CN106632205A - 一种从云南松树皮中提取原花青素的方法 - Google Patents

一种从云南松树皮中提取原花青素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从云南松树皮中提取原花青素的方法。该方法包括：(1)将云南松树皮粉碎后加入纤维素酶和醋酸‑醋酸钠缓冲溶液，进行酶解；(2)酶解过程辅以超声波处理；(3)在酶解悬浊液中加入乙醇溶液，混合均匀后再次进行超声波处理；(4)对粗提液进行分离和纯化，得到花青素提取物。本发明的提取方法工艺简单，操作方便，效率高，提高了原花青素的得率，较普通溶剂提取法高15‑25％，适合工业化生产。

Description

一种从云南松树皮中提取原花青素的方法
技术领域
本发明属于天然产物提取技术领域，具体涉及一种从云南松的树皮中成分离提取原花青素的方法。
背景技术
原花青素是黄烷-3-醇单体及其聚合体缩合而成的聚多酚类化合物，通常由儿茶素和表儿茶素这两类原花青素单体组成。原花青素属于羟基供体，它在植物组织中的主要作用是保护植物中易氧化的成分。20世纪80年代人们逐渐认识到清除自由基和抗氧化是营养保健的重要前提和基础。而原花青素作为清除自由基能力最强的、其他抗氧化剂所无可比拟的抗氧化剂。
抗氧化性能主要体现在以下几个方面：
1、有效地清除超氧阴离子自由基O2.-，保护和稳定维生素C。
原花青素是一种比VC和VE作用更强的自由基清除剂。
2、抑制脂质氧化。原花青素通过参与脂质代谢，阻断自由基链式反应，保护脂质不发生过氧化损伤。
3、和金属Cu2+等螯合。原花青素能与金属离子如铁、铝、钼等螫合形成原花青素一金属(Vc-Cu)复合物，它能稳定存在于生物机体内，与人类的生活和健康密切相关。
上述原花青素的抗氧化性能使其具备了医用保健功能。由于其卓越的抗氧化能力，它可以清除人体内致病的自由基，减缓细胞死亡和细胞膜变性，从而延缓衰老。而且花青素还能通过抑制酶的活性来降低血压，达到防止中风、偏瘫的作用。并且原花青素能通过降低胆固醇水平，减少血管壁上的胆固醇沉积，通过提高血管壁弹性而达到降压的功能。
有研究认为它还可运用于皮肤保健和美容方面。在欧美国家花青素享有“皮肤维生素”、“口服化妆品”的美誉其主要功效为：(I)它可以维护皮肤胶原合成，抑制弹性蛋白酶，从而减少皱纹产生；(2)原花青素可抑制络氨酸酶活性，具有防晒美白的作用；(3)原花青素具有的多羟基结构使它在空气中易吸湿，且能与多糖(透明质酸)、蛋白质、脂类(磷脂)、多肽等复合，从而达到保湿收敛皮肤的效。
原花青素还可在食品中应用。随着科技的发展，人们对食品添加剂的安全性越来越重视，天然添加剂的开发利用已成为添加剂发展使用的总趋势。花青素在食品中不但可作为营养强化剂，而且还可作为食品防腐剂代替苯甲酸等合成防腐剂，并且可作为食品着色剂应用于平常饮料和食品，符合人们对食品添加剂天然、安全、健康的总要求。
我国作为一个植物资源大国，植物物种得天独厚，但关于原花青素的研究起步较晚，这也导致了制约原花青素发展的瓶颈问题-原花青素的提取分离。
原花青素的提取是目前原花青素研究发展的热点问题，也是原花青素生产、投入使用的关键性环节。近年来，在传统提取方法的基础之上，一些凭借新技术或经过改良后的提取方法也开始崭露头角。目前国内外广泛使用的提取方法如下：
1、有机溶剂萃取法这是目前国内外广泛使用的花青素的提取方法。多数选择甲醇、乙酮、丙酮等混合溶剂对材料进行溶解过滤，通过调节溶液酸碱度萃取滤液中的花青素。有机溶剂萃取法的关键是选择有效溶剂，要求既要对被提取的有效成分有较大溶解度，又要避免大量杂质的溶解。该方法原理简单，对设备要求较低，不足之处是大多数有机溶剂毒副作用大且产物提取率低。
