CN110538204B - 一种从松树皮中提取酚类物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从松树皮中提取酚类物质的方法，包括以下步骤：(1)采用复合酶对松树皮粉末进行酶解反应，得到酶解液，离心所述酶解液，分别收集上清液和沉淀物；(2)对步骤(1)得到的沉淀物进行乙醇提取，离心收集上清液；(3)合并步骤(1)和步骤(2)得到的上清液，依次进行浓缩、干燥；所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶、漆酶。该提取方法采用了生物酶解降解植物细胞壁；通过第一次水提与第二次醇提相配合，实现了松树皮活性成分的高效提取。该提取方法具有工艺简单、无污染、酚类活性成分提取率高、适于大规模工业化生产等优点。

Description

一种从松树皮中提取酚类物质的方法
技术领域
本发明涉及天然产物的化学提取技术领域，具体涉及一种从松树皮中提取酚类物质的方法。
背景技术
松树是组成我国大面积针叶林的重要树种，也是林业经营的主要树种。松树不仅是重要的农林资源，其果实和树皮也具有较高的药用价值及保健功能。
研究表明，松属植物中含有萜类、酚类、生物碱等多种生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤及抗菌等生物功能活性，其中酚类被认为是其主要活性成分，酚类物质中以水溶性极高的原花青素低聚物为主，还含有没食子酸、鞣花酸、水杨酸、阿魏酸等酚酸。原花青素可抑制肠道有害菌生长，并显著提高畜禽机体抗氧化能力、清除体内自由基，从而改善肠道菌群结构、缓解和修复机体氧化损伤，提升畜禽生产性能。酚酸等具有的强抗氧化能力能改善畜禽所受到的氧化应激，提高机体免疫力，增强生长性能。而松树皮的木质素，纤维素，半纤维素含量极高，松树皮中原花青素通常以结合态与蛋白质、纤维素结合在一起，不易提取，造成活性成分提取率低。
传统工艺常采用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂浸提，但有机溶剂提取具有成本高、耗能大、易污染环境等缺点；而仅以水作为溶剂的提取工艺则大多采用高温提取，极易造成原花青素等酚类活性物质的降解和氧化。近年来出现了一些通过物理方法辅助提取的工艺，如超声波提取、微波提取、超临界流体提取、加压液相萃取等，这在一定程度上提高了提取效率，然而相关提取方法对仪器设备要求较高，操作较复杂，成本高、难以实现大规模工业化生产。因此实际生产中需要一种高效、无污染、可适用于大规模工业化生产的松树皮活性成分提取方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从松树皮中提取酚类物质的方法。该提取方法具有工艺简单、无污染、酚类活性成分提取率高、适于大规模工业化生产等优点。
为此，本发明提供一种从松树皮中提取酚类物质的方法，包括：
(1)采用复合酶对松树皮粉末进行酶解反应，得到酶解液，离心所述酶解液，分别收集上清液和沉淀物；
(2)对步骤(1)得到的沉淀物进行乙醇提取，离心收集上清液；
(3)合并步骤(1)和步骤(2)得到的上清液，依次进行浓缩、干燥；
所述复合酶包括纤维素酶、果胶酶、漆酶。
进一步，所述步骤(1)之前还包括预处理步骤：将松树皮依次干燥、粉碎、过筛，得到所述松树皮粉末。
进一步，所述预处理步骤中，干燥的温度为45-55℃，优选50-55℃。
进一步，所述预处理步骤中，所述过筛的目数为20-60目，优选40-60目，更优选40目。
进一步，步骤(1)中，所述复合酶的用量为160000IU-240000IU/g底物。所述底物即为所述松树皮粉末。
进一步，步骤(1)中，所述纤维素酶、果胶酶、漆酶的酶活力(IU)比值为2-3：3-5：2，优选为2：3-5：2，更优选为1：2：1。
进一步，步骤(1)中，所述酶解反应的料液比为1：40-60，优选1:50。
进一步，步骤(1)中，所述酶解反应时的pH值为4.0-5.0，优选4.0-4.5，更优选4.0。在具体的实施方式中，所述酶解反应的缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液。
