨鱼醇溶蛋白抗氧化肽进行DPPH自由基清除实验（见图4）、羟基自由基清除实验（见图5）、ABTS自由基清除实验（见图6）、超氧阴离子自由基清除实验（见图7）、β-胡萝卜素－亚油酸体系实验（见图8）和脂质过氧化抑制实验（见图9）。实验结果表明：Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys对羟基自由基（EC₅₀ 0.15mg/mL和0.24mg/mL）、ABTS(EC₅₀ 0.34mg/mL和0.12mg/mL)和超氧阴离子自由基(EC₅₀ 0.09mg/mL和0.12mg/mL)具有良好的清除作用，而对DPPH自由基(EC₅₀ 3.63mg/mL和4.11mg/mL)显示出中等的清除活性；同时，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用和对β-胡萝卜素亚油酸体系中产生的过氧化氢自由基的良好清除作用。

最后，尚需注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种用鲨鱼醇溶蛋白制备的抗氧化肽，其特征在于该抗氧化钛的氨基酸序列分别为Trp-Asp-Arg或者/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys，ESI-MS检测给出分子离子峰m/z 476.40[M+H]⁺或者/和m/z 668.60[M+H]⁺。

2.一种权利要求1所述的抗氧化肽的制备方法，其特征在于步骤依次为：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤2）中的木瓜蛋白酶的酶活力≥1.5×10⁶U/g。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）中的灭酶处理为：将步骤2）所得的酶解产物升温至90~100℃，并于此温度保持10min～15min，再冷却至10~20℃以终止酶反应，然后离心，取上清液作为酶解液。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤3）的脱盐、超滤和层析的具体过程为：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述大孔树脂为D101。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述凝胶柱层析分离中采用的凝胶为葡聚糖凝胶G-25；所述反相高效液相色谱的条件为：色谱柱为Zorbax C18，进样量19~21μg；流动相：A水，含质量浓度0.09~0.11%三氟乙酸，B乙腈，含质量浓度0.09~0.11%三氟乙酸；梯度洗脱：0-10min：100%A；10-50min：0-100%B；洗脱速度0.9~1.1ml/min；紫外检测波长280nm。

8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述步骤1）的鲨鱼醇溶蛋白的提取方法，包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述鲨鱼为路氏双髻鲨。

10.一种权利要求1所述的抗氧化肽的应用，其特征在于Trp-Asp-Arg或/和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys对羟基自由基、ABTS自由基和超氧阴离子自由基具有良好的清除作用，而对DPPH自由基显示出中等的清除活性；同时，Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys亦显示出良好的脂质过氧化抑制作用和对β-胡萝卜素亚油酸体系中产生的过氧化氢自由基的良好清除作用；Trp-Asp-Arg和Pro-Tyr-Phe-Asn-Lys具有安全无毒副作用、抗氧化活性强和易于消化吸收优点，可以作为药品、保健食品或者食品添加剂上应用。