2、水溶液提取法。有机溶剂萃取的花青素多有毒性残留且生产过程环境污染大，有鉴于此，水溶液提取应运而生。该方法一般将植物材料在常压或高压下用热水浸泡.。它是Duncan等(1998)发明的提取花青素的方法，此方法设备要求简单，但产品纯度低。
3、超临界流体萃取法。超临界流体萃取是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响进行提取。这种方法产品提取率高，对环境无污染，但设备成本过高。
4、微波提取法。微波提取法是利用在微波场中，吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热，从而使得被萃取物质从基体或体系中分离，进入到具有较小介电常数、微波吸收能力相对较差的萃取溶剂中。该技术选择性好，萃取率高，速度快，操作简单，废液排放量少。
5、超声波提取法。超声波在20世纪50年代后逐渐应用于化学化工生产过程之中，且主要集中在植物中药用成分、多糖以及其它功能性成分的提取等研究领域。超声波提取运用前景好、操作简单、快速高效、生产过程清洁无公害。
6、微生物发酵提取法。此方法将生物发酵技术应用于花青素的提取之中，是生物科学与化工生产之间的超强渗透与有效结合。微生物发酵法利用微生物或酶让含有花青素的细胞胞壁降解分离，使细胞胞体内花青素充分溶入到提取液中，从而增加提取的产率与速率。该方法的优点是操作稳定性及可靠性高，环境友好。
7、加压溶剂萃取加压溶剂萃取法是通过加压提高溶剂的沸点，进而使被提取物在溶剂中的溶解度增加，从而获得较高的萃取效率。该法的优点是提取率高，但经济成本亦较高。
上述方法各有优缺点，所以单一使用这些方法并不能达到从云南松的树皮中提取原花青素最佳提取效果。
申请号CN102924423A公布了一种从香蕉皮中提取花青素的方法。是采用超声波辅助微生物发酵法从青香蕉皮中提取花青素，利用微生物发酵法通过黑曲霉代谢产物对香蕉皮细胞壁的破坏，再通过超声波产生的空化作用，使得花青素充分释放。但黑曲霉对松树皮纤维处理效果差于纤维素酶，而且未对使用的超声波功率和频率进行详细阐述。而且酶解液未运用有机溶液处理，使得部分高聚原花青素流失，影响了得率。
发明人杨磊，祖元刚等提出的中国专利申请CN104974124A一种从兴安落叶松树皮中提取原花青素的方法，其特征在于：将兴安落叶松树皮阴干后粉碎，加入溴化1-烯丙基-3-甲基咪唑离子液体溶液，超声波辅助提取，得提取液，将提取液用大孔树脂吸附，乙醇溶液解析，解析液浓缩后干燥即得到产品。该发明工艺选用溴化1-烯丙基-3-甲基咪唑离子液体溶液为提取剂，由于价格较高不适用于工业化生产原花青素。
发明人刘明提出的中国专利申请CN201510502133.3公开了一种制备云南松树皮花青素的方法。该方法包括：1)将云南松树皮粉碎后过筛，于溶剂中进行酶解辅助浸提，得到酶解液；2)将步骤1)所得酶解液依次进行胶磨均质和高压脉冲电场处理，再将所得产物离心，收集上层清液，浓缩得到花青素的粗提液；3)将步骤2)所得原花青素的粗提液纯化，干燥而得。在该发明中，先将树皮酶解，再通过高压脉冲电场处理酶解液，以提高得率。该方法中高压脉冲电场处理不能和酶解过程同时处理。
利用现有上述技术从云南松的树皮中提取原花青素都存在一定不足，所以需要一种新的提取方法能以低成本高效地从云南松的树皮中提取出花青素。
发明内容
针对现有技术对云南松树皮中提取原花青素存在的不足，为了降低生产成本，缩短提取分离时间，提高产品率，本发明提供了一种提取云南松树皮中原花青素的制备方法。为实现发明目的，本发明采用如下技术方案，该方法包括：
(1)将烘干云南松树皮粉碎后加入纤维素酶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，进行酶解；
(2)酶解过程辅以超声波处理；
