CN110859865A

CN110859865A - 一种蒲公英提取复合物的制备方法

Info

Publication number: CN110859865A
Application number: CN201911258024.6A
Authority: CN
Inventors: 王楠; 夏道宗
Original assignee: Zhejiang Lvjing Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Lvjing Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-12-10
Filing date: 2019-12-10
Publication date: 2020-03-06

Abstract

本发明提供了一种蒲公英提取复合物的制备方法，属于蒲公英提取工艺领域。它解决了现有现有市面上，蒲公英提取物大多为单一的提取物，存在药效作用单一的缺点，且提取效率低等问题，一种蒲公英提取复合物的制备方法，包括如下步骤：S01：制备蒲公英干粉；S02：用三种不同的溶剂，并加入酶进行酶解处理，再灭酶，离心取上清液，得到蒲公英提取液A、蒲公英提取液B和蒲公英提取液C；S03：混合步骤S02中的三种蒲公英提取液，浓缩，冻干即得蒲公英提取复合物。本发明制备的蒲公英提取复合物具有抑菌作用和抑制肿瘤生长的作用等优点。

Description

一种蒲公英提取复合物的制备方法

技术领域

本发明属于蒲公英提取工艺领域，特别涉及一种蒲公英提取复合物的制备方法。

背景技术

蒲公英是菊科蒲公英属多年生草本植物。全世界大约有蒲公英属植物2000余小种，分布于我国的各个地区，其中华北、西北、西南、东北等省区分布较多。蒲公英营养丰富，食味独特，不但是营养价值很高的食用山野菜，也是药用价值较高的中草药，蒲公英凭借其资源储量大、独特的生物学特性、药食两用并可以长期食用的安全性等优势，近年来在功能性食品、饮品、保健品、化妆品等领域的发展已取得初步成果。

现有市面上，蒲公英提取物大多为单一的提取物，存在药效作用单一的缺点，且提取效率低。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种蒲公英提取复合物的制备方法。

本发明的目的可通过下列技术方案来实现：一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01：制备蒲公英干粉；

S02：用三种不同的溶剂，并加入酶进行酶解处理，再灭酶，离心取上清液，得到蒲公英提取液A、蒲公英提取液B和蒲公英提取液C；

S03：混合步骤S02中的三种蒲公英提取液，浓缩，冻干即得蒲公英提取复合物。

优选地，步骤S02中，酶解温度为50℃，酶解pH为4.5。

优选地，步骤S02中，三种溶剂分别为水溶液、45％乙醇溶液、75％乙醇溶液。

优选地，步骤S02中，加入的酶为纤维素酶、果胶酶中的一种或两种混合。

优选地，步骤S02中，酶解处理后进行超声浸提，再通过沸水浴的方式灭酶。

优选地，步骤S02中，当溶剂为45％乙醇溶液，酶解处理时，料液比为1:20，纤维素酶的添加量为2mg/g，果胶酶的添加量为2mg/g，酶解时间为1.5小时，最后得到蒲公英提取液A。

优选地，步骤S02中，当溶剂为水溶液，酶解处理时，料液比为1:40，纤维素酶的添加量为2mg/g，果胶酶的添加量为4mg/g，酶解时间为2小时，最后得到蒲公英提取液B。

优选地，步骤S02中，当溶剂为75％乙醇溶液，酶解处理时，料液比为1:20，纤维素酶的添加量为4mg/g，果胶酶的添加量为2mg/g，酶解时间为1.5小时，最后得到蒲公英提取液C。

优选地，步骤S03中，蒲公英提取液A、蒲公英提取液B和蒲公英提取液C的混合比例为1:2:2。

优选地，步骤S03中，蒲公英提取液A、蒲公英提取液B和蒲公英提取液C按比例混合后，旋转蒸发浓缩，不足50ml的加水补足，-20℃冷冻干燥24h，即得蒲公英提取复合物。

本发明的工作原理：蒲公英洗净后冷冻干燥，粉碎过80目筛，即得蒲公英干粉，置干燥器中备用。

以45％乙醇溶液为溶剂，并加入酶进行酶解处理，再灭酶，离心取上清液，得到蒲公英提取液A。

以水溶液为溶剂，并加入酶进行酶解处理，再灭酶，离心取上清液，得到蒲公英提取液B。

以75％乙醇溶液为溶剂，并加入酶进行酶解处理，再灭酶，离心取上清液，得到蒲公英提取液C。

按照比例混合蒲公英提取液A、B、C，旋转蒸发浓缩，不足50ml的加水补足，-20℃冷冻干燥24h，即得蒲公英提取复合物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明通过酶法提取了蒲公英中的三种主要药效物质，对提取方法进行了研究，并通过不同配比，获得不同的提取物复合物，并通过实验证实，该复合物具有抑菌作用和抑制肿瘤生长的作用。将多种提取物混合，最大程度的还原了蒲公英全草的作用，具有广阔前景。

