CN102631381A

CN102631381A - 一种从红松树皮中提取多酚物质的方法

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Publication number: CN102631381A
Application number: CN2012101256317A
Authority: CN
Inventors: 王振宇; 黄雨洋
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Northeast Forestry University
Priority date: 2012-04-18
Filing date: 2012-04-18
Publication date: 2012-08-15

Abstract

一种从红松树皮中提取多酚物质的方法属于林业天然产物的化学提取领域，以红松树皮为原料，采用粉碎处理后与水混合得到混合液，向混合液中加入纤维素酶进行酶解，酶解后离心分离得到上清液与残渣，取上清液加入乙醇超声提取后进入大孔吸附树脂分离纯化既得多酚类物质；本发明具有工艺方法简单、条件温和、多酚物质提取率高的特点。

Description

一种从红松树皮中提取多酚物质的方法

技术领域

本发明属于农业天然产物的化学提取领域，主要涉及一种从红松树皮中提取多酚物质的方法。

背景技术

红松(Pinus koraiensis)，亦称果松、海松，常绿乔木，高达40m。叶五针一束，长6-12cm。分布于我国东北长白山到小兴安岭地区，常与鱼鳞松、红皮云杉等组成混交林，是重要的农林资源，其果实红松种子以其颗粒饱满，营养丰富而闻名，自古就是食疗佳品，具有较高的药用价值及保健功能。研究表明，松属植物中含有萜类、多酚类、生物碱等多种生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤及抗菌等生物活性，其中多酚类成分是重要的抗氧化剂，具有很大的开发潜力。

多酚是植物中十分重要的一类抗氧化活性成分，广泛分布于植物体内，是目前倍受关注的天然活性物质之一。世界上先进水平的多种抗氧化剂，降血脂制剂及心脑血管等疾病药物的功能因子都来源于多酚类化合物。临床实验显示多酚类物质是一种重要的营养因子和药理因子。茶多酚具有阻断亚销酸钠等多种致癌物质在体内合成的功效，并具有直接杀伤癌细胞和增强机体免疫力的功效，对病原菌、病毒有明显的抑制和杀灭作用。

目前国内外多酚粗品的提取的方法主要有：溶剂提取法、离子沉淀法、树脂吸附分离法、超临界流体萃取法、超声波浸提方法、微波浸提法等6种方法.此外，还有低温纯化酶提取法，和盐吸法等。

溶剂提取法虽然稳定、可靠，但是用水提取多酚提取率低产品纯度低，产品易氧化，且其中含有大量杂质，离子沉淀提取法虽然减少了有机溶剂的使用，生产安全性好，但是损失较大，对提取过程进行超声波强化处理，利用超声波的机械破碎和空化作用，加速多酚浸提物向溶剂扩散的速度，缩短浸提时间，但是多酚提取率并不高。

发明内容

本发明目是通过对酶解处理、超声波提取以及纯化分离过程中多个工艺参数的研究与确定，针对红松树皮中多酚类物质提取率低的问题，研究一种从红松树皮提取多酚物质的方法，达到增加多酚得率的目的。

一种从红松树皮中提取多酚物质的方法，提取方法步骤如下：(1)将红松树皮粉碎后过40目筛后与水混合得到混合液，红松树皮与水重量比为1∶30-40；(2)向混合液中加入纤维素酶进行酶解得到酶解液，其酶解温度为40-60℃，酶解时间为2-3h，加酶量为混合液中红松树皮物料重量的100-140U/g底物，酶解PH为4-6；(3)将酶解液以4000r/min转速离心10min，得到上清液与残渣；(4)向步骤(3)得到的上清液中加入乙醇进行超声提取，乙醇浓度为40-60％，超声时间为2-3h，超声温度40-65℃，超声功率700-1200W；(5)将超声提取的样品旋转蒸发后进入大孔吸附树脂AB-8分离纯化既得多酚，上样浓度1-3mg/mL，上样流速1-4bv/h，上样PH为3-5。