进一步，步骤(1)中，所述酶解的温度为45-55℃，例如45℃、50℃、55℃；时间为2-6h，例如2h、3h、4h、5h、6h。
进一步，步骤(2)中，所述乙醇提取的温度为40-55℃，例如40℃、45℃、50℃、55℃；时间为2-6h，例如2h、3h、4h、5h、6h。
进一步，步骤(2)中，所述乙醇提取所用乙醇的浓度为70％。
进一步，步骤(3)中，所述干燥为冷冻干燥。
纤维素酶是催化降解纤维素水解而生成葡萄糖和低聚合度纤维的一组酶的总称，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和纤维二糖酶三个主要组分，它不是单一种酶，而是起协同作用的多组分酶系。纤维素酶存在于微生物、某些昆虫和植物中，已广泛应用于纺织、日用化工、造纸、食品发酵、废水处理等各个领域，应用十分广泛。
果胶酶可分解植物的主要成分果胶质。果胶酶广泛存分布于高等植物和微生物中，工业生产中主要采用黑霉作为生产菌。商业用果胶酶的有效成分主要包括三种酶，一种是果胶甲酯酶，主要作用为催化甲酯果胶以脱去甲酯基；另一种为聚半乳糖醛酸酶，其作用是使果胶以α-1,4-键结合的半乳糖醛基水解为还原糖；第三种是果胶裂解酶，可使果胶断裂得到寡糖。
漆酶是一种含有四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，最早发现于漆树的分泌物中，并存在于多种高等植物的细胞壁中，实际用于生产的漆酶主要来自于细菌、真菌。漆酶具有非常广泛的底物特异性，可氧化多酚物质，在漆酶的催化氧化过程中，底物失去一个电子而形成自由基，不稳定的自由基可进一步参与漆酶催化的氧合反应或非酶促反应，如水合反应、聚合反应。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
本发明通过采用生物酶解降解植物细胞壁，有效促进了松树皮中活性成分的释放；同时，采用低pH值、低温提取，减少了活性成分的降解；通过第一次水提与第二次醇提相配合，实现了松树皮活性成分的高效提取。
此外，本发明在研究过程中偶然发现，三种酶单独使用时，漆酶的效果显著差于果胶酶和纤维素酶；两种酶联用时，纤维素酶与漆酶联用的效果差于单独使用纤维素酶，果胶酶与漆酶联用的效果差于单独使用果胶酶；然而，当同时应用纤维素酶、果胶酶和漆酶对松树皮粉末进行酶解时，这三种酶可起到协同增效的作用，意料不到地提高酚类物质的产率。
本发明的提取工艺简单、无污染、无需复杂设备即可实现大规模工业化生产，应用前景十分广泛。
具体实施方式
下面将详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然下文中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
在下文实施例中，纤维素酶(CAS No.9012-54-8，10000IU/g)，果胶酶(CASNo.9032-75-1，60000IU/ml)，漆酶(CAS No.80498-15-3，10000IU/ml)；无水乙酸钠、乙酸均为分析纯；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
(1)将洗净的松树皮于烘箱中55℃烘干，使用粉碎机粉碎，过40目筛；
(2)称取0.2g松树皮粉末，加入1g纤维素酶、0.33ml果胶酶和1ml漆酶，加入pH值为4.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，使料液比为1:50，将混合液转移至锥形瓶中，使用封口膜封口；将锥形瓶置于气浴震荡仪中，调节温度为50℃，荡幅300，酶解提取3h；
(3)将步骤(2)得到的酶解液离心取上清，剩余沉淀加入70％乙醇，置于气浴震荡仪中，调节温度为50℃，荡幅300，提取3h，离心取上清；
(4)将步骤(3)得到的上清液合并，使用旋转蒸发仪于60℃浓缩，待提取至膏状后，将其置于-20℃冷冻，然后置于冷冻干燥机干燥，即得酚类提取物。经检测，酚类提取物的得率为7.80％。
实施例2
(1)将洗净的松树皮于烘箱中50℃烘干，使用粉碎机粉碎，过60目筛；