(3)在酶解悬浊液中加入乙醇溶液，混合均匀后再次进行超声波处理；
(4)对粗提液进行分离和纯化，得到原花青素提取物。本发明的提取方法工艺简单，操作方便，效率高，提高了原花青素的得率较普通溶剂提取法高15-25％，适合工业化生产。
本发明所述的提取方法：
所述步骤(1)将烘干云南松树皮原料粉碎后，经过60-80目的筛网筛选，按料液重量比1∶5-20投入pH为4-5(优选pH4.8)的纤维素酶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液(优选1∶10-12)，温度控制在35-38℃。所述纤维素酶的酶活为0.2-1.0U/mg。用量方面，随着酶的浓度的升高，与底物的接触面积增大，酶解反应速率增大。但当酶的浓度达到过饱和时，会对酶产生抑制作用，酶得不到充分利用，造成浪费。所以所述纤维素酶酶添加量为树皮干重的0.1-0.5％。浸提出原花青素的温度越高越好，但考虑纤维素酶的酶活性最适条件为30℃。所以所述纤纤维素酶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液最佳温度在35-38℃。
所述步骤(2)酶解过程辅以超声波处理，超声强度为6-12W/cm2，声波频率范围为2-3MHz，时间为40-70分钟。
超声波是一种弹性机械振动波，能破坏植物的细胞，使溶媒渗透到植物细胞中，从而加速树皮中花青素的溶解。在我的实验探索中发现，超声波参数(频率、声强度等)在超声提取树原皮花青素多次实验中，使用不同频率和声强度等提取都会得到不同的结果。按照实验中的发现，超声强度为6-12W/cm2，声波频率范围为2-3MHz，提取率最高。
所述步骤(3)在酶解悬浊液中加入乙醇溶液，混合均匀后再次进行超声波处理。加入乙醇溶液体积为所述步骤(1)中醋酸-醋酸钠缓冲溶液的20-60％(35％最优)，溶液温度提高到50-80℃，超声强度为6-12W/cm2，声波频率范围为2-3MHz，时间为15-30分钟。
所述步骤(4)对粗提液进行分离和纯化。该步骤采用传统离心分离后浓缩，最后通过大孔树脂吸附达到提纯。
本发明同以往发明相比有以下优点：
1.加入纤维素酶提高了原花青素从云南松树皮的浸出率，同时还不需要传统溶液提取法的高温或高压，节约了设备投入，减少了能耗运行成本。
2.辅以超声波处理通过机械振动波产生空化效应、机械效应，破坏植物的细胞，使溶媒渗透到植物细胞中，从而加速树皮中原花青素的溶解。相比仅以纤维素酶处理大大节约处理时间。
3.在纤维素酶处理后，通过乙醇加入改变溶剂极性，能最大极限将原花青素从松树皮中溶解出。前期通过纤维素酶，超声波处理后使得乙醇用量和浸提时间相比有机溶剂萃取法都大幅减少很多。
4.通过纤维素酶，超声波，有机溶剂组合使用除大幅降低浸提时间，降低了浸提温度，还能最大极限使各聚合度的原花青素浸出。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明不限于以下实施例。
实施例1
称取100g过60目的粉碎云南松树皮原料，按料液重量比1∶10投入预先配制好的pH为4.8的纤维素酶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液。所用纤维素酶的酶活为0.2-1.0U/mg，重量为云南松树皮原料的0.3％。溶液温度控制在35-38℃，持续搅拌40分钟，并辅以超声强度为6-12W/cm2，声波频率范围为2MHz的超声波。
40分钟酶解结束后，向混合溶液中按醋酸-醋酸钠缓冲溶液体积的35％加入95％的乙醇溶液，温度提高到70℃，辅以超声强度为6-12W/cm2，声波频率范围为2MHz的超声波，持续搅拌15分钟。