所述方法优选参数是：红松树皮与水重量比为1∶32。

所述方法酶解优选参数是：酶解时间为2.6h、酶解温度为50℃、加酶量为107U/g底物、酶解PH为4.7。

所述方法超声优选参数是：乙醇浓度为56％、超声时间为2.8h、超声温度为60℃、超声功率为1000W。

所述方法分离优选参数是：上样浓度为2.0mg/mL，上样流速为3.0bV/h，上样pH为4.0。

本发明方法将原本废弃的红松树皮加以利用，从中提取出具有高价值的多酚类物质，并且采用纤维素酶进行酶解处理，大大增加了红松树皮中多酚物质的提取率。

附图说明

图1是红松树皮中提取多酚物质的工艺流程图

图2是乙醇浓度、液料比对多酚得率的响应面图

图3是乙醇浓度、酶解温度对多酚得率的响应面图

图4是乙醇浓度、加酶量对多酚得率的响应面图

图5是乙醇浓度、pH对多酚得率的响应面图

图6是酶解时间、液料比对多酚得率的响应面图

图7是酶解时间、加酶量对多酚得率的响应面图

图8是液料比、酶解温度对多酚得率的响应面图

图9是液料比、加酶量对多酚得率的响应面图

图10是液料比、pH对多酚得率的响应面图

图11是酶解温度、加酶量对多酚得率的响应面图

图12是酶解温度、pH对多酚得率的响应面图

图13是加酶量、pH对多酚得率的响应面图

图14是超声时间对红松树皮中多酚提取率的影响单因素图

图15是超声温度对红松树皮中多酚提取率的影响单因素图

图16是超声功率对红松树皮中多酚提取率的影响单因素图

图17是上样浓度对大孔树脂吸附多酚的影响单因素图

图18是上样流速对大孔树脂吸附多酚的影响单因素图

图19是上样pH对大孔树脂吸附多酚的影响单因素图

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述，

一种从红松树皮中提取多酚物质的方法，提取方法步骤如下：(1)将红松树皮、粉碎后过40目筛后与水混合得到混合液，红松树皮与水重量比为1∶30-40；

(2)向混合液中加入纤维素酶进行酶解得到酶解液，其酶解温度为40-60℃，酶解时间为2-3h，加酶量为混合液中红松树皮物料重量的100-140U/g底物，酶解PH为4-6；(3)将酶解液以4000r/min转速离心10min，得到上清液与残渣；(4)向步骤(3)得到的上清液中加入乙醇进行超声提取，乙醇浓度为40-60％，超声时间为2-3h，超声温度40-65℃，超声功率700-1200W；(5)将超声提取的样品旋转蒸发后进入大孔吸附树脂AB-8分离纯化既得多酚，上样浓度1-3mg/mL，上样流速1-4bv/h，上样PH为3-5。

所述方法优选参数是：红松树皮与水重量比为1∶32。

所述方法酶解优选参数是：酶解时间为2.6h、酶解温度为50℃、加酶量为底物、酶解PH为4.7。

实施例1酶解参数优化

1材料与方法

1.1原料与试剂

原料：红松树皮收集于黑龙江省伊春，粉碎后40目过筛，低温干燥至恒质量后备用。

试剂：纤维素酶(Sanland-chem international Inc，30u/mg)、没食子酸、福林试剂、碳酸钠、浓盐酸、氢氧化钠、无水乙醇均为国产分析纯。甲醇，高效液相级。

1.2仪器

高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器公司；恒温水浴锅，北京医疗电子仪器厂；酸度计，上海大中分析仪器厂；T6新世纪紫外可见分光光度计；北京普析通用公司；R-205B旋转蒸发仪，上海申胜仪器公司；电子天平，西安兴成智仪器；Essentia LC-15C型高效液相，日本岛津。