2、本发明中，当蒲公英提取液A、蒲公英提取液B和蒲公英提取液C的混合比例为1:2:2时，此时具有较强的抑制肿瘤生长的作用和最佳抑制细菌生长的作用。

3、本发明通过酶法提取蒲公英，获得不同的药效物质，并通过一定配比混合提取物制备得到蒲公英复合物，该方法提高了提取效率的同时，改善了市面上单一提取物存在药效作用单一的缺点。

附图说明

图1是本发明的结构示意图。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。

蒲公英提取液中总多糖、总黄酮、总酚酸的含量测定方法

总多糖含量测定：采用苯酚硫酸法，具体如下：配制葡萄糖溶液(0.1mg/mL)作为标准品；精密吸取0.2mL；0.4mL；0.6mL；0.8mL；1.0mL；1.2mL葡萄糖溶液于试管中，加水补足至2mL，精密加入5％苯酚溶液1mL，摇匀，迅速精密加入硫酸5mL，沸水浴中反应15min后，取出立即进行冰水浴，冷却至室温后于490nm处进行检测。样品检测方法同标准品。

总黄酮含量测定：精密吸取标准溶液0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00ml置于10ml的比色管中，往每只比色管中加入5％的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀放置6分钟，再加入10％的硝酸铝溶液0.30ml,摇匀，放置6min接着加入4％的氢氧化钠4ml,加入60％的乙醇溶液至刻度线定容，摇匀，放置15min.最后在波长510nm处测定吸光度。样品检测方法同标准品。

总酚酸的含量测定：精密称取4.5mg没食子酸至25毫升的容量瓶，得到0.18mg/ml的没食子酸对照品，分别取0.1、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5毫升放入10毫升的容量瓶中，依次加入2ml去离子水和0.5毫升的福林酚试剂，静置3分钟后加入2毫升的10％碳酸钠溶液。迅速用去离子水定容至刻度。混匀后置于室温静置2小时，测定吸光度，重复5次(吸光度760)。样品检测方法同对照品。

单因素实验

实施例1加酶量的研究

准确称取蒲公英干粉10g放入三角瓶中，分别以水溶液、45％乙醇溶液、75％乙醇溶液为溶剂，料液比为1:25，在pH 5.0的情况下，添加不同含量的纤维素酶和果胶酶(添加量见下表)，并在50℃水浴振荡下酶解1.5h，再经超声温度40℃、功率100W处理0.5h后，沸水浴灭酶5min，离心取上清液，分别测定加酶量对总多糖得率、总黄酮得率、总酚酸得率的影响。

表1加酶量筛选

表1以水溶液为溶剂时，纤维素酶和果胶酶的添加量；以45％乙醇溶液为溶剂时，纤维素酶和果胶酶的添加量同表1，以75％乙醇溶液为溶剂时，纤维素酶和果胶酶的添加量同表1，故共有27组实验。

结果：当溶剂相同时，当纤维素酶添加量为2mg/g，果胶酶添加量为2mg/g时，总黄酮含量最高；纤维素酶添加量为2mg/g，果胶酶添加量为4mg/g时总多糖含量最高；当纤维素酶添加量为4mg/g，果胶酶添加量为2mg/g时总酚酸含量最高。

当纤维素酶和果胶酶的添加量相同时，以水溶液为溶剂，总多糖含量最高；以45％乙醇溶液为溶剂，总黄酮含量最高；以75％乙醇溶液为溶剂，总酚酸含量最高。

实施例2料液比的研究

准确称取蒲公英干粉10g放入三角瓶中，分别以水溶液、45％乙醇溶液、75％乙醇溶液为溶剂，分别在料液比为1：10、1：20、1：30、1:40(g/mL)，pH 5.0的情况下，添加纤维素酶2mg、果胶酶4mg，并在50℃水浴振荡下酶解1.5h，再经超声温度40℃、功率100W处理0.5h后，沸水浴灭酶5min，离心取上清液，分别测定加酶量对总多糖得率、总黄酮得率、总酚酸得率的影响。

结论：(1)溶剂选用45％乙醇溶液，在上述料液比下，蒲公英总黄酮的提取率分别为3.417％，3.655％，3.648％，3.523％。当料液比大于1：20时，蒲公英总黄酮提取率随比例的升高而降低，因此，提取中料液比不宜过高或过低，故后续的正交试验选择料液比为1：10、1：20、1:30三个水平。