最后对提取液进行传统分离提纯。提取液离心分离，所述离心在转速3000-6000rpm下离心5-15min得上清液，经过过滤浓缩后的浓缩液再经大孔树脂吸附，树脂可以是LSA-10、HPD-400或者AB-8，该实施例中采用AB-8，吸附温度为40℃，吸附时间为4h。最后进行洗脱并得到洗脱液，再浓缩，干燥制得成品3.8g，原花青素含量74.5％。
色谱检测条件：
1.色谱柱：ODS C18，5μm，250mm×4.6mm
2.流动相A：9％乙腈，0.1％甲酸(水溶液)
流动相B：40％乙腈(水溶液)
3.流速：0.8ml/min
4.检测波长：280nm
5.柱温：40℃
实施例2
醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH值调整为3.8代替4.8，重复实施例1的制备步骤。得成品3.4g，原花青素含量75.3％。
实施例3
酶解液温度调整为50℃代替35-38℃，重复实施例1的制备步骤。得成品3.3g，原花青素含量72.5％。
实施例4
超声强度调整为20W/cm2代替6-12W/cm2，重复实施例1的制备步骤。得成品3.2g，原花青素含量70.8％。
实施例4
酶解后不再加入乙醇溶液，直接分离提纯，重复实施例1的制备步骤。得成品3.5g，原花青素含量77.1％。
比较例1
称取100g过60目的粉碎云南松树皮原料，按料液重量比1∶10投入70％乙醇溶液。80℃，持续搅拌40分钟。
最后对提取液进行传统分离提纯。提取液离心分离，所述离心在转速3000-6000rpm下离心5-15min得上清液，经过过滤浓缩后的浓缩液再经大孔树脂吸附，树脂可以是LSA-10、HPD-400或者AB-8，该实施例中采用AB-8，吸附温度为40℃，吸附时间为4h。最后进行洗脱并得到洗脱液，再浓缩，干燥制得成品2.8g，原花青素含量73.5％。
比较例2
称取100g过60目的粉碎云南松树皮原料，按料液重量比1∶10投入70％乙醇溶液。80℃，持续搅拌40分钟，并辅以超声强度为6-12W/cm2，声波频率范围为2MHz的超声波。
最后对提取液进行传统分离提纯。提取液离心分离，所述离心在转速3000-6000rpm下离心5-15min得上清液，经过过滤浓缩后的浓缩液再经大孔树脂吸附，树脂可以是LSA-10、HPD-400或者AB-8，该实施例中采用AB-8，吸附温度为40℃，吸附时间为4h。最后进行洗脱并得到洗脱液，再浓缩，干燥制得成品3.4g，原花青素含量70.5％。

Claims (5)

1.一种从云南松树皮中提取原花青素的方法。该方法包括：
(1)将云南松树皮粉碎后加入纤维素酶和醋酸-醋酸钠缓冲溶液，进行酶解；(2)酶解过程辅以超声波处理；
(3)在酶解悬浊液中加入乙醇溶液，混合均匀后再次进行超声波处理；
(4)对粗提液进行分离和纯化，得到原花青素提取物。
2.根据权利要求1所述的提取原花青素的方法，其特征在于：所述步骤(1)所述含酶的水溶剂中含有纤维素酶，添加量为树皮干重的0.1-0.5％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)通过醋酸-醋酸钠缓冲溶液将液体调为pH为4-5酸性溶液，温度温度控制在35-38℃。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)辅以超声波处理，超声强度为6-12W/cm2，声波频率范围为2-3MHz。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)在酶解悬浊液中加入乙醇溶液，混合均匀后再次进行超声波处理，加入乙醇溶液体积为所述步骤(1)中醋酸-醋酸钠缓冲溶液的20-60％(35％最优)。
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