1.3试验方法

1.3.1Folin-ciocalteu法测定多酚类成分含量

1)准确量取标样没食子酸50mg没食子酸，先加入少量蒸馏水带没食子酸全部溶解后，加蒸馏水定容至500mL混合均匀得浓度为100ug/mL的没食子酸溶液。量取0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35mL于10mL比色管中，加蒸馏水定容至2mL，摇匀后加1.0mL福林试剂，4min后加入1.0mL 10％的碳酸钠溶液，25℃水浴下保持2h后测定溶液在765nm处的吸光值(A765)，得到标准曲线方程。

y＝0.0534x+0.1529 R²＝0.9992

式中x：多酚含量(mg/g干重)y：吸光度

2)松树皮提取物中多酚含量的测定

准确吸取适量体积的松树皮提取液1mL于10mL比色管中，加蒸馏水定容至2mL。加入1.0mL福林试剂后摇匀，4min后加入1.0mL10％碳酸钠溶液，25℃水浴下保持2h后测定溶液在765nm处的吸光度值。将吸光度值代入标准曲线方程计算样品中多酚类成分含量。

1.3.2响应面优化设计试验

分别考察乙醇浓度、提取时间、液料比、酶解温度、加酶量对红松树皮中多酚得率的影响，以确定各因素的适应范围。在单因素试验基础上，综合考虑5个因素对提取物中多酚得率的影响，按SAS9.0对红松树皮多酚多酚条件进行优化。

2结果与分析

2.2.1响应面试验设计

以红松树皮多酚得率(y mg/g)为响应值进行相应分析试验，SmallComposite：Hartley Method设计每个因素取5个水平，以(-2，-1，0，1，2)编码，对数据进行二次回归拟合，得到包括一次项、平方项和交互项的二次方程，分析各因素的主效应和交互效应，最后在一定水平范围内求取最佳值(添加试验设计参考文献)。因素水平编码如表1所示，表2中33组试验为因点和零点，其中析因点位自变量取值在x₁、x₂、x₃、x₄、x₅、x₆所构成的三维顶点，零点为区域的中心点，零点试验重复5次，用以估计试验误差。

表1 Small Composite：Hartley Method试验设计因素和水平

表2 Small Composite：Hartley Method设计方案及试验结果

2.2.2回归方程建立与方差及降维分析

利用SAS9.1软件对表2试验数据进行多元回归拟合，得到多酚得率(y)对乙醇浓度(x₁)、酶解时间(x₂)、液料比(x₃)、酶解温度(x₄)、加酶量(x₅)、pH(x₆)的二次多项回归模型为：

y = 3.116 + 0.133 x_{1} + 0.11 x_{2} - 0.016 x_{3} + 0.054 x_{4} + 0.053 x_{5} - 0.006 x_{6} - 0.126 x_{1}^{2} -

0.043 x_{1} x_{3} - 0.031 x_{1} x_{4} - 0.064 x_{1} x_{5} - 0.111 x_{1} x_{6} - 0.081 x_{2}^{2} - 0.042 x_{2} x_{3} - 0.004 x_{2} x_{4} -

0.116 x_{3}^{2} + 0.119 x_{3} x_{5} + 0.072 x_{3} x_{6} - 0.127 x_{4}^{2} + 0.117 x_{4} x_{6} - 0.03 x_{5}^{2} + 0.068 x_{5} x_{6} -

0.219 x_{6}^{2}

表3回归与方差分析结果

表3是对方程的方差和回归分析结果。由表3可知，模型一次项的因子贡献率为x₂＞x₄＞x₅＞x₁＞x₆＞x₃，即单因素对多酚得率的影响大小依次是酶解时间、酶解温度、加酶量、乙醇浓度、pH、液料比；二次项x₁ ²、x₂ ²、x₃ ²、x₄ ²、x₅ ²、x₆ ²显著，x₅ ²不显著；交互项中x₁x₃、x₁x₄、x₁x₅、x₁x₆、x₂x₃、x₂x₅、x₃x₄、x₃x₅、x₃x₆、x₄x₅、x₄x₆、x₅x₆显著，其他交互项不显著。由表3可知F_Model＝111.5612，P＜0.01，表明二次多元回归模型极显著；P_失拟项＝0.104381＞0.05，说明模拟失拟不显著；模型的相关系数R²＝96.30％，表明方程模型与试验数据有96.30％的符合度，该模型有很高的可信度化，可以用此模型对红松树皮提取多酚的工艺进行分析和预测。