(2)溶剂选用水溶液，在上述料液比下，蒲公英总多糖的提取率分别为2.312％，2.451％，2.533％，2.529％。在料液比为1：30时，蒲公英总多糖提取率最高，当料液比大于1：30时蒲公英总多糖提取率随比例的升高而降低。因此，提取中料液比不宜过高或过低，故后续的正交试验选择料液比为1：20、1:30、1：40三个水平。

(3)溶剂选用75％乙醇溶液，在上述料液比下，蒲公英总酚酸的提取率分别为3.362％，3.411％，3.019％，3.022％。结果表明，在料液比为1：20时，蒲公英总多糖提取率最高，当料液比大于1：20时，蒲公英总多糖提取率随比例的升高而降低。因此，提取中料液比不宜过高或过低，故后续的正交试验选择料液比为1：10、1：20、1:30三个水平。

实施例3pH值的研究

准确称取蒲公英干粉10g放入三角瓶中，分别以水溶液、45％乙醇溶液、75％乙醇溶液为溶剂，料液比为1:25(g/mL)，分别在PH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的条件下，添加纤维素酶2mg、果胶酶4mg，并在50℃水浴振荡下酶解1.5h，再经超声温度40℃、功率100W处理0.5h后，沸水浴灭酶5min，离心取上清液，分别测定加酶量对总多糖得率、总黄酮得率、总酚酸得率的影响。

结论：在pH为4.5时，总多糖，总黄酮，总酚酸的含量皆达到最高，且随着pH升高，提取率下降，因此正交试验中选用pH 4.0、4.5、5.0三个水平。

实施例4酶解温度

准确称取蒲公英干粉10g放入三角瓶中，分别以水溶液、45％乙醇溶液、75％乙醇溶液为溶剂，料液比为1:25，在PH 5.0的情况下，添加纤维素酶2mg、果胶酶4mg，分别在30、35、40、45、50、55℃水浴振荡下酶解1.5h，再经超声温度40℃、功率100W处理0.5h后，沸水浴灭酶5min，离心取上清液，分别测定加酶量对总多糖得率、总黄酮得率、总酚酸得率的影响。

结论：在酶解温度为50℃时总多糖，总黄酮，总酚酸的含量皆达到最高，且随着温度升高，提取率下降，因此正交试验中选用45、50、55℃三个水平。

实施例5酶解时间

准确称取蒲公英干粉10g放入三角瓶中，分别以水溶液、45％乙醇溶液、75％乙醇溶液为溶剂，料液比为1:25，在pH 5.0的情况下，添加纤维素酶2mg、果胶酶4mg，并在50℃水浴振荡下酶解1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h再经超声温度40℃、功率100W处理0.5h后，沸水浴灭酶5min，离心取上清液，分别测定加酶量对总多糖得率、总黄酮得率、总酚酸得率的影响。

结论：在酶解时间为2h时总多糖，总黄酮，总酚酸的含量皆达到临界点，且随着时间增加，提取率升高不大，因此正交试验中选用1.5h、2h、2.5h三个水平。

正交实验

经过上述单因素实验后，设计正交实验，正交实验的结论如下：

总黄酮提取中，可知影响因素的大小顺序为料液比＞酶解温度＞pH＞酶解时间，蒲公英总黄酮的最佳提取工艺为A2B2C1D2即乙醇浓度为45％，料液比1：20(g/mL)、纤维素酶添加量为2mg/g，果胶酶添加量为2mg/g、pH4.5、酶解时间为1.5h、酶解温度为50℃。黄酮正交结果如表2所示：

表2黄酮提取率正交实验

总多糖提取中，由结果可知影响因素的大小顺序为酶解时间＞料液比＞PH＝酶解温度，蒲公英总多糖的最佳提取工艺为A2B3C2D2即水溶液为溶剂，料液比1：40(g/mL)、纤维素酶添加量为2mg/g，果胶酶添加量为4mg/g、pH4.5、酶解时间为2h、酶解温度为50℃。多糖正交结果如表3所示：

表3多糖提取率正交实验

总酚酸提取中，由结果可知影响因素的大小顺序为酶解时间＞料液比＞pH＞酶解温度，蒲公英总多糖的最佳提取工艺为A1B2C2D2即乙醇浓度为75％，料液比1：20(g/mL)、纤维素酶添加量为4mg/g，果胶酶添加量为2mg/g、pH4.5、酶解时间为1.5h、酶解温度为50℃。酚酸正交结果如表4所示：