(2)称取0.2g松树皮粉末，加入1.2g纤维素酶、0.3ml果胶酶和0.8ml漆酶，加入pH值为4.5的乙酸-乙酸钠缓冲液，使料液比为1:55，将混合液转移至锥形瓶中，使用封口膜封口；将锥形瓶置于气浴震荡仪中，调节温度为55℃，荡幅300，酶解提取3h；
(3)将步骤(2)得到的酶解液离心取上清，剩余沉淀加入70％乙醇，置于气浴震荡仪中，调节温度为45℃，荡幅300，提取5h，离心取上清；
(4)将步骤(3)得到的上清液合并，使用旋转蒸发仪于60℃浓缩，待提取至膏状后，将其置于-20℃冷冻，然后置于冷冻干燥机干燥，即得酚类提取物。经检测，酚类提取物的得率为7.69％。
实施例3
(1)将洗净的松树皮于烘箱中45℃烘干，使用粉碎机粉碎，过40目筛；
(2)称取0.2g松树皮粉末，加入1g纤维素酶、0.25ml果胶酶和0.8ml漆酶，加入pH值为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液，使料液比为1:50，将混合液转移至锥形瓶中，使用封口膜封口；将锥形瓶置于气浴震荡仪中，调节温度为55℃，荡幅300，酶解提取3h；
(3)将步骤(2)得到的酶解液离心取上清，剩余沉淀加入70％乙醇，置于气浴震荡仪中，调节温度为50℃，荡幅300，提取3h，离心取上清；
(4)将步骤(3)得到的上清液合并，使用旋转蒸发仪于60℃浓缩，待提取至膏状后，将其置于-20℃冷冻，然后置于冷冻干燥机干燥，即得酚类提取物。经检测，酚类提取物的得率为7.72％。
实验例
本实验例测试了酶解步骤中，所用酶的种类和料液比，对多酚物质提取效率的影响。将松树皮按照实施例1中步骤(1)处理后得到松树皮粉末，按照以下分组进行酚类物质提取和检测，各组的实验方法同实施例1，区别在于酶解步骤中所加入的酶和料液比。酚类物质的得率检测结果见下表，其中“酶种类”示出了每组所用的酶，且漆酶用量为1ml，果胶酶用量为0.33ml，纤维素酶用量为1g；“料液比”示出了加入缓冲液后的料液比。
Figure BDA0002188526720000051
由上表可知，三种酶单独使用时，按照提取酚类物质的得率，由高到低排序为：纤维素酶、果胶酶、漆酶。将组2与组4相比可知，在果胶酶的基础上加入漆酶，使得提取效果变差；将组3与组6相比可知，在纤维素酶的基础上加入漆酶，也使得提取效果变差。然而，将组5与组7相比可知，在果胶酶和纤维素酶联用的基础上，加入漆酶可有效提高酚类物质的得率，取得了意料不到的技术效果。
尽管对其中的原理不完全清楚，但可提出一种合理的假设，即尽管漆酶对植物细胞壁有一定降解作用，但由于漆酶对酚类物质有一定氧化作用，在与纤维素酶、果胶酶中的任一种联用时，其对酚类物质的氧化作用相对较强，以至于对酚类物质的提取产生负面作用；而三种酶联用时，因为产生了氧化酚类物质的拮抗作用和/或降解植物细胞壁的协同作用，从而导致三种酶联用时，意料不到地提高了酚类物质的提取效率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种从松树皮中提取酚类物质的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）预处理步骤：将松树皮依次干燥、粉碎、过筛，得到松树皮粉末；其中，所述干燥的温度为45-55℃，所述过筛的目数为40目；
（2）采用复合酶对所述松树皮粉末进行酶解反应，得到酶解液，离心所述酶解液，分别收集上清液和沉淀物；
其中，所述酶解反应的缓冲液为乙酸-乙酸钠缓冲液；所述酶解反应的pH值为4.0，温度为45-55℃，时间为2-6h；所述酶解反应的料液比为1:50；所述复合酶的用量为160000 IU-240000 IU/g底物；所述复合酶由纤维素酶、果胶酶和漆酶组成；所述纤维素酶、果胶酶、漆酶的酶活力比值为1:2:1；
（3）对步骤（2）得到的沉淀物进行乙醇提取，离心收集上清液；
其中，所述乙醇提取所用乙醇的浓度为70%，所述乙醇提取的温度为40-55℃，时间为2-6h；
（4）合并步骤（2）和步骤（3）得到的上清液，依次进行浓缩、干燥，得到所述酚类物质。
2.如权利要求1所述的从松树皮中提取酚类物质的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述干燥为冷冻干燥。
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