2.2.3多酚得率的等高线分析

等高线分析的图形是特定的响应值对应自变量构成的一个二维空间图，可以直观的反映出各自变量对响应值的影响。图2-13为各因素交互作用显著的等高线。12个等高线反映出在优化条件下(红松树皮多酚得率)存在极大值。

乙醇浓度与液料比对红松树皮多酚得率的交互作用见图2。乙醇浓度一定时，随着液料比的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在乙醇浓度为52％时出现极大值，之后随着液料比的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；乙醇浓度在30～66％范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明乙醇浓度、液料比的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

乙醇浓度与酶解温度对红松树皮多酚得率的交互作用见图3。乙醇浓度一定时，随着酶解温度的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在乙醇浓度为52％时出现极大值，之后随着酶解温度的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；乙醇浓度在30～66％范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明乙醇浓度、酶解温度的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

乙醇浓度与加酶量对红松树皮多酚得率的交互作用见图4。乙醇浓度一定时，随着液料比的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在乙醇浓度为46％时出现极大值，之后随着加酶量的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；乙醇浓度在30～66％范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着乙醇浓度方向的等高线密度比较大，说明乙醇浓度对多酚得率影响较大。沿着加酶量增加方向的等高线密度较小，说明加酶量对多酚得率影响较小，但乙醇浓度、加酶量的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

乙醇浓度与pH对红松树皮多酚得率的交互作用见图5。乙醇浓度一定时，随着液料比的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在乙醇浓度为52％时出现极大值，之后随着pH的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；乙醇浓度在30～66％范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明乙醇浓度、pH的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当酶解时间为2.9h时，酶解时间与液料比对红松树皮多酚得率的交互作用见图6。酶解时间一定时，随着液料比的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在酶解时间为2.9h时出现极大值，之后随着液料比的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；酶解时间在1.5～3.3h范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明酶解时间、液料比的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当酶解时间为2.9h时，酶解时间与加酶量对红松树皮多酚得率的交互作用见图7。酶解时间一定时，随着加酶量的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在酶解时间为3.3h时出现极大值，之后随着加酶量的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；酶解时间在1.5～3.3h范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明酶解时间、加酶量的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当液料比为35∶1时，液料比与酶解温度对红松树皮多酚得率的交互作用见图8。液料比一定时，随着酶解温度的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在液料比为27∶1～45∶1时出现极大值，之后随着酶解温度的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；液料比在27∶1～45∶1范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明液料比、酶解温度的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当液料比为38∶1时，液料比与加酶量对红松树皮多酚得率的交互作用见图9。液料比一定时，随着酶解温度的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在液料比为27∶1～45∶1时出现极大值，之后随着加酶量的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；液料比在27∶1～45∶1范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着液料比方向的等高线密度比较大，说明液料比对多酚得率影响较大。沿着加酶量变化等高线密度较小，说明加酶量对多酚得率影响较小，但加酶量的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当液料比为35∶1时，液料比与加酶量对红松树皮多酚得率的交互作用见图10。液料比一定时，随着pH的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在液料比为27∶1～45∶1时出现极大值，之后随着pH的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；液料比在27∶1～45∶1范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明液料比、pH的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当酶解温度为52℃时，酶解温度与加酶量对红松树皮多酚得率的交互作用见图11。液酶解温度一定时，随着加酶量的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在酶解温度为30～66℃时出现极大值，之后随着加酶量的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；酶解温度在30～66℃范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明酶解温度、加酶量的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当酶解温度为52℃时，酶解温度与pH对红松树皮多酚得率的交互作用见图12。酶解温度一定时，随着pH的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在酶解温度为30～66℃时出现极大值，之后随着pH的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；酶解温度在30～66℃范围内红松树皮多酚得率变化较明显。沿着两因素变化方向的等高线密度比较大，说明酶解温度、pH的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