表4酚酸提取率正交实验

蒲公英提取复合物的抑菌效果以及抑制肿瘤细胞增殖效果的研究

取三种以最佳工艺制备的提取液，蒲公英提取液A为最佳总黄酮提取物，蒲公英提取液B为最佳总多糖提取物，蒲公英提取液C为最佳总酚酸提取物，按一定比例混合(混合比例见表2)，旋转蒸发浓缩，不足50mL的加水补足，-20℃冷冻干燥24h，测定不同混合比例对最小抑菌浓度(MIC(mg/mL))及肿瘤细胞增殖作用的影响。

表5蒲公英提取复合物制备

结论：由表5结果可知，当复合物组成的蒲公英提取液A：蒲公英提取液B：蒲公英提取液C为1：2：2时，此时具有最佳的抑菌作用，最小抑菌浓度为0.125mg/mL。

如表2和图1所示，该复合物具有一定抑制肿瘤生长的作用，当复合物组成的蒲公英提取液A：蒲公英提取液B：蒲公英提取液C为2：2：1时，具有最强的抑制作用，当组分比为1：2：2时具有较强的抑制作用，且此时具有最佳抑制细菌生长的作用，选定此配比为最佳配比。

复合物对测试细菌的最小抑菌浓度测定

微量肉汤稀释法，用接种环分别小心挑取4种标准菌株(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，枯草芽孢杆菌)适量，接种于5mL营养肉汤中，37℃培养16h至生长对数期，激活细菌。用接种环沾取适量细菌液接种在营养琼脂斜面。用灭菌PBS洗脱缓冲液洗脱，制成细菌原液，移取适量细菌原液于无菌试管中进行等倍稀释，同时使用麦氏比浊法调节细菌浓度为10⁶CFU/mL。将此浓度的细菌按100μL/孔接种于96孔板中，并加入100μL倍比稀释的提取物溶液，单独加入200μL细菌作为生长对照，加入药液与培养基作为空白对照。迅速置于酶标仪中，在600nm波长处测定各培养孔OD值。然后置37℃孵育24h后再次测定OD值。供试药抑菌的OD＝培养后OD(加供试药培养孔-空白对照孔)-培养前OD(各供试药培养孔-空白对照孔)。当生长对照孔内细菌明显生长，实验才有意义，OD差值越小，表明细菌数越少，药物的抑菌活性越强。含供试药培养孔的OD低于或等于空白对照孔的OD，该培养孔的药物浓度即为MIC。

复合物对肿瘤细胞系Huh-7增值作用的影响

采用CCK8法：取对数生长期的细胞，以3×10⁴/mL的密度接种于96孔细胞培养板中，每孔200μL，于孵箱中培养24小时后去除上清，加入100μL DMEM培养液继续培养12小时后，去DMEM培养液，分别加入梯度浓度的药物溶液作用于细胞，并以正常条件培养正常组作为对照，每个浓度设5个复孔。各组分别作用24h后，每孔加入20μL CCK-8继续孵育1小时后，置酶标仪上，测各孔450nm波长处吸光度值(OD值)。

本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims

1.一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S01：制备蒲公英干粉；

2.根据权利要求1所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，酶解温度为50℃，酶解pH为4.5。

3.根据权利要求1所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S02中，三种溶剂分别为水溶液、45％乙醇溶液、75％乙醇溶液。

4.根据权利要求3所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S02中，加入的酶为纤维素酶、果胶酶中的一种或两种混合。

5.根据权利要求1所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S02中，酶解处理后进行超声浸提，再通过沸水浴的方式灭酶。

6.根据权利要求4所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S02中，当溶剂为45％乙醇溶液，酶解处理时，料液比为1:20，纤维素酶的添加量为2mg/g，果胶酶的添加量为2mg/g，酶解时间为1.5小时，最后得到蒲公英提取液A。

7.根据权利要求4所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S02中，当溶剂为水溶液，酶解处理时，料液比为1:40，纤维素酶的添加量为2mg/g，果胶酶的添加量为4mg/g，酶解时间为2小时，最后得到蒲公英提取液B。

8.根据权利要求4所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S02中，当溶剂为75％乙醇溶液，酶解处理时，料液比为1:20，纤维素酶的添加量为4mg/g，果胶酶的添加量为2mg/g，酶解时间为1.5小时，最后得到蒲公英提取液C。

9.根据权利要求1所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S03中，蒲公英提取液A、蒲公英提取液B和蒲公英提取液C的混合比例为1:2:2。

10.根据权利要求1所述的一种蒲公英提取复合物的制备方法，其特征在于，步骤S03中，蒲公英提取液A、蒲公英提取液B和蒲公英提取液C按比例混合后，旋转蒸发浓缩，不足50ml的加水补足，-20℃冷冻干燥24h，即得蒲公英提取复合物。