当加酶量为145U/g时，加酶量与pH对红松树皮多酚得率的交互作用见图13。加酶量一定时，随着pH的增加，红松树皮多酚得率先增加后降低，在加酶量为80～160U/g时出现极大值，之后随着pH的增加，红松树皮多酚得率呈下降趋势；加酶量在80～160U/g范围内红松树皮多酚得率变化不明显。沿着pH方向的等高线密度比较大，说明pH对红松树皮多酚得率的影响较大。沿着加酶量变化方向等高线密度较小，说明加酶量对多酚得率影响较小，但加酶量、pH的交互作用对红松树皮多酚得率的影响较大。

2.2.4试验验证与对比试验

为了检验模型预测的准确性，采用响应面优化的工艺条件(见表4，乙醇浓度56％、酶解时间2.6h、液料比32∶1、提取温度50℃、加酶量107U/g、pH4.7)进行红松树皮多酚得率提取试验。由表5结果可知，3次验证试验结果所测得的红松树皮多酚得率的平均值为9.78mg/g，与预测值误差小于0.01，可见该模型能较好地预测红松树皮多酚的提取情况，证明此次RSM试验参数准确可靠，具有一定的应用价值。由表5对比试验结果可知，在加酶提取工艺条件下(乙醇浓度56％、酶解时间2.6h、液料比32∶1、提取温度50℃、加酶量107U/g、pH4.7)，多酚得率可达到9.78mg/g，在不加酶条件下(乙醇浓度56％、酶解时间2.6h、液料比32∶1、提取温度50℃、pH4.7)，多酚得率可达到7.76mg/g。由此可见，在乙醇提取红松树皮多酚工艺中，采用纤维素酶预先进行酶解可以增加多酚得率，增加量为2.02mg/g。

表4响应面优化结果

表5验证和对比试验结果

3结论

在单因素试验的基础上，考察了乙醇浓度、酶解时间、液料比、提取温度、pH红松树皮多酚得率的影响。由Small Composite：Hartley Method响应面分析试验得出，酶解时间、酶解温度、加酶量、乙醇浓度是影响红松树皮多酚得率的主要因素，其中酶解时间的影响最为显著。依据回归分析确定红松树皮多酚提取的最佳工艺为乙醇浓度56％、酶解时间2.6h、液料比32∶1、提取温度50℃、加酶量107U/g、pH4.7。在此工艺条件下，红松树皮多酚得率可达到9.78mg/g。由验证试验结果可见，通过响应面分析法优化红松树皮多酚的提取工艺条件在实践上是可靠的。根据对比试验可知，在乙醇提取红松树皮多酚工艺中，采用纤维素酶预先进行酶解可以增加多酚得率，增加量为2.02mg/g。

实施例2超声波提取工艺优化

2.1实验方法

2.1.1红松种皮多酚提取单因素试验

2.1.1.1超声温度因素考察

精确称取7份2.00g的红松种皮粉于100mL烧杯中，加入56％乙醇作为提取溶剂，置于超声波破碎仪中，分别按40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃温度条件进行超声波提取2.5h。收集各温度条件下提取的样品，立即以4000rpm转速离心10min。收集上清液于锥形瓶中待测。待各温度条件提取的样品均收集完全后，按照福林酚法测定其中多酚含量并计算多酚得率。

2.1.1.2超声时间因素考察

精确称取6份2.00g的红松树皮粉于100mL烧杯中，加入56％乙醇作为提取溶剂，置于超声波破碎仪中在温度为60℃条件下分别提取2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3.0h，按照设定的时间取出提取样品，取出后立即离心，将提取液以4000rpm转速离心10min。收集上清液于锥形瓶中待测。待各时间提取样品均收集完全后，按照福林酚法测定其中多酚含量并计算多酚得率。

2.1.1.2超声功率因素考察

精确称取6份2.00g的红松树皮粉于100mL烧杯中，加入56％乙醇作为提取溶剂，置于超声波破碎仪中在温度为60℃条件下超声功率分别设为700w、800w、900w、1000w、1100w、1200w，按照设定的时间取出提取样品，取出后立即离心，将提取液以4000rpm转速离心10min。收集上清液于锥形瓶中待测。待各时间提取样品均收集完全后，按照福林酚法测定其中多酚含量并计算多酚得率。

2.2结果与分析

2.2.1超声时间对提取红松树皮多酚得率的影响

按照试验设定的各超声时间条件对红松树皮中多酚成分进行提取进行提取，取上清液测定不同超声时间条件下红松树皮提取液中多酚含量，计算红松种壳中的多酚得率，实验结果见图14。结果显示，超声波作用时间对多酚得率具有较为显著的影响。超声波作用时间为2h时多酚提取得率较低，随着超声波作用时间的延长，多酚得率提高，当超声波作用时间到达2.8h后，多酚提取率达到最大，时间提高到3.0h时多酚提取的得率略有下降。超声波提取时间单因素试验结果显示确定适宜的提取时间为2.8h。

2.2.2超声温度对提取红松树皮多酚得率的影响

按照试验设定的温度条件提取红松树皮多酚，取上清液测定多酚含量，计算红松树皮中的多酚得率，实验结果见图15。实验结果显示超声波提取温度对红松种壳多酚得率影响较为显著，提取得到松壳多酚得率随温度升高而上升且上升幅度较大。提取温度40℃至50℃之间变化时，多酚得率相对较低，50℃至60℃升温时多酚得率较高，温度继续升高到65℃时多酚得率上升幅度不大并且温度过高仪器稳定性不够理想，因此确定在实验可行条件下适宜的提取温度为60℃。

2.2.3超声功率对提取红松树皮多酚得率的影响

按照试验设定的温度条件提取红松树皮多酚，取上清液测定多酚含量，计算红松种壳中的多酚得率，实验结果见图16。实验结果显示超声波提取功率对红松种壳多酚得率影响较为显著，提取得到松壳多酚得率随超声功率升高而上升且上升幅度较大。超声功率700w至900w之间变化时，多酚得率相对较低，900w至1000w时多酚得率较高，功率继续升高到1200时多酚得率上升幅度不大，因此确定在实验可行条件下适宜的超声功率为1000w。

实施例3红松树皮多酚纯化工艺优化研究

3.1实验方法

3.1.1大孔树脂预处理

将大孔树脂AB-8置于乙醇中浸泡24h，充分溶胀后用蒸馏水充分洗涤，冲洗至无白色浑浊物出现后用5％盐酸浸泡8h，蒸馏水充分洗涤至中性，再用5％氢氧化钠溶液浸泡8h，蒸馏水充分洗涤至中性后备用。

3.1.2大孔树脂装柱

大孔树脂AB-8湿法装柱，将预处理后的AB-8型大孔树脂置于大烧杯中并于真空箱中排出树脂中的气泡，先在层析柱中加入蒸馏水，放开层析柱底端的活塞排除层析柱中残留的气泡至蒸馏水剩余高度约三分之一高度时关闭活塞。将大孔树脂搅拌均匀在悬浮状态下灌入层析柱中，快速打开层析柱下端活塞同时继续向层析柱中加入大孔树脂至层析柱高度的四分之三。用3倍柱体积蒸馏水平衡大孔树脂柱，使其顶端平整柱体均一且树脂高度不变。

3.1.3样品浓度对红松树皮多酚吸附性能影响测定

准确称取6份10.0g预处理后的大孔树脂于100mL锥形瓶中，加入浓度分别为0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mL、2.0mg/mL、2.5mg/mL、3.0mg/mL的红松种壳多酚提取物样品液。放置于恒温恒速振荡器中，在25℃条件下振荡吸附一定时间，量取一定量红松种壳多酚样品液，采用福林酚法显色后测定其吸光度值，通过计算吸附量来研究样品液浓度对大孔树脂吸附多酚效果的影响。

3.1.4上样液流速对红松树皮多酚吸附的影响

动态吸附实验：以静态吸附试验确定的红松树皮多酚样品液浓度及pH条件为基础，分别以1.0BV/h、1.5BV/h、2.0BV/h、3.0BV/h、4.0BV/h的流速进行样品上柱，上样结束后用蒸馏水洗涤3倍柱体积，测定漏出液中多酚含量，研究上样液流速对松壳多酚动态吸附的影响。

3.1.5上样pH对红松树皮多酚吸附性能测定

准确称取6份10.0g预处理后的大孔树脂于100mL锥形瓶中，加入浓度为1.0mg/mL的红松种壳多酚样品液40mL，并分别调节pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，调节pH后加入蒸馏水补齐体积至50mL。放置于恒温恒速振荡器中，在25℃条件下振荡吸附一定时间，量取等量的红松树皮多酚样品液，采用福林酚法显色后测定其吸光度值，研究pH值对大孔树脂吸附红松树皮多酚效果的影响。

3.1.6红松种树皮酚纯度计算

红松树皮多酚纯度按照以下公式计算：

P＝(M₁/M₂)×100％

式中P——红松树皮多酚纯度(％)；

M₁——洗脱液中多酚含量(mg)；

M₂——洗脱物干重(mg)。

3.2结果与分析

3.2.1样品浓度对红松树皮多酚吸附效果的影响

将等质量红松种壳多酚提取物样品制成不同浓度溶液分别进行吸附，通过计算吸附平衡时红松壳多酚的吸附量用以考察样品浓度对吸附的影响。图17为不同浓度条件下红松树皮多酚供试液吸附效果。由图17可以看出，红松树皮多酚浓度对树脂的吸附性能有一定影响，浓度过高不利于吸附，较低的含量有利于多酚吸附率的提高。由图17可知，随着样品浓度的增加，吸附量逐渐增加，但是当多酚的浓度增加到2mg/mL后，吸附率随浓度增加而下降，不利于吸附的进行。这说明在一定多酚浓度范围内，随着多酚浓度的提高，可吸附物质的量也随着增加，因而使树脂对红松树皮多酚的吸附量增加。但是，随着浓度的提高，与多酚竟争吸附的杂质量也随之增加，随着料液浓度的增加，可能使红松树皮多酚等物质在树脂内部扩散能力降低，因而吸附量趋于饱和甚至下降。综合考虑适宜红松树皮多酚吸附的样品浓度为2mg/mL。

3.2.2上样流速对红松树皮多酚吸附效果的影响

取等量红松树皮样品溶液，分别以1BV/h、1.5BV/h、2.0BV/h、3.0BV/h、4.0BV/h流速进行上样，上样结束后用蒸馏水洗脱3倍柱体积，测定漏出液中多酚含量，不同上柱流速的树脂动态吸附曲线如图18所示。

在其它条件相同，仅流速改变的情况下，上柱流速分别为1BV/h、1.5BV/h、2.0BV/h、3.0BV/h、4.0BV/h时漏出液中多酚成分的含量1BV/h、1.5BV/h、2.0BV/h流速时没有明显差异，而当流速上升到3.0BV/h至4.0BV/h时，漏出液中多酚物质含量升高，这说明过高的上样流速不利于样品的吸附。不同的上样液流速对树脂溶质向树脂表面扩散产生影响，因而影响吸附的效果。多酚为一类分子较大的酚类化合物，其扩散速度较慢，如果上柱流速过大，则大量多酚类化合物还来不及被树脂充分吸附便流出树脂柱，这样会降低树脂的工作效率，造成吸附率较低。虽然较低的流速对吸附有利，但流速过低，不仅延长了操作时间，而且会使样品过于分散，因此，适中的流速对于达到较好的分离效果具有重要的意义，在实际生产中应综合考虑选择上柱速度。过高的上柱流速会造成红松种壳多酚溶液与大孔树脂表面接触的时间过短，在较短的时间内，多酚分子无法及时的扩散到树脂的内表面达到吸附的效果从而发生漏过，导致吸附率降低。

而较小的流速可以使红松树皮多酚分子有足够的时间与树脂的内表面充分接触，有利于树脂对红松种树皮多酚的充分吸附，减少多酚的漏出量，从而提高其吸附率。虽然低流速有利于吸附地进行，但是过低的流速会造成成本与能耗增加，并使红松树皮多酚纯化实验周期增长，不够经济合理。实验过程中发现，上柱流速为3.0BV/h时，虽然流速与1.0BV/h相比快2倍，但是测定漏出液中红松种树皮多酚的含量与上样流速为1.0BV/h时漏出液中多酚含量没有特别明显的差异，结果显示其漏出现象不明显，因此综合流速对吸附的影响及纯化成本及周期，选择上柱流速为2.0BV/h比较适宜。

3.2.3pH值对红松树皮多酚吸附效果的影响

调节pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，研究pH值条件对大孔树脂吸附红松种壳多酚效果的影响，采用福林酚法测定吸附前后溶液中多酚含量计算大孔树脂对多酚的吸附率，比较各pH值条件下吸附率的差异，结果如图19所示。结果显示在其它操作条件不变的情况下，pH值的降低有利于大孔树脂对红松种壳多酚成分的吸附，吸附率随pH的降低而逐渐升高，达到一定值后趋于平衡。多酚吸附率增大说明低pH值条件有利于吸附的进行。该实验结果可以通过多酚物质的性质解释，红松种壳提取物主要由多酚化合物组成，由于酚羟基的结构使其成为弱酸性物质，其酚羟基上的氢在于水中可以解离出来而以氢离子形式存在。大孔树脂倾向于吸附以分子形态存在的物质，当被吸附物质以离子形态存在的时候则不易被所用的大孔树脂吸附。由酸碱电离平衡理论可知，酸性物质在pH值下降时向分子形态平衡方向移动，因此，当pH值下降时，红松种壳多酚以分子形态存在的数量增加，就易于被大孔树脂所吸附，当pH值下降到一定值后红松壳多酚几乎完全以分子态存在，此后树脂的选择性吸附趋于平衡，pH值对树脂吸附能力影响不大。综上所述，pH值4.0的条件较适于大孔树脂吸附红松种壳多酚成分。尽管较低的pH值有利于红松壳多酚的吸附，但是总体来看pH的变化对多酚吸附率影响不是特别显著。试验测定发现红松壳多酚提取物溶于水后pH值为4.0左右，因此将多酚直接溶于水后进行吸附即可。

Claims

1.一种从红松树皮中提取多酚物质的方法，其特征在于提取方法步骤如下：(1)将红松树皮粉碎后过40目筛后与水混合得到混合液，红松树皮与水重量比为1∶30-40；(2)向混合液中加入纤维素酶进行酶解得到酶解液，其酶解温度为40-60℃，酶解时间为2-3h，加酶量为混合液中红松树皮物料重量的100-140U/g底物，酶解PH为4-6；(3)将酶解液以4000r/min转速离心10min，得到上清液与残渣；(4)向步骤(3)得到的上清液中加入乙醇进行超声提取，乙醇浓度为40-60％，超声时间为2-3h，超声温度40-65℃，超声功率700-1200W；(5)将超声提取的样品旋转蒸发后进入大孔吸附树脂AB-8分离纯化既得多酚，上样浓度1-3mg/mL，上样流速1-4bv/h，上样PH为3-5。

2.根据权利要求1所述的一种从红松树皮中提取多酚物质的方法，其特征在于所述方法优选参数是：红松树皮与水重量比为1∶32。

3.根据权利要求1所述的一种从红松树皮中提取多酚物质的方法，其特征在于所述方法酶解优选参数是：酶解时间为2.6h、酶解温度为50℃、加酶量为107U/g底物、酶解PH为4.7。

4.根据权利要求1所述的一种从红松树皮中提取多酚物质的方法，其特征在于所述方法超声优选参数是：乙醇浓度为56％、超声时间为2.8h、超声温度为60℃、超声功率为1000W。

5.根据权利要求1所述的一种从红松树皮中提取多酚物质的方法，其特征在于所述方法分离优选参数是：上样浓度为2.0mg/mL，上样流速为3.0bV/h，上样pH为